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1、(10)申请公布号 CN 102960251 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102960251 A *CN102960251A* (21)申请号 201210510932.1 (22)申请日 2012.12.03 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 无限极 （中国） 有限公司 地址 510620 广东省广州市天河区珠江新城 珠江西路 12 号无限极中心 17 层 申请人 高要市董福行农副产品种植管理有 限公司 (72)发明人 秦垂新 罗江清 姚松君 郭爱玲 郑志娟 梁展 陈伟文 孙君社 郑志安 张秀清 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司。
2、 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 一种获得巴戟天体细胞再生植株的方法及其 培养基 (57) 摘要 本发明公开了一种获得巴戟天体细胞再生植 株的方法及其培养基。所述培养基为成套培养 基， 包括诱导培养基、 增殖培养基和 / 或生根培养 基 ； 所述诱导培养基为在 MS 基本培养基中添加细 胞分类素 (6-BA 或 KT)0.1mg/L 和生长素 （2,4-D 或 NAA） 0.1mg/L ； 所述增殖培养基为在 MS 基本培 养基中添加细胞分类素 (6-BA)1.02.0mg/L 和 生长素 （2,4-D 或 NAA） 0.5mg/L ； 所述生根培养基 为在 1/21/8。
3、MS 基本培养基中添加 NAA 0.01 0.1mg/L。本发明的优点如下 ： 诱发巴戟天不定芽 的时间短， 从接种带节茎段至获得 1-3cm 长的不 定芽只需 15 天 ； 增殖频率高， 繁殖系数为 （46 56） /50 天 ； 生长周期短、 且苗齐苗壮、 生长良好。 本发明为巴戟天组培快繁提供了一种高效的方法 和途径。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 1/2 页 2 1.用于获得巴戟天 （Morinda officinalis How.）。
4、 体细胞再生植株的成套培养基， 其特 征在于 ： 所述成套培养基中含有独立包装的培养基 A， 所述培养基 A 为由 MS 基本培养基、 细 胞分裂素、 生长素、 蔗糖或葡萄糖、 和凝固剂制成的固体培养基 ； 所述培养基 A 中的所述细胞分裂素的含量为 0.1mg/L ； 所述培养基 A 中的所述生长素的含量为 0.1mg/L。 2. 根据权利要求 1 所述的成套培养基， 其特征在于 ： 所述培养基 A 中的所述细胞分裂素为 6-BA 或 KT ； 和 / 或， 所述培养基 A 中的所述生长素为 2,4-D 或 NAA ； 和 / 或， 所述培养基 A 中的所述蔗糖或葡萄糖的含量为 20g/L 。
5、； 和 / 或， 所述培养基 A 中的所述凝固剂为琼脂， 所述琼脂在所述培养基 A 中的含量为 78g/L。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的成套培养基， 其特征在于 ： 所述成套培养基中含有独立 包装的培养基B， 所述培养基B为由MS基本培养基、 细胞分裂素、 生长素、 蔗糖和凝固剂制成 的固体培养基 ； 所述培养基 B 中的所述细胞分裂素的含量为 1.02.0mg/L ； 所述培养基 B 中的所述生长素的含量为 0.5mg/L。 4. 根据权利要求 3 所述的成套培养基， 其特征在于 ： 所述培养基 B 中的所述细胞分裂素为 6-BA ； 和 / 或， 所述培养基 B 中的所述生长素。
