异长春花苷内酰胺及喜果苷在制备抗皮肤色素沉着药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103585167 A (43)申请公布日 2014.02.19 CN 103585167 A (21)申请号 201210302944.5 (22)申请日 2012.08.14 A61K 31/706(2006.01) A61K 8/60(2006.01) A61P 17/16(2006.01) A61P 17/00(2006.01) A61Q 19/02(2006.01) A61Q 19/10(2006.01) A61Q 1/06(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) (71)申请人 江苏中康药物科技有限公司 地址 210019 江苏省南京市建。

2、邺区奥体大街 69 号新城科技大厦 01 栋 6 层 申请人 江苏康缘药业股份有限公司 (72)发明人 萧伟 丁岗 王振中 孟兆青 曹亮 刘文君 李娜 (54) 发明名称 异长春花苷内酰胺及喜果苷在制备抗皮肤色 素沉着药物中的应用 (57) 摘要 本发明涉及一种化合物的药物用途， 具体涉 及异长春花苷内酰胺以及喜果苷在制备抗皮肤色 素沉着、 抗紫外线、 治疗色素增加性皮肤病、 增白、 祛斑药物及化妆品中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书12页 (10)申请公布号 CN 103。

3、585167 A CN 103585167 A 1/1 页 2 1. 异长春花苷内酰胺及其异构体喜果苷在制备抗皮肤色素沉着、 抗紫外线、 治疗色素 增加性皮肤病、 增白、 祛斑药物及化妆品中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的制药应用， 其特征在于所述药物及化妆品为膏剂、 乳霜、 乳 液、 化妆水、 洗剂、 凝胶、 美容液、 粉底霜、 填塞物、 面膜、 口红和淋浴液中的一种形式。 3. 根据权利要求 2 所述的制药应用， 其特征在于 ： 异长春花苷内酰胺在膏剂、 乳霜、 乳液、 化妆水、 洗剂、 凝胶、 美容液、 粉底霜、 填塞物、 面膜、 口红和淋浴液中的质量百分比为 0.1 10。 4。

4、. 根据权利要求 2 所述的制药应用， 其特征在于 ： 喜果苷在膏剂、 乳霜、 乳液、 化妆水、 洗剂、 凝胶、 美容液、 粉底霜、 填塞物、 面膜、 口红和淋浴液中的质量百分比为 0.1 10。 权 利 要 求 书 CN 103585167 A 2 1/12 页 3 异长春花苷内酰胺及喜果苷在制备抗皮肤色素沉着药物中 的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种化合物的制药用途， 具体涉及异长春花苷内酰胺及其异构体喜果 苷在在制备抗皮肤色素沉着、 抗紫外线、 治疗色素增加性皮肤病、 增白、 祛斑药物及化妆品 中的应用。 背景技术 0002 色素沉着是指皮肤或粘膜颜色加深和色素量增加。 皮肤色素。

5、沉着是一种常见的体 征， 病因较多， 可涉及临床各科百余种疾病， 色素沉着在我国发病率极高， 发病人群尤其集 中在中年女性。有许多种面部色素沉着疾病。皮肤的色素沉着大致可分为两大类， 一类是 自身产生的， 称为内源性色素 ； 另一类是外来的， 称为外源性色素， 主要来自药物、 食物及外 来异物。色素沉着的颜色有多种， 有蓝色， 灰色等， 但以黑褐色最常见。发病因素归纳起来 大致有以下几类 ： 遗传因素 ： 代表性疾病有雀斑、 脂溢性角化病、 神经皮肤黑变病、 色素 沉着肠息肉综合征， 此组疾病的色素沉着均为局限性。代谢性因素 ： 肝豆状核变性、 血色 病等。内分泌因素 ： 阿狄森氏病、 某些垂。

6、体肿瘤、 较长期接受雌激素治疗、 妊娠和黄褐斑 等。 营养不良 ： 恶性营养不良， 糙皮病、 维生素B12缺乏等。 化学及药物因素 ： 某些抗肿 瘤及抗免疫药物、 抗疟疾药物、 焦油、 沥青、 蒽油及其它碳氢化合物。 物理因素 ： 机械外伤， 紫外线， 某些放射线， 慢性瘙痒搔抓及摩擦等。炎症及传染病 ： 皮肤慢性炎症等。某些 肿瘤。其他因素。 0003 目前， 治疗皮肤色素沉着的方法主要有物理疗法和药物疗法两种。物理疗法采用 仪器 ( 激光仪、 光子嫩肤仪等 ) 以及磨削治疗等物理方法清除皮肤表面的色素沉着。但容 易造成色素增多、 加深、 复发以及皮肤屏障功能严重破坏、 出现瘫痕等副作用。药。

