由 Burkholderia contaminans 菌株产生的独特的抗真菌 糖肽 Occidiofungin 相关申请的交叉参考
本申请要求 2009 年 5 月 26 日提交的美国临时专利申请 No.61/217,026 的优先权， 该申请全文以引用方式并入于此。
政府资助声明
本发明是在 USDA 州合作研究、 教育和推广服务部给予的 0204332 政府资助下完成 的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域 本发明涉及抗菌化合物及其在预防或治疗真菌性感染或疾病的治疗应用的领域。 本发明涉及新型抗真菌化合物作为药用和农用杀真菌剂在动物和植物中的应用。 本发明还 涉及产生该新型抗真菌化合物的菌株。
背景技术 本发明提供用于预防或治疗真菌性感染的新型抗真菌糖肽类化合物以及与其相 关的至少一个新型氨基酸残基。本发明在优选实施方案中还提供了药用和农用组合物， 其 包括用于治疗或预防真菌性感染的该新型化合物及其盐。
考虑到病原体对当前抗真菌剂的抗性普遍增强， 新型抗真菌剂的需求在不断增 长。当前有四种主要的抗真菌剂治疗组 ： 多烯抗真菌剂、 唑类抗真菌剂、 烯丙胺类抗真菌 剂和棘白菌素类 (echinocandins)。前三组主要靶向麦角固醇产物或与麦角固醇结合， 破坏真菌的膜。麦角固醇与哺乳动物细胞中发现的胆固醇很像， 对于维持细胞适宜的渗 透性和流动性十分重要。第四组棘白菌素类是合成 - 修饰的脂肽， 源自产生于构巢曲霉 (Aspergillus nidulans) 的天然化合物棘白菌素 B(echinocandin B)。在真菌中， 两个共 价交联的多糖 (1， 3)-β- 葡聚糖和几丁质 (chitin) 形成负责细胞壁结构完整性和形状的 主要构架。抗真菌剂的棘白菌素类抑制 (1， 3)-β- 葡聚糖合成酶， 该酶为使尿苷二磷酸葡 葡糖聚合为 (1， 3)-β- 葡聚糖聚合物的酶复合物。
伯克霍尔德菌属 (Burkholderia) 一些菌株的显著特点是产生各种抗真菌化合 物， 使该有机体具有用于真菌性疾病控制的潜力。 然而， 从胆囊纤维症患者分离的伯克霍尔 德菌 (Burkholderia spp.) 被重新分类为机会性病原体， 因此妨碍该细菌直接用于真菌性 疾病控制。 对作为所观察伯克霍尔德菌株的植物疾病抑制活性来源的抗真菌剂的分离和鉴 别， 将为开发生物杀真菌剂提供重要的途径， 而且消除了直接使用细菌带来的潜在健康风 险。由于免疫功能不全患者的真菌性感染的重要性， 以及现有可获得抗真菌剂因其活性谱 和毒性的限制， 因此需要新型抗真菌剂。 而且， 新的抗真菌剂对于充足且可负担的食物供给 的生产和食品保存有重要的意义。本发明中， 我们对命名为 occidiofungin， 含义为真菌杀 手的新型抗真菌化合物的结构和活性进行了表征。 该抗真菌剂的完全共价结构已被 TOCSY、 NOESY、 ROESY 和 HSQC， 2D NMR 光谱实验阐明。Occidiofungin 对不同动物和真菌病原体的
抗真菌活性已被检测并证实。此外， 暴露于亚致死浓度的 Occidiofungin 后观察到发生了 膜形态畸变， 类似于已有报道的棘白菌素类抗真菌剂， 这表明 Occidiofungin 也靶向细胞 外被膜。这项工作为旨在理解该化合物的作用模式以及研究 Occidiofungin 的药学和农学 潜能的今后实验提供了重要基础。
结果， 杀真菌剂领域存在对有效对抗对典型杀真菌剂具有抗性的动物和植物病原 体的新型抗真菌化合物的需求， 本发明提供了这样的化合物和组合物。
发明概述
本发明提供一种名称为 Occidiofungin 的新型抗真菌环状糖肽化合物， 其上连接 新的氨基酸， 还提供一种包含该化合物的组合物。 本发明能有效地对抗广谱的影响人、 动物 和植物的真菌性病原体。而且， 本发明能破坏正常真菌的膜形态。本发明还提供一种产生 该新型抗真菌化合物的新菌株。
本发明是从 Burkholderia contaminans 菌株中纯化得到， 并包含八 (8) 个氨基酸 残基。一个氨基酸上连接酰基和木糖。一种抗真菌组合物， 其包括该新型化合物及其盐和 至少一种可接受的载体或稀释剂用于目标施用。一种治疗真菌性感染或疾病的方法， 其包 括： 在消除或减轻感染的条件下， 向目标施用所述化合物和组合物一段时间。
本发明前述提及的和其他目的、 特征和优点将在下文阐明， 可以通过参考下面对 本发明优选实施方案的详细描述和所附的权利要求更好地理解本发明的性质。 附图说明 这些附图以及对本发明的详述用于进一步解释本发明及其优点。 附图被组合在一 起并形成说明书的一部分， 来说明本发明某些优选的实施方案， 而且， 与整个说明书一起， 用于向本领域技术人员解释本发明优选实施方案。
