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1、(10)申请公布号 CN 102512439 A (43)申请公布日 2012.06.27 CN 102512439 A *CN102512439A* (21)申请号 201110333015.6 (22)申请日 2011.10.28 A61K 31/716(2006.01) A61K 31/702(2006.01) A61K 31/7016(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 焦丽丽 地址 130117 吉林省长春市净月经济开发区 博硕路 1035 号 (72)发明人 焦丽丽 (54) 发明名称 人参寡糖组合物及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明公。
2、开了一种人参寡糖组合物及其制备 方法和应用。所述人参寡糖组合物中所含寡糖的 单糖组成为葡萄糖， 并且所含寡糖的分子量分布 在 360-2000 的范围内。所述人参寡糖组合物的 制备方法包括以下步骤 ： a. 将干燥的人参粉碎 ； b. 用蒸馏水于 70条件下提取， 在相同条件下重 复 3 次， 合并三次提取液， 减压浓缩， 冷冻干燥 ； c. 将 b 骤步冷冻干燥后粉末中加入 95乙醇浸 泡， 离心， 残渣重复上述操作， 常温下挥干乙醇， 得 到残渣 ； d.将c步骤得到残渣复溶于蒸馏水， 用截 留分子量 3000 的膜透析， 冷冻干燥得到人参寡糖 组合物。本发明所述人参寡糖组合物在体外对小 。
3、鼠淋巴细胞和巨噬细胞有良好的免疫激活作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 1/2 页 2 1. 一种人参寡糖组合物， 其特征在于， 所含寡糖的单糖组成为葡萄糖， 并且所含寡糖的 分子量分布在 360-2000 的范围内。 2. 根据权利要求 1 所述的人参寡糖组合物， 其特征在于， 所述寡糖组合物中包括结构 式如下的寡糖， 3.制备权利要求1或2所述的人参寡糖组合物的方法， 其特征在于， 该方法包括下述步 骤 ： A 将人参粉碎， 得人参粉末 ； 权 利 要 求 书 C。
4、N 102512439 A 2 2/2 页 3 B 对所述人参粉末进行水提取， 然后过滤， 得滤液 ； C 将所述滤液进行离心， 取上清液进行冷冻干燥， 得干燥粉末 ； D 向所述干燥粉末中加入 95乙醇， 然后离心， 得残渣 ； E 将所述残渣溶于水中， 通过透析或膜过滤， 得所述人参寡糖组合物。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 B 如下进行 ： 首先将所述人参粉末加入到重量是其 8-15 倍的水中浸泡 1-2 小时， 然后在 50-70下 提取 60-120 分钟。 5. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 D 如下进行 ： 向所述干燥粉末。
5、中加入体积是其 3-5 倍的 95乙醇浸泡 15-30 分钟后离心， 得到所述 残渣 ； 并将得到的所述残渣重复该操作 5-8 次， 然后在常温下将所述残渣挥干乙醇。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤E中的所述透析或膜过滤的截留分子 量小于等于 3000。 7. 权利要求 1 所述的人参寡糖组合物在制备具有免疫刺激活性的药物中的应用。 8. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 所述免疫刺激活性为促进淋巴细胞增殖。 9. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 所述免疫刺激活性为增强巨噬细胞的吞 噬功能， 并促进巨噬细胞对一氧化氮、 肿瘤坏死因子 - 和活性氧的。
