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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410613549.8 (22)申请日 2014.11.05 A01K 67/027(2006.01) A61K 35/74(2015.01) A61K 38/17(2006.01) (71)申请人 季旭明 地址 250000 山东省济南市长清大学科技园 山东中医药大学 75 信箱 (72)发明人 季旭明 张桂菊 吴金勇 袭雷鸣 卢立伟 李燕宁 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 贾波 (54) 发明名称 一种湿热哮喘动物模型的建立方法 (57) 摘要 本发明公开了一种湿热哮喘动物模型的建立 方法， 用。
2、高脂饲料喂养大鼠， 并灌服大肠杆菌， 造 成大鼠湿热证型 ； 在喂养高脂饲料期间用卵蛋白 氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠致敏 ； 致敏后进 行卵蛋白生理盐水溶液激发， 得到湿热哮喘动物 模型。本发明将传统哮喘动物模型与中医湿热证 型动物模型有机结合， 形成中医湿热证型哮喘动 物模型， 切合中医临床哮喘研究应用， 方便中医平 喘药物筛选的研究。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104396880 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104396880 A 1/1 页 。
3、2 1. 一种湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 用高脂饲料喂养大鼠， 并灌服大肠 杆菌， 造成大鼠湿热证型 ； 在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠 致敏 ； 致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发， 得到湿热哮喘动物模型。 2. 根据权利要求 1 所述的湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是， 包括以下步骤 ： （1） 在正常喂养的同时， 于每日上午和夜间对大鼠分别灌胃高脂饲料， 用量为 2ml/ 只， 连续喂养 14 天 ； （2） 在第 12 天进行大肠杆菌灌服， 用量为 2ml/ 只， 灌服大肠杆菌后 12h 再次灌服大肠 杆菌， 用量为 1ml/ 只 ； （3）。
4、 从第 13 天开始将大鼠放入温度 31-35、 相对湿度 92-98% 的环境中造模 3 天， 每 天 8 小时 ； （4） 分别在第 7 天和第 14 天用 10% 卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠进行致敏， 致敏方式为 ： 将 1ml 混悬液对大鼠进行腹腔注射或者将 2ml 混悬液对大鼠进行灌胃 ； （5） 从第 16 天开始将大鼠放入雾化箱中， 使大鼠吸入 2% 卵蛋白生理盐水溶液激发哮 喘， 每日一次， 每次 30min， 连续 7d ； 激发过程中大鼠出现哮喘发作症状， 湿热哮喘造模成 功。 3. 根据权利要求 1 所述的湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 所述高脂饲料由。
5、 猪油、 白糖、 奶粉、 蛋黄按照 1 ： 1 ： 1: 1 的质量比配制而成。 4. 根据权利要求 1 所述的湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 步骤 （2） 中， 灌服 的大肠杆菌的浓度为 109/ ml。 5.根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 10%卵清蛋白氢氧 化铝生理盐水混悬液由以下成分组成 ： 卵蛋白100mg， 氢氧化铝100mg， 生理盐水1m1 ； 2% 卵 蛋白生理盐水溶液由以下成分组成 ： 卵蛋白 2g， 生理盐水 100ml。 6. 根据权利要求 1 所述的湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 所用大鼠为 SPF 级大鼠， 体。