6、为 2,4-D 或 NAA ； 和 / 或， 所述培养基 B 中的所述蔗糖的含量为 20g/L ； 和 / 或， 所述培养基 B 中的所述凝固剂为琼脂， 所述琼脂在所述培养基 B 中的含量为 78g/L。 5.根据权利要求14中任一所述的成套培养基， 其特征在于 ： 所述成套培养基中含有 独立包装的培养基 C， 所述培养基 C 为 1/21/8 的 MS 基本培养基、 NAA 和凝固剂制成的固 体培养基 ； 所述培养基 C 中的所述 NAA 的含量为 0.010.1mg/L ； 所述培养基 C 中的所述凝固剂具体为琼脂， 所述琼脂在所述培养基 C 中的含量为 4 6g/L。 6. 获得巴戟天 。
7、（Morinda officinalis How.） 体细胞再生植株的方法， 其特征在于 ： 所 述方法包括将所述巴戟天的带节茎段用权利要求 1 或 2 中的所述培养基 A 进行诱导培养获 得巴戟天不定芽的步骤。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括将所述巴戟天不定芽用权 利要求 3 或 4 中的所述培养基 B 进行扩繁培养的步骤。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括将所述巴戟天不定芽 用权利要求 5 中的所述培养基 C 进行生根培养的步骤。 9. 根据权利要求 68 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述将所述巴戟天的带。
8、节茎段用权利要求 1 或 2 中的所述培养基 A 进行诱导培养前， 将所述巴戟天的带节茎段按照包括如下步骤 1） -2） 的方法进行消毒的步骤 ： 1） 用体积百分含量为 75% 的乙醇溶液浸泡 30 秒 ； 权 利 要 求 书 CN 102960251 A 2 2/2 页 3 2） 用有效氯质量百分含量为 10% 的次氯酸钠溶液浸泡 20 分钟。 10. 根据权利要求 69 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述诱导培养的光照条件为先黑暗培养 7 天再按照如下光照条件培养 ： 每天 24 小时 中光照 12 小时， 光照的强度为 10003000lux， 其余时间为黑暗 ； 所述诱导培养的。
9、温度为 2628 ； 和 / 或， 所述扩繁培养的光照条件为先在每天 24 小时中光照 12 小时、 光照强度为 2000lux、 其余时间为黑暗的条件下培养 7 天， 再移至每天 24 小时中光照 12 小时， 光照强度 为 10001500Lux， 其余时间为黑暗的条件下培养 ； 所述扩繁培养的温度为 2628 ； 和 / 或， 所述生根培养的光照条件为先在每天 24 小时中光照 12 小时， 光照强度为 10001500Lux， 其余时间为黑暗的条件下培养， 再在 1000-2000Lux 条件下培养 ； 所述生根 培养的温度为 22。 权 利 要 求 书 CN 102960251 A 。
10、3 1/7 页 4 一种获得巴戟天体细胞再生植株的方法及其培养基 技术领域 0001 本发明涉及一种获得巴戟天体细胞再生植株的方法及其培养基。 背景技术 0002 巴戟天 （Morinda officinalis How.） 是茜草科多年生木质藤本植物， 肉质根入 药， 根皮含蒽醌化合物， 环烯醚萜甙、 植物甾醇及多糖、 低聚糖等药用成分。具有补肾壮阳、 强筋骨、 祛风湿等功效， 用途十分广泛， 是目前我国出口创汇和内需的主要中药品之一， 加 上近年来巴戟天的市场需求量大， 以至巴戟天的栽培规模不断扩大， 由于巴戟天种植是剪 取自身藤条作为种苗， 对于大规模种植时所需种苗产生了瓶颈制约， 本技。
