山楂麦芽颗粒的药物应用 【技术领域】
本发明属于药物领域， 涉及一种中药组合物在治疗厌食症方面的应用。背景技术 摄食障碍 (eating disorders， EDS) 以严重异常的进食行为为特征， 可分为神经性 厌食症 (anorexia nervosa， AN)、 神经性贪食症 (bulimia nervosa， BN)、 不典型摄食障碍 (atypital eating disorder) 和暴食症 (binge eating disorder， BED)。EDS 多见于青少 年， 女性居多， 男性发病较少， 流行病学资料显示普通人群中患病率约 0.5％ -3％， 男性仅 占 0.5％。过往关于 EDS 的研究集中在环境、 心理等因素为主， 近年来随着对摄食基因网络 调控研究深入， 摄食 - 能量 - 代谢平衡已成为研究热点。发明人在上述理论指导下， 采用侧 脑室埋管持续刺激方法， 成功复制摄食障碍 ( 厌食证 ) 模型， 并探讨山楂麦芽颗粒的干预研 究。
儿童厌食证是儿童常见的脾胃疾病， 临床以长期见食不贪， 食欲不振， 甚者拒食为 特征。发病原因主要是由于喂养不当， 饮食失节， 导致脾胃运化不健所致。本病各年龄儿童 均可发生， 城市儿童发病率较高。 引起厌食的病因较多， 主要为喂养不当， 或先天不足， 或病 后失调所致， 病机为脾胃运化失健。本病治疗原则以调理脾胃， 恢复运化功能为主。根据不 同的临床表现， 分别采用运脾和胃、 健脾益气等法。
国外用于胃肠道病适应症的儿科药， 多为处方药。 临床上常用的是促胃肠动力药， 分为 4 代 ： 甲氧氯普胺、 多潘立酮、 西沙必利、 莫沙必利。上述药物作用机理明确， 但对于脾 胃未发育成熟的儿童并不适宜。 在国内助消化中药产品中， 多数产品作用机理不明， 产品处 方无专利保护。
山楂炒麦芽颗粒是中山市中智药业集团科研人员根据医院协定处方， 通过科学改 进后开发出的一个固体饮料类食品， 由山楂、 麦芽、 山药、 茯苓等组成， 具有益气健脾， 消食 除湿的功能， 通过促进胃肠蠕动、 胃肠消化液分泌， 对湿困脾胃引起的小儿消化不良， 以及 胃肠动力不足引起的胀痛等症有辅助治疗作用， 临床效果良好。
发明内容
本发明目的在于提供山楂麦芽颗粒在制备治疗和 / 或预防厌食症的药物中的应用。 山楂麦芽颗粒能够抑制胃壁组织中的消化细胞数量减少。
山楂麦芽颗粒能够促进胃肠运动， 还具有改善食欲和增加体重的作用。
山楂麦芽颗粒能够提高下丘脑中 NPY 的含量。
山楂麦芽颗粒能够使食欲因子促黑色素表达下降。
山楂麦芽颗粒能够使促进食欲因子刺鼠相关蛋白表达增加。
山楂麦芽颗粒具有健脾和胃， 促进食欲的效应， 其效应是通过调控外周促进食欲 因子 ghrelin 表达， ghrelin 与其受体结合后， 透过血脑屏障， 介导下丘脑食欲调控中枢， 调
控 NPY/AGRP-MSH 系统有关。
本发明所述药物山楂麦芽颗粒 ( 商品名 ： 吃得香 )， 能够在市场上购买到， 也可以 通过以下方法制备得到 ： 白扁豆 0.5 ～ 2 重量份、 山楂 1 ～ 2 重量份、 山药 0 ～ 1 重量份、 麦 芽 1 ～ 2 重量份、 生姜 0.2 ～ 1 重量份、 茯苓 0.5 ～ 1 重量份、 鸡内金 0.5 ～ 1.5 重量份、 陈 皮 0.2 ～ 1 重量份、 春砂仁 0.5 ～ 1 重量份、 甘草 0.5 ～ 1.5 重量份、 白砂糖适量组成。
制备过程如下 ：
步骤一、 取处方量的山楂， 麦芽， 山药， 茯苓， 鸡内金， 陈皮， 春砂仁， 白扁豆， 甘草， 生姜 ； 加水， 煎煮两次， 合并煎煮液 ；
步骤二、 浓缩上述步骤一得到的煎煮液， 过 80 ～ 120 目筛过滤， 滤液减压浓缩至相 对密度为 1.10， 放料， 加醇沉淀 ；