6、重 140-160g， 月龄 1-1.5 月。 7. 根据权利要求 1 所述的湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 所述大肠杆菌为 侵袭性大肠杆菌。 8. 根据权利要求 1 所述的湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 哮喘症状包括烦 躁、 不停抓挠头面部， 呼吸加快和紫绀中的至少一种。 权 利 要 求 书 CN 104396880 A 2 1/7 页 3 一种湿热哮喘动物模型的建立方法 技术领域 0001 本发明涉及动物药理实验技术领域， 特别涉及一种湿热哮喘动物模型的建立及检 测方法。 背景技术 0002 过敏性哮喘的病因和发病机制是外部抗原进入机体后引起的 I 型变态反应。而 。
7、根据外来抗原进入机体导致 I 型变态反应这个基本原理而制备的动物模型已经成为研究 平喘药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面的重要工具。哮喘的发 生多为宿疾内伏于肺， 遇外感、 饮食、 情志、 劳倦等诱因而引发 , 以致痰阻气道、 肺失肃降致 病。然而由于气候的变化和饮食结构改变， 肥甘厚腻辛辣煎炸饮食者众， 而使肠胃积湿积 热 , 发病后不论外感内伤多从湿化热 , 湿与热合 , 缠绵难愈。肺与大肠相表里 , 肺气肃降 有助于大肠传导功能的发挥， 大肠传导功能正常， 则有助于肺气的肃降。 肠胃湿热可影响肺 之肃降功能而致胸满咳喘。基于此可以看出， 目前哮喘临床特征和病理特点受诸多。
8、因素的 影响， 单纯以外来抗原复制的哮喘中医模型与中医哮喘临床辨证难以完全匹配。因此单纯 外来抗原诱导复制的动物模型无法体现中医辨证思想的优势， 也不适合中医哮喘临床证型 的研究。 0003 儿童哮喘患者在哮喘人群中占有较大的比例， 并且随着社会的发展， 儿童哮喘人 数有增加的趋势。 随着人们生活水平不断提高， 现今的青少儿摄入过多的脂肪和蛋白， 且活 动量比以往减少 , 出现肥胖率增长的倾向。儿童因生理病理有别于成人， 肺脾不足， 且为纯 阳之体， 不论外感湿热之邪， 或饮食不节， 过食膏粱厚味， 脾失健运， 湿热内生， 大肠传导失 司， 部分患儿易表现为病情迁延， 咳喘痰多， 伴腹胀、 恶。
9、心、 呕吐， 大便粘腻， 舌红苔黄厚腻， 这种饮食情况和生活方式使青少儿的体质中医辨证属于湿热证候。 该因素在患儿罹患哮喘 疾病过程中有相关性。而传统的哮喘模型仅考虑外部抗原的因素， 无法将湿热因素纳入到 模型当中， 因此无法准确将中医辨证论治思想贯彻执行于动物实验研究过程中， 更无法体 现中药辨证组方应用实际意义。因此， 研究将儿童湿热性体质因素纳入到哮喘动物模型的 建立之中， 对开展中医药在儿童哮喘药物的药效学研究更有实际意义， 并推进中医治疗哮 喘药物的技术进步。 0004 而将成功的中医证候动物模型与哮喘动物模型相结合是一种行之有效的方式， 适 应中医临床需要。 发明内容 0005 本。
10、发明的目的是提供一种湿热哮喘动物模型的建立方法， 采用该方法能够得到具 有湿热症状的哮喘动物模型， 更加接近于当今儿童体质， 更利于儿童哮喘湿热证型的研究。 0006 本发明建立大鼠的湿热哮喘动物模型， 为进行中医哮喘湿热证型研究提供动物模 型， 并可进一步拓展应用于哮喘的防治技术的使用。 0007 本发明是这样实现的 ： 说 明 书 CN 104396880 A 3 2/7 页 4 一种湿热哮喘动物模型的建立方法， 其特征是 ： 用高脂饲料喂养大鼠， 并灌喂大肠杆 菌， 造成大鼠湿热证型 ； 在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠致 敏 ； 致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发，。
11、 得到湿热哮喘动物模型。 0008 上述湿热哮喘动物模型的建立方法， 具体包括以下步骤 ： （1） 在正常喂养的同时， 于每日上午和夜间对大鼠分别灌胃高脂饲料， 用量为 2ml/ 只， 连续喂养 14 天 ； （2） 在第 12 天进行大肠杆菌灌服， 用量为 2ml/ 只， 灌服大肠杆菌后 12h 再次灌服大肠 杆菌， 用量为 1ml/ 只 ； （3） 从第 13 天开始将大鼠放入温度 31-35、 相对湿度 92-98% 的环境中造模 3 天， 每 天 8 小时 ； （4） 分别在第 7 天和第 14 天用 10% 卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠进行致敏， 致敏方式为 ： 将 1ml 混。
