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1、(10)申请公布号 CN 104258398 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104258398 A (21)申请号 201410541635.2 (22)申请日 2014.10.14 A61K 45/00(2006.01) A61K 31/353(2006.01) A61K 31/55(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 19/06(2006.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 。
2、A61P 25/28(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (71)申请人 中国科学技术大学 地址 230026 安徽省合肥市包河区金寨路 96 号 (72)发明人 周荣斌 江维 闫宜青 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 王旭 (54) 发明名称 DRD1 及其激动剂在制备治疗 NLRP3 炎症小体 相关炎症性疾病药物中的用途 (57) 摘要 本发明公开了 DRD1 蛋白及其激动剂在制备 治疗 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病药物中的用 途。 所述蛋白在其内源性激动剂多巴胺的作用下， 诱导炎症小体重要成分 NLRP3 蛋白的降解， 。
3、起到 抑制 IL-1 等炎性因子成熟和分泌的效果， 从而 抑制 NLRP3 炎症小体的活化。本发明提供了 DRD1 蛋白作为 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病 ( 外周 系统炎症和中枢系统炎症 ) 的靶点的应用， 可以 用于筛选研发 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病的 药物。本发明还提供了 DRD1 蛋白的人工合成激 动剂 A-68930， ()-SKF-38393 hydrochloride， SKF 89626和6-Chloro-PB hydrobromide的抗炎 效果， 为这些激动剂或其活性成分制备抗炎药物 和治疗炎症性疾病提供了原创思路和理论支持。 (51)Int.Cl. 权利要。
4、求书 1 页 说明书 11 页 序列表 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 序列表3页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104258398 A CN 104258398 A 1/1 页 2 1.DRD1 蛋白用于制备治疗炎症性疾病的药物或试剂盒的用途。 2.DRD1 蛋白用作治疗 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病的药物的靶点的用途。 3.DRD1 蛋白用于筛选治疗 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病药物的用途。 4. 根据权利要求 1-3 任一项所述的用途， 所述炎症性疾病为 NLRP3 炎症小体相关的炎 症性疾。
5、病， 优选为二型糖尿病、 动脉粥样硬化、 痛风、 肠炎、 肝炎、 硅肺、 紫外线所诱导的皮肤 晒伤、 接触性超敏反应、 脓毒血症肿瘤或神经退行性疾病， 所述 DRD1 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No ： 1 所示。 5. 根据权利要求 1-3 任一项所述的用途， 所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎 症， 优选为外周腹腔炎症。 6.DRD1 蛋白的激动剂用于制备治疗炎症性疾病的药物或试剂盒的用途。 7. 根据权利要求 6 所述的用途， 所述激动剂通过 DRD1 蛋白发挥治疗作用。 8.根据权利要求6所述的用途， 所述炎症性疾病为NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病， 优选为二型糖尿病、 。
6、动脉粥样硬化、 痛风、 肠炎、 肝炎、 硅肺、 紫外线所诱导的皮肤晒伤、 接触 性超敏反应、 脓毒血症肿瘤或神经退行性疾病。 9. 根据权利要求 6 所述的用途， 所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症， 优选为 外周腹腔炎症。 10. 根据权利要求 6 所述的用途， 所述 DRD1 蛋白的激动剂选自多巴胺、 A-68930、 ()-SKF-38393hydrochloride、 SKF 89626 和 6-Chloro-PB hydrobromide 或其组合。 权 利 要 求 书 CN 104258398 A 2 1/11 页 3 DRD1 及其激动剂在制备治疗 NLRP3 炎症小体相关炎。