6、分泌。 权 利 要 求 书 CN 102512439 A 3 1/6 页 4 人参寡糖组合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种人参寡糖组合物及其制备方法和应用， 所述人参寡糖组合物具有 免疫激活作用。 背景技术 0002 人参是五加科植物人参 (Panax ginseng C.A.Meyer) 的干燥根， 自古以来被认为 是医食同补的尚佳药用植物。具有大补元气， 固脱生津， 安神的作用。大量研究表明人参水 提物具有良好的免疫调节活性， 能诱导淋巴细胞增殖及 T 淋巴细胞活性。人参水提物中除 含有多糖、 皂苷、 蛋白质之外， 还含有一定量的人参寡糖。 0003 寡糖一般是指由。
7、 2-10 个单糖分子通过糖苷键连接而成的化合物， 在生命体内， 主 要以糖蛋白、 糖脂和糖肽等形式参与生命活动， 在发挥生物学功能的过程中起决定作用。 随 着对天然寡糖研究的日益深入， 它的独特性也逐渐展现在人们面前。天然寡糖不仅具有抗 炎症、 抗凝血、 促新血管生成、 抗病毒、 免疫调节等生物活性， 而且安全无毒。 另外， 寡糖具有 相对较小的分子量， 这将更有利于对其结构的精确测定， 同时有利于对寡糖生物活性以及 其构效关系的研究。 因此， 天然寡糖的研究及其在保健食品、 医药领域的应用已逐渐成为结 构化学、 分子生物学、 医学和食品学新兴研究领域。 发明内容 0004 本发明的目的在于。
8、提供一种具有免疫刺激活性的人参寡糖组合物及其制备方法 和应用。 0005 首先， 本发明提供一种人参寡糖组合物， 该寡糖组合物中所含寡糖的单糖组成为 葡萄糖， 并且所含寡糖的分子量分布在 360-2000 的范围内。 0006 并且， 在本发明的人参寡糖组合物中包括结构式如下的寡糖， 0007 说 明 书 CN 102512439 A 4 2/6 页 5 0008 本发明还提供制备上述人参寡糖组合物的方法， 该方法包括下述步骤 ： 0009 A 将人参粉碎， 得人参粉末 ； 0010 B 对所述人参粉末进行水提取， 然后过滤， 得滤液 ； 0011 C 将所述滤液进行离心， 取上清液进行冷冻干。
9、燥， 得干燥粉末 ； 0012 D 向所述干燥粉末中加入 95乙醇， 然后离心， 得残渣 ； 0013 E 将所述残渣溶于水中， 通过透析或膜过滤， 得所述人参寡糖组合物。 0014 优选在上述步骤 B 中， 首先将所述人参粉末加入到重量是其 8-15 倍的水中， 浸泡 1-2 小时， 然后在 50-70下提取 60-120 分钟。 0015 优选在上述步骤 D 中， 向所述干燥粉末中加入体积是其 3-5 倍的 95乙醇， 浸泡 说 明 书 CN 102512439 A 5 3/6 页 6 15-30 分钟后离心， 得到所述残渣， 并向得到的所述残渣中加入体积是其 3-5 倍的 95乙 醇， 。
10、浸泡 15-30 分钟后离心， 重复该操作 5-8 次， 然后在常温下将所述残渣挥干乙醇。 0016 优选在上述步骤 E 中， 所述透析或膜过滤的截留分子量小于等于 3000。透析液浓 缩、 冷冻干燥得人参寡糖组合物。 0017 本发明还提供人参寡糖组合物在制备具有免疫刺激活性的药物中的应用。 0018 所述免疫刺激活性可以为促进淋巴细胞增殖。 0019 所述免疫刺激活性还可以为增强巨噬细胞的吞噬功能， 并促进巨噬细胞对一氧化 氮 (NO)、 肿瘤坏死因子 -(TNF-) 和活性氧 (ROS) 的分泌。 0020 本发明提取的人参寡糖组合物能促进淋巴细胞增殖， 并对巨噬细胞有激活作用， 因此具。
11、有免疫激活作用。 具体实施方式 0021 下面基于具体实施例说明本发明的人参寡糖组合物及其制备方法， 但本发明并不 限于所列举的实施例。 0022 需要说明的是， 本发明中使用的仪器为 ： Aglient RRLC 1200SL 液相色谱仪， Applied Biosystems公司的Voyager-DE STR MALDI TOF质谱仪 ； Thermo的LTQ XL线性离 子阱色谱仪 ； Bruker 公司的 Vertex 7.0 红外光谱仪。 0023 实施例 1 0024 称取人参 1000 克， 粉碎至 40-60 目， 用 15 升蒸馏水浸泡 1.5 小时后在 70下提 取 90 。