12、悬液对大鼠腹腔进行注射或者将 2ml 混悬液对大鼠进行灌胃 ； （5） 从第 16 天开始将大鼠放入雾化箱中， 使大鼠吸入 2% 卵蛋白生理盐水溶液激发哮 喘， 每日一次， 每次 30min， 连续 7d ； 激发过程中大鼠出现哮喘发作症状， 湿热哮喘造模成 功。 0009 上述建立方法中， 所述高脂饲料由猪油、 白糖、 奶粉、 蛋黄按照 1 ： 1 ： 1: 1 的质量比 配制而成。 0010 上述建立方法中， 步骤 （2） 中， 灌服的大肠杆菌的浓度为 109个 / ml。 0011 上述建立方法中， 10% 卵清蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液由以下成分组成 ： 卵蛋 白 100mg， 氢氧化。
13、铝 100mg， 生理盐水 1m1。 0012 上述建立方法中， 2% 卵蛋白生理盐水溶液由以下成分组成 ： 卵蛋白 2g， 生理盐水 100ml。 0013 上述建立方法中， 所用大鼠为 SPF 级大鼠， 体重 140-160g， 月龄 1-1.5 月。 0014 上述建立方法中， 所述大肠杆菌为侵袭性大肠杆菌。 0015 上述建立方法中， 哮喘症状包括烦躁、 不停抓挠头面部， 呼吸加快和紫绀中的至少 一种。 0016 本发明针对现有哮喘模型针对性低的问题， 针对现今儿童体质普遍存在湿热症状 的特征， 将中医湿热证型动物模型引入哮喘模型中， 通过对造模参数的大量筛选， 研制出了 本发明适合于。
14、现今生活状态下的青少儿的动物哮喘模型， 该模型能更好的反应出现今儿童 哮喘的特点， 对儿童哮喘药物的研究更加有益。本发明并非简单的将湿热证模型和哮喘模 型进行简单的叠加， 还针对这两种方法的结合对建模参数都进行了优化和调整， 使这两种 方法能很好的搭配在一起， 不会出现相互抵触和矛盾的问题。例如将湿热环境与致敏步骤 进行重叠保证大鼠对于过敏原的敏感性， 也使试验时间缩短减少其他不稳定因素干预的机 会。 将细菌接种、 湿热环境和卵蛋白激发紧密衔接来模拟患儿外感加湿热诱发哮喘的过程。 此外， 本发明方法造模成功率高， 模型重复性好， 造模过程中大鼠死亡率低， 能够大批量获 得动物模型。 0017 。
15、本发明将传统哮喘动物模型与中医湿热证型动物模型有机结合， 形成中医湿热证 型哮喘动物模型， 切合中医临床哮喘研究应用， 方便中医平喘药物筛选的研究。 说 明 书 CN 104396880 A 4 3/7 页 5 附图说明 0018 图 1 为正常对照组的 HE 染色图。 0019 图 2 为湿热哮喘模型组的 HE 染色图。 具体实施方式 0020 为了更好的解释本发明， 下面对具体的建模过程进行详细的描述。 0021 实施例 1 1、 所需材料 1.1 实验动物 SPF级大鼠20只 （山东中医药大学实验动物中心， 许可证号:SCXK(冀)2008-1-003,合 格证编号 :1011003） 。
16、体重 150 士 10g， 月龄 1-1.5 月左右。 0022 1.2 实验药品 卵清蛋白干粉 :OVA（Ovalbumin） , 1g/ 瓶， 5g/ 瓶， 北京鼎盛昌盛生物技术有限责任 公司公司分装， 临用前配置成 10% 和 2% 溶液。 0023 侵袭性大肠杆菌干燥菌种 ： 购于山东省卫生防疫站菌种室， 菌号 8099。 0024 氢氧化铝粉剂 ： 分析纯 AR, 500g/ 瓶， 天津恒兴化学试剂制造有限公司， 生产口 期 :2013 年 3 月 01 日。 0025 水合氯醛 : 分析纯 AR, 250g/ 瓶， 天津市科密欧化学试剂有限公司， 批号 201001100， 临用前。
17、用生理盐水配制成 10% 的溶液置 4 0冰箱备用。 0026 1.3 高脂饲料 高脂饲料的配制方法 ： 猪油， 白糖， 奶粉， 蛋黄根据 1 ： 1 ： 1 ： 1 的质量比配制。 0027 1.4 仪器设备 超声雾化器 ： S666F 型超声雾化器， 北京芬道实验器材有限公司生产。 0028 电子天平 ： 赛多利斯科学仪器 （北京） 有限公司， 型号， BSA124S。 0029 数字肛温计 ： 上海华辰医用仪表有限公司。 0030 离心机 ： 湖南仪器仪表总厂离心机厂， 型号， GL20A。 0031 光学显微镜 ： 奥林巴斯 CHC 双目生物显微镜。 0032 温箱 ： 电热恒温水浴箱。