图 1 是 occidiofungin 的共价结构的说明。A 图中显示了 occidiofungin A 和 occidiofungin B 的代表性结构。B 图中显示了新型氨基酸 NAA2 的代表性结构。在它们各 自的原子旁边给出了化学位移值 (ppm)。NOE 值写在环的旁边， 箭头表示质子的相互作用。
图 2 是木糖标准品 (A) 和 occidiofungin(B) 的聚糖 (glycan) 的 GC 色谱的图解 ； 两个样品都加了内标。木糖标准品显示两个峰 (Xyl1 和 Xyl2) ； 基于两个峰有同样的迁移 时间， occidiofungin 聚糖被鉴定为木糖。
图 3 是 occidiofungin 的 TOCSY 和 NOESY NMR 谱图的图解。A 图中， TOCSY 2D NMR 谱的放大图显示了 occidiofungin A( 黑色 ) 和 occidiofungin B( 灰色 ) 中每个指定残基 的 α 酰胺和侧链自旋体系酰胺。B 图中， NOESY 2D NMR 谱的放大图显示了 occidiofungin 中的短酰基和木糖的化学位移。酰基碳 2 和 3 中的质子与 NAA 的 Hε 质子的 NOE 谱 ( 灰色 ) 用箭头标示区分。
图 4 是 occidiofungin 的 NOES YNMR 谱 的 图 解。 放 大 图 显 示 了 α 酰 胺 和 侧 链酰胺的相互作用。各自的氨基酸的相互作用在残基间 NOE 谱图上用红色标在旁边。 occidiofungin A 和 occidiofungin B 的残基分别用黑色和灰色标示。
图 5 是 occidiofungin 活性谱的表格和图注。 A 图中， 示出了针对几种植物和动物 病原体的 MIC 值。 MIC 和 MIC50 分别代表 100％的生长抑制和大于 50％的生长抑制。 B 图中， 显示了产脂肪酶菌 (Geotrichum candidum) 的生物测试板。A1 孔中的初始浓度是 32μg/
mL， C2 孔中的最终浓度是 62.5ng/mL。最后两个孔用作阴性对照 ( 无抗真菌化合物 )。A4 孔是 MIC50 的最佳代表， 其中超过了 50％的真菌生长被抑制。
图 6 是光学显微镜下的画面图示。A 图和 B 图中， 与对照 (B 图 ) 相比， 立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani) 在亚抑菌浓度 (A 图 ) 下的生长观察到明显的菌丝形态的变化。黑 色箭头指向的是细胞内的内含物形成， 白色箭头指向的是膜畸变。C 图和 D 图中， 产脂肪酶 菌暴露于 4μg/mL 的 occidiofungin 48 小时 (C 图 )， 与对照 (D 图 ) 相比， 其结果是细胞明 显肿胀。
图 7 是透射电镜的画面图示。 产脂肪酶菌暴露于 4μg/mL 的 occidiofungin 48 小 时 (B 图 )， 与对照 (A 图 ) 相比， 其结果是明显的形态变化。与对照相比， 细胞壁厚度大大减 小。经处理的产脂肪酶菌外细胞壁出现剥落 ( 黑色箭头 )。鉴于处理的样品内部缺少对照 物 ( 白色箭头 )， 这表明细胞溶解和细胞内容物流出。 C 图所示为含有暴露于 occidiofungin 中的几个分节孢子的较宽视野。图 A、 B 和 C 的放大倍数均为 8000 倍。
发明详述
本发明的新型抗真菌环状糖肽化合物能有效对抗广泛的真菌性感染。 本文公开了 该化合物的结构， 以及与其连接的至少一个新型氨基酸的结构。 在本发明另一个实施方案中， 一种抗真菌组合物， 其包括该新型化合物及其盐以 及至少一种药用或农用载体或稀释剂， 在需要真菌疗法和治疗时施用于人、 动物和 / 或植 物目标 (subject)。
在另一个实施方案中， 本发明提供了一种产生包括本发明所述抗真菌化合物的新 分离的菌株。
出于公开的目的， 各缩写词如下 ： NMR， 核磁共振 ； NOE， 核欧沃豪斯效应 ； NOESY， 二 维核欧沃豪斯效应谱 ； TOCSY， 全相关谱 ； ROESY， 旋转坐标系二维核欧沃豪斯效应谱 ； HSQC， 异核单量子相关谱 ； ESI-MS， 电喷雾离子化质谱 ； MS/MS， 串联质谱 ； GC， 气相色谱 - 质谱 ； NRPS， 非核糖体肽合成酶 ； NAA， 新型氨基酸 ； MIC， 最小抑菌浓度。
