一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103305480 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103305480 A *CN103305480A* (21)申请号 201310119378.9 (22)申请日 2013.04.08 C12N 9/02(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 辽宁盘谷科技发展有限公司 地址 110179 辽宁省沈阳市浑南新区新隆街 10-1 号 (72)发明人 李东旭 苏。

2、珊 李晓军 荣嘉鑫 (74)专利代理机构 沈阳晨创科技专利代理有限 责任公司 21001 代理人 张晨 (54) 发明名称 一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及 其制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种来源于牛血液细胞的超氧化 物歧化酶及其制备方法， 该超氧化物歧化酶的核 苷酸序列如图 1 所示 ； 超氧化物歧化酶的氨基酸 序列如图 2 所示 ； 核苷酸分子的载体是酵母质粒 ； 核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得 ； 所述超 氧化物歧化酶的核苷酸分子细胞是包含所述核酸 分子或用所述载体转化的毕赤酵母。本发明制备 出能够高效表达并分泌 Cu， Zn-SOD 的重组生产 株， 实现 Cu， Z。

3、n-SOD 的生产产业化， 获得具有很好 的 pH 稳定性， 良好的热稳定性以及蛋白酶水解能 力的 Cu， Zn-SOD 产品。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103305480 A CN 103305480 A *CN103305480A* 1/1 页 2 1. 一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶， 其特征在于 ： 该超氧化物歧化酶为铜锌 超氧化物歧化酶 Cu， Zn-SOD， 该超氧化物歧化酶具有图 1 所示的核苷酸序列。。

4、 2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶， 其特征在于 ： 所述超氧化物歧化酶具有图2 所示的氨基酸序列。 3.一种权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体， 其特征在于 ： 该重组载体是酵母质粒。 4. 根据权利要求 3 所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体， 其特征在于 ： 所 述的重组载体为 pPIC9k-SOD。 5. 一种权利要求 1 或 2 所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞， 其特征在于 ： 该宿主细胞由重组载体转化得到， 所述宿主细胞为酵母细胞。 6. 根据权利要求 5 所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞， 其特征在于 ： 所述 宿主细胞为毕赤。

5、酵母。 7. 一种权利要求 1 或 2 所述的超氧化物歧化酶的制备方法， 其特征在于 ： 该方法步骤 为 ： 从牛血液中分离提取 mRNA， 将 mRNA 反转录为 cDNA， 再用 PCR 扩增 ； 扩增结束后取 PCR 产物进行电泳检测， 并回收凝胶中的 Cu， Zn-SOD 目标基因 ； 将所得目标基因进行 DNA 测序， 并在 NCBI 数据库中进行比对分析， 得到 Cu， Zn-SOD 基因。 8. 一种权利要求 3 所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体的构建方法， 其特 征在于 ： 该构建方法为 ： 采用所述的 Cu， Zn-SOD 编码序列经 Xho 和 Not 双酶切后与。

6、同 样经 Xho 和 Not 双酶切的 pPIC9k 载体连接， 得到酵母重组表达载体 pPIC9k-SOD。 9. 一种权利要求 5 所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞的构建， 其特征在 于 ： 该构建方法是用所述重组载体转化来构建的 ； 所述宿主细胞选酵母细胞， 选用毕赤酵 母构建重组细胞表达 Cu， Zn-SOD。 10. 一种权利要求 1 或 2 所述的超氧化物歧化酶的表达， 其特征在于 ： 培养包含 Cu， Zn-SOD 编码序列的细胞或所述经转化的细胞， 诱导其表达， 收获表达产物 ； 具体为通过包 含 Cu， Zn-SOD 编码序列的酵母发酵来生产 Cu， Zn-SOD， 。

7、并通过硫酸铵沉降， 离子交换层析和 凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。 权 利 要 求 书 CN 103305480 A 2 1/6 页 3 一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及 其制备方法。 背景技术 0002 1938 年， Mann 和 Keilin 首次从牛红细胞中分离出一种蓝色铜蛋白 ( 血铜蛋 白， Hemocuprein)。1969 年， MeCord 和 Fridovich 发现这种从红细胞纯化而来的含铜蛋 白具有清除超氧阴离子自由基 (O2-.) 的功能， 将其命名为。