7、物疗法包 括全身治疗和局部治疗。如口服或注射维生素 C(E) 或其衍生物， 谷胱甘肽以及植物提取物 等用以全身治疗皮肤色素沉着。 局部治疗可以采用涂抹氢醌、 维甲酸、 果酸等达到祛斑的效 果。 0004 皮肤色素沉着因其病因复杂， 影响因素众多， 属于难以彻底根治的疾病。 目前尚无 十分理想之药物及产品， 因此开发此类的产品尤其必要。我国用中草药治疗和护理各种皮 肤疾病已有几千年的历史。近年来， 出于对化学美白祛斑产品毒性、 刺激性的疑虑， 越来越 多的科学研究者倾向于从天然植物中寻找安全高效的美白活性物质。 0005 文献报道， 异长春花苷内酰胺及喜果苷具有一定的抗病毒、 抗疟疾、 解热、 。

8、抗炎等 方面的活性。 发明人在研究过程中对两种化合物进行了广泛的活性筛选， 筛选中意外发现， 异长春花苷内酰胺及喜果苷能抑制成纤维细胞增生， 能呈量效关系的抑制黑色素瘤细胞的 有丝分裂和增殖， 能够诱导细胞的凋亡或致死亡， 有抗黑色素瘤细胞生长的作用， 抑制黑色 素合成， 表明其可能作为皮肤脱色剂应用。因此对异长春花苷内酰胺及喜果苷的抗色素沉 着作用进行了进一步的研究， 佐证了其作用活性。另外在研究中还发现上述两个化合物能 够吸收紫外线， 转化为荧光， 具有较强的抗紫外线作用。 说 明 书 CN 103585167 A 3 2/12 页 4 0006 异长春花苷内酰胺及其异构体喜果苷为吲哚生物。

9、碱糖苷， 结构式如下 ： 0007 0008 结 构 式 1 异 长 春 花 苷 内 酰 胺 (Strictosamide) 结 构 式 2 喜 果 苷 (Vincoside-lactam) 0009 这两个化合物 3 位的氢键构型不同， 前者是 构型， 后者是 构型。 发明内容 0010 本发明的目的在于提供异长春花苷内酰胺及喜果苷在抗皮肤色素沉着、 抗紫外 线、 治疗色素增加性皮肤病、 增白、 祛斑药物及化妆品中的应用。 0011 上述异长春花苷内酰胺及喜果苷制备为膏剂、 乳霜、 乳液、 化妆水、 洗剂、 凝胶、 美 容液、 粉底霜、 填塞物、 面膜、 口红和淋浴液， 其中异长春花苷内酰胺。

10、或喜果苷在制剂中的质 量百分比为 0.1 10。 0012 本发明的上述目的是通过如下方法予以实现的 ： 0013 本发明人以异长春花苷内酰胺或喜果苷为研究对象， 采用黄体酮肌肉注射攻击 小鼠引起皮肤色素沉着观察异长春花苷内酰胺及喜果苷的防治作用。试验指标选择观 测皮肤、 肝脏组织酪氨酸 (Tyr)、 超氧化物歧化酶 (SOD)、 丙二醛 (MDA) 含量变化， 并运用 ElivisionTM plus 免疫组化法观测黑色素细胞在表皮中的分布及分泌功能情况。结果显示 各模型组小鼠皮肤黑色素沉着增加， 皮肤、 肝脏酪氨酸 Tyr、 丙二醛 MDA 含量明显升高， SOD 含量降低。异长春花苷内酰。

11、胺和喜果苷组小鼠皮肤 Tyr、 MDA 水平较模型组显著降低， SOD 水平升高 ； 小鼠表皮黑色素沉着面积减小、 黑色素沉着程度降低。 提示异长春花苷内酰胺和 喜果苷可改善黄体酮注射致小鼠色素沉着， 可能主要通过抑制黑色素细胞的增殖和黑色素 细胞合成而发挥作用。 0014 异长春花苷内酰胺及喜果苷对 B-16 细胞内酪氨酸酶活性抑制的研究结果表明， 异长春花苷内酰胺和喜果苷对调控黑色素合成的关键酶之一酪氨酸酶的活性具有明 显抑制作用。 0015 还采用了中波紫外线 (UVB) 照射豚鼠以形成色素沉着模型。观察异长春花苷内酰 胺及喜果苷的防治作用。结果同样显示模型组豚鼠皮肤黑色素沉着增加， T。

12、yr、 MDA 含量明 显升高， SOD 含量降低。异长春花苷内酰胺和喜果苷能减轻模型豚鼠表皮黑色素沉着， 显著 降低模型豚鼠皮肤 Tyr、 MDA 水平， 升高 SOD 水平。提示异长春花苷内酰胺和喜果苷对中波 紫外线诱导豚鼠色素沉着有一定抑制作用。 0016 本发明的异长春花苷内酰胺或喜果苷是指本领域技术人员采用常规的任何一种 从含有异长春花苷内酰胺或喜果苷的植物提取得到的粗提物， 也可以是继续纯化后的精制 物。 说 明 书 CN 103585167 A 4 3/12 页 5 0017 本发明的有益效果 ： 0018 1、 本发明以异长春花苷内酰胺、 喜果苷为研究对象， 对其进行了黄体酮肌。