除非特别指明， 分子术语为其通常含义。术语 “酰基 (acyl) 定义为一个羰基自由 基接在烷基、 烯基、 炔基、 环烷基、 杂环基、 芳基或杂芳基上， 实例包括但不限于自由基如乙 酰基和苯酰基。词语 “治疗有效量” 定义为真菌与所述化合物或组合物接触， 足以导致杀真 菌效果的给药量。 药学上或农业上组合物的治疗有效量取决于含有该组合物的成分和组分 以及治疗理论。
本发明中， 菌株 Burkholderia contaminans MS 14 是从抑制草坪草褐斑病的土壤 中分离。该新型抗真菌化合物是从这种细菌的液体培养基中纯化而得。两种纯化的紧密相 关的抗真菌化合物的完全共价结构通过 TOCSY、 NOESY、 ROESY、 13C HSQC 2D NMR、 ESI-MS 和 GC 确定。纯化的制备产物的单一同位素质量分析表明存在两种相关的化合物， 测定的质量 为 1199.543Da 和 1215.518Da ； 该差异是由一个氧原的质量产生的。GC 分析表明该抗真菌 化合物连接一个木糖。NMR 实验表明该化合物是环状的， 包括八个氨基酸， 其中两个是 Tyr 和 Asn 的 β- 羟基衍生物， 一个是新型的氨基酸。该新型氨基酸作为构架连接木糖与短酰 基链。抗真菌活性的活性谱和浓度通过微量滴定盘检测进行确定。该抗真菌化合物对广泛 的真菌性植物和动物病原体及两种腐霉菌 (Pythium spp.) 具有强大的抗真菌活性。显微 镜观察表明该抗真菌化合物破坏了正常的膜形态。暴露于抗真菌化合物的亚抑菌浓度下，
真菌细胞充满了大量包涵体， 膜变为畸形并肿胀。 我们的数据支持新型抗真菌剂的认定， 该 化合物被命名为 occidiofungin， 意为真菌杀手。
Burkholderia contaminans 菌株 MS 14 是预先从抑病土壤中分离出来的， 该土壤 中土壤传播的病原体在对宿主植物的损害很少或没有。 对这种菌株的最初表征表明它抑制 广谱真菌病原体的生长。接下来， 转座子突变确证了产生抗真菌活性的基因组区域， 56-kb 基因 DNA 片断已测序并存储于 GenBank， 登录号为 EU938698。这个基因组区域包括几个开 放阅读框， 其中一些编码调节蛋白、 环状肽转运载体、 糖基转移酶、 转氨酶和非核糖体肽合 成酶 (NRPS) 催化模块。分离该抗真菌化合物， 氨基酸分析证实该抗真菌化合物的骨架是一 个通过 NRPS 机理合成的寡肽。
实验规程
所有的化学试剂均购自 Sigma(St.Louis， MO)， 且除非特别指出， 均是最高级别。 按 照前面所述的方法合成和纯化 Occidiofungin。
质 谱。 该 抗 真 菌 化 合 物 活 性 部 分 用 电 喷 雾 离 子 化 质 谱 (ESI-MS) 分 析， 使用 Micromass Q-TOF II 质谱仪。将该化合物溶于 50/50 的乙腈 / 水 (v/v) 的 0.1％甲酸溶液 中， 用 Harvard 注射泵以 1μL/min 流速注入该同样的溶剂。流体用纳米 LC 接口进行喷雾。 以单电荷离子用标准碰撞能 (34V) 及较高的碰撞能 (50V) 进行串联质谱 (MS/MS)。 单糖组分分析。纯化的 occidiofungin 中的单糖通过气液色谱分析确定为甲基 葡糖苷三氟醋酸酯 (trifiuoroacetate of methyl glycoside)。通过装配 25-m 熔融石英 ( 内径 0.22-mm)OV-1701WCOT 柱 (Chrompack， Bridgewater， NJ) 和电子捕获检测器的气相 色谱分析仪 (5890 型， Hewlett-Packard， Sacramento， CA) 进行分析。同时处理糖标准品 ( 戊糖、 己糖、 N- 乙酰氨基己糖 ) 作为测试化合物， 基于与糖标准品的色谱图进行比较， 确定 occidiofungin 中的糖。山梨醇为内标。
NMR 光谱。 Occidiofiingin 不溶于适于 NMR 测试所需浓度的水溶液。 因此， 在总体 积为 700μL 的 50％乙腈 -d3( 剑桥同分异构， Cambridge Isotopes) 和 50％水中制备 5mM Occidiofiingin 样品。NMR 数据由 Varian NMR 系统 Cold ProbeTM 分光仪采集， 在 800MHz 1 的质子频率下操作。按照 TOCSY 和 NOESY 仪器的标准方法指认 H 共振。ROESY 和 13C-HSQC 实验用于澄清 TOCSY 和 NOESY 光谱的模糊区。TOCSY、 NOESY 和 13C HSQC NMR 实验在 25℃下 采集， ROESY 实验于 4℃下采集。载波频率以水的共振为中心， 用极有效的双脉冲梯度选择 回波共振技术控制。扫描之间有 1.5s 的弛豫延迟。TOCSY 实验用 DIPSI-2 序列设定 60ms 的混合时间。