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1、(10)申请公布号 CN 104304010 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104304010 A (21)申请号 201410534187.3 (22)申请日 2014.10.11 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 湖北师范学院 地址 435002 湖北省黄石市黄石港区磁湖路 11 号 (72)发明人 王友如 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 杨晞 (54) 发明名称 一种紫萍愈伤组织快速诱导、 继代和再生的 方法 (57) 摘要 本发明提供了一种紫萍愈伤组织的快速诱 导、 继代培养及高效再生的方法， 以浮萍。
2、科紫萍属 紫萍为材料， 通过紫萍愈伤组织的诱导和继代、 紫 萍愈伤组织的再生首创了紫萍快速再生体系 ； 本 发明能用无激素配方高效诱导紫萍再生植株的形 成， 并且再生时间缩短为两周， 再生植株再生率和 紫萍根再生率均达到 100； 本发明建立的高效紫 萍快速再生体系， 能很好地应用到相关的研究和 生产工作当中， 也为转基因等研究提供了重要的 技术平台和支持。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104304010 A CN 10430。
3、4010 A 1/1 页 2 1. 一种紫萍愈伤组织诱导、 继代和再生的方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 1). 紫萍愈伤组织的诱导和继代 ： 取生长旺盛的紫萍植株， 并对其叶基部横切， 将处理 好的外植体置于紫萍诱导培养基中， 在光照 16h/ 黑暗 8h， 光照温度 26 / 黑暗温度 24、 光照强度 70-80mol/m2s 的培养条件下， 10-15 天后外植体开始膨大， 两周后愈伤组织开 始形成， 挑选绿色部分移至紫萍继代培养基上进行继代培养， 4 周后长处生长良好的的愈伤 组织， 每两周继代一次愈伤组织 ； 所述紫萍诱导培养基组成包括 ： a).大量元素， 其中含有1900mg。
4、/L KNO3、 1650mg/L NH4NO3、 370mg/L MgSO4 7H2O、 170mg/ L KH2PO4、 440mg/L CaCl22H2O ； b). 微量元素， 其中含有 22.3mg/L MnSO44H2O、 8.6mg/L ZnSO47H2O、 6.2mg/L H3BO3、 0.83mg/L KI、 0.25mg/L Na2MoO47H2O、 0.025mg/L CuSO45H2O4、 0.025mg/L CoCl26H2O ； c). 铁盐， 其中含有 37.3mg/L Na2-EDTA2H2O、 27.8mg/L FeSO47H2O ； d). 有机物， 其中含。
5、有 2.0mg/L 甘氨酸、 0.5mg/L 盐酸吡哆醇、 0.1mg/L 盐酸硫铵素、 0.5mg/L 烟酸、 100mg/L 肌醇 ； e). 激 素 成 分， 其 中 含 有 1.2mg/L 萘 乙 酸、 1mg/L 赤 霉 素、 2.5mg/L 6-BA、 3.5mg/L 2,4-D ； f). 固化剂， 其中含有 1500mg/L 的 Gelrite 和 4000mg/L 的琼脂 ； g). 碳源， 其中含有 30000mg/L 的蔗糖 ； 铁盐配制方法为 ： 将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450mL 蒸馏水中， 两液混 合后作为母液贮存使用， 调 。
6、pH 值至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条件下 20min 高压灭菌后使用 ； 所述紫萍继代培养基组成以及铁盐配制方法均同于所述紫萍诱导培养基 ； 2). 紫萍愈伤组织的再生 ： 将紫萍愈伤组织移至再生培养基中， 培养条件同第 1) 步， 14 天后， 愈伤组织形成再生植株， 20 天后， 再生植株再生率高达 100， 再生植株移入生根培 养基， 6 天后紫萍根再生率 100 ； 所述紫萍再生培养基 pH 值为 5.7， 组成包括 ： 质量百分比为 0.8的琼脂和超纯水 ； 所述紫萍生根培养基 pH 值为 5.7， 组成包括 ： a). 大量元素， 其中含。