11、术是利用植物细 胞的全能性进行苗木培育 ： 植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因组， 并具有发育 为完整植株的潜能， 因为每个细胞都是来自于受精卵， 所以有与受精卵具有相同的遗传物 质。基于植物此特点， 有必要对巴戟天进行组培快繁研究， 为种植户提供优质、 大量巴戟天 种苗， 切实解决巴戟天苗木需求的瓶颈， 提高巴戟天种植产量。 发明内容 0003 本发明的一个目的是提供一种用于获得巴戟天 （Morinda officinalis How.） 体 细胞再生植株的成套培养基， 它含有独立包装的培养基 A （即诱导培养基） ， 所述培养基 A 为 由 MS 基本培养基、 细胞分裂素、 生长素、。
12、 蔗糖或葡萄糖、 和凝固剂制成的固体培养基 ； 0004 所述培养基 A 中的所述细胞分裂素的含量为 0.1mg/L ； 0005 所述培养基 A 中的所述生长素的含量为 0.1mg/L。 0006 在上述成套培养基中， 所述培养基 A 中的所述细胞分裂素为 6-BA 或 KT ； 0007 和 / 或， 所述培养基 A 中的所述生长素为 2,4-D 或 NAA ； 0008 和 / 或， 所述培养基 A 中的所述蔗糖或葡萄糖的含量为 20g/L ； 0009 和 / 或， 所述培养基 A 中的所述凝固剂为琼脂， 所述琼脂在所述培养基 A 中的含量 为 78g/L。 0010 在上述成套培养基。
13、中， 还可含有独立包装的培养基 B （即增殖培养基） ， 所述培养基 B 为由 MS 基本培养基、 细胞分裂素、 生长素、 蔗糖和凝固剂制成的固体培养基 ； 0011 所述培养基 B 中的所述细胞分裂素的含量为 1.02.0mg/L ； 0012 所述培养基 B 中的所述生长素的含量为 0.5mg/L。 0013 在上述成套培养基中， 所述培养基 B 中的所述细胞分裂素为 6-BA ； 0014 和 / 或， 所述培养基 B 中的所述生长素为 2,4-D 或 NAA ； 0015 和 / 或， 所述培养基 B 中的所述蔗糖的含量为 20g/L ； 0016 和 / 或， 所述培养基 B 中的所。
14、述凝固剂为琼脂， 所述琼脂在所述培养基 B 中的含量 为 78g/L。 0017 在上述成套培养基中， 还可含有独立包装的培养基 C （即生根培养基） ， 所述培养基 C 为由 1/21/8 的 MS 基本培养基、 NAA 和凝固剂制成的固体培养基 ； 说 明 书 CN 102960251 A 4 2/7 页 5 0018 所述培养基 C 中的所述 NAA 的含量为 0.010.1mg/L， 如 0.01mg/L、 0.05mg/L 或 0.1mg/L ； 0019 所述培养基 C 中的所述凝固剂具体为琼脂， 所述琼脂在所述培养基 C 中的含量为 46g/L。 0020 本发明的另一个目的是提。
15、供一种获得巴戟天 （Morinda officinalis How.） 体细 胞再生植株的方法， 所述方法包括将所述巴戟天的带节茎段用所述培养基 A 进行诱导培养 获得巴戟天不定芽的步骤。 0021 所述方法还可包括将所述巴戟天不定芽用所述培养基 B 进行扩繁培养以获得更 多不定芽的步骤。 0022 所述方法还可包括将所述巴戟天不定芽用所述培养基 C 进行生根培养的步骤。 0023 在上述方法中， 所述将所述巴戟天的带节茎段用所述培养基 A 进行诱导培养前， 包括将所述巴戟天的带节茎段按照包括如下步骤 1） -2） 的方法进行消毒的步骤 ： 0024 1） 用体积百分含量为 75% 的乙醇溶液。