13、肉注射 攻击小鼠引起皮肤色素沉着(模拟内分泌失调致皮肤色素沉着)、 中波紫外线(UVB)照射豚 鼠以形成色素沉着模型 ( 模拟日晒因素致皮肤色素沉着 ) 引起皮肤色素沉着研究， 结果显 示异长春花苷内酰胺和喜果苷可两种模型的皮肤色素沉着， 可能主要通过抑制黑色素细胞 的增殖和黑色素细胞合成而发挥作用。 提示可以异长春花苷内酰胺和喜果苷用于色素沉着 的防治或外用化妆品的增白祛斑功能。异长春花苷内酰胺及喜果苷对 B-16 细胞内酪氨酸 酶活性抑制的研究结果表明， 异长春花苷内酰胺和喜果苷对调控黑色素合成的关键酶之一 酪氨酸酶的活性具有明显抑制作用。 0019 2、 随机选择自愿者试用异长春花苷内酰。

14、胺和喜果苷制成的软膏剂， 结果表明 ： 有 明显美白亮肤效果， 其中有黄褐斑的试用者使用后有色斑部位颜色有不同程度的减淡。 0020 3、 本发明提供一种植物活性成分的新应用， 不但扩充了异长春花苷内酰胺及喜果 苷的药用价值， 而且本植物提取物经过前期大量研究表明， 外用无皮肤及肌肉刺激性及过 敏反应， 安全可靠。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例对本发明做进一步描述， 但具体实施例并不对本发明做任何 限定。 0022 本发明的异长春花苷内酰胺、 喜果苷可以采用本领域技术人员从含有该成分植物 中提取的任何一种常用方法制备， 也可以从市场上采购。 0023 实施例 1 ： 异长春花苷内。

15、酰胺及喜果苷用于对黄体酮注射诱导小鼠色素沉着动物 模型的试验研究 0024 将异长春花苷内酰胺及喜果苷进行了黄体酮肌肉注射攻击小鼠引起皮肤色素沉 着模型的试验研究， 对其是否具有抑制色素沉着功效进行检测。将异长春花苷内酰胺及喜 果苷和化妆品中常用的助剂进行搭配， 制成 5的软膏剂 ( 异长春花苷内酰胺、 喜果苷占软 膏体总质量的 5 ) 0025 根据色素沉着的发生与内分泌紊乱有关及目前通行的 “雌激素和黄体酮增多进而 刺激黑色素细胞而致色素沉着” 的发病学假说， 以及根据过伟峰等研究， 用黄体酮攻击雌性 小鼠， 复制小鼠色素沉着动物实验模型。本研究观察了两种软膏剂对黄体酮攻击雌性小鼠 所致色。

16、素沉着的预防作用， 观察了相关生化指标及形态学指标的变化。 0026 1、 实验材料 0027 1.1 仪器 ： 奥林巴斯显微镜， 日本。RF-5301 荧光光度计， 日本岛津公司 ； UV2401PC 紫外分光光度计， 日本岛津公司 ； CMIAS 系列 98A 型多功能真彩色病理图像分析仪， 北京航 天航空大学图象中心 ； 1470 型 Wizard 全自动伽玛计数器， 芬兰 Pharmacia 公司。 0028 1.2 药物 ： 异长春花苷内酰胺及喜果苷软膏剂 ( 异长春花苷内酰胺及喜果苷占软 膏体总质量的 5 )， 自制。 0029 2、 实验方法 0030 ICR 小鼠 60 只， 。

17、18 22g， 全部为雌性。分为 6 组， 每组 10 只。(1) 正常组 ： 给予 赋形剂 ； (2)模型组 ： 给予赋形剂 ； (3)维A酸乳膏组(Tretinoin Cream组) ： 1.8mg/kg ； (4) 说 明 书 CN 103585167 A 5 4/12 页 6 异长春花苷内酰胺软膏剂 ： 2.5mg/kg ； (5)喜果苷软膏剂 ： 2.5mg/kg。 正常组按5ml/kg体重 肌肉注射灭菌射生理盐水。 其余5组以0.4的黄体酮注射液按5ml/kg体重给小鼠后腿每 日肌肉注射， 两腿交替， 连续 30d。攻击同时， 软膏用赋形剂将原制剂稀释， 各组涂药 ( 或赋 形剂 。

18、)5ml/kg。每日 1 次， 连续 30 日。每日观察小鼠一般情况， 注射黄体酮注射液 20 日后 用 10 Na2S 溶液给小鼠背部脱毛并每日观察脱毛部位皮肤变化情况。攻击 30 天后， 小鼠 背部以 10 Na2S 溶液给脱毛， 脱颈椎处死小鼠， 剥取小鼠右侧背部去毛皮肤一块， 10福 尔马林固定。常规石蜡包埋切片， 片厚 4 5m， 载玻片经防脱片处理后捞片、 烘片。再经 脱蜡至水、 抗原修复后， 用 HMB45(melanoma 黑色素瘤 ) 为第一抗体， 以 ElivisionTM plus 免疫组化方法显示表皮中的黑色素颗粒， 以研究黑色素细胞在表皮中的分布及分泌功能情 况。取背。