8、超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase， EC1.15.1.1， 简称 SOD)。 0003 SOD 是 广 泛 存 在 于 生 物 体 中 的 一 类 金 属 酶，按 金 属 辅 基 的 不 同 主 要 可 分 为 Cu， Zn-SOD， Mn-SOD， Fe-SOD 和 Ni-SOD。 它 通 过 催 化 下 列 反 应 将生物体内多余的并对细胞破坏力极强的超氧阴离 子自由基岐化产生过氧化氢和氧气， 过氧化氢随后被体内的过氧化氢酶 (CAT) 或过氧化物 酶 (POD) 分解掉， 从而解除 O2-.所造成的氧化胁迫， 因此在维持生物体内超氧阴离子自由基 的产生与消除的动。

9、态平衡中起着重要作用。人们己对它进行了广泛的研究， 它是目前 2000 多种酶中研究报道最多的一种， 也是当今生物学前沿研究课题之一。对它的研究在自由基 生物学方面具有十分重要的作用， 受到生物化学界、 医 ( 药 ) 学界、 化工界的高度重视。在 临床应用中， SOD 具有抗衰老、 抗辐射、 防治肿瘤、 细胞信号传导、 治疗心肌缺血与缺血再灌 注综合征、 治疗自身免疫性疾病及某些心血管疾病等方面的作用。此外， SOD 作为保健食品 及化妆品的有效成分也展示出广泛的应用前景。 0004 目前， SOD 的制备来源主要有动物、 植物和微生物。目前市场上的 SOD 产品大部分 是从动物血液中提取的。

10、。由于原材料有限、 纯化困难等原因， 导致 SOD 的纯度低、 产量少， 特别是随着世界各地疯牛病、 禽流感、 口蹄疫以及由动物传播的 SARS 等恶性传染病不时报 道， 生产动物源血液制品的风险加大， 此外， 对产品纯度要求的增高也增加了生产成本。天 然微生物和植物来源的 SOD 也因其种类少、 表达量低、 酶分子量大、 与动物及人体内 SOD 的 同源性低， 从而也难以得到广泛的应用。因此， 寻找优质的动物来源的 SOD 外源基因， 对其 进行合理的改造， 构建廉价、 高效的表达系统， 是突破传统制备方法的有效途径之一。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种来源于牛血液细胞的超氧化。

11、物歧化酶及其制备方法 ； 具体是一种动物来源的 SOD 基因， 以及将其在酵母细胞中克隆表达的方法 ； 解决上述现有 技术的不足之处， 构建出能高效表达并分泌 Cu， Zn-SOD 的重组生产株， 实现 Cu， Zn-SOD 的 生产产业化， 获得具有很好的 pH 稳定性， 良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力的 Cu， Zn-SOD 产品。 0006 本发明提供了一种超氧化物歧化酶， 该超氧化物歧化酶为铜锌超氧化物歧化酶 说 明 书 CN 103305480 A 3 2/6 页 4 （Cu， Zn-SOD） ， 该超氧化物歧化酶的核苷酸序列如图 1 所示 ； 该超氧化物歧化酶的氨基酸序 列如图。

12、 2 所示。 0007 本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体， 该重组载体是酵 母质粒 （优选为 pPIC9k-SOD） 。 0008 本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞， 该宿主细胞选酵母 细胞 ； 所述编码序列的细胞由所述载体转化而得。所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细 胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的毕赤酵母。 0009 本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的制备方法， 该方法步骤如下 ： Cu， Zn-SOD 基因的获得 ： 从牛血液中分离提取mRNA， 将mRNA反转录为cDNA， 再用PCR扩增 ； 扩增结束后 取 PCR 产物进行电泳检测，。

13、 并回收凝胶中的 Cu， Zn-SOD 目标基因 ； 制备好的 cDNA 进行亚克 隆 ： 将所得目的基因进行 DNA 测序， 并在 NCBI 数据库中进行比对分析， 得到 Cu， Zn-SOD 基 因。 0010 本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体的构建方法， 该构 建方法为 ： 采用所述的 Cu， Zn-SOD 编码序列经 Xho 和 Not 双酶切后与同样经 Xho 和 Not 双酶切的 pPIC9k 载体连接， 得到酵母重组表达载体 pPIC9k-SOD。 0011 本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞的构建， 该宿主细 胞的构建方法是用所述重组载体。