7、症性疾 病药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及 DRD1 蛋白及其激动剂在制备治疗 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病药 物中的用途。 背景技术 0002 NLRP3 炎症小体是一种胞内的多聚蛋白复合物， 它主要由 NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3)， ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) 和 caspase-1 三种蛋白质所组成。NLRP3 炎症小体及其信号通路在 启动炎症及其相关免疫应答过程中具有至关重要的作用 (Davis。
8、 et al.,2011,Annu Rev Immunol ； Marltinon et al.,2009,Immunol)。所以， NLRP3 炎症小体的活化， 必须受到精确 而严格的调控。如果炎症反应的失调， 比如过度放大或者持续存在， 都会引发机体损伤， 甚 至导致炎症性疾病的发生。NLRP3 炎症小体的异常活化会促进多种人类重大疾病的发生发 展， 比如说二型糖尿病(Zhou et al.,2010,Nat Immunol ； Yan et al.,2013,Immunity)、 动 脉粥样硬化 (Duewell et al.,2010,Nature)、 痛风 (Martinon et 。
9、al.,2006,Nature)、 肠 炎(Siegmund et al.,2001,Proc Natl Acad Sci USA.)、 肝炎(Negash et al.,2013,PLoS Pathog)、 硅肺 (Dostert et al.,2008,Science)、 紫外线所诱导的皮肤晒伤 (Watanabe et al.,2007,J Investig D ermatol. ； Feldmeyer et al.,2007,Curr Biol)和接触性超敏反 应(Watanabe et al.,2007,J Investig Dermatol ； Sutterwala et al.,。
10、2006,Immunity)、 脓毒血症 (Mao et al.,2013,Cell Res)， 甚至是肿瘤 (Ghiringhelli et al.,2009,Nat Med ； Allen et al.,2010,J Exp Med) 和 神 经 退 行 性 疾 病 (Halle et al.,2008,Nat Immunol) 等。 0003 既然 NLRP3 炎症小体及其诱导的炎症反应参与多种人类重大疾病的发生过程， NLRP3炎症小体自然就成为对这些疾病进行预防和治疗的 潜在靶点。 目前该领域的基础和 临床研究主要集中在利用 IL-1 受体中和性抗体或者拮抗剂来阻断 IL-1 与其受。
11、体结合， 从 而抑制炎症反应 (Dinarello et al.,2012,Annu Rev Immunol)。但是， 虽然 IL-1 是 NLRP3 活化之后产生的一个非常重要的介导炎症的效应分子， 但并不是唯一的分子。 NLRP3炎症小 体活化也能产生IL-18、 IL-33、 HMGB1和促炎症的脂类物质等炎症介质， 因而抑制IL-1活性 可能并不会产生很好的抗炎效果(von Moltke et al.,2012,Nature)。 与针对IL-1及其受 体的干预手段相比， 靶向 NLRP3 炎症小体活化的干预手段则能从根本上抑制 IL-1、 IL-18、 IL-33和HMGB1等介导的炎。
12、症反应， 有可能取得更好的抗炎效果。 但是， 迄今为止， 还没有有 效的针对 NLRP3 炎症小体的抗炎药物问世。 0004 多巴胺 (DA) 是一种重要的神经递质。它不仅能够调节机体的行为， 运动， 内分 泌， 心血管， 肾脏和消化系统功能， 而且还可以作为神经系统和免疫系统的分子桥梁。在 几乎所有的免疫细胞中， 多巴胺受体都有表达。多巴胺受体共发现有五个亚型， 分别是 Drd1， Drd2， Drd3， Drd4 和 Drd5， 其中， Drd1 和 Drd5 被称为 D1 样多巴胺受体， 而 Drd2， 说 明 书 CN 104258398 A 3 2/11 页 4 Drd3 和 Drd。
13、4 被称为 D2 样多巴胺受体。多项报道指出， 多巴胺通过它的各个受体， 可以 有效调节免疫细胞的活化， 增殖和细胞因子的分泌 (Beck et al.,2004， Crit Care ； Shao et al.,2013， Nature)。另外， 多巴胺受体 Drd2 缺陷鼠罹患神经炎症， 这提示了多巴胺 和它的下游信号通路具有抗炎功能 (Shao et al.,2013， Nature)。而且， 有报道指出， 多 巴胺持续低水平与帕金森氏病发病过程中的免疫系统紊乱和中枢神经系统炎症密切相关 (Wullner&Klockgether， 2003， J Neurol ； Meredith et。
14、 al.,2005， Immunology)。这些工作 提示我们， 多巴胺很可能具有抗炎功能， 无论是在外周， 还是在中枢系统。 但是， 目前该领域 的基础和临床研究主要集中在用多巴胺及多巴胺受体的激动剂来治疗和缓解帕金森氏病， 还没有用于治疗 NLRP3 炎症小体相关的炎症性疾病的成功范例。 0005 我们通过确定多巴胺对 NLRP3 炎症小体的抑制作用， 研究多巴胺的靶标受体。多 巴胺抗炎靶点的确定， 可以为多种 NLRP3 炎症小体相关的炎症性疾病提供治疗思路和理论 依据， 更可以为筛选和制备治疗炎症性疾 病的药物提供分子靶点和制备思路。 发明内容 0006 本发明的目的是提供 DRD1。