12、分钟。然后用 5 层纱布过滤。过滤得到的残渣在相同条件下重复提取两次。合并三 次提取所得滤液， 以 4000 转 / 分钟离心 10 分钟， 收集上清液， 所得上清液利用旋转蒸发仪 在 60下蒸发至 100mL， 冷冻干燥， 得到干燥粉末 (521.3 克 )。 0025 称取上述干燥粉末 100 克， 向其中加入约 500mL 的 95乙醇， 浸泡 20 分钟， 离心， 弃去上清。向离心得到的残渣中再次加入约 500mL 的 95乙醇， 浸泡 20 分钟， 离心， 得残 渣。将该操作重复 8 次， 然后在常温下挥干乙醇， 得干燥残渣。 0026 将上述干燥残渣溶解于蒸馏水中， 固液比为 1 。
13、5(w/w)。利用截留分子量为 3000 的膜对溶解液进行透析， 透析 96 小时。收集透析外液， 于 60下减压浓缩， 并冷冻干燥， 得 人参寡糖组合物。 0027 本发明得到的人参寡糖组合物经完全酸水解， 利用 HPLC 在下述测定条件下进行 分析， 得一个洗脱峰， 洗脱时间为 24.055 分钟， 由此可知， 该人参寡糖组合物中所含寡糖由 葡萄糖组成。 0028 HPLC 测定条件如下 ： 0029 色谱柱 ： DIKMA Inertsil ODS-3(4.6mm150mm) 0030 检测器 ： UV-VIS DAD 0031 检测波长 ： 245nm 0032 流动相 ： PBS(0。
14、.1M， pH 7.0) 乙腈 82 18(v/v)， pH 7.0 0033 流速 ： 1.0mL/min 0034 进样量 ： 20L 0035 MALDI-MS 分析图谱中出现的质荷比 (m/z) 分别为 ： 365， 527， 689， 851， 1013， 说 明 书 CN 102512439 A 6 4/6 页 7 1175， 1337， 1499， 1661， 1823， 1985。结果表明， 所述该人参寡糖组合物的分子量分布范围 360-2000， 聚合度为 2-12。 0036 取干燥的人参寡糖组合物， 以 KBr 压片， 在 4000 400cm-1的范围内进行红外光 谱扫。
15、描， 记录红外光谱图数据如下 ： 在 3600 3200cm-1处为羟基 O-H 伸缩振动吸收峰， 在 30002800cm-1处显示甲基或次甲基的C-H伸缩振动吸收峰， 在16651635cm-1处显示水 化物羟基的弯曲振动吸收峰。1800 700cm-1区域则能反映出不同糖类物质所具有的糖种 类、 取代基和差向异构等特征。其中 1500 1200cm-1显示 C-H 变形振动， 在 1150 1060cm 围 -1处显示C-O-C的伸缩振动吸收峰。 960930cm-1处显示糖类分子振动峰， 930900cm-1 处显示吡喃环的非对称环伸缩振动峰， 785 755cm-1处显示吡喃环的对称。
16、环伸缩振动峰， 973961cm-1处显示脱氧糖次甲基的横摇振动， 915876cm-1处显示吡喃糖-端基差向 异构的 C-H 变角振动， 855 810cm-1处显示吡喃糖 - 端基差向异构的 C-H 变角振动。 0037 取人参寡糖组合物 200 毫克， 溶于 0.1mL 蒸馏水中， 10000rpm 离心 5min， 取上清 液上样于 Bio-gel P-2 凝胶层析制备柱 (3.090cm)， 洗脱液为蒸馏水， 流速 0.4mL/ 分钟， 每管收集 12mL， 苯酚 - 硫酸法跟踪监测， 分别收集适当的洗脱峰， 得到 4 个级份， 分别是 ： WGOS-1、 WGOS-2、 WGOS-。
17、3、 WGOS-4。 0038 WGOS-1 的一级全扫描谱图中丰度最高的是 m/z 365， 结合前面 HPLC 对单糖残基 分析的结果， 可以确定是葡二糖。其二级串联质谱图分析得 Glc2+Na+ 离子 (m/z 365)， 经碰撞诱导解离产生 Y1(m/z 203)、 B1(m/z 185)、 0， 2A 2(m/z 305)、 0， 3A 2(m/z 275)、 0， 4A 2(m/ z 245) 离子。其中 0， 2A 2(m/z 305)、 0， 3A 2(m/z275)、 0， 4A 2(m/z 245) 分别来自于母离子丢失 C2H4O2(-60Da)、 C3H6O3(-90D。