14、转化来构建的 ； 所述宿主细胞选酵母细胞 （优选为毕赤酵 母） ， 选用毕赤酵母构建重组细胞表达 Cu， Zn-SOD。 0012 本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的表达， 培养包含 Cu， Zn-SOD 编码序列的细 胞或所述经转化的细胞， 诱导其表达， 收获表达产物。通过包含 Cu， Zn-SOD 编码序列的酵母 发酵来生产 Cu， Zn-SOD， 并通过硫酸铵沉降， 离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式 的目的蛋白。 0013 详述 ： 0014 本发明涉及从牛血液细胞中克隆的 Cu， Zn-SOD 基因。 0015 本发明涉及从牛血液中克隆 Cu， Zn-SOD 的编码序列。实施方。

15、式之一， 本发明提取 牛血液细胞的基因组 DNA， 通过基因组文库构建好活性筛选的方法克隆到编码 Cu， Zn-SOD 的全长序列。实施方式之一中， 所述编码序列包含如图 1 所示的核酸序列， 称之为 Cu， Zn-SOD。实施方式之一中， 所述编码序列是图 1 中的核苷酸 1 至 459 所示的核苷酸序列。 0016 本发明还涉及包含所述 Cu， Zn-SOD 编码序列的重组载体， 例如由各种本领域常用 的表达载体制备的重组载体， 其中， 所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序 列。 实施方式之一中， 将不带内源性信号肽编码序列的本发明Cu， Zn-SOD编码序列经Xho 和 Not。

16、 双酶切后与 Xho 和 Not 双酶切的 pPIC9k 载体连接， 得到酵母重组表达载体 pPIC9k-SOD。 0017 本发明还制备包含本发明 Cu， Zn-SOD 编码序列的细胞。实施方式之一中， 所述细 胞是用上述发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物发酵生产的细 胞， 此类细胞已为本领域熟知并常用， 例如酵母细胞。在本发明的实施方式之一中， 选用毕 赤酵母 GS115 构建表达 Cu， Zn-SOD 的重组细胞。 0018 本发明还提供了表达 Cu， Zn-SOD 的方法， 包括 ： 培养前文所述本发明包含 Cu， Zn-SOD 编码序列的细胞或所述经转化的细胞， 。

17、诱导其表达， 收获表达产物， 还可以可行性地 说 明 书 CN 103305480 A 4 3/6 页 5 包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中， 本发明通过包含本发明 Cu， Zn-SOD 编码序列 的酵母 （例如毕赤酵母 GS115） 发酵来生产 Cu， Zn-SOD， 并通过硫酸铵沉降， 离子交换层析和 凝胶层析纯化得到纯酶形式的目的蛋白。 0019 本发明利用基因工程手段制备了能高效表达并分泌 Cu， Zn-SOD 的重组生产株， 实 现了 Cu， Zn-SOD 的生产产业化， 并获得了优质的 Cu， Zn-SOD 产品。本发明通过酶学性质鉴 定， 进行了酶的最适作用温度、 最适作用。

18、 pH 值、 pH 稳定性、 热稳定性及比活力等理化性质的 分析， 证明本发明的 Cu， Zn-SOD 具有很好的 pH 稳定性， 良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解 能力。 附图说明 0020 图 1 来源于牛血液细胞的 SOD 的核苷酸序列 ； 0021 图 2 来源于牛血液细胞的 SOD 的氨基酸序列 ； 0022 图 3 牛血液细胞的 SOD 在质粒 pPIC9k 上的重组子结构图 ； 0023 图 4 毕赤酵母表达牛血液细胞的 SOD 的最适反应温度 ； 0024 图 5 毕赤酵母表达牛血液细胞的 SOD 的最适反应 pH ； 0025 图 6 毕赤酵母表达牛血液细胞的 SOD 的热稳定。

19、性 ； 0026 图 7 毕赤酵母表达牛血液细胞的 SOD 的 pH 稳定性 ； 0027 图 8 毕赤酵母表达牛血液细胞的 SOD 的发酵工程中的酶活力 ； 0028 图 9 毕赤酵母表达牛血液细胞的 SOD 的分子量 ； 0029 图 10 毕赤酵母表达牛血液细胞的 SOD 对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。 具体实施方式 0030 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制本发明。 实施例 0031 实验材料和试剂 0032 1、 菌体和载体 0033 毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司 （Carlsbad， CA， USA） 。 0034 。