15、 蛋白作为制备治疗 NLRP3 炎症小体相关的炎症性疾病 的药物应用， 提供 DRD1 蛋白的激动剂多巴胺， A-68930， ()-SKF-38393hydrochloride， SKF 89626和6-Chloro-PB hydrobromide作为治疗NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病的药 物的活性成分的应用。 0007 具体而言， 本发明的第一个方面提供 DRD1 蛋白用于制备治疗炎症性疾病药物或 试剂盒， 用作治疗 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病的药物的靶点以及用于筛选治疗 NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病药物的用途。 0008 在一个优选的实施方案中， 所述 DRD1 蛋白的。
16、氨基酸序列如 SEQ ID No ： 1 所示。 0009 在一个优选的实施方案中， 所述炎症性疾病为 NLRP3 炎症小体相关的炎症性疾 病。 0010 在一个优选的实施方案中， 所述炎症性疾病为二型糖尿病、 动脉粥样硬化、 痛风、 肠炎、 肝炎、 硅肺、 紫外线所诱导的皮肤晒伤、 接触性超敏反应、 脓毒血症肿瘤或神经退行性 疾病。 0011 在一个优选的实施方案中， 所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症， 优选为 外周腹腔炎症。 0012 本发明的第二个方面提供 DRD1 蛋白的激动剂用于制备治疗炎症性疾病的药物或 试剂盒的用途。 0013 在一个优选的实施方案中， 所述激动剂通过 DR。
17、D1 蛋白发挥治疗作用。 0014 在一个优选的实施方案中， 所述炎症性疾病为 NLRP3 炎症小体相关的炎症性疾 病。 0015 在一个优选的实施方案中， 所述炎症性疾病为二型糖尿病、 动脉粥样硬化、 痛风、 肠炎、 肝炎、 硅肺、 紫外线所诱导的皮肤晒伤、 接触性超敏反应、 脓毒血症肿瘤或神经退行性 疾病。 0016 在一个优选的实施方案中， 所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症， 优选为 外周腹腔炎症。 说 明 书 CN 104258398 A 4 3/11 页 5 0017 在一个优选的实施方案中， 所述 DRD1 蛋白的激动剂选自多巴胺、 A-68930、 ()-SKF-38393。
18、hydrochloride、 SKF 89626 和 6-Chloro-PB hydrobromide 或其组合。 0018 在一个优选的实施方案中， 所述DRD1蛋白的激动剂可以抑制IL-1的分泌、 通过 其膜上受体 DRD1 抑制 NLRP3 炎症小体的活化、 诱导 NLRP3 的降解， 从而实现治疗炎症性疾 病， 尤其是 NLRP3 炎症小体相关的炎症性疾病。 附图说明 0019 图 1DA 抑制 IL-1 的分泌 0020 图 2DA 抑制 NLRP3 炎症小体的活化 0021 图 3DA 通过其膜上受体 DRD1 抑制 NLRP3 炎症小体的活化 0022 图 4DA 诱导 NLRP。
19、3 的降解 0023 图 5DA 通过其膜上受体 DRD1 诱导 NLRP3 的降解 0024 图 6DRD1 激动剂抑制 NLRP3 炎症小体的活化 0025 图 7DRD1 激动剂 A-68930 诱导 NLRP3 的降解 0026 图 8DA 可以通过 DRD1 抑制小胶质细胞炎症小体的活化 0027 图 9DA 可以通过 DRD1 抑制星形胶质细胞炎症小体的活化 0028 图 10DRD1 蛋白可以抑制中枢系统炎症 0029 图 11DRD1 激动剂 A-68930 可以抑制中枢系统炎症 0030 图 12DA 可以抑制 LPS 诱导的外周系统炎症 0031 图 13DRD1 蛋白可以。
20、抑制 LPS 诱导的外周系统炎症 0032 图 14DA 可以抑制 MSU 诱导的外周腹腔炎症 0033 图 15DRD1 蛋白可以抑制 MSU 诱导的外周腹腔炎症 具体实施方式 0034 以下的实例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自常 规生化试剂商店购买得到的。 0035 BMDM( 骨髓来源的巨噬细胞 ) ： 制备方法见文献 (Yan et al.,2013， Immunity)。 0036 小胶质细胞 ： 制备方法见文献 (Shao et al.,2012， Natur。
21、e)。 0037 星形胶质细胞 ： 制备方法见文献 (Shao et al.,2012， Nature)。 0038 Drd1缺陷鼠:来源见文献(Martinon et al.,2006， Nature ； Kelly et al.,1997， Neuron ； Drago et al.,1994， Proc Natl Acad Sci USA)。 0039 抗鼠 IL-1 抗体 :R&D,AF-401-NA。 0040 抗鼠 caspase-1 抗体 :Adipogen,AG-20B-0042。 0041 抗 NLRP3 抗体 :Adipogen,AG-20B-0014。 0042 抗 -a。