步骤三、 按浓缩体积， 加纯度 83 ～ 87％乙醇使乙醇在浓缩液中的浓度至 65-75％， 静置 20 ～ 30 小时 ；
步骤四、 上清液 400 目三层过滤， 得滤液 I ； 残渣 250 目过滤， 滤渣离心过滤， 离心 液合并滤液 400 目三层过滤， 得滤液 II， 合并滤液 I 利 II， 弃去残渣 ；
步骤五、 收醇 ： 滤液回收乙醇至相对密度为 1.00 ～ 1.10， 得低醇液 ； 步骤六、 水沉 ： 低醇液加 1 ～ 3 倍量热水搅拌均匀， 静置 20-30 小时得水沉液 ；
步骤七、 茯苓单独提取， 按药材重最的 4-8 倍量加水， 第一次煎煮 1.5 ～ 2.5 小时， 第二次煎煮 1 ～ 2 小时， 过滤， 静置 24 小时以上， 400 目三层过滤， 滤液浓缩成相对密度为 1.05， 得茯苓清膏 ；
步骤八、 浓缩 ： 水沉液 400 目三层过滤， 合并茯苓清膏， 在温度为 65 ～ 70℃的条件 下， 减压浓缩至相对密度为 1.23 ～ 1.25 时 200 目过滤收膏。
本发明对山楂麦芽颗粒进行深入的研究后发现， 山楂麦芽颗粒在治疗和 / 或预防 厌食症方面具有显著的效果， 特别是在治疗儿童厌食症方面也取得了良好的效果。本发明 主要是从脑肠肽 - 食欲调节中枢的角度进行研究以阐明山楂麦芽颗粒提食欲作用的机理。
本发明的研究结果显示， 山楂麦芽颗粒还具有益气健脾， 消食除湿的功能， 通过促 进胃肠蠕动、 胃肠消化液分泌， 对湿困脾胃引起的小儿消化不良， 以及胃肠动力不足引起的 胀痛等症有辅助治疗作用， 临床效果良好。
附图说明
图1： 各组大鼠平均进食量 ( 单位 g)
图2： 造模后大鼠体重变化
图3： 大鼠下丘脑神经肽 Y 含量 ( 单位 ： g)
图4： 大鼠血浆神经肽 Y 含量 ( 单位 ： g)( 各组之间比较没有差异 )
图5： A： ghrelin 溶解曲线、 B： GAPDH 溶解曲线
图6： A 下丘脑 ghrelin 扩增曲线， B： 胃 ghrelin 扩增曲线
图7： 胃 ghrelin 蛋白阳性表达，
注： A： 正常组 ； B： 模型组 ； C： 香砂组 ； D： 吃得香低剂量组 ； E： 吃得香组 ；
图8： 外周食欲调控因子介导下丘脑食欲调节中枢的反馈机制具体实施方式
实验 1 ： 侧脑室注射瘦素致大鼠厌食症及山楂麦芽颗粒干预的研究
1 材料
1.1 试剂与仪器
Leptin 购自 Sigma-aldrich 公司 ( 货号 L5037， 1mg， lot077k1283)， 将其溶于 2ml 生理盐水， 并分装成 200μL 小包装， -40℃保存。阿奇霉素颗粒剂 ( 商品名希舒美 0.1×6 包 )， 购自广州中医药大学第一附属医院药房。抑肽酶购自广州科宏生物科技有限公司。
小动物脑立体定位仪 (Cat NO ： MP8002， SN ： 06041714)、 套管针 ( 包括针套和针芯 62001)、 注射内管、 PE 管和微量注射器均来自深圳市瑞沃德生命科技有限公司 ； 电动牙科 钻 (M-1701)、 牙科自凝粉、 II 型牙科水， 购自广州市和茂医疗器材有限公司 ； 甲醛、 无水乙 醇： 广州东征生化试剂公司 ； 30％ H2O2、 PBS、 0.9％生理盐水、 10％水合氯醛购自广州东征 公司 ； 液氮由广州气体公司提供 ； 二甲苯、 Harris 苏木精液、 伊红染色液、 1％盐酸酒精等 ； 手术器械、 研钵、 直灌胃针、 金属夹、 石蜡油、 一次性注射器 (1ml、 5ml、 10ml) ； 3ml 抗凝管购 自广州合达生物技术公司 ； 0.5ml 及 1.5ml Eppendorf 管购自美国 AEGEN 公司。TP1020 自 动脱水机、 RM2135Leica 切片机、 HI1210Leica 摊片机、 HI1220Leica 烘片机、 EG1160Leica 自动包埋机等。