NOESY 和 ROESY 实验分别设定 400ms 和 100ms 的混合时间。将采集 HSQC 谱 13 的参数优化， 以观察脂肪族 CH 基团 ( 转移延迟时间调整为 140Hz 耦合常数， C 补偿设置为 35ppm)。TOCSY、 NOESY 和 ROESY 的光谱扫描宽度在二维上均为 9000Hz(11.25ppm)。HSQC 的 光谱扫描宽度在质子维度上为 9000.0Hz(11.25ppm)、 碳维度上为 21,200.0Hz(105.5ppm)。 除了 HSQC 数据分别在直接和间接维度的 1024 和 192 复点采集外， 所有 2 维数据均在获得 维度的 8192 复点和间接维度上的 320 ～ 512 复点采集。NOESY、 ROESY 和 TOCSY 实验的相 位感应间接检测通过 States-TPPI 法完成。 利用梯度选择高灵敏度增强脉冲序列采集 HSQC 1 谱。 H 化学位移以乙腈 (1.93ppm) 为参比。 用 nmrPipe 软件处理数据， 首先通过去卷积减去 水残留信号， 乘以两个维度数据的余弦平方函数， 或者乘以 608 位移 ( 对于 HSQC 谱中的 1H 维度 ) 的余弦平方函数， 清零一次， 傅立叶变换， 基线修正。用交互式计算机程序 NMR View
处理数据。用 NMR View 测量 NOE 交叉峰强度。根据 rab6 ＝ rcal6(Vcal/Vab) ＞关联计算距离， 其中 rab 是原子 a 和 b 之间的距离， Vab 是 NOESY 谱中 a 到 b 交叉峰的体积， rcal 是已知距离， Vcal 是 NOESY 谱校准交叉峰的相应体积。用于校准的距离为 β- 羟基 Tyr4 Hδ 和 Hε 芳香 质子 微 生 物。 真 菌 菌 株 来 自 美 国 密 西 西 比 州 立 大 学 兽 医 学 研 究 诊 断 实 验 中 心 (Mississippi State University′ s Veterinary Medical Research and Diagnostic Laboratory System) 和昆虫和植物病理学系保藏处， 或购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection， Manassas， Va.)。 本研究所用的真菌分离体是互隔交 链孢霉 (Alternaria alternata)、 烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)、 黑曲霉 (Aspergillus niger.)、 番茄镰刀菌萎焉病菌 (Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)ATCC9848、 白地 霉 (Geotrichum candidum)F-260、 桑树内生真菌 (Macrophomina phaseolina)61、 石膏样 小孢子菌 (Microsporum gypseum)、 青霉菌 (Penicillium sp)、 立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)MSCOT-1 和 须 发 癣 菌 (Trichophyton mentagrophytes)。 而 且， 对两种腐霉 属的菌株也进行了试验 ： 刺 腐 霉 (Pythium spinosum)472-04 和 终 极 腐 霉 (Pythium ultimum)671-04。
抗真菌敏感性试验。 最小抑菌浓度通过微量琼脂稀释法确定。 Occidiofungin 被无 菌水连续两倍稀释 (32μg/mL 至 62.5ng/mL)， 加入至平底的 12 孔板。每个孔注入一个 (1) mL 沙保罗氏 (Sabouraud) 葡萄糖琼脂培养基 DifcoTM(BD Diagnostics， Franklin Lakes， NJ)。 当琼脂凝固后， 平板倒置于 4℃下保存待用。 真菌培养物生长于 100×15mm 沙保罗氏葡 萄糖琼脂板 (Thermo Fisher Scientific Remel Products， Lenexa， KS) 上， 22℃生长 7 天。 从真菌汇合生长的板区域制作一个圆形穿孔， 其含有直径 1cm 的琼脂板真菌塞 (plug)。将 该真菌塞置于 3mL PBS 中， 用 Ten-brock 均质机以约 30 次挤压进行研磨。 将五 (5)μL 上清 液置于每个孔的中心， 干燥， 然后于 22℃在微量滴定板上孵育。除须发癣菌 (Trichophyton mentagrophytes) 在 72 小时测定外， 每种菌株在 48 小时测定最小抑菌浓度。MIC 确定为抑 制可见的真菌生长的最小浓度。MIC50 值确定为与对照比较， 抑制可见的菌群生长降低超过 50％ ( 直径 ) 的浓度。