20、2、 酶类及其他生化试剂 0035 DEPC、 限制性内切酶、 DNAMaker、 蛋白质 Maker 均购自 Fermentas（MBI） ， SOD 检测 试剂盒购自南京建成生物工程研究所， 其他常规试剂为上海生工或进口， 皆为分析纯。 0036 3、 培养基 0037 使用的培养基 ： LB 培养基， YPD， YPAD， BMDY， BNNY， MM， MD 培养基均参照 Invitrogen 毕赤酵母操作手册。 0038 4、 本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中， 除非特殊说明， 所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行， 包括 ： 。

21、美 J. 莎姆布鲁克等， 分子克隆实验指南 ； 赵永芳等， 生物化学技术原理及其应用 （第二 版） ； 朱检等， 生物化学实验 M。 0039 5、 本发明中所有相关的酶活、 酶活力、 酶活性均是指 SOD 酶活性， 均采用 SOD 检测 说 明 书 CN 103305480 A 5 4/6 页 6 试剂盒 （购自南京建成生物工程研究所） ， 并按照其说明书中所述的方法进行测定及计算。 0040 实施例 1Cu， Zn-SOD 基因的获得 0041 （1） mRNA 的分离提取 0042 取正常牛新鲜血液 5ml， 加入 0.4ml 浓度为 15g/L 的 EDTA 溶液， 防止血液凝固， 用。

22、微量移液器吸取 0.25ml， 按照 1:1 的比例用 DEPC 处理水进行稀释， 取 0.25ml 稀释后的 新鲜血液于 1.5ml 离心管中， 加入 1mlTRIzol 溶液 （TRIzolReagent， InvitrogenTMCat NO.15596-026） ， 并按说明书方法操作提取总 RNA。 0043 取 1l 稀释 100 倍并进行定量检测， 取必要的量用于反转录 （RT） ， 剩余的量加入 三倍体积的乙醇混合， 于 -80贮存。 0044 （2） cDNA 的第一链的合成 0045 RT-PCR 是先将 mRNA 反转录为 cDNA， 再用 PCR 扩增。cDNA 是指以。

23、 mRNA 为模板， 在 反转录酶的作用下形成的互补 DNA （complementaryDNA， 简称 cDNA） 。cDNA 第一链的合成有 两个关键因素， 一是模板 mRNA， 二是反转录酶。本 cDNA 第一链的合成应用申能博彩逆转录 试剂盒， 并按说明进行操作。 0046 （3） PCR 获取目的基因 0047 根据 NCBI 发表的牛 SOD 序列设计上、 下游引物 P1 和 P2。上、 下游引物分别含有 Xho 和 Not 酶切位点， 由上海生工合成， 引物序列如下 ： 0048 P1 ： 5 -CGGAATTCATGTCTTCATTTCAATTGCC-3 0049 P2 ： 5。

24、 -GTCGGTACCTGTTTTTGTGATTGAATTGC-3 0050 本研究 PCR 程序为 ： 94预变性 4min ； 94变性 30s， 62退火 30s， 72延伸 2min， 循环扩增 30 次 ； 最后 72延伸 10min。扩增结束后取 PCR 产物进行电泳检测， 并回收 凝胶中的目标基因。 0051 （4） cDNA 亚克隆 0052 制备好的双链 cDNA 插入到载体系统 pPIC9k 上， 得到重组质粒 pPIC9k-SOD （如图 3 所示） ， 用感受态细胞转化法转化受体菌GS115， 在含有100mg/ml Amp和0.5%X-gal的LB平 板上 37培养过。

25、夜。挑取蓝色的单克隆 （蓝色斑筛选） 菌落接种到 2ml 含有 100mg/ml Amp 的LB液体培养基中， 37200rpm培养3-6h， 10000rpm离心10min收集菌体， 提取质粒， 酶切 回收目的基因备用 （质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit 和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒） 。 将所得目的基因进行DNA序列测定 （Invitrogen 公司） ， 由此所得到的 SOD 的编码序列共有 459bp（图 1） ， 其中第 457-459 位为终止密码子 TAA， 第1-456位编码不含信号肽的成熟蛋。