22、ctin 抗体 :Abmart,P30002。 0043 抗 ASC 抗体 :Santa Cruz,sc-22514。 0044 DA( 多巴胺 ) ： Sigma， H8502。 0045 Ultrapure LPS ： Invivogen， tlrl-3pelps。 说 明 书 CN 104258398 A 5 4/11 页 6 0046 Nigericin( 尼日利亚菌素 ) ： Sigma， N7143。 0047 MSU( 尿酸结晶 ) ： Sigma， U0881。 0048 ATP ： Sigma， A1852。 0049 Imject-Alum( 铝 ) ： Pierce Bi。
23、ochemicals， 77161。 0050 MPTP ： Sigma， M0896。 0051 LPS ： Sigma， L2630。 0052 A-68930 ： Sigma， A8852。 0053 ()-SKF-38393hydrochloride ： Sigma， D047。 0054 SKF 89626 ： Sigma， S3066。 0055 6-Chloro-PB hydrobromide ： Sigma， S143。 0056 实施例 1， DA 及其激动剂在体外抑制巨噬细胞 NLRP3 炎症小体的活化 0057 一、 DA 抑制 IL-1 的分泌 0058 1， 第一天，。
24、 将 BMDM 分到十二孔板上， 每个孔 5*105个细胞。 0059 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的opti-MEM， 处 理三个小时。分成五组， 每组三个复孔。 0060 第一组， 阴性对照组。 0061 第二组， 每孔加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0062 第三组， 每孔加入终浓度为 0.15mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度 为 10M 的 Nigericin 半小时。 0063 第四组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。。
25、 0064 第五组， 每孔加入终浓度为 0.25mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0065 3， 步骤2处理后的细胞， 收集细胞上清(SN)和细胞裂解液(Input)用抗鼠IL-1 抗体和抗鼠 caspase-1 抗体进行 western blotting 分析。结果见图 1( 泳道 1 为第一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第四组， 泳道 5 为第五组 )。 0066 在第一信号 LPS 和第二信号 Nigericin 的共同作用下， 炎症小体活化， p20 和 IL-1 成熟并分泌到上清之中 ( 泳道 2)，。
26、 DA 的加入， 有效地抑制了 p20 和 IL-1 成熟和 分泌， 并且， 这种效果是呈剂量依赖性的 ( 泳道 3， 泳道 4 和泳道 5)。 0067 二、 DA 抑制 NLRP3 炎症小体的活化 0068 1， 第一天， 将 BMDM 分到十二孔板上， 每个孔 5*105个细胞。 0069 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的opti-MEM， 处 理三个小时。分成十组， 每组三个复孔。 0070 第一组， 阴性对照组。 0071 第二组， 每孔加入终浓度为 150g/ml 的 MSU 六小时。 0072 第三组， 每孔加入终浓度为 1。
27、0M 的 Nigericin 半小时。 0073 第四组， 每孔加入终浓度为 2.5mM 的 ATP 半小时。 0074 第五组， 每孔加入终浓度为 300g/ml 的 Alum 六小时。 0075 第六组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时。 说 明 书 CN 104258398 A 6 5/11 页 7 0076 第七组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度为 150g/ml 的 MSU 六小时。 0077 第八组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0078 第九组，。
28、 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度为 2.5mM 的 ATP 半小时。 0079 第十组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度为 300g/ml 的 Alum 六小时。 0080 3， 步骤2处理后的细胞， 收集细胞上清(SN)和细胞裂解液(Input)用抗鼠IL-1 抗体和抗鼠 caspase-1 抗体进行 western blotting 分析。结果见图 2( 泳道 1 为第一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第四组， 泳道 5 为第五组， 泳道 6 为第六组， 泳 道 7 为第七组， 泳道 8 为第。