显微镜检查。 前面所述的生长在平底 12 孔板的真菌用于检验 occidiofungin 对真 菌菌丝和分节孢子的效果。 对于每个真菌， 取在 48 小时观察到 MIC50 的与 MIC 孔相邻生长的 菌丝或分节孢子， 制备光学显微镜和透射电镜 (TEM) 的载玻片。对于光学显微镜， 用乳酚棉 蓝液 (lactophenol cotton blue solution)(sigma) 作为阳性染色剂和载玻片装载媒介。 对于 TEM， 在 4℃用 2.5％戊二醛的 0.1M 磷酸缓冲液 (pH 7.2) 固定白地霉 (G.candidum) 样 品。 以缓冲液冲洗后， 样本用 2％四氧化锇的该磷酸缓冲液中再固定。 用磷酸缓冲液清洗样 本后， 用系列梯度乙醇 (50 ～ 100％ ) 脱水， 然后包埋在 Spurr 树脂中。用 Reichert-Jung Ultracut E 超薄切片机 (Reichert-Jung Ultracut E Ultramicrotome)(60-90nm) 制备薄 切片， 如前述的用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色。在透射电镜 Jeol JEM-IOOCXII(Joel Ltd.， Tokyo， Japan) 下观察栅格， 图像放大倍数为 5000 ～ 8000。
结果
Occidiofungin 是一种环状糖肽。高分辨率质谱数据显示存在两种结构变体的抗 真菌肽， 一个的单一同位素质量是 1,199.543Da， 另一个的单一同位素质量是 1215.518Da，
其相应于第一个化合物增加了氧。这些质量与图 1 中阐明的结构相一致 ( 计算的单一同位 素质量为 1199.5584 和 1215.5533)。鉴于两种结构变体的存在， 该抗真菌化合物的变体被 称为 occidiofungin A(1,199.5584Da) 和 occidiofungin B(1,215.5533Da)。抗真菌化合 物的 ESI-TOF MS/MS 分析是非决定性的， 因为标准碰撞能量仅导致聚糖 (glycan) 的损失， 而击碎抗真菌化合物所需的高碰撞能量产生了子离子的系列组合。然而， 需要高分裂能量 以产生碎片的事实说明该化合物是一个环状肽。 标准分裂方法只导致母离子中损失 149Da， 表明有戊糖存在。GC 分析表明连接在寡肽上的糖是木糖 ( 图 2)。如先前所报道， 氨基酸分 析表明存在赖氨酸。然而， 试图用胰蛋白酶消化肽， 没有成功， 可能是因为该化合物 ( 数据 未示出 ) 特殊的结构特征。抗真菌剂的肽没有实现线性化， 妨碍了后续的 ESI-MS 分析。
NMR 被证实是用来确定抗真菌剂的寡肽结构的可靠方法。为确定该抗真菌剂肽的 完全共价结构， 我们采集了 TOCSY、 NOESY、 ROESY 和 HSQC 数据。TOCSY 和 NOESY 数据组提供 了清楚的顺序排列， ROESY 和 HSQC 数据组用于支持证明基于质子的排列。TOCSY/NOESY 数 据组表明在光谱的酰胺质子频率中有 13 个明显的自旋体系存在。自旋体系的数量比预期 质量为 1199 和 1215Da 的寡肽多。进一步的分析数据表明有氧化变体 occidiofungin B 在 TOCSY 光谱 ( 图 3A) 的酰胺频率中有几个明显的自旋体系存在。
Occidiofungin A 包 括 Asn1- 新 型 氨 基 酸 2(NAA2)-Trp3-β- 羟 基 Tyr4-Lys5-Gly6-Asn7-Ser8( 图 1A)。氨基酸的数字排列归因于测序数据指示出 NRPS 复合 物中硫酯酶区域的位置 ； 硫酯酶区域的位置通常被指定在寡肽的 C 末端。occidiofungin A 的残基 1 和 7 有 Asn 残基的化学位移图谱特征 ( 表 1)。NAA2 有脱氨基赖氨酸的化学位 移图谱特征， 连接有短酰基 (acyl) 和木糖 ( 图 1B 和 3B)。鉴于该残基独特的特征， 其结构 在下面单独讨论。残基 3 有 Trp 残基的化学位移图谱特征。该化合物中吲哚环上的质子 与 Trp 上的 β 质子以及其他残基之间不存在 NOE 效应。这表明在溶剂中色氨酸环非受限 制地旋转， 由于构象的平均距离大于 致使一个信号损失。色氨酸吲哚环的溶剂可接触 性 (solvent accessibility) 的进一步证据源自 Trp 的吲哚环 NH(ε) 的共振缺失。当吲 哚环处于酸性 pH 值的溶剂中， 吲哚环上的 NH 质子与水环境的交换加速， 由于谱线变宽导致 信号缺失。残基 4 是经修饰的 Tyr 残基。β 碳被羟基化， 导致 β 质子明显的低场位移至 5.16ppm。在芳环 δ 质子至 β 羟基 Tyr 的 β 质子之间观察到 NOE， 因而最后确定芳香质子 频率的排列。残基 5、 6 和 8 分别有典型的 Lys、 GIy 和 Ser 化学位移图谱。Occidiofungin B 与 occidiofungin A 的不同之处在于 Asn 1 的 β 碳被羟基化， 导致位置 1 有 β- 羟基 Asn 残基。