19、部脱毛皮肤及肝脏各一块， 用预冷生理盐水 (4 摄氏度 ) 冲洗， 除尽杂质， 拭干， 切 取皮肤或者肝脏各 0.5g 左右， 分别放入有 2.0ml 预冷生理盐水的小试管内， 用高速分散机 以 10000rpm 匀浆两次， 每次 10s， 匀浆后以 3500rpm 离心 15min， 取上清液进行相关指标测 定。酪氨酸 (Tyr) ： 采用同步荧光分析法 (RF-5301 荧光光度计 ) 检测含量。丙二醛 (MDA)、 超氧化物歧化酶 (SOD) ： 采用紫外分光光度法 ( 紫外光栅分光光度计 ) 检测 MDA、 SOD 活性。 0031 3、 结果 0032 3.1 一般情况 0033 开。

20、始观察小鼠每日一般情况， 小鼠行为活动、 精神状况、 排泄物等无明显异常。注 射黄体酮注射液20日后用10Na2S溶液给小鼠脱毛(背部右下侧)并每日观察脱毛部位 皮肤变化情况发现模型组及各给药组脱毛部位皮肤色泽暗于正常组， 以模型组最为严重， 各给药组情况好于模型组。 0034 3.2 对造模小鼠表皮黑色素沉积的影响 0035 正常组 (Normal) ： 基底层细胞排列较紧密， 中间层细胞胞体较大， 角化层细胞很 薄。基底层细胞间偶见黑色素颗粒阳性反应的黑色素细胞， 中间层的角质形成细胞内有时 可见被吞噬的少量、 淡染的黑色素颗粒存在。 0036 模型组 (Control) 表皮角质形成细胞。

21、的基底层细胞间， 常见有数个黑色素细胞夹 杂其间， 中间层的角质形成细胞内有被吞噬的大量、 浓染的黑色素颗粒存在。 0037 维 A 酸乳膏组 (Tretinoin Cream) 表皮结构正常。基底层细胞间偶见黑色素颗粒 阳性反应的黑色素细胞， 中间层的角质形成细胞内有时可见被吞噬的较少量、 淡染的黑色 素颗粒存在。 0038 异长春花苷内酰胺软膏剂组表皮结构正常。 基底层细胞间偶见黑色素颗粒阳性反 应的黑色素细胞， 中间层的角质形成细胞内有时可见被吞噬的少量、 淡染的黑色素颗粒存 在。 0039 喜果苷软膏剂组夹杂在表皮角质形成细胞基底层间的黑色素细胞较少见， 被吞噬 的黑色素颗粒在角质形成。

22、细胞内分布少， 且淡染。 0040 3.3对造模小鼠皮肤酪氨酸(Tyr)、 丙二醛(MDA)、 超氧化物歧化酶(SOD)含量的影 响 0041 结果显示， 造模后小鼠皮肤 Tyr、 MDA 水平升高， SOD 水平降低， 与正常组比较有显 著性差异 (p 0.05， p 0.01) ； 各给药组较模型组 Tyr、 MDA 降低， SOD 水平升高， 与模型 组比较有显著性差异(p0.05， p0.01)。 提示异长春花苷内酰胺软膏剂、 喜果苷软膏剂 说 明 书 CN 103585167 A 6 5/12 页 7 组对模型小鼠皮肤酪氨酸、 MDA 水平升高， SOD 水平降低有一定的抑制作用。结。

23、果见下表。 0042 表 1 对小鼠实验性色素沉着皮肤 Tyr、 MDA、 SOD 的影响 0043 0044 p 0.05，p 0.01 vs 正常 ；*p 0.05，*p 0.01 vs 模型 0045 3.4对造模小鼠肝脏酪氨酸(Tyr)、 丙二醛(MDA)、 超氧化物歧化酶(SOD)含量的影 响 0046 结果显示， 造模后小鼠肝脏酪氨酸、 MDA 水平显著升高， SOD 水平显著降低， 与正常 组比较有显著性差异 (p 0.05) ； 各给药组较模型组酪氨酸、 MDA 水平降低， SOD 水平升高， 与模型组比较有显著性差异 (p 0.05， p 0.01)。提示异长春花苷内酰胺软膏。

24、剂、 喜果 苷软膏剂组对模型小鼠肝脏酪氨酸、 MDA 水平升高， SOD 水平降低有一定的抑制作用。结果 见下表。 0047 表 2 对小鼠实验性色素沉着肝脏 Tyr、 MDA、 SOD 的影响 0048 0049 p 0.01 vs 正常 ；*p 0.01 vs 模型 0050 4、 讨论 0051 东方人 ( 黄种皮肤 ) 色素沉着大致分三类 ： 增生性色素沉着、 炎症性色素沉着、 非 炎症性色素沉着。增生性如黑色素细胞性肿瘤 ； 炎症性如日晒、 换肤、 化学剥脱、 痤疮愈后、 磨削术后等引起的色素沉着 ； 非炎症性如黄褐斑 ( 部分为遗传性 )、 雀斑等。临床表现为表 皮外观正常， 无自。