29、八组， 泳道 9 为第九组， 泳道 10 为第十组 )。 0081 Nigericin， MSU， ATP 和 Alum 是几乎已知的所有可以活化 NLRP3 炎症小体的第二 信号。在第一信号 LPS 和这些第二信号的共同作用下， 炎症小体活化， p20 和 IL-1 成熟 并分泌到上清之中 ( 泳道 2， 泳道 3， 泳道 4 和泳道 5)， DA 的加入， 有效地抑制了这些刺激剂 所诱导的 p20 和 IL-1 成熟和分泌 ( 泳道 7， 泳道 8， 泳道 9 和泳道 10)。 0082 三、 DA 通过其膜上受体 DRD1 抑制 NLRP3 炎症小体的活化 0083 1， 第一天， 将野。
30、生鼠(WT)和Drd1缺陷鼠的BMDM分到十二孔板上， 每个孔5*105个 细胞。 0084 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的opti-MEM， 处 理三个小时。两种 BMDM 各分成三组， 共六组， 每组三个复孔。 0085 第一组， WT 鼠 BMDM， 阴性对照组。 0086 第二组， WT 鼠 BMDM， 每孔加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0087 第三组， WT 鼠 BMDM， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0088 第四组。
31、， Drd1 缺陷鼠 BMDM， 阴性对照组。 0089 第五组， Drd1 缺陷鼠 BMDM， 每孔加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0090 第六组， Drd1 缺陷鼠 BMDM， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓 度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0091 3， 步骤2处理后的细胞， 收集细胞上清(SN)和细胞裂解液(Input)用抗鼠IL-1 抗体和抗鼠 caspase-1 抗体进行 western blotting 分析。结果见图 3( 泳道 1 为第一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第四。
32、组， 泳道 5 为第五组， 泳道 6 为第六组 )。 0092 对于野生型鼠的巨噬细胞来讲， DA的加入， 有效的抑制了Nigericin所诱导的p20 和 IL-1 成熟和分泌 ( 泳道 3)， 也就是说， 有效的抑制了 NLRP3 炎症小体的活化。而对于 Drd1 缺陷鼠的巨噬细胞， DA 的加入， 并不能有效的抑制 NLRP3 炎症小体的活化 ( 泳道 6)。 因此， DA 是通过其膜上受体 DRD1 起到抑制 NLRP3 炎症小体活化的作用的。 0093 四、 DA 诱导 NLRP3 的降解 0094 1， 第一天， 将 BMDM 分到十二孔板上， 每个孔 2*105个细胞。 0095。
33、 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的opti-MEM， 处 说 明 书 CN 104258398 A 7 6/11 页 8 理三个小时。分成六组， 每组三个复孔。 0096 第一组， 阴性对照组。 0097 第二组， 每孔加入终浓度为 0.15mM 的 DA 三个小时。 0098 第三组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时。 0099 第四组， 每孔加入终浓度为 0.25mM 的 DA 三个小时。 0100 第五组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 两个小时。 0101 第六组， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 D。
34、A 四个小时。 0102 3， 步骤 2 处理后的细胞， 收集细胞裂解液用抗 NLRP3 抗体， 抗 ASC 抗体， 抗鼠 caspase-1 抗体和抗 -actin 抗体进行 western blotting 分析。结果见图 4A 和图 4B( 图 4A 泳道 1 为第一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第四组。图 4B 泳道 1 为第 一组， 泳道 2 为第五组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第六组 )。 0103 DA 可以使得 BMDM 中的 NLRP3 降解， 并且， 这种降解是呈现剂量与时间依赖性的。 这可以证明， DA 可以诱导 NLRP3 降解。
35、， 这也许是 DA 抑制 NLRP3 炎症小体活化的原因。 0104 五 DA 通过其膜上受体 DRD1 诱导 NLRP3 的降解 0105 1， 第一天， 将野生鼠(WT)和Drd1缺陷鼠的BMDM分到十二孔板上， 每个孔2*105个 细胞。 0106 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的opti-MEM， 处 理三个小时。两种 BMDM 各分成两组， 共四组， 每组三个复孔。 0107 第一组， WT 鼠 BMDM， 阴性对照组。 0108 第二组， WT 鼠 BMDM， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时。 0109 第三。