β 碳的羟基化导致 β 质子从 2.67ppm 低场位移到 4.24ppm。而且， Asn1 中 β 碳 的羟基化导致 NAA2、 Trp3、 Asn7 和 Ser8 的酰胺质子频率产生明显的化学位移变化， 表明 occidiofungin A 的整体构象不同于 occidiofungin B。抗真菌化合物中所有的 Asn 残基 和 β- 羟基 Asn 残基明确的排列均来自 ROESY 数据组， 其中观察到酰胺基团 β 质子到 δ 质子之间的 ROE 效应 ( 数据未示出 )。
occidiofungin A 和 occidiofungin B 中的残基 1 至 8 通过 Hαi 和 Hβi 至 HNi+1 的 序贯行进 (sequential walk) 而顺序排列。occidiofunginA 和 occidiofunginB 的 NOE 连 通性在图 4 中用红色表示。能完成对 occidiofungin 的两个变体进行完整的序贯行进。每 个变体的 Asn1 的 Hα 和 Hβ 与 β- 羟基 Asn1 的 Hα 与 NAA2 的 HN 之间存在 NOE。每个变体的NAA2 的 Hα、 Hβ 和 Hγ 与 Trp3 的 HN 之间存在 NOE。Trp3 与 β- 羟基 Tyr4 的 HN 具有 Hα 质子 的 NOE。β- 羟基 Tyr4 和 Lys5 的 Hα 和 Hβ 与 Lys5 和 Gly6 的 HN 之间分别存在 NOE。每个 变体的 Gly6 与 Asn7 的 HN 具有 Hα 质子的 NOE。其它的 NOE 存在于每个变体的 Asn7 的 Hα 和 Hβ 与 Ser8 的 HN 之间。此外， 寡肽的环状性质的证据来自于 occidiofunginA 中 Ser8 的 α H 以及 occidiofunginB 中 Ser8 的 Hα 和 Hβ 分别与 Asn1 的 HN 和 β- 羟基 Asn1 的 HN 之间 存在 NOE。在 occidiofunginA 和 occidiofunginB 的 NAA2 与 Trp3、 Lys5 与 Gly6、 Gly6 与 N N Asn7 以及 Asn7 与 Ser8 中均观察到 H i 与 H i+1 的 NOE( 数据未示出 )。在 occidiofunginA 和 occidiofunginB 的 Asn1 与 NAA2 以及 β- 羟基 Asn1 与 NAA2 之间观察到其它的 HNi 与 HNi+1 的 NOE。
因其独特的结构， 残基 2 示于图 1B 中。NAA2 的结构基础类似于脱氨基的赖氨酸。 假定这一残基由在基因组区域内发现的负责合成该抗真菌化合物的酮酰酯合酶和转氨酶 形成 (Gu、 Smith 和 Lu， 未发表 )。利用脱氨基的赖氨酸的元素指认作为参比， α、 β、 γ、 δ， α β γ N ε 质子的化学位移指认得到 NOE 数据的支持。观察到 NAA2 的 H 、 H 、 H 与 Trp3 的 H 之 N 间存在 NOE。当质子与 Trp3 的 H 距离增加时 NOE 强度下降 ( 图 1B)。此外， 如前面的 NOE 所观察到的， 脱氨基的氨基酸 - 样的末端氨基共价连接在前面的 Asn 残基的羰基上。 这一区 域的化学位移分析表明， NAA2 提供连接四个碳酰基链和木糖的基体 ( 表 1)。数据支持在脱 氨基的赖氨酸残基中， 酰基链连接在 δ 碳、 木糖连接在 β 碳上。预期的这一区域中位于饱 和碳上质子的化学位移值约为 1.7ppm。β 和 δ 质子明显从该预期向低场位移至 4.28ppm 和 3.56ppm。这些质子的化学位移变化表明基团存在吸电子基团， 例如， 其附近有氧。预测 δ 和 β 碳上的双键氧， 其可能作为由酮酯酰合酶合成的脂肪酸的部分， 被还原为羟基， 随 后四个碳酰基链和木糖通过浓缩反应连接。酰基碳 2 和 3 上的质子与脱氨基赖氨酸样的残 基的 Hε 质子之间存在 NOE( 图 1B)， 表明酰基连接于 δ 碳。分子中的 Ser8 残基也支持木糖 的连接。然而， 缺乏任何明显的预期的化学位移值变化， 而明显增加了 NAA2 中 Hβ 质子大幅 的低场位移。分子中木糖与其它残基的连接导致木糖分子中失去一个氧， 导致比前面描述 的质谱数据所观察的更低的质量。因此， NAA2 中的 β 碳最可能是连接木糖的位置。HSQC 数据提供了更多 NAA2 的质子与经修饰残基的碳共振的相关性。例如， γ 碳的碳共振有两 个明显的 1.89 和 1.39ppm 的质子共振 ( 图 1)。