16、浸泡 30 秒 ； 0025 2） 用有效氯质量百分含量为 10% 的次氯酸钠溶液浸泡 20 分钟。 0026 在上述方法中， 所述诱导培养的光照条件为先黑暗培养 7 天再按照如下光照条件 培养 ： 每天24小时中光照12小时， 光照的强度为10003000lux， 其余时间为黑暗 ； 所述诱 导培养的温度为 2628 ； 0027 和 / 或， 所述扩繁培养的光照条件为先在每天 24 小时中光照 12 小时、 光照强度为 2000lux、 其余时间为黑暗的条件下培养 7 天， 再移至每天 24 小时中光照 12 小时， 光照强度 为 10001500Lux， 其余时间为黑暗的条件下培养 ； 。
17、所述扩繁培养的温度为 2628 ； 0028 和 / 或， 所述生根培养的光照条件为先在每天 24 小时中光照 12 小时， 光照强度为 10001500Lux， 其余时间为黑暗的条件下培养， 再移至 1000-2000lux 条件下培养 ； 所述生 根培养的温度为 22。 0029 所述 MS 基本培养基的溶剂为水， 溶质及其浓度如表 1 所示。 0030 使用本发明所提供的培养基和培养方法进行巴戟天体细胞再生植株培养的优点如 下 ： 诱发巴戟天不定芽的时间短， 从接种带节茎段至获得 1-3cm 长的不定芽只需 15 天， 而现 有技术一般为20-30天 ； 增殖频率高， 繁殖系数为 （46。
18、-56） /50天， 现有技术一般为6/50天 ； 生 长周期短、 且苗齐苗壮、 生长良好。本发明为巴戟天组培快繁提供了一种高效的方法和途径。 附图说明 0031 图 1 为巴戟天经诱导培养获得的带不定芽的茎段。 0032 图 2 为巴戟天不定芽经扩繁培养获得的丛生芽。 0033 图 3 为巴戟天的生根培养。 0034 图 4 为包括根茎叶的巴戟天再生植株。 0035 图 5 为经组织培养获得的巴戟天再生植株移栽后的杯苗。 具体实施方式 0036 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0037 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 说 。
19、明 书 CN 102960251 A 5 3/7 页 6 0038 下述实施例中所用的 MS 基本培养基的溶剂为水， 溶质及其浓度如表 1 所示。 0039 表 1.MS 基本培养基 0040 大量元素培养基中浓度 （gL-1） NH4NO31.65 KNO31.9 KH2PO40.17 MgSO47H2O0.37 CaCl22H2O0.44 微量元素培养基中浓度 （mgL-1） FeSO47H2O27.8 Na2EDTA37.3 MnSO44H2O22.3 ZnSO44H2O8.6 H3BO36.2 KI0.83 Na2MoO42H2O0.25 CuSO45H2O0.025 CoCl26H2。
20、O0.025 有机成分培养基中浓度 （mgL-1） 甘氨酸2.0 盐酸硫胺素0.1 盐酸吡哆素0.5 烟酸 VB50.5 肌醇100 说 明 书 CN 102960251 A 6 4/7 页 7 0041 0042 实施例 1、 获得巴戟天体细胞再生植株的方法 0043 1、 外植体的获取 0044 选择生长优良的巴戟天 （Morinda officinalis How.） 枝条， 采集巴戟天新梢生至 30 50 的茎， 选择晴好的天气， 剪下新枝， 除去叶子， 留一小段叶柄， 立即放入装有少量 清水的塑料袋运回组培室 ； 先用自来水冲洗15分钟， 去掉老叶， 剪成约35长的带节 茎段。 00。
21、45 2、 外植体的消毒 0046 将步骤 1 获得的巴戟天带节茎段在超净工作台中进行如下消毒处理 ： 0047 用体积百分含量为 75% 的乙醇溶液浸泡 30 秒 ； 除去液体后用无菌水洗一遍 ； 用有 效氯质量百分含量为 10% 的次氯酸钠溶液浸泡 20 分钟， 除去液体用无菌水洗三至五次 ； 用 无菌吸水纸吸干巴戟天带节茎段表面水份。 0048 3、 芽的诱导培养 0049 无菌条件下， 将经步骤 2 消毒处理过的带节茎段的两端伤口剪去， 获得 12cm 长 的带节茎段， 插入诱导培养基中进行不定芽诱导培养 ； 培养的光照条件为先黑暗培养 1 周 再按照如下光照条件培养 ： 每天 24 。