25、觉症状。其色素冬季变淡 . 夏季加重， 发生于暴露部位， 从组织病理来看， 黑色素细胞的活化增强， 产生黑色素颗粒增加。 0052 黑色素的生成过程是一个较为复杂的过程， 该过程除与酪氨酸酶有关外， 还与自 由基等因素密切相关。研究表明， 酪氨酸酶的催化作用和多巴醌及其以后的自动氧化反应 均需自由基的参与， 自由基数目减少可减少黑色素的生成。黄褐斑患者治疗后血清中 SOD 含量明显降低、 丙二酮 (MDA) 含量升高。从而提出自由基与皮肤黑色素的形成及色素沉着 说 明 书 CN 103585167 A 7 6/12 页 8 有关。抗氧化剂 SOD 能有效清除多余超氧自由基， 使 LPO、 MD。

26、A 形成减少， 从而阻止色素沉着 的产生。 0053 过伟峰等关于建立小鼠实验动物模型的初步研究中采取免疫组化技术， 以抗体 HMB45 作为抗体来标记黑色素阳性细胞取得成功。本研究沿用了此实验方法， 研究结果显 示， 正常组小鼠黑色素细胞较少， 模型组明显增多， 呈强阳性反应。黄体酮注射攻击的同时 用药物干预小鼠， 黑色素细胞数与模型组比较明显减少， 颜色变淡， 证明药物确有减轻模型 小鼠皮肤黑色素沉积的作用。 0054 本研究观察了对模型小鼠皮肤以及肝脏酪氨酸、 MDA、 SOD 含量的影响， 结果显示异 长春花苷内酰胺软膏、 喜果苷软膏剂对黄体酮攻击小鼠的色素沉着模型具有降低皮肤、 肝 。

27、脏酪氨酸含量， 降低皮肤、 肝脏 MDA 水平， 升高 SOD 水平， 抑制氧化反应， 调节氧化与抗氧化 之间平衡紊乱的作用。 0055 实施例 2 ： 异长春花苷内酰胺及喜果苷用于对中波紫外线诱导豚鼠色素沉着模型 的试验研究 0056 将异长春花苷内酰胺及喜果苷进行了中波紫外线 (UVB) 照射豚鼠以形成色素沉 着模型的试验研究， 对其是否具有抑制色素沉着功效进行检测。将异长春花苷内酰胺及喜 果苷和化妆品中常用的助剂进行搭配， 制成 1的软膏剂 ( 异长春花苷内酰胺、 喜果苷占软 膏体总质量的 1 ) 0057 中波紫外线 (UVB) 波长 320 275nm， 是紫外线生物学效应最活跃部分。

28、， 红斑反应 的作用很强， 促进黑色素产生以及抑制变态反应等作用， 使黑色素细胞增殖。 因此本研究采 用 UVB 照射动物以形成色素沉着模型， 观察异长春花苷内酰胺及喜果苷用于对中波紫外线 诱导豚鼠色素沉着模型的影响。 0058 1、 实验材料 0059 1.1 仪器 ： 奥林巴斯显微镜， 日本。RF-5301 荧光光度计， 日本岛津公司。UV2401PC 紫外分光光度计， 日本岛津公司。CMIAS 系列 98A 型多功能真彩色病理图像分析仪， 北京航 天航空大学图象中心。 1470型Wizard全自动伽玛计数器， 芬兰Pharmacia公司 ； 220V， 60W， UVB 灯管， 上海市灯。

29、具研究所生产。XHF-1 型高速分散器， 上海金达生化仪器厂。 0060 1.2 药物 ： 异长春花苷内酰胺及喜果苷软膏剂 ( 异长春花苷内酰胺及喜果苷占软 膏体总质量的 1 )， 自制。 0061 2、 实验方法 0062 2.1 皮肤色素沉着动物造模、 实验分组及给药方法 0063 造模方法 ： 取豚鼠， 雌性， 体重 200 220g。以 10 Na2S 水溶液脱去背毛， 裸露出 皮肤一块面积约 4cm3cm， 每周脱毛一次。取 10 只作为正常组， 除正常组以外的豚鼠用波 长约320nm的中波紫外线(UVB)照射裸露部位， 每日一次， 每次照射时间60min， 连续30日。 分组及给药。

30、方法 ： 紫外线照射第 31 日， 根据造模后动物一般状况， 选取模型豚鼠分为 5 组。 (1) 模型组 ： 给予赋形剂 ； (2) 维 A 酸乳膏组 (Tretinoin Cream 组 ) ： 0.9mg/kg ； (3) 异长春 花苷内酰胺软膏剂 ： 1.25mg/kg ； (4) 喜果苷软膏剂 ： 1.25mg/kg。另 10 只豚鼠设为正常组， 给予赋形剂。药物组用赋形剂将原制剂稀释， 各组涂药 ( 或赋形剂 )1.8ml/kg。涂药后每日 继续以 UVB 照射试验鼠， 同时继续涂药一日 1 次， 涂药后用无菌纱布、 油纸和无刺激性胶带 加以固定， 4h后拆除、 洗净。 连续给药30。