18、a)、 C4H8O4(-120Da)所产生， 可以判断WGOS-1是异麦芽糖。 WGOS-2 的一级全扫描谱图中丰度最高的是 m/z 527， 说明 WGOS-2 中主要含有葡三糖。其二级串联 质谱如图中主要的碎片离子是 Y 离子和 B 离子。0， 2A3(m/z 467) 和 2， 4A 3(m/z 407) 说明靠 近还原端的糖苷键是 1 4 类型 ； 而 0， 2A 2(m/z 305)、 0， 3A 2(m/z 275)、 0， 4A 2(m/z 245) 的存在 说明靠近非还原端的糖苷键是 1 6 类型。WGOS-3 的一级全扫描图谱中丰度最高的是 m/z 689， 说明 WGOS-。
19、3 中主要含有葡四糖。对其串联质谱分析， Glc4+Na+(m/z 689) 的母离子 依次丢失 1， 2， 3 个糖单元， 分别得到三个 Y 型子离子 Glc3+Na+(m/z 527)、 Glc2+Na+(m/ z365)、 Glc+Na+(m/z 203)， 说明 WGOS-3 是直链结构。0， 2A4(m/z 629) 和 2， 4A 4(m/z 569) 的存在说明靠近还原端的第一个糖苷键是 1 4 ； 0， 2A(m/z 467、 305)、0， 3A(m/z 437、 275)、0， 4A(m/z 407、 245) 表明另外两个糖苷键均为 1 6 类型。WGOS-4 一级全扫描。
20、图谱中主要存 在 m/z 851， 1013， 1175， 1337， 1499， 1661， 1823， 1985， 说明 WGOS-4 中含有聚合度为 5-12 的 8 种聚合度的葡寡糖， 对其串联质谱分析得出相似的谱图， 均只产生 0， 2A 系列的离子和2， 4A 系列的离子， 而不产生 0， 3A 系列的离子， 这说明 WGOS-4 中的糖苷键均为 1 4 类型。另外， 连续的 Y 离子和 B 离子说明这些寡糖没有分支， 都是直链结构。 0039 药效试验 0040 利用实施例 1 制备得到的人参寡糖组合物进行免疫活性实验 0041 1、 人参寡糖组合物刺激小鼠淋巴细胞转化实验 00。
21、42 脾细胞悬液的制备 ： ICR 雄性小鼠 (202g) 断颈处死后， 无菌条件下解剖小鼠取 脾 ； 用剪刀剔除结缔组织和脂肪并剪碎脾脏后， 加 3mL RPMI1640 培养液用匀浆器研磨脾 组织制成脾细胞液， 用纱布过滤， 吸取 D-Hanks 液冲洗纱布。悬液收集到无菌离心管内， 说 明 书 CN 102512439 A 7 5/6 页 8 1500rpm， 离心5min， 弃上清液， 向离心管内加入0.01mol/L的Tris-NH4Cl低渗液， 以裂解红 细胞 1min， 离心， 再用 D-Hanks 液洗涤细胞两次， 用 1640 培养液将细胞稀释成 2106个 / mL， 制成。
22、单细胞悬液。 0043 将上述细胞悬液加入 96 孔细胞培养板中， 每孔 100L。将人参寡糖组合物以 1， 10， 50， 100， 200g/mL的浓度加入96孔板中， 每孔10L， 用完全培养基将每孔补至200uL， 并设空白对照和 ConA(5g/mL) 对照孔， 及 LPS(10g/mL) 对照孔。混匀后放入 37培养 箱中培养 72 小时， 培养结束前 4 小时， 每孔加入 MTT 液 (5mg/mL)20L， 培养结束时每孔吸 去上清， 加入二甲基亚砜 150L， 用酶标仪检测 570nm 处 OD 值 (A570)， 每组实验点设 3 个复 孔。 0044 表 1 人参寡糖组合。
23、物对小鼠淋巴细胞增殖影响 0045 0046 注 ： 与对照组比较 ： *p 0.05，*p 0.01 ； 0047 与 ConA 组比较 ： p 0.01 ； 0048 与 LPS 组比较 ： 0049 由表1可知， 人参寡糖组合物在10-200g/mL浓度范围内单独作用于小鼠淋巴细 胞时， 能不同程度地促进淋巴细胞增殖。并能促进 ConA 诱导的 T 淋巴细胞与 LPS 诱导的 B 淋巴细胞的增殖。 0050 2、 人参寡糖组合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞实验 0051 (1) 人参寡糖组合物刺激腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验 ： 0052 腹腔巨噬细胞制备 ： ICR 雄性小鼠 (202g) 连续。