18、 DHG-9031， 上海。 0033 1.5 实验试剂 大鼠 IL-2 ELISA 试剂盒 ： 上海研辉生物科技有限公司 ； 大鼠 IL-4 ELISA 试剂盒 ： 上海研辉生物科技有限公司 ； 大鼠 IL-5 ELISA 试剂盒 ： 上海研辉生物科技有限公司 ； 大鼠 IL-6 ELISA 试剂盒 ： 上海研辉生物科技有限公司 ； 大鼠 IFN-ELISA 试剂盒 ： 上海研辉生物科技有限公司 ； HE 染液 ： 广州威佳生物科技有限公司。 0034 2、 方法 2.1 动物分组 大鼠称重， 随机 （随机数字表法） 分为正常对照组、 湿热哮喘模型组， 每组 10 只。 0035 2.2 湿。
19、热证哮喘模型的建立 说 明 书 CN 104396880 A 5 4/7 页 6 造模时， 湿热造模和哮喘造模有机的结合、 重叠进行。 0036 2.2.1 湿热证型造模 实验开始， 在正常喂养的同时， 模型组于每日上午 （10 时） 和夜间 （20 时） 分别灌胃高脂 饲料， 用量 2ml/ 只， 连续喂养 14 天 ； 正常对照组相同时间给与生理盐水灌胃， 2ml/ 只。 0037 在实验第 12 天模型组进行大肠杆菌灌服 （浓度 109个 /ml） ， 用量为 2ml/ 只， 灌服 12h 后再加强灌服大肠杆菌 （浓度 109个 /ml） ， 用量为 1ml/ 只。 0038 从实验第 。
20、13 天开始将模型组大鼠放入温度 (332) , 相对湿度 (953)% 中造 模 3d， 每天 8h。 0039 2.2.2 哮喘模型造模 在实验第 7 天和第 14 天用 10% 卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液 （100mg 卵蛋白 +100mg 氢氧化铝 +1m1 生理盐水） 对模型组大鼠进行致敏 ； 致敏方式为 ： 用 1ml10% 卵蛋白氢氧化铝 生理盐水混悬液对大鼠腹腔注射致敏， 或者用 2ml10% 卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对 大鼠灌服致敏。 0040 哮喘模型激发 ： 从实验第 16 天开始将模型组大鼠放入密闭有机玻璃雾化箱中， 使 大鼠吸入 2% 卵蛋白生理盐水溶液 （卵蛋。
21、白 2g， 生理盐水 100ml） 激发哮喘， 每日 1 次， 每次 30min， 连续 7d。正常对照组组则给予生理盐水雾化吸入。激发过程中模型组大鼠出现烦 躁、 不停抓挠头面部， 呼吸加快、 紫绀等哮喘发作等症状为哮喘造模成功。 0041 3、 湿热证哮喘模型各性能指标检测 3.1 标本采集 最后一次激发后 24 内以 10% 水合氯醛 3ml/kg 腹腔注射麻醉， 腹主动脉取血 5ml ； 4 5000 r/min 离心 , 15 min 后提取血清 , 置 -80低温冰箱待测。打开胸腔采集左肺上叶， 浸泡于 10% 福尔马林液体中待测。 0042 3.2 观查指标 3.2.1 一般指标。
22、观察 ： 自造模之日起， 观察并记录两组大鼠体温、 体重、 食量、 饮水量、 症状和舌苔的变化。 0043 3.2.2 标本检测 ELISA 法测定大鼠血清 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IFN- 水平， 步骤参照试剂盒说明书。 进行大鼠肺组织常规 HE 染色 ： 10% 甲醛固定常规脱水， 透明， 浸蜡包埋， 制作蜡块， 分别进行 HE 染色。 0044 3.3 统计方法 采用 spss17.0 软件进行分析， 计量资料采用方差分析， 计数资料采用秩和检验。 0045 P0.05） 。灌服大肠杆菌后， 第 13 天模型组大鼠体温出现显著升高， 偏离正常温 度， 平均 38.。
23、60.17左右， 显著高于空白组 （P0.01） 。湿热环境期间， 模型组大鼠体温均 高于空白组 （P0.05） ， 湿热环境结束后， 模型组大鼠体温渐趋回复， 到第 19 天， 模型组大鼠 体温开始下降， 至试验结束， 模型组大鼠体温持正常体温。 0048 3.4.1.3 饮食量， 如表 3 所示 ： 从上表可以看出， 常温环境饲养下， 所有大鼠均采食活跃， 模型组大鼠饮食与空白组饮 食无统计学意义。第 12 天大肠杆菌灌胃和进入湿热环境后， 与空白组大鼠相比， 模型组大 鼠饮食量显著减少 （P0.01） 。移出湿热环境， 模型组大鼠饮食逐渐增多， 至实验结束， 模型 组大鼠饮食量仍显著低于。