Occidiofungin 具有广谱的抗真菌活性。针对于广泛的真菌性植物和动物病 原体， Occidiofungin 显示了明显的抗真菌活性 ( 图 5)。丝核菌 (R.solani) 对 MIC 为 2μg/mL 的真菌实验最敏感， 而且在 0.5μg/mL 浓度时表现了明显的生长抑制。烟曲霉 菌 (A.fumigatus) 和黑曲霉菌 (A.niger) 通常引起侵袭性肺曲霉病， 均分别易感于 MIC 8μg/mL 和 4μg/mL 的 Occidiofungin。两种相关的真菌， 石膏样小孢子菌 (Microsporum gypseum) 和须发癣菌 (Trichophyton mentagrophytes) 与皮肤癣菌病有关， 都易感于 MIC 4μg/mL 的 Occidiofungin。更多的病原性真菌， 青霉菌 (Penicillium sp.)、 互隔交链孢 菌 (Alternaria alternata) 和桑树内生真菌 (Macrophomina phaseolina)， 分别显示出易 感于 MIC 32μg/mL、 8μg/mL 和 2μg/mL 的 Occidiofungin。真菌尖镰孢菌 (F.oxysporum) 对 Occidiofungin 敏感性最低， MIC ＞ 32μg/mL。然而一种动物和植物酵母病原体， 白地霉 菌在 16μg/mL 下观察到明显的生长抑制， 在 MIC 8μg/mL 下明显受到抑制， 4μg/mL 生长 被显著抑制 ( 图 5B)。次腐菌和终极腐菌对 Occidiofungin 最敏感， MIC 分别为 1μg/mL 和2μg/mL。这些数据表明 Occidiofungin 可应用于作为针对抗植物和动物真菌性病原体的 强效广谱抗真菌剂。
Occidiofungin 改变了膜的完整性。 同龄的菌丝和细胞用于本研究中。 将生长于亚 抑制浓度的 Occidiofungin(0.5μg/mL) 中的立枯丝核菌的菌丝与生长于无抗真菌化合物 存在下的立枯丝核菌的菌丝进行比较。在此浓度下， 立枯丝核菌生长的减少超过 50％ ( 图 5A)。Occidiofungin 导致明显的菌丝形态变化， 最明显的变化之一就是细胞内包涵体的形 成 ( 图 6， A 和 B， 黑色箭头 )。另一个值得注意的区别是暴露于 Occidiofungin 后， 菌丝尖 端畸变和细胞膜波纹状图案 ( 图 6， A 和 B， 白色箭头 )。同样的观察结果出现在生长于亚抑 制浓度下的桑树内生真菌的菌丝形态 ( 未显示 )。 与未经处理的细胞相比， 白地霉菌的节孢 子暴露于 4μg/mL Occidiofungin 中 48 小时后有明显的因细胞肿胀导致的不定形状 ( 图 6 中 C 图和 D 图 )。TEM 数据表明白地霉菌暴露于 Occidiofungin 亚抑制浓度 48 小时后， 细 胞壁厚度有急剧下降 ( 图 7)。此外， 经处理的样品中有细胞壁脱落 ( 黑色箭头 )， 表明细胞 壁的完整性受到暴露于 Occidiofungin 的影响。处理后的白地霉菌缺少细胞内部的对比， 表明细胞被溶解 ( 白色箭头 )。很可能变薄的细胞壁不能维持渗透压。鉴于分节孢子为圆 柱形状以及交叉切割它们的机率很高， 由 TEM 数据不能得到肿胀的说明。几个分节孢子的 更宽视野表明确实有几个分节孢子保持了圆柱形状 ( 图 7， C 图 )。虽然如此， 如 B 图中所 示的分节孢子， 它们都有细胞内部和细胞壁形态畸变。这些观察结果表明， occidiofungin 通过破坏细胞壁的形成靶向膜的完整性， 而且 occidiofungin 可以抑制酶的功能， 因为可 见的包涵体的形成一般有助于物质的积聚。 讨论
此研究的发现包括 ： 阐述了 occidiofungin 完整共价结构包括新型的氨基酸 ； 对 occidiofungin 广谱抗真菌活性的表征 ； 以及对持续暴露于抗真菌化合物中的细胞内容物 和膜不稳定性的体外观察。