1.2 动物
清 洁 级 雄 性 SD 大 鼠 60 只， 体 重 为 300±20g， 由广东省动物实验中心提供 (SCXK( 粤 )2008-0002)， 合格证号 0063422。全部大鼠适应性喂养 1 周后， 按体重随机分为 5 组， 正常组、 模型组、 香砂六君子汤组、 吃得香高剂量组、 吃得香低剂量组， 每组 12 只。
1.3 实验药物
山楂麦芽颗粒 ( 商品名 ： 吃得香 ) ： 白扁豆、 山楂、 山药、 麦芽、 生姜、 茯苓、 鸡内 金、 陈皮、 春砂仁、 甘草、 白砂糖组成， 中山市中智药业集团监制 ( 粤卫食证字 2008 第 2040A02679 号 )， 规格 ： 6g/ 袋。
香砂六君子汤 ： 广木香 24g， 西砂仁 24g， 炒党参 60g， 炒白术 60g， 茯苓 60g， 炙甘草 30g， 炒广皮 30g， 制半夏 60g。购自广州中医药大学第一附属医院。第一次加 10 倍量水浸 泡 4h 后煎煮， 水开后煮 40min 后将药液倒出， 再加 8 倍量水直接煎煮， 水开后再煮 30min 后 将药液倒出， 两次水提液合并， 浓缩至药物含量 13.6g/kg/10ml， 按公斤体重计， 约为成人用 量的 15 倍， 灌胃给药。
2. 方法
2.1 大鼠侧脑室埋管
大鼠侧脑室埋管步骤 ： 10 ％水合氯醛腹腔麻醉 (0.3ml/100g) →将大鼠固定在 脑立体定位仪上→剪毛、 75％酒精皮肤消毒→用手术剪沿中线剪开、 充分暴露颅骨→ 3％ H2O2 搽去骨膜、 暴露囟门→沿囟门向下 1.5mm、 向左 1.5mm →牙科钻破骨→埋入套管。自埋 管第 2d 起， 给希舒美 90mg/kg 灌胃， 连续给药 3d， 以预防颅内感染。
2.2 大鼠侧脑室注射瘦素
除正常组外， 其余大鼠在术后第 5d 开始分组给药， 同时予侧脑室注射瘦素 10μg/ kg/20μL 组。 给药时一人按住大鼠， 另一人用眼科镊子协助将套管内芯取出， 把预先准备好 的微量进样器连接 PE 管及注射针， 沿套管直接注射至下丘脑， 继而把内芯重新拧紧。连续予瘦素侧脑室注射 3 次， 隔日 1 次， 记录大鼠体重变化。
2.3 标本取材
全部大鼠在给药第 8d， 在腹腔麻醉下 (10％水合氯醛 0.33ml/100g)， 腹主动脉取 血置于抗凝管 ( 管内加入 60μL 1μg/ml 抑肽酶 )， 抗凝血 4℃ 3000rpm/min 离心 15min， 取上清冷冻 -20 ℃保存。取血后处死大鼠， 剪下头颅， 取出下丘脑分别置于 10 ％中性甲 醛、 -80 ℃低温冰箱备用待测 ； 剖开腹腔， 取出大鼠全胃， 沿大弯侧剪开， 洗净后分别置于 10％中性甲醛、 -80℃低温冰箱备用待测。
2.4 指标检测
2.4.1 一般指标
详细记录大鼠体重变化。
2.4.2 病理指标
观察大鼠下丘脑、 胃病理改变。
2.5 统计学分析
实验数据以均数 ± 标准差表示， 用 SPSS11.5for Windows 软件进行数据处理与分析。Oneway Analysis Of Variance(One-way ANOVA) 进行各组间方差分析， 方差齐 同时用 LSD 法， 方差不齐时用 Tambane’ S T2 法， P ＜ 0.05 为有统计学意义。检验水准为 α ＝ 0.05。
3 结果
3.1 大鼠一般状况分析
正常组大鼠体重呈自然增长， 耗食量、 体重及精神活动未见异常。 模型组、 香砂组、 吃得香组、 低剂量组大鼠均呈现体重下降、 精神萎靡等变化。耗食量及耗水量无法计量。在 整个实验过程中， 香砂六君子汤组死亡 1 例、 脱针 2 例， 吃得香高剂量组死亡 2 例， 模型组死 亡 3 例， 吃得香低剂量组死亡 2 例。同时， 吃得香组及低剂量组各见 1 例大鼠腹胀明显， 状 态较差。总体来说， 大鼠死亡率 8％ -10％， 脱针率为 3％ -5％。