7、有 2495mg/L KNO3、 290mg/L NH4H2PO4、 400mg/L MgSO47H2O、 440mg/L CaCl22H2O ； b). 微量元素， 其中含有 8.45mg/L MnSO44H2O、 4.3mg/L ZnSO47H2O、 3.1mg/L H3BO3、 0.4mg/L KI、 0.125mg/L Na2MoO47H2O、 0.125mg/L CuSO45H2O4、 0.0125mg/L CoCl26H2O ； c). 铁盐， 其中含有 18.65mg/L Na2-EDTA2H2O 和 13.9mg/L FeSO4.7H2O ； d).有机物， 其中含有0.08m。
8、g/L甘氨酸、 0.02mg/L盐酸吡哆醇、 0.004mg/L盐酸硫铵素、 0.02mg/L 烟酸、 4mg/L 肌醇 ； e). 碳源， 其中含有 12000mg/L 的蔗糖 ； 铁盐配制方法为 ： 将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450mL 蒸馏水中， 两液混 合后作为母液贮存使用， 调 pH 值至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条件下 20min 高压灭菌后使用。 权 利 要 求 书 CN 104304010 A 2 1/9 页 3 一种紫萍愈伤组织快速诱导、 继代和再生的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物愈伤组。
9、织再生的方法， 特别是一种用无激素配方诱导浮萍科 (1emnaceae) 多根紫萍属 (Spirodela) 水生漂浮植物紫萍快速高效再生的方法。 背景技术 0002 紫萍 (Spirodela polyrrhiza， 也称多根紫萍 ) 是浮萍科 (1emnaceae) 多根紫萍 属 (Spirodela) 水生漂浮植物， 浮萍 (lemna) 是浮萍科 (1emnaceae) 浮萍属 (Lemna) 水生 漂浮植物。浮萍科不同属间植物最适生长所需的大量元素、 微量元素和有机物以及植物激 素的量很不一致， 导致它们愈伤组织的诱导、 分化和叶状体的形成条件有别， 而从进化关系 上来说， 紫萍是浮。
10、萍科中最原始的类型， 其基因组也比其他浮萍科植物小， 这是浮萍和紫萍 再生体系差别大的主要原因， 因而紫萍的愈伤组织的诱导、 分化和叶状体的形成所需要的 生长条件大量元素、 微量元素和有机物以及植物激素的量是有别于浮萍科的其他种属， 事 实上目前 38 个种的浮萍科植物中， 只有 5 种植物的再生体系获得成功， 而且这 5 种植物再 生体系条件也是完全不一样的， 紫萍的再生体系是完全有别于其他类型的浮萍科植物的。 0003 紫萍是最小的开花植物之一， 完整植物都比较小 ； 结构比较简单， 仅由叶状体和根 系组成， 主要进行无性繁殖。叶状体倒卵形或椭圆形， 4 5.5mm 长， 3 3.5 宽，。
11、 表深绿色， 里紫红色， 根 5 11 条。 0004 紫萍蛋白质含量高， 生长速度快， 成本低廉使其成为高通量外源蛋白表达乃至生 产药用蛋白的首选和理想材料。尽管专利 CN 102487827 B 公开了一种浮萍再生体系， 但是 实验表明， 该技术并不适用于紫萍再生体系的建立。 紫萍再生体系成功的例子尚未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的是解决紫萍尚未建立再生体系的问题， 提供一种运用无激素配方， 快速高效地对浮萍科多根紫萍属紫萍愈伤组织诱导、 继代和再生的方法， 填补技术空白， 应 用于相关的研究和生产工作中， 并为转基因研究提供重要的技术平台和支持。 0006 为了实现上述目的，。
12、 发明人通过探讨不同外植体种类、 培养基、 激素种类和浓度、 蔗糖浓度、 暗培养时间等因素对紫萍愈伤组织和叶状体形成的影响， 建立了紫萍高效快速 再生体系。 0007 本发明提供的紫萍愈伤组织诱导、 继代和再生的方法包括如下步骤 ： 0008 1). 紫萍愈伤组织的诱导和继代 ： 取生长旺盛的紫萍植株， 并对其叶基部横切， 将 处理好的外植体置于紫萍诱导培养基中。在光照 16h/ 黑暗 8h， 光照温度 26 / 黑暗温度 24， 光照强度 70-80mol/m2s 的培养条件下， 10-15 天后外植体开始膨大， 两周后愈伤组 织开始形成， 挑选绿色部分移至紫萍继代培养基上进行继代培养， 4。