24、三天注射 6可溶性淀粉 2mL 后 处死。D-Hanks(10mL) 清洗腹腔， 将腹腔中液体收集入离心管中， 4离心 (1000rpm/min， 10min)， 弃上清， 用1640完全培养基重悬细胞。 调整细胞浓度为2106个/mL， 每孔100L 加入96孔板中。 在二氧化碳培养箱中(CO2： 5CO2、 37)预孵3h后， 用37预温的PBS(PH 7.4) 洗 2-3 遍， 去除未贴壁细胞， 即获得纯化的巨噬细胞。 0053 巨噬细胞吞噬中性红 ： 巨噬细胞经过纯化后， 加入浓度为 1， 10， 50， 100， 200g/ mL 人参寡糖组合物 (100L/ 孔 )， 继续培养 2。
25、4h， 吸去上清， 每孔加入 100L， 浓度为 0.075中性红溶液， 继续培养 1h， 用 PBS(PH 7.4) 洗去剩余的中性红后， 加入 100L 的 细胞裂解液 ( 乙醇乙酸 1 1， v/v)， 裂解 24h， 用酶标仪检测， 波长为 550nm。 0054 (2) 人参寡糖组合物刺激腹腔巨噬细胞分泌 NO 实验 ： 0055 按照上述方法制备纯化的腹腔巨噬细胞， 并用 1， 10， 50， 100， 200g/mL(200l/ 说 明 书 CN 102512439 A 8 6/6 页 9 孔 ) 人参寡糖组合物刺激巨噬细胞 24 小时后， 获得巨噬细胞培养液上清。吸取 100L。
26、 细 胞培养液上清加入另一 96 孔培养板中， 并加入等体积的 Griess 试剂， 10min 后用酶标仪检 测， 检测波长为 540nm， 并根据所绘制的 NaNO2溶液标准曲线计算出不同浓度样品刺激巨噬 细胞后 NO 的产量。 0056 (3) 人参寡糖组合物刺激腹腔巨噬细胞分泌 TNF- 实验 ： 0057 按照上述方法制备纯化的腹腔巨噬细胞， 并用 1， 10， 50， 100， 200g/mL(200l/ 孔 ) 人参寡糖组合物刺激巨噬细胞 24 小时后， 获得巨噬细胞培养液上清。将 L929 细胞以 3106个 /mL 的浓度加入 96 孔板中， 200l/ 孔。待细胞贴壁后， 。
27、弃去细胞培养液， 加入上 述所得巨噬细胞培养液上清 (100l/ 孔 )， 继续培养 18 小时。培养结束后， 用 PBS 冲洗细 胞2遍， 每孔加入MTT液(5mg/mL， 20L)， 培养结束后吸去上清， 每孔加入150L二甲基亚 砜， 用酶标仪检测 570nm 处 OD 值， 每实验点设 3 个复孔。计算 L929 细胞活力， 其细胞活力 间接反映了 TNF- 水平。 0058 细胞毒性 ( ) ( 阴性对照 OD 值 - 样品 OD 值 )/ 阴性对照 OD 值 100 0059 以细胞毒 50为一个活性单位 0060 (4) 人参寡糖组合物刺激腹腔巨噬细胞分泌 ROS 实验 ： 00。
28、61 采用 DCFH-DA 作为指示细胞内 ROS 水平的荧光探针， 研究人参寡糖组合物对小鼠 巨噬细胞 ROS 释放量的影响。DCFH-DA 本身不发荧光， 脂溶性 DCFH-DA 进入细胞后， 被细胞 内的 ROS 氧化后发出荧光， 从而指示细胞内的 ROS 水平。按照上述方法制备纯化的腹腔巨 噬细胞， 用 1， 10， 50， 100， 200g/mL 人参寡糖组合物刺激巨噬细胞， 200l/ 孔， 作用 24 小 时后， 弃去细胞培养液上清。每孔加入含有 DCFH-DA(10mol/L) 探针的无血清 RPMI1640 培养液继续培养 30min。弃去上清， 用 PBS 洗去未进入细胞的探针， 每孔中再加入 200L PBS， 在酶标仪上读取荧光值 ( 激发波长 488nm， 发射波长 525nm)。 0062 表 2. 人参寡糖组合物对巨噬细胞激活作用实验 0063 0064 * 表示实验组与阴性对照组相比 p 0.01 0065 结果如表 2 所示， 人参寡糖组合物在 1-200g/mL 能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞 的吞噬功能， 增加 NO、 TNF- 和 ROS 的分泌水平， 并存在量效关系， 当作用浓度为 50g/mL 时， 作用最显著。提示人参寡糖组合物对巨噬细胞有显著的免疫刺激活性。 说 明 书 CN 102512439 A 9 。