36、组， Drd1 缺陷鼠 BMDM， 阴性对照组。 0110 第四组， Drd1 缺陷鼠 BMDM， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时。 0111 3， 步骤 2 处理后的细胞， 收集细胞裂解液用抗 NLRP3 抗体， 抗 ASC 抗体， 抗鼠 caspase-1 抗体和抗 -actin 抗体进行 western blotting 分析。结果见图 5( 泳道 1 为第 一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第四组 )。 0112 DA 在膜上有五个受体， DRD1， DRD2， DRD3， DRD4 和 DRD5， 接下来， 我们看 DA 是否是 通过 。
37、DRD1 行使其功能的。DA 可以诱导野生鼠 BMDM 中 NLRP3 的降解， 但是， 在 Drd1 缺陷鼠 中， DA 的这种作用就没有了， 因此， DA 是通过其膜上受体 Drd1 起作用的。 0113 六、 DRD1 激动剂抑制 NLRP3 炎症小体的活化 0114 1， 第一天， 将 BMDM 分到十二孔板上， 每个孔 5*105个细胞。 0115 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的opti-MEM， 处 理三个小时。分成十五组， 每组三个复孔。 0116 第一组， 阴性对照组。 0117 第二组， 每孔加入终浓度为 10M 的 。
38、Nigericin 半小时。 0118 第三组， 每孔加入终浓度为的 10M 的 A-68930 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0119 第四组， 每孔加入终浓度为 20M 的 A-68930 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0120 第五组， 每孔加入终浓度为 30M 的 A-68930 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 说 明 书 CN 104258398 A 8 7/11 页 9 Nigericin 半小时。 0121 第六组， 阳性对照组。每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓度。
39、为 10M 的 Nigericin 半小时。 0122 第七组， 每孔加入终浓度为20M的()-SKF-38393hydrochloride三个小时， 再 加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0123 第八组， 每孔加入终浓度为40M的()-SKF-38393hydrochloride三个小时， 再 加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0124 第九组， 每孔加入终浓度为 100M 的 ()-SKF-38393hydrochloride 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0125 第十组， 每孔加入终浓度为 20M 的。
40、 SKF 89626 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0126 第十一组， 每孔加入终浓度为 40M 的 SKF 89626 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0127 第十二组， 每孔加入终浓度为 100M 的 SKF 89626 三个小时， 再加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0128 第十三组， 每孔加入终浓度为 20M 的 6-Chloro-PB hydrobromide 三个小时， 再 加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0129 第十四组， 每孔加入终浓度为 40M 。
41、的 6-Chloro-PB hydrobromide 三个小时， 再 加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0130 第十五组， 每孔加入终浓度为100M的6-Chloro-PB hydrobromide三个小时， 再 加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0131 3， 步骤2处理后的细胞， 收集细胞上清(SN)和细胞裂解液(Input)用抗鼠IL-1 抗体和抗鼠 caspase-1 抗体进行 western blotting 分析。结果见图 6A 和图 6B( 图 6A 泳 道 1 为第一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第四。