26、白， 该成熟蛋白含有152个氨基酸 （图2） 。 根据在 NCBI 数据库里同源性比对的结果初步确定所得到的 SOD 为 Cu， Zn-SOD， 并且从 DNA 水平上 验证了外源基因的插入位点、 方向和序列正确。 0053 实施例 2 毕赤酵母发酵生产重组 SOD 0054 将实施例1中所得到的pPIC9k-SOD经Sac酶切， 得到线性化质粒pPIC9k-SOD1。 0055 取构建好的线性重组质粒 DNA50g， 直接加入到仍在零度以下的感受态细胞中 （毕赤酵母 GS115） ； 加入 1.0ml 含 5g/ml 的鲑鱼精 DNA 的溶液 （40%（w/v）聚乙二醇 1000， 0.2M。

27、 N， N- 二羟乙基甘氨酸， pH8.35） ； 30水浴保温 1h 以上， 每隔 15min 轻轻的混匀 一次 ； 42保温10min ； 室温3000g离心5min， 弃去上清， 用1.0ml的溶液 （0.15M NaCl， 说 明 书 CN 103305480 A 6 5/6 页 7 10mMN,N-二羟乙基甘氨酸， pH8.35） 重新悬浮菌体 ； 室温3000g离心5min， 移去800l上 清， 用剩余的 200l 上清重新悬浮菌体 ； 将 200l 菌液涂 YPD 平板 （YP 和 20%D 单独灭菌， 倒平板之前按1 ： 9向YP中加入20%D ； 筛选抗性为80g/ml A。

28、mp） ， 30倒置培养3-4天， 在 抗性平板上生长的为含量有重组质粒的阳性克隆子， 并进行重组子鉴定。 0056 取重组质粒 pPIC9k-SOD1 转化的毕赤酵母 GS115 菌株阳性克隆子， 接种于 150ml YPD 培养液中， 30 250rpm 震荡培养至 OD600nm=0.3-0.5（约 20h） ， 然后接种于 3L 发酵基 本培养基 （26.2ml/ 磷酸， 0.80g/L 硫酸钙， 18.7g/L 硫酸钾， 15.5g/L 硫酸镁， 4.17g/L 氢氧 化钾， Glucose40g/L） 中， 于 5L 发酵罐中进行发酵。 0057 在起始阶段菌体生长阶段， 发酵过程。

29、中用 25% 的氨水调节 pH， 使其维持在 6.5， 并且以 4.0ml/h 的速度流加 PTM1（30mM 硫酸铜， 0.54mM 硫酸亚铁， 1.6mM 生物素， 0.19M 硫 酸） ， 进行连续流加补料。搅拌并通气培养 20-24h， 在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于 100%， 直至碳源耗尽， 溶氧又逐渐上升至高于 80%， 此时菌湿重可达到 70g/L。 0058 进入碳源饲喂阶段， 以 25ml/h 的流速流加用蒸馏水配置的含有 25%（w/v） 的葡萄 糖和 12ml/L PTM1 的溶液， 持续流加 4-6h, 并调节通气量， 使溶氧维持在 20% 上下， 到该阶 段的末。

30、期， 菌湿重可达到 200g/L。 0059 在诱导阶段， 以20-30ml/h的流速流加含有12ml/L PTM1的甲醇， 使培养基中甲醇 的终浓度最高不要超过 0.3% （v/v） ， 并调节通气量， 使溶氧维持在 20% 上下。在诱导阶段的 发酵过程中每隔 8-16h 取样 10ml， 10000rpm 离心 5min， 收集上清液测定 SOD 活力， 结果如 图 8 所示。发酵 160h 时， 湿菌重可达到 335g/L， SOD 的表达水平 （以发酵液上清的酶活力表 示） 可达到 3700U/ml， 说明牛血液细胞来源的 SOD 基因均在毕赤酵母中得到了表达和积累。 0060 实施例。

31、 3 重组 SOD 的纯化 0061 将实施例 2 所制备的发酵培养液 10000rpm 离心 10min 去除菌体， 取上清液作为粗 酶液， 用截留分子量为 8000Da 的外压式中空纤维超滤膜进行超滤， 以去除粗酶液中小分子 的杂质， 并将其浓缩 3-5 倍。 0062 将上面所得粗酶液的浓缩液置于冰浴中， 边搅拌边缓慢加入硫酸铵至 85%， 13000rpm 离心 15min， 取沉淀， 用缓冲液重新溶解， 置于截留分子量为 8000Da 的透析袋中， 以 pH8.0， 10mM Tris-HCl 为透析外液， 透析外液与内液的体积比大于 50， 4透析 12-16h， 中间每隔 4h 。