31、日。 每日观察豚鼠的一般情况以及背部脱毛部位皮 说 明 书 CN 103585167 A 8 7/12 页 9 肤变化情况。末次涂药 24h 后， 脱颈椎处死豚鼠， 剥取豚鼠右侧背部去毛皮肤一块， 以 10 福尔马林固定。常规石蜡包埋切片， 片厚 4 5m， 载玻片经防脱片处理后捞片、 烘片。再 经脱蜡至水、 抗原修复。用 HMB45(melanoma 黑色素瘤 ) 为第一抗体， 采用 ElivisionTM plus 免疫组化方法显示表皮中的黑色素颗粒， 以研究黑色素细胞在表皮中的分布及分泌功能情 况。各组每只动物去毛部位皮肤各制成 1 张病理切片， 每片观察 5 个不同视野， 找到阳性目 。

32、标后， 用病理图像分析仪对目标图像进行定量分析 ： 得出每张切片 5 个视野的目标面积、 目 标个数、 面密度、 数密度、 周密度、 平均灰度、 平均光密度、 积分光密度等。取脱毛部位皮肤， 用预冷生理盐水 (4 ) 冲洗， 除尽杂质， 拭干， 切取皮肤 0.5g 左右， 分别放入有 2.0ml 预冷 生理盐水的小试管内， 用高速分散机以 10000rpm 匀浆两次， 每次 10s， 匀浆后以 3500rpm 离 心 15min， 取上清液进行指标测定。MDA、 SOD 水平 ： 采用分光光度法检测 MDA、 SOD 水平。Tyr 含量 ： 采用荧光分析法检测含量。 0064 3、 结果 00。

33、65 3.1 一般情况 0066 紫外线照射 15 日后造模豚鼠活动减少， 出现部分动物抓挠后足 ； 紫外线照射的脱 毛部位逐日出现色泽加深。给药期间， 给药各组豚鼠皮肤色泽略有好转， 呈淡化好转趋势 ； 而模型组较严重。 0067 3.2 对表皮黑色素沉积的影响 0068 正常组 ： 真皮可见毛囊、 皮脂腺及毛发， 上皮下为致密的纤维结缔组织。基底层细 胞为立方形或柱状， 其内可见少量个别黑色素颗粒染色阳性细胞。 0069 模型组 ： 基底层内可见大量胞质染深棕褐色的细胞， 高倍镜下见细胞内充满染色 阳性的颗粒， 因颗粒数量多， 致使胞质呈深棕褐色。细胞数量多且密集成行。 0070 维 A 。

34、酸乳膏组 ： 皮肤基底层黑色素细胞数量略有减少。 0071 异长春花苷内酰胺软膏剂组 ： 基底层内胞质染深棕褐色的黑色素细胞数量较模型 组明显减少， 黑色素细胞散在、 稀疏分布， 密集分布的现象较少。 0072 喜果苷软膏剂组 ： 基底层内胞质染深棕褐色的黑色素细胞数量较模型组明显减 少。黑色素细胞散在、 分布稀疏。 0073 3.3 对黑色素细胞面积、 数量的影响 0074 紫外线照射 60 日， 豚鼠黑色素细胞目标面积、 目标个数、 面密度、 周密度、 数密度 明显升高， 模型组显著高于正常组(p0.01)。 异长春花苷内酰胺软膏剂、 喜果苷软膏剂组 黑色素细胞目标面积、 目标个数、 面密。

35、度、 周密度、 数密度均呈下降趋势， 指标水平与模型组 比较有统计学差异 (p 0.05， p 0.01)。结果见下表。 0075 表 3 对豚鼠实验性色素沉着黑色素细胞面积、 数量的影响 0076 说 明 书 CN 103585167 A 9 8/12 页 10 0077 p 0.01 vs 正常 ；*p 0.05，*p 0.01 vs 模型 0078 3.4 对黑色素细胞染色深浅度的影响 0079 豚鼠黑色素细胞染色深浅度用灰度值和光密度值表示， 颜色越深， 灰度值越小， 光 密度越大。 积分光密度是平均光密度与面积的乘积， 颜色越深， 面积越大， 积分光密度越高。 紫外线照射 60 日，。

36、 豚鼠黑色素细胞平均灰度值降低、 光密度值和积分光密度值明显升高 (p 0.01)。 各给药组平均灰度值有一定的升高， 平均光密度值、 积分光密度值有一定的降低， 异长春花苷内酰胺软膏剂、 喜果苷软膏剂组积分光密度值与模型组比较有显著性差异 (p 0.05， p 0.01)。结果见下表。 0080 表 4 对豚鼠实验性色素沉着黑色素细胞染色深浅度的影响 0081 0082 0083 p 0.01 vs 正常 ；*p 0.05，*p 0.01 vs 模型 0084 3.5 对皮肤 Tyr、 SOD、 MDA 含量的影响 0085 豚鼠皮肤Tyr、 MDA水平升高， SOD水平降低， 模型组与正常。