22、小时中光照 12 小时， 光照的强度为 10003000Lux， 其 余时间为黑暗 ； 培养温度为 2628 ； 空气湿度在 70% 以下。 0050 经上述诱导培养的茎段， 其茎节处会长出不定芽 （图 1） ， 当不定芽长为 13 时， 可用于步骤 4 的增殖培养。 0051 上述诱导培养基的基础培养基是MS基本培养基 （表1） ， 向MS基本培养基中添加激 素 NAA 0.1mg/L、 6-BA 0.1mg/L， 葡萄糖 20g/L 和琼脂 7g/L， 灭菌前调 pH 值为 5.7， 121高 压灭菌 20min， 得到的固体培养基即为该诱导培养基。 0052 统计方法 ： 随机取 304。
23、5 个带节茎段， 每 1015 个为一个重复， 在带节茎段插入 诱导培养基 7 天后， 统计污染率 （长菌茎段数 / 插入茎段数） ； 在插入诱导培养基 14 天后， 统 计诱导率 （即获得长 13 不定芽的茎段数占插入茎段数的百分比） 。结果如表 2 所示。 0053 4、 芽的扩繁培养 0054 无菌条件下， 将步骤3获得的长为1-3的不定芽切下， 接种于增殖培养基上进行 扩繁培养获得丛生芽 （图 2） ； 培养的光照条件为先在每天 24 小时中光照 12 小时、 光照强度 为2000lux、 其余时间为黑暗的条件下培养7天， 再移至每天24小时中光照12小时， 光照强 度为 1000-1。
24、500Lux， 其余时间为黑暗的条件下培养 ； 培养温度为 2628 ； 空气湿度在 70% 以下。 0055 上述增殖培养基的基础培养基是 MS 基本培养基， 向 MS 基本培养基中添加 NAA0.5mg/L、 6-BA 2mg/L、 蔗糖 20g/L 和琼脂 7g/L， 灭菌前调 pH 值为 5.7， 121高压灭菌 20min， 得到的固体培养基即为该增殖培养基。 0056 每个接种的不定芽经扩繁培养发育为一个丛生芽， 当丛生芽长到高为 2 时， 将 丛生芽分成的高为 12cm 单个不定芽， 转移至新配制的增殖培养基按照同样方法进行再 次扩繁培养。 0057 统计方法 ： 随机取 961。
25、20 个初次扩繁培养的不定芽， 每 3240 个不定芽为一个 重复， 经扩繁培养 50 天后 （即扩繁 2 次， 每次 25 天） ， 统计繁殖系数 （即获得高为 12cm 的 说 明 书 CN 102960251 A 7 5/7 页 8 不定芽数目 / 初次扩繁培养的不定芽数目） ， 结果如表 2 所示。 0058 5、 生根培养 0059 从经步骤 4 扩繁培养 2 次获得的高为 2 的丛生芽上取高为 12 的不定芽转 移到生根培养基中进行生根培养 （图 3） ， 获得包括根茎叶的巴戟天再生植株 （图 4） ； 生根培 养的光照条件 ： 为先在每天 24 小时中光照 12 小时， 光照强度。
26、为 10001500Lux， 其余时间 为黑暗的条件下培养， 再移至 1000-200Lux 条件下培养 ； 所述生根培养的温度为 22。 0060 上述生根培养基的基础培养基是 1/2 的 MS 基本培养基， 向 1/2MS 基本培养基中添 加 NAA 0.01mg/L、 琼脂 4g/L， 灭菌前调 pH 值为 5.7， 121高压灭菌 20min， 得到的固体培养 基即为该生根培养基。 0061 统计方法 ： 随机取 60 个进行生根培养的不定芽， 每 20 个为一个重复， 经生根培养 7 天后， 统计生根率 （即生根的再生植株数占进行生根培养的不定芽数的百分比） ， 同时观察 再生植株主。