32、更换透析外液一次， 透析完后， 取透析内液用真空旋转蒸发仪进行浓缩， 再进 行冷冻干燥后， 置于 -20的低温冰箱中保存待用。 0063 取 20mg 上面所得到的冻干粉末于离心管中， 加入 2ml pH8.0， 10mMTris-HCl 缓冲 液， 使其充分溶解后， 上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱。 先用pH8.0， 10mM Tris-HCl 缓冲液平衡柱子， 然后流加样品， 再用相同缓冲液配置的 0-0.5M NaCl 梯度洗脱 5 个柱体 积， 流速为 1ml/min， 用部分收集器收集， 每管 3ml。然后对收集管中的溶液测定 SOD 活力及 蛋白电泳分析。

33、。 0064 收集离子交换分离后的活性峰， 浓缩、 脱盐、 冻干后， 再用 pH7.0， 20mM PBS 缓冲液 洗脱 1.5 个柱体积， 流速为 0.25ml/min， 按峰收集， 然后对收集的样品测定 SOD 活力及进行 蛋白质电泳分析。 0065 纯化完成后， 牛血液基因来源的 SOD 比活性从粗酶液的 256U/mg 提高到纯酶 3869U/mg， 纯化倍数为 15.1， 得率为 14.5。SDS-PAGE 结果 （图 9） 表明， 牛血液基因来源的 说 明 书 CN 103305480 A 7 6/6 页 8 SOD 纯化后的 SOD 蛋白仅有单一的条带， 分子量均约为 18kDa。

34、。 0066 实施例 4 重组 SOD 的酶学性质分析 0067 将实施例 3 所制备的 SOD 在不同的 pH 下进行酶促反应以测定其最适 pH。所用缓 冲液为pH2.0-10.0的广泛缓冲液 （柠檬酸、 磷酸二氢钾、 硼酸、 氢氧化钠、 巴比妥） 。 SOD在不 同的 pH 的缓冲液中， 40下测定 pH 的适应性结果， 表明牛血液基因来源 SOD 的最适 pH 为 7.0-8.0（图 5） 。将 SOD 酶液在不同 pH 值的缓冲液中于室温下处理 60min， 再测定残余酶 活性以研究 SOD 的 pH 稳定性。结果表明 （图 7） ， 在 pH4.0-10.0 之间， SOD 的残余活。

35、性均在 88% 以上。这说明牛血液基因来源 SOD 有很好的 pH 稳定性。 0068 最适反应温度的测定在磷酸盐 （pH7.0） 缓冲体系及不同温度下 （30 -80） 进 行酶促反应。热稳定性研究为在不同温度下处理 10-60min， 再进行酶活性测定。酶促反应 最适温度测定结果 （图 4） 表明， SOD 的最适反应温度为 37。在 30 -50的范围内保温 60min， 残余酶活力均可维持在 90% 以上 （图 6） 。在 60保温 60min， 残余酶活力为 87% 左 右， 在 70保温 60min， 残余酶活力为 75% 左右， 在 80保温 60min， 残余酶活力仍可达到 4。

36、9% 左右。说明牛血液基因来源 SOD 有较好的热稳定性。 0069 分别在牛血液基因来源 SOD 酶溶液中加入 0.05ml 胰蛋白酶 （0.1mg/ml， 用 pH7.0PBS 缓冲液配制） 和胃蛋白酶 （0.1mg/ml， 用 pH2.0 甘氨酸 -HCl 缓冲液配制） 于 37处 理 30-240min， 稀释后再测定 SOD 活性。经胰蛋白酶处理 240min 后， SOD 的残余酶活力仍维 持在 95%， 无明显的损失 ； 经胃蛋白酶处理 240min 后， SOD 残余酶活力在 68% 左右 （图 10） ， 说明牛血液基因来源 SOD 具有较好的抗蛋白酶水解能力。 说 明 书 CN 103305480 A 8 1/6 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103305480 A 9 2/6 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 103305480 A 10 3/6 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103305480 A 11 4/6 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103305480 A 12 5/6 页 13 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103305480 A 13 6/6 页 14 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103305480 A 14 。