3.2 大鼠体重变化
3.2.1 大鼠侧脑室埋管后体重变化
造模大鼠自侧脑室埋管后第 2d 起， 体重逐渐下降， 正常组大鼠呈自然增长趋势， 自第 2d 起， 模型组大鼠与正常组大鼠比较， 有统计学意义， 见表 1。
表 1 大鼠侧脑室埋管后 4d 体重变化
注： 模型组与正常组比较， P ＜ 0.05。 3.2.2 大鼠侧脑室注射瘦素后体重变化 正常组大鼠体重呈自然增长趋势 ； 其余各组大鼠在注射瘦素后， 大鼠体重无明显增长， 尤其是吃得香低剂量组体重呈下降趋势， 与正常组比较， 无统计学意义。模型组与治 疗组比较， 无统计学意义。见表 2。
表 2 侧脑室注射瘦素后及山楂麦芽颗粒干预大鼠体重变化注： 各组与正常组比较， 第 1d- 第 3d 大鼠体重变化无统计学意义 *P ＞ 0.05 ； 吃得 香低剂量组与正常组比较， 第 4d- 第 7 天大鼠体重变化有统计学意义 #P ＜ 0.05。模型组与 治疗组比较， 无统计学意义。
3.3 大鼠胃黏膜病理变化
正常组 ： 胃粘膜上皮完整， 腺体排列整齐， 极向好， 主细胞、 壁细胞数量正常， 粘膜 下层可见少量单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润， 未见溃疡、 坏死等病变。
模型组 ： 胃粘膜上皮完整， 腺体排列整齐， 极向好， 部分样本主细胞、 壁细胞数量稍 减少， 分布稍稀疏， 腺腔稍扩大， 粘膜下层可见少量单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润， 未见溃 疡、 坏死等病变。
香砂组 ： 胃粘膜上皮完整， 腺体排列整齐， 极向好， 主细胞、 壁细胞数量正常， 粘膜 下层可见少量单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润， 与正常组相似。
吃得香高剂量组 ： 胃粘膜上皮完整， 腺体排列整齐， 极向好， 主细胞、 壁细胞数量正 常， 粘膜下层可见少量单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润， 与正常组相似。
吃得香低剂量组 ： 胃粘膜上皮完整， 腺体排列整齐， 极向好， 部分样本局部主细胞、 壁细胞数量稍减少， 分布稍稀疏， 腺腔稍扩大， 粘膜下层可见少量单核细胞及嗜酸性粒细胞 浸润， 未见溃疡、 坏死等病变。
3.4 大鼠下丘脑病理变化
正常组 ： 各神经核团形态清晰、 正常， 神经元细胞较大、 神经突起明显， 神经细胞核 大、 核仁清晰。神经纤维束分布正常， 未见出血、 坏死灶及炎细胞浸润。
模型组、 香砂组、 吃得香高剂量组、 吃得香低剂量组 ： 镜下所见与正常组相似， 未见 明显病理变化。
4. 讨论
研究证实下丘脑与其它脑区有广泛的纤维联系， 接受大脑皮层， 边缘系统如海马， 脑于的传入神经纤维， 发出大量的纤维到达大脑皮层， 边缘系统， 中脑， 脑桥和延髓等区。 高 级中枢大脑皮层产生与摄食相关的下传信号可通过海马 - 下丘脑 - 延髓 DVC( 迷走神经复 合体 )- 迷走神经这一环路对胃运动及摄食调控。摄食是一个复杂的生理过程， 下丘脑食欲 调节中枢在摄食过程中占据重要地位， NPY/AgRP 信号通路， 以及增进摄食因子与抑制摄食 因子之间的平衡是厌食症的关键所在。因此， 采用下丘脑注射抑制摄食因子或者采用物理 刺激方法损伤下丘脑比如 LHA、 VMN 等部位， 均有可能导致厌食。