13、 周后长出生长良好的的 愈伤组织， 每两周继代一次愈伤组织 ； 0009 2). 紫萍愈伤组织的再生 ： 将紫萍愈伤组织移至再生培养基中， 培养条件同第 1) 步， 14 天以后， 愈伤组织形成再生植株， 20 天后， 再生植株再生率高达 100， 再生植株移入 说 明 书 CN 104304010 A 3 2/9 页 4 生根培基， 6 天后紫萍根再生率 100 ； 0010 其中， 在第 1) 步中所述紫萍诱导培养基的组成包括 ： 0011 0012 铁盐配制方法为 ： 将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450mL 蒸馏水中， 两 液混合后作为母液贮存使用 P。
14、H 至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条件下 20min 高压灭菌后使用 ； 0013 在第1)步中所述紫萍继代培养基的组成以及铁盐配制方法均同于在第1)步中所 说 明 书 CN 104304010 A 4 3/9 页 5 述紫萍诱导培养基 ； 0014 在第 2) 步中所述紫萍再生培养基 pH 值为 5.7， 组成包括 ： 质量百分比为 0.8的 琼脂和超纯水 ； 0015 在第 2) 步中所述紫萍生根培养基 PH 值为 5.7， 组成包括 ： 0016 0017 铁盐配制方法为 ： 将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450m。
15、L 蒸馏水中， 两 液混合后作为母液贮存使用， 调 pH 值至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条 件下 20min 高压灭菌后使用。 0018 运用现有其他相关技术如专利CN 102487827 B的方法， 没能成功诱导出紫萍愈伤 组织， 更不能通过愈伤组织形成完整的紫萍叶状体， 这主要是紫萍的愈伤组织的诱导、 分化 和叶状体的形成所需要的生长条件大量元素、 微量元素和有机物以及植物激素的种类和量 是有别于浮萍科的其他种属所致。 0019 而运用本发明提供的技术， 首创了紫萍再生体系， 并用无激素配方高效诱导紫萍 再生植株的形成， 利用本发明技术可将再生时间。
16、缩短为两周。本发明建立的高效紫萍快速 说 明 书 CN 104304010 A 5 4/9 页 6 再生体系， 为转基因研究提供了重要的技术平台和支持。 附图说明 0020 图 1 为紫萍外植体诱导 14 天后愈伤组织开始形成 ； 0021 图 2 为紫萍愈伤组织继代培养 4 周后的绿色愈伤组织 ； 0022 图 3 为紫萍愈伤组织在再生固体培养基上 14 天后分化， 再生新的紫萍叶状体 ； 0023 图 4 为再生紫萍叶状体用生根培养基培养 6 天后 100生根成活。 具体实施方式 0024 实施例 1 ： 本发明提供的紫萍愈伤组织诱导、 继代和再生的方法 0025 1). 取生长旺盛的紫萍。
17、植株， 并对其叶基部横切， 将处理好的外植体置于紫萍诱导 培养基中， 在光照 16h/ 黑暗 8h， 光照温度 26 / 黑暗温度 24、 光照强度 70-80mol/m2s 的培养条件下， 10天后外植体开始膨大， 两周后愈伤组织开始形成(图1)， 挑选绿色部分移 至紫萍继代培养基上进行继代培养， 4周后长出生长良好的的愈伤组织(图2)， 每两周继代 一次愈伤组织 ； 0026 2).将紫萍愈伤组织移至再生培养基中， 培养条件同第1)步， 15天后， 紫萍的愈伤 组织再生率达到90(图3)， 20天后， 再生率高达100， 再生植株移入生根培养基， 6天后 紫萍根再生率 100 ( 图 4)。
18、 ； 0027 其中， 在步骤 1) 中所述紫萍萍愈伤组织诱导培养基的组成包括 ： 0028 说 明 书 CN 104304010 A 6 5/9 页 7 0029 铁盐配制方法为 ： 将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450mL 蒸馏水中， 两 液混合后作为母液贮存使用 PH 至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条件下 20min 高压灭菌后使用 ； 0030 在步骤 1) 中所述紫萍继代培养基组成以及铁盐配制方法均同于所述紫萍诱导培 养基 ； 0031 在步骤 2) 中所述紫萍愈伤组织再生培养基 PH 值为 5.7， 组成包括。