24、空白组 （P0.05） 。 0049 3.4.1.4 饮水量， 如表 4 所示 ： 说 明 书 CN 104396880 A 7 6/7 页 8 从上表可以看出， 常温环境饲养下， 两组大鼠饮水量差异无统计学意义， 湿热造模开始 后， 与空白对照组相比， 模型组大鼠饮水量显著减少 （P0.01） 。湿热环境造模结束后， 模型 组大鼠饮水量有所升高， 但仍低于空白组， 差异有统计学意义 （P0.05） 。持续至实验结束， 模型组大鼠饮水量持续低于空白对照组。 0050 3.4.2 症状观察 常温环境饲养下， 所有大鼠均状态良好， 行动灵活， 采食活跃， 正常对照组大鼠毛色光 泽， 食欲好， 活动。
25、正常 ； 模型组大鼠体重增长较快， 大便粘滞较软。 第7天首次卵蛋白氢氧化 铝生理盐水混悬液致敏后， 模型组大鼠开始出现倦卧、 食少等表现。第 12 天灌服大肠杆菌 后， 出现不同程度的发热、 大便粘滞或溏泄。第 13 天进入湿热环境后， 模型组大鼠体温出现 显著升高， 显著高于对照组 （P0.01） 。进入湿热环境造模约 10 分钟后， 模型组大鼠开始出 现躁动， 活动增加， 攀爬笼壁， 呼吸急促， 颈部、 背部、 胸部毛发开始湿润等症状 ； 约 1h 后进 入安静状态， 活动减少， 散在静卧， 偶有仰卧， 腹部皮肤潮红， 全身毛发湿润， 至移出湿热环 境， 大鼠持续安静状态， 未见活动、 。
26、饮水量增加 ； 回到室温后， 约 1 h 恢复常态。进入湿热环 境后， 模型组大鼠出现大便溏泄或粘腻加重的症状， 饮食量、 饮水量较对照组大鼠均减少， 渐见肛周污秽、 红肿， 倦怠， 反应迟钝。第 14 天再次致敏后， 模型组大鼠出现烦躁、 呼吸加 快、 腹式呼吸， 两只大鼠因过敏性休克死亡， 约 40min 后， 模型组大鼠呼吸渐趋平稳。哮喘激 发开始， 2min 左右模型组大鼠即开始出现烦躁、 不停抓挠头面部， 打喷嚏 ； 9min 左右出现呼 吸加快、 加深、 静伏不动、 弓背， 严重者伸颈、 缩胸、 收缩呈喘息状， 呼吸加快、 紫绀等哮喘发 作症状。随造模时间推移， 模型组大鼠逐渐毛发。
27、蓬松， 颜色枯稿。 0051 3.4.3 舌苔变化 实验开始后， 模型组大鼠逐渐出现腻苔， 至第 10 天， 约 6 只老鼠出现薄腻苔。灌服大肠 杆菌之后， 第 14 天， 腻苔出现率达 100%， 至 15 天结束， 模型组大鼠腻苔出现高峰， 舌苔厚腻 略黄。至试验结束， 模型组大鼠舌苔持续腻苔。 0052 3.4.4 运用 ELISA 检测大鼠血清 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IFN- 情况， 见表 5。 0053 从表中可以看出， 模型组中代表TH-2细胞的炎症因子IL-4、 IL-5、 IL-6浓度增高， 代表 TH-1 细胞的炎症因子 IL-2、 IFN- 浓度降。
28、低。 说 明 书 CN 104396880 A 8 7/7 页 9 0054 3.4.5 肺组织 HE 染色结果 HE 染色显示 ： 正常组支气管壁光滑、 完整， 肺组织及气道、 血管周围未见炎性细胞浸 润 ； 模型组均出现严重的气道粘膜破坏， 炎症细胞侵润， 气道和肺泡上皮细胞严重坏死脱 落， 肺组织及气道、 血管周围大量炎性细胞和血细胞浸润。 0055 正常对照组和湿热哮喘模型组 HE 染色情况见图 1 和图 2。 0056 4、 结论 由上可知 ： 本发明造模方法是可行的， 能很好的反应出哮喘情况， 该方法得到的动物模 型切合中医临床湿热哮喘研究应用， 方便中医湿热原因平喘药物筛选的研究。 0057 实施例 2 采用上述实施例 1 的方法连续进行 10 批动物模型建立， 每批建模大鼠 20 只。建模过 程中， 共有 8 只大鼠死亡， 死亡时间集中在放入人工气候箱期间。造模结束后， 对存活小鼠 按照实施例1的方法对动物模型进行各性能指标检测， 结果显示100%的存活大鼠表现出很 好的湿热哮喘症状特征， 表示模型建立成功。 0058 由此可以看出， 本发明方法成功率高， 重现性好， 大鼠死亡率低， 具有推广价值。 说 明 书 CN 104396880 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104396880 A 10 。