42、组， 泳道 5 为第五组， 泳道 6 为第六组 ； ) 图 6B 泳道 1 为第一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第六组， 泳道 4 为第七组， 泳 道 5 为第八组， 泳道 6 为第九组， 泳道 7 为第十组， 泳道 8 为第十一组， 泳道 9 为第十二组， 泳道 10 为第十三组， 泳道 11 为第十四组， 泳道 12 为第十五组 )。 0132 如图 6A 所示， 在第一信号 LPS 和第二信号 Nigericin 的共同作用下， 炎症小体活 化， p20 和 IL-1 成熟并分泌到上清之中 ( 泳道 2)， A-68930 的加入， 有效地抑制了 p20 和 IL-1 成熟和分。
43、泌， 并且， 这种效果是呈剂量依赖性的 ( 泳道 3， 泳道 4 和泳道 5)。图 6B 研 究了其它几种 DRD1 的激动剂 ()-SKF-38393hydrochloride， SKF 89626 和 6-Chloro-PB hydrobromide。这些激动剂的加入， 可以有效地抑制了 p20 和 IL-1 成熟和分泌， 并且， 这 种效果是呈剂量依赖性的 ( 泳道 4， 泳道 5 和泳道 6 显示了 ()-SKF-38393hydrochloride 的抑制效果 ； 泳道 7， 泳道 8 和泳道 9 显示了 SKF 89626 的抑制效果 ； 泳道 10， 泳道 11 和泳 道 12 。
44、显示了 6-Chloro-PB hydrobromide 的抑制效果 )。 0133 七 DRD1 激动剂 A-68930 诱导 NLRP3 的降解 0134 1， 第一天， 将 BMDM 分到十二孔板上， 每个孔 2*105个细胞。 0135 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的opti-MEM， 处 理三个小时。分成六组， 每组三个复孔。 说 明 书 CN 104258398 A 9 8/11 页 10 0136 第一组， 阴性对照组。 0137 第二组， 每孔加入终浓度为 20M 的 A-68930 三个小时。 0138 第三组， 每孔。
45、加入终浓度为 30M 的 A-68930 三个小时。 0139 第四组， 每孔加入终浓度为 40M 的 A-68930 三个小时。 0140 第五组， 每孔加入终浓度为 30M 的 A-68930 两个小时。 0141 第六组， 每孔加入终浓度为 30M 的 A-68930 四个小时。 0142 3， 步骤 2 处理后的细胞， 收集细胞裂解液用抗 NLRP3 抗体， 抗 ASC 抗体， 抗鼠 caspase-1 抗体和抗 -actin 抗体进行 western blotting 分析。结果见图 7A 和图 7B( 图 七 A 泳道 1 为第一组， 泳道 2 为第二组， 泳道 3 为第三组， 泳。
46、道 4 为第四组。图 7B 泳道 1 为 第一组泳道 2 为第五组， 泳道 3 为第三组， 泳道 4 为第六组 )。 0143 DRD1 激动剂 A-68930 可以使得 BMDM 中的 NLRP3 降解， 并且， 与 DA 相同， 这种降解 是呈现剂量与时间依赖性的。 0144 实施例 2,DRD1 蛋白可以抑制中枢系统炎症 0145 一、 DA 可以通过 DRD1 抑制小胶质细胞炎症小体的活化 0146 1， 第一天， 将野生鼠 (WT) 和 Drd1 缺陷鼠的小胶质细胞分到十二孔板上， 每个孔 1*106个细胞。 0147 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LP。
47、S(500ng/ml)的opti-MEM， 处 理三个小时。两种小胶质细胞各分成三组， 共六组， 每组三个复孔。 0148 第一组， WT 鼠小胶质细胞， 阴性对照组。 0149 第二组， WT 鼠小胶质细胞， 每孔加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0150 第三组， WT 鼠小胶质细胞， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加入终浓 度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0151 第四组， Drd1 缺陷鼠小胶质细胞， 阴性对照组。 0152 第五组， Drd1 缺陷鼠小胶质细胞， 每孔加入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 。
48、0153 第六组， Drd1 缺陷鼠小胶质细胞， 每孔加入终浓度为 0.2mM 的 DA 三个小时， 再加 入终浓度为 10M 的 Nigericin 半小时。 0154 3， 步骤 2 处理后的细胞， 收集细胞上清用 ELISA 的方法进行 IL-1 等细胞因子的 测定。结果见图 8。 0155 对于野生型鼠的小胶质细胞来讲， DA 的加入， 有效的抑制了 Nigericin 所诱导的 IL-1 的分泌， 也就是说， 有效的抑制了 NLRP3 炎症小体的活化。而对于 Drd1 缺陷鼠的小 胶质细胞， DA 的加入， 并不能有效的抑制 NLRP3 炎症小体的活化。因此， 与巨噬细胞类似， 在小胶质细胞之中， DA 也是通过其膜上受体 DRD1 起到抑制 NLRP3 炎症小体活化的作用的。 0156 二、 DA 可以通过 DRD1 抑制星形胶质细胞炎症小体的活化 0157 1， 第一天， 将野生鼠(WT)和Drd1缺陷鼠的星形胶质细胞分到十二孔板上， 每个孔 1*106个细胞。 0158 2， 第二天， 先吸去上清， 每孔加入500l含ultra-LPS(500ng/ml)的o。