1994 年， Rockefeller 大学的 Zhang 等引利用分子生物学方法成功克隆了小鼠和 人的肥胖基因， 该基因主要在白色脂肪细胞中表达， 产物是一种由 167 个氨基酸残基组成， 分子量为 16,000 的蛋白质激素。因该物质能使动物变瘦， 故被命名为 “瘦素” 。根据其信 号序列的构成， 预测它是一种分泌性蛋白。瘦素作为神经内分泌激素， 能够提供调节信号， 通过抑制食物摄取、 提高代谢率来限制脂肪的储存， 在能量平衡中起着重要作用。 瘦素主要 是通过与其受体的结合来实现调节体脂平衡和能量代谢等方面的重要作用的。 瘦素受体属 I 类细胞因子受体家族， 为单跨膜受体， 由胞外、 跨膜和胞内三个结构域构成， 主要在大脑脉 络丛、 下丘脑、 肝脏、 肾脏、 心脏、 脾脏、 睾丸、 脂肪组织及胰岛细胞表面。 在实验研究中发现， 侧脑室多次注射瘦素， 必然会出现感染， 如何预防感染？如何 减少因感染导致大鼠体重的混杂因素亦是值得深思的问题。 同时， 侧脑室注射针置入多少， 如何减少因侧脑室注射带来的机械损伤导致摄食信号传递障碍？通过本次实验研究， 提示 予大鼠灌胃希舒美连续 3d 预防感染， 注意无菌操作， 可以控制感染 ； 注射针以置入 4mm 为 宜， 过深会导致物理损伤。 侧脑室隔日注射瘦素成功复制大鼠摄食障碍模型， 推测其机理可 能为瘦素与分布在下丘脑瘦素受体结合， 影响海马 - 下丘脑 - 胃食欲环路， 调节 NPY/AgRP 信号通路， 抑制食物摄取， 达到减少摄食的生物学效应， 关于厌食症具体的生物学效应机制 尚需要深入研究。
山楂麦芽颗粒剂， 商品名 “吃得香” ， 主要由白扁豆、 山楂、 山药、 麦芽、 生姜、 茯苓、 鸡内金、 陈皮、 春砂仁、 甘草、 白砂糖组成， 方中以山楂、 麦芽二药开胃消食、 化滞消积为君 药， 扁豆、 茯苓、 春砂仁补气健脾、 化湿和中为臣药， 陈皮调中快膈、 降气化痰， 鸡内金消食健 胃， 佐以甘草调和诸药， 全方共奏健脾益气， 消食化痰之功效。香砂六君子汤出自 《太平惠 民和剂局方》 ， 全方由广木香、 西砂仁、 炒党参、 炒白术、 茯苓、 炙甘草、 炒广皮、 制半夏等药组 成， 具有益气健脾， 化痰和胃之功效。 主要用于脾虚气滞， 消化不良， 嗳气食少， 脘腹胀满， 大 便溏泄。
综合病理结果提示厌食症模型大鼠胃壁组织中的消化细胞数量有所减少， 吃得香 组对此有改善作用， 其效果与香砂组相似。 而吃得香低剂量的治疗效果稍差 ； 厌食症模型大 鼠下丘脑组织未见明显形态学改变。 大鼠体重变化提示吃得香组及吃得香低剂量组具有一 定改善大鼠体重的效应， 吃得香组优于低剂量组。
实验 2 ： 山楂麦芽颗粒药效学研究
本实验拟观察 “吃得香” 3 个批号样品对胃肠运动、 进食量、 体重增长、 胃液胃酸分 泌、 胃蛋白酶活性影响的差异。
实验材料
受试药 ： 山 楂 麦 芽 颗 粒， 中 山 市 中 智 药 业 集 团 股 份 有 限 公 司 出 品， 粤卫食证
字 (2004) 第 2040A01521 号， 3 个 批 号 分 别 为 20060820( 称 为 山 楂 麦 芽 颗 粒 0820)、 20061110( 山楂麦芽颗粒 1110) 和 20061114( 山楂麦芽颗粒 1114)， 均为棕黄色颗粒剂， 每 包重 6g， 儿童临床用量每日 3 包。阳性对照药为健胃消食片， 江中药业股份有限公司出品， 国药准字 Z36021464， 批号 0608719， 由太子参、 陈皮、 山药、 麦芽、 山楂等组成， 能健胃消食， 用于脾胃虚弱， 消化不良， 每片重 0.5g( 实验剂量以药片重量计算 )， 儿童临床用量每次 2-4 片， 每日 3 次。