37、组比较有显著性差异(p 0.01) ； 异长春花苷内酰胺软膏剂、 喜果苷软膏剂组较模型组 Tyr、 MDA 水平降低， SOD 水 平升高， 与模型组比较有显著差异 (p 0.05， p 0.01)。提示异长春花苷内酰胺软膏剂、 喜果苷软膏剂对紫外线照射攻击模型豚鼠皮肤Tyr、 MDA水平升高以及SOD水平降低有一定 的改善作用。结果见下表。 0086 表 5 对豚鼠实验性色素沉着皮肤 Tyr、 SOD、 MDA 含量的影响 0087 0088 p 0.01 vs 正常 ；*p 0.05，*p 0.01 vs 模型 0089 4、 讨论 0090 本试验用异长春花苷内酰胺软膏剂、 喜果苷软膏剂。

38、进行给药干预， 结果显示二者 能减少黑色素细胞数， 并使色素沉着区黑色素细胞颜色变淡、 面积变小， 证明其有防治黑色 素沉积的作用。 这为异长春花苷内酰胺、 喜果苷应用于防治色素沉着， 防治雀斑、 黄褐斑、 蝴 说 明 书 CN 103585167 A 10 9/12 页 11 蝶斑、 神经皮肤黑变病等提供了依据。 0091 实施例 3 ： 长春花苷内酰胺治疗黄褐斑临床观察 0092 1 临床资料和方法 0093 1.1 一般资料 ： 124 例自愿者， 均为女性。依据中国中西医结合学会皮肤性病专业 委员色素病学组制定的 黄褐斑的临床诊断和疗效制定标准 入选。采用随机、 平行、 对照 实验分组。

39、， 治疗组 67 例， 对照组 57 例。 0094 治 疗 组 ： 年 龄 25 49 岁，平 均 (38.255.23) 岁，病 程 3 15 年，平 均 (6.454.21) 年， 色斑面积积分 2.560.38， 色素程度积分 2.340.48 ； 0095 对 照 组 ： 年 龄 25 48 岁，平 均 (37.345.34) 岁，病 程 3 16 年，平 均 (6.384.25) 年， 色斑面积积分 2.640.75， 色素程度积分 2.340.69。 0096 两组一般构成比较， 资料具有可比性。 0097 1.2 治疗方法 ： 0098 治疗组 ： 异长春花苷内酰胺和化妆品中常。

40、用的助剂进行搭配， 制成 10的软膏剂 ( 异长春花苷内酰胺占软膏体总质量的 10 )， 外用， 2 次 / 天， 按摩面部 ； 0099 对照组 ： 维A酸乳膏(重庆华邦制药股份有限公司， 规格0.025)， 每天晚上外用 1 次， 按摩面部。4 6 周为一个疗程。 0100 1.3 判定标准 ： 0101 基本治愈 ： 肉眼视色斑面积消退大于 90， 颜色基本消失， 评分法计算治疗后下 降指数 0.8 ； 0102 显效 ： 肉眼视色斑面积消退大于 60， 颜色明显变淡， 评分法计算治疗后下降指 数 0.5 ； 0103 好转 ： 肉眼视色斑面积消退大于 30， 颜色变淡， 评分法计算治疗。

41、后下降指数 0.3 ； 0104 无效 ： 肉眼视色斑面积消退 30， 颜色变化不明显， 评分法计算治疗后下降指 数 0.3。 0105 下降指数计算方法 ： ( 下降指数总积分 - 治疗后总积分 )/ 治疗前总积分， 皮损面 积以平方厘米为单位记录。评分方法积分标准见表 6。 0106 表 6 临床症状积分评分标准 0107 0108 1.4 统计学方法 ： 观察数据以 xs 表示， 计量资料采用 t 检验， 计数资料采用 2 检验。 0109 2 临床结果 0110 治疗组显效 36 例， 有效 26 例， 无效 5 例， 总有效率 92.5 ； 0111 对照组显效 19 例， 有效 2。

42、8 例， 无效 10 例。总有效率 82.46。 0112 两组有效率比较差异有显著性 (P 0.01)。 说 明 书 CN 103585167 A 11 10/12 页 12 0113 两组治疗前后临床症状积分变化比较情况， 详见表7。 两组有效率比较差异有显著 性 (#P 0.05)。 0114 表 7 两组治疗前后症状积分值变化 0115 0116 t 检验 ： #P 0.05， *P 0.01， 与治疗前比较 ； #P 0.05， 与对照组比较 0117 实施例 4 ： 喜果苷治疗黄褐斑临床观察 0118 1 临床资料和方法 0119 1.1一般资料 ： 98例自愿者， 均为女性。 依。