19、 ： 质量百分比为 0.8的琼脂和超纯水 ； 0032 在步骤 2) 中所述紫萍生根培养基 PH 值为 5.7， 组成包括 ： 说 明 书 CN 104304010 A 7 6/9 页 8 0033 0034 铁盐配制方法为 ： 将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450mL 蒸馏水中， 两 液混合后作为母液贮存使用， 调 pH 值至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条 件下 20min 高压灭菌后使用。 0035 实施例 2 ： 运用本发明方法与专利 CN 102487827 B 处理浮萍的方法处理紫萍的对 比实验 0036 A)。
20、. 运用本发明方法处理紫萍 ： 0037 1). 取生长旺盛的紫萍植株， 并对其叶基部横切， 将处理好的外植体置于紫萍萍 愈伤组织诱导培养基中。在光照 16h/ 黑暗 8h， 光照温度 26 / 黑暗温度 24， 光照强度 70-80mol/m2s 的培养条件下， 10-15 天后外植体开始膨大， 两周后愈伤组织开始形成 ( 图 1)， 挑选绿色部分移至紫萍继代培养基上进行继代培养， 4 周后长出生长良好的的愈伤组织 ( 图 2) ： 每两周继代一次愈伤组织 ； 0038 2).将紫萍愈伤组织移至再生培养基中， 培养条件同第1)步， 15天后， 紫萍的愈伤 组织再生率达到90(图3)， 20天。
21、后， 再生率高达100， 再生植株移入生根培养基， 6天后 说 明 书 CN 104304010 A 8 7/9 页 9 紫萍根再生率 100 ( 图 4) ； 0039 其中， 在 1) 中所述紫萍诱导萍愈伤组织培养基的组成包括 ： 0040 0041 铁盐配制将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450mL 蒸馏水中， 两液混合后 作为母液贮存使用 PH 至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条件下 20min 高压 灭菌后使用 ； 0042 在步骤 1) 中所述紫萍继代培养基组成以及铁盐配制方法均同于所述紫萍诱导培 养基 ； 说 。
22、明 书 CN 104304010 A 9 8/9 页 10 0043 在步骤 2) 中所述紫萍愈伤组织再生培养基 PH 值为 5.7， 组成包括 ： 质量百分比为 0.8的琼脂和超纯水 ； 0044 在步骤 2) 中所述紫萍生根培养基 PH 值为 5.7， 组成包括 ： 0045 0046 铁盐配制方法为 ： 将 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别溶于 450mL 蒸馏水中， 两 液混合后作为母液贮存使用， 调 pH 值至 5.5 加水定容至 1000mL， 并于 102.9Pa,121的条 件下 20min 高压灭菌后使用。 0047 B). 运用专利 CN 102487。
23、827 B 处理浮萍的方法处理紫萍 ： 0048 取生长旺盛的紫萍植株， 并对其叶基部横切， 将处理好的外植体置于专利 CN 102487827 B 方法提供的诱导培养基中， 在光照 16h/ 黑暗 8h， 光照温度 26 / 黑暗温度 24、 光照强度 70-80mol/m2s 的培养条件下， 10-15 天后外植体开始萎缩， 逐渐变黄直至 死亡， 愈伤组织无法形成， 更不能诱导分化 / 形成完整的紫萍叶状体。 0049 实验结果表明， 运用专利 CN 102487827 B 处理浮萍的方法来处理紫萍， 没能成功 诱导出紫萍愈伤组织， 更不能通过愈伤组织形成完整的紫萍叶状体， 这主要是浮萍和。
24、紫萍 基因型的差异所致。 说 明 书 CN 104304010 A 10 9/9 页 11 0050 C). 培养基的对比 ： 0051 从本发明所用诱导培养基与专利 CN 102487827 B 所用诱导培养基的对比可以看 出无论是从大量元素、 微量元素、 无机物的含量、 以及激素、 固化剂碳源的成份和含量均有 极大差别。培养基成分对比如下表所示 ： 0052 0053 浮萍科不同属间植物最适生长所需的大量元素、 微量元素和有机物以及植物激素 的量很不一致， 导致愈伤组织的诱导、 分化和叶状体的形成条件有别， 紫萍愈伤组织的诱 导、 分化和叶状体的形成所需要的大量元素、 微量元素和有机物以及植物激素的种类和量 是明显有别于现有相关技术的， 是独特的。 说 明 书 CN 104304010 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104304010 A 12 2/2 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 104304010 A 13 。