结构表征确定 occidiofungin 是一种独特的抗真菌剂。上述质谱和 NMR 数据完全 符合并支持图 1 所示的 occidiofungin 结构。该结构数据提供清晰的氨基酸排列使我们能 区别 occidiofungin 的两种变体， occidiofungin A 和 occidiofungin B。一个完全的沿着 每个分子骨架的序贯行进被示出。此外， C- 末端残基 Ser8 与 occidiofungin A 中 Asn1 之 间的 NOE、 以及与 occidiofungin B 的 β 羰基 Asn1 之间的 NOE 证实了此前所预测的寡肽的 环状结构。
一种新型氨基酸被确认及通过 NMR 数据很好地表征。此独特的残基对抗真菌活性 的重要性是未知的， 但成为发明人小组极大关注的方面。而且， 两个氨基酸衍生物， β- 羟 基 Asn( 除 occidiofunginB 外 ) 和 β- 羟基 Tyr 通过 NMR 谱确认 ( 表 1)。每个变体的色 谱分离还没有完成。因此， Asn1 的 β 碳羟基化是否对化合物生物活性很重要尚且不知道。 靠近 β- 羟基 Asn1 的酰胺频率的急剧位移表明 Asn1 上的 β 碳羟基化后确实改变了肽的 构象。
Occidiofungin 活性的准确机理尚不知道， 但这项研究提供了坚实的基础去开展 阐明活性机理的实验。Occidiofungin 对两种腐霉菌属菌种展现了很强的抑制活性。腐霉 属不是一种真正的真菌， 麦角固醇不是作为主要甾醇存在于其细胞膜中 ； 结果， 它对靶向麦 角固醇的抗真菌剂不敏感。因此， Occidiofungin 的抗真菌活性很可能不包括与麦角固醇
结合或抑制麦角固醇的合成。值得注意的是腐霉菌细胞壁不包括几丁质， 该卵菌亚纲的细 胞壁中含有有大量的 β- 葡聚糖。因此， Occidiofungin 可能不会靶向几丁质的合成。
暴露于 Occidiofungin 中的真菌的形态与文献报道的暴露于棘白菌素的真菌的 形态类似， 表明 Occidiofungin 可以靶向葡聚糖的合成。暴露于米卡芬静 (micafungin) ( 一种棘白霉素 ) 的抑制浓度的烟曲霉菌， 表现出菌丝破裂并表现出波缘膜， 以及在亚抑菌 浓度下菌丝尖端畸变现象。暴露于棘白菌素的致死剂量的白色念珠菌诱导了肿胀， 并在亚 抑菌剂量下在膜上观察到不正常的形态变化。 在烟曲霉中的不正常的膜形态的形成与在亚 抑菌浓度下生长的立枯丝核菌和桑树内生真菌所观察到的相似， 并且白色念珠菌的细胞肿 胀与暴露于 Occidiofungin 的亚抑菌剂量的白地霉所观察到的相似。令人惊奇的是， 镰刀 菌对棘白霉素有抵抗作用。其抵抗机理归因于 1， 3-β- 葡聚糖合成酶催化亚基中的天然变 异和细胞壁结构中天然差异， 特别地， 镰刀菌具有更少的 1， 3-β- 葡聚糖。在这项研究中， 当尖孢镰刀菌的 MIC 大于 32μg/mL 时， Occidiofungin 在 16μg/mL 下令人惊奇地减慢了 该真菌的生长。另外的研究将揭示 occidiofungin 是否抑制了葡聚糖真菌细胞壁合成， 尤 其是其抑制 1， 3-β- 葡聚糖合成酶的能力。细胞壁形成和对细胞壁损坏的应答涉及复杂的 细胞信号转导网络， 其在真菌细胞壁表面与合成及修复的生物合成酶之间进行联系。 因此， occidiofungin 的准确的作用机理可能涉及全新的靶标。 根据感染或疾病的严重程度， 可以治疗有效的量将包括本发明的组合物施予目标 动物或植物， 由此预防或减轻真菌感染的短期或长期影响。
本公开第一次描述并完整表征了一系列新型且非常有效的抗真菌化合物， 其用于 预防和减轻在人、 动物和植物对象中的广谱真菌感染， 本文还公开了产生抗真菌化合物的 分离出的新型菌株。
以上的详细描述可使本领域任何技术人员制造和使用本发明。 公开了具体描述以 提供对本发明的综合理解， 并用于解释其提供的信息。然而这些具体描述并不要求体现在 本发明中， 因为其对本领域普通技术人员是显而易见的。 对具体应用、 分析和计算的描述仅 作为代表性的实例。各种适当变化、 改进、 组合和优选实施方案的等效方案以及增加的、 不 同的相互作用和材料及产生的有益效果对本领域普通技术人员是显而易见的， 本发明的一 般原理可适用于其他实施方案和应用， 其均包含在本发明的精神和范围内。权利要求书和 说明书不应解释为过分缩小如本发明所提出的全部保护范围。 本发明所提供的图也应理解 为仅作示例的目的。不应将本发明限制于所示的实施方案， 本发明应被赋予与本文所公开 的原理和特征一致的最宽的可能的范围。
表 1 化学位移
质子化学位移值来自 TOCSY 实验。圆括号的化学位移是来自 HSQC 实验的 13C 值。 occidiofungin B 的区别化学位移值写在方括号中。* 表示是来自 ROESY 实验的化学位移 值。
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