43、据中国中西医结合学会皮肤性病专业委 员色素病学组制定的 黄褐斑的临床诊断和疗效制定标准 入选。采用随机、 平行、 对照实 验分组， 治疗组 50 例， 对照组 48 例。 0120 治 疗 组 ： 年 龄 26 50 岁，平 均 (37.235.46) 岁，病 程 3 16 年，平 均 (6.564.45) 年， 色斑面积积分 2.780.56， 色素程度积分 2.140.41 ； 0121 对 照 组 ： 年 龄 27 49 岁，平 均 (36.346.12) 岁，病 程 2 16 年，平 均 (6.344.61) 年， 色斑面积积分 2.340.35， 色素程度积分 2.540.62。 0。

44、122 两组一般构成比较， 资料具有可比性。 0123 1.2 治疗方法 ： 0124 治疗组 ： 喜果苷和化妆品中常用的助剂进行搭配， 制成 10的软膏剂 ( 异长春花 苷内酰胺占软膏体总质量的 10 )， 外用， 2 次 / 天， 按摩面部 ； 0125 对照组 ： 维A酸乳膏(重庆华邦制药股份有限公司， 规格0.025)， 每天晚上外用 1 次， 按摩面部。4 6 周为一个疗程。 0126 1.3 判定标准 ： 0127 基本治愈 ： 肉眼视色斑面积消退大于 90， 颜色基本消失， 评分法计算治疗后下 降指数 0.8 ； 0128 显效 ： 肉眼视色斑面积消退大于 60， 颜色明显变淡，。

45、 评分法计算治疗后下降指 数 0.5 ； 0129 好转 ： 肉眼视色斑面积消退大于 30， 颜色变淡， 评分法计算治疗后下降指数 0.3 ； 0130 无效 ： 肉眼视色斑面积消退 30， 颜色变化不明显， 评分法计算治疗后下降指 数 0.3。 0131 下降指数计算方法 ： ( 下降指数总积分 - 治疗后总积分 )/ 治疗前总积分， 皮损面 积以平方厘米为单位记录。评分方法积分标准见表 8。 0132 表 8 临床症状积分评分标准 0133 说 明 书 CN 103585167 A 12 11/12 页 13 0134 1.4 统计学方法 ： 观察数据以 xs 表示， 计量资料采用 t 检。

46、验， 计数资料采用 2 检验。 0135 2 临床结果 0136 治疗组显效 32 例， 有效 15 例， 无效 3 例， 总有效率 94.0 ； 0137 对照组显效 15 例， 有效 24 例， 无效 9 例。总有效率 81.25。 0138 两组有效率比较差异有显著性 (P 0.01)。 0139 两组治疗前后临床症状积分变化比较情况， 详见表9。 两组有效率比较差异有显著 性 (#P 0.05)。 0140 表 9 两组治疗前后症状积分值变化 0141 0142 t 检验 ： #P 0.05， *P 0.01， 与治疗前比较 ； #P 0.05， 与对照组比较 0143 实施例 5 ：。

47、 异长春花苷内酰胺及喜果苷吸收紫外线的试验研究 0144 将异长春花苷内酰胺及喜果苷分别配制成浓度为 1mg/ml 的水溶液各 5 份 (5ml/ 份)， 在365nm紫外灯下依次照射5min、 10min、 30min、 60min、 120min， 结果发现 ： 在365nm紫 外灯下， 异长春花苷内酰胺和喜果苷水溶液均呈现淡蓝色荧光， 随着照射时间的延长， 异长 春花苷内酰胺和喜果苷的黄色水溶液 ( 自然光下 ) 逐渐变淡， 120min 时已退为无色。说明 异长春花苷内酰胺和喜果苷能够吸收紫外线， 转化为荧光， 具有较强的抗紫外线作用。 0145 实施例 6 ： 异长春花苷内酰胺及喜果。

48、苷对 B-16 细胞内酪氨酸酶活性抑制的研究 0146 对 B-16 黑色素瘤细胞株生长的影响 ： B-16 黑色素瘤细胞株生长至近融合状态， 胰 蛋白酶消化， 用含小牛血清的 RPMI 1640 培养液传代， CO2培养箱培养。初始接种细胞浓度 约 5000 个 /cm2。接种 24h 后， 用添加受试剂的新鲜培养基换液 1 次 ( 各设 5 个浓度组 )。 孵育 72h 计数活细胞数后进行酪氨酸酶活性测定。 0147 酪氨酸酶活性的测定 ： 各组细胞胰蛋白酶消化离心后用 PBS 缓冲液清洗两次， 将 沉淀细胞吹打记数， 备用。取备用细胞加 PBS 缓冲液， 调节细胞密度， 各吸取 1ml 细胞悬液 分别置于 3 个平行管中， 离心后弃去上清液， 加入 0.5脱氧胆酸钠溶液， 并充分振摇使细 胞溶解， 制备含有活性酪氨酸酶的细胞裂解物。将试管置于 0 1。