27、根粗壮， 须根较多， 叶色浓绿， 苗茎紫红。结果如表 2 所示。 0062 6、 再生植株的移栽 0063 待步骤5获得的包括根茎叶的再生植株长至含5片叶以上时， 从培养基中取出， 洗 去培养基， 用多菌灵浸泡 10 分钟， 移栽到黄心土和泥炭土 （或椰糠） 为 2:10 的混合基质中， 置于温室中进行常规栽培管理， 定时浇水， 注意遮光保湿。 30天后统计再生植株的移栽成活 率， 结果如表 2 所示。 0064 表 2. 巴戟天体细胞植株再生实验结果 （一） 0065 重复污染率 (%）诱导率 (%）繁殖系数 (50 天 )生根率 (%） 成活率 (%） 11080598085 268552。
28、7590 3789587884 平均7.785567786 0066 0067 实施例 2、 获得巴戟天体细胞再生植株的方法 0068 1、 外植体的获取 0069 与实施例 1 中步骤 1 的方法相同。 0070 2、 外植体的消毒 0071 与实施例 1 中步骤 1 的方法相同。 0072 3、 芽的诱导培养 0073 按照实施例 1 中步骤 3 的方法进行， 不同之处在于 ： 诱导培养基是向 MS 基本培养 基中添加 2,4-D 0.1mg/L,KT 0.1mg/L, 蔗糖 20g/L 和琼脂 8g/L。 0074 4、 芽的扩繁培养 0075 按照实施例 1 中步骤 4 的方法进行， 。
29、不同之处在于 ： 增殖培养基是向 MS 基本培养 基中添加 NAA 0.5mg/L、 6-BA 2mg/L、 蔗糖 20g/L 和琼脂 7.5g/L。 说 明 书 CN 102960251 A 8 6/7 页 9 0076 5、 生根培养 0077 按照实施例 1 中步骤 5 的方法进行， 不同之处在于 ： 生根培养基的基础培养基是 1/6 的 MS 基本培养基， 向该基础培养基中添加 NAA 0.05mg/L 和琼脂 5g/L。 0078 6、 再生植株的移栽 0079 按照实施例 1 中步骤 6 的方法进行。结果如表 3 所示。 0080 表 3. 巴戟天体细胞植株再生实验结果 （二） 0。
30、081 重复污染率 (%）诱导率 (%）繁殖系数 (50 天 )生根率 (%） 成活率 (%） 1888489584 2872528887 3780548974 平均7.780519082 0082 实施例 3、 获得巴戟天体细胞再生植株的方法 0083 1、 外植体的获取 0084 与实施例 1 中步骤 1 的方法相同。 0085 2、 外植体的消毒 0086 与实施例 1 中步骤 1 的方法相同。 0087 3、 芽的诱导培养 0088 按照实施例 1 中步骤 3 的方法进行， 不同之处在于 ： 诱导培养基是向 MS 基本培养 基中添加 2,4-D 0.1mg/L,6-BA 0.1mg/L。
31、, 蔗糖 20g/L 和琼脂 8g/L。 0089 4、 芽的扩繁培养 0090 按照实施例 1 中步骤 4 的方法进行， 不同之处在于 ： 增殖培养基是向 MS 基本培养 基中添加 2,4-D 0.5mg/L,6-BA 1.0mg/L, 蔗糖 20g/L 和琼脂 8g/L。 0091 5、 生根培养 0092 按照实施例 1 中步骤 5 的方法进行， 不同之处在于 ： 生根培养基的基础培养基是 1/8 的 MS 基本培养基， 向该基础培养基中添加 NAA 0.1mg/L 和琼脂 6g/L。 0093 6、 再生植株的移栽 0094 按照实施例 1 中步骤 6 的方法进行。结果如表 4 所示。 0095 表 4. 巴戟天体细胞植株再生实验结果 （三） 0096 重复污染率 (%）诱导率 (%）繁殖系数 (50 天 )生根率 (%） 成活率 (%） 1771427176 21082567278 说 明 书 CN 102960251 A 9 7/7 页 10 3973407276 平均8.675467277 说 明 书 CN 102960251 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102960251 A 11 。