受试药剂量设置和配制 ： 山楂麦芽颗粒临床给药途径为颗粒剂口服， 动物灌胃给 药， 经预实验确定实验剂量 ( 剂量以颗粒剂重量计算 )， 小鼠小肠推进实验时吃得香剂量为 2g/kg 和 1g/kg( 以儿童体重 20kg 计， 相当于临床用量 1.8 倍和 3.6 倍 )， 其余实验均剂量 为 4g/kg 和 2g/kg( 相当于临床用量的 7.2 倍和 3.6 倍 )， 每日给药一次， 以蒸馏水研磨配 制。健胃消食片实验时研碎并以蒸馏水配制， 小鼠小肠推进实验剂量为 0.5g/kg( 以儿童体 重 20kg， 每日 9 片计， 相当于临床用量 2.2 倍 )， 其余实验剂量均为 1.0g/kg( 相当于临床用 量 4.4 倍 )。
试剂 ： 氯化钠， 天津大茂化学试剂厂， 批号 20061011 ； 活性炭， 天津大茂化学试剂 厂， 批号 20020120 ； 复方地芬诺酯片， 常州市康普药业有限公司， 批号 0611020， 国药准字 H32022716。 使用时以蒸馏水配成 10mg/kg/20ml 的水溶液 ； 氢氧化钠， 天津市大茂化学试剂 厂， 批号 0612010 ； 阿拉伯树胶， 广州市医药公司化学试剂玻璃仪器批发部进口分装， 批号 980809。
动物 ： NIH 小鼠， 雌雄各半， 体重 18 ～ 22g， 广州中医药大学实验动物中心提供， 许 可 证 号 SCXK( 粤 )2003-0001， 粤 监 证 字 2006A005， 动 物 号 合 格 证 号 分 别 为 0020634、 0020683、 0020821、 0020918 ； SD 大鼠， 雌雄各半， 广州中医药大学实验动物中心， 许可证号 SCXK( 粤 )2003-0001， 粤监证字 2006A014， 合格证号分别为 0020725、 0021034。
仪器 ： 岛津紫外可见分光光度计， 型号 ： UV mini-1240。
数据统计采用 SPSS11.5 软件进行分析。
2.2 方法与结果
2.2.1 山楂麦芽颗粒对小鼠小肠推进运动的影响
小鼠禁食不禁水 12h， 随机分为 8 组， 分别灌胃给药， 1.5h 后每只小鼠给炭末 0.2mL(5％炭末以 10％阿拉伯树胶液配制 )， 20min 后处死小鼠， 迅速开腹， 从幽门起至回盲 部取小肠全长铺于纸上， 测量出幽门至炭末前端和幽门至回盲部的小肠全长， 小肠推进率 ＝ ( 幽门至炭末前沿距离 / 幽门至回盲部距离 )×100％。结果见表 3。
表 3 对正常小鼠小肠推进运动的影响
注： 方差分析 ( 下同 )， 与正常组比较， *P ＜ 0.05
表 3 表明， 山楂麦芽颗粒 1110 组、 山楂麦芽颗粒 1114 组 2g/kg 剂量可以促进正常 小鼠的小肠运动。
2.2.2 山楂麦芽颗粒对小鼠胃排空的影响
小鼠按体重分层随机分为 8 组， 禁食不禁水 12h， 灌胃给药， 1.5h 后每只小鼠灌胃 酚红溶液 0.5mL( 含酚红 100μg)， 15min 后处死小鼠， 剖腹取胃， 把胃放入 10mL0.1mol/L 氢 氧化钠溶液中剪开洗涤， 以滤纸过滤， 滤过液在分光光度计在 558nm 处测其吸光值， 为胃内 残存酚红量。 将 0.5mL 酚红注入小鼠胃内马上处死， 取出胃放如 10mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶 液中剪开洗涤， 以滤纸过滤， 滤过液的吸光值为投入酚红量。 胃排空率＝ [( 投入酚红量 - 胃 内残存酚红量 )/ 投入酚红量 ]×100％。结果见表 4。
表 4 对正常小鼠胃排空运动的影响
注： 与蒸馏水组比较， *P ＜ 0.05 表 4 可见， 健胃消食片组、 山楂麦芽颗粒 1110 组和山楂麦芽颗粒 1114 组 2g/kg 剂量均可促进正常小鼠胃排空。其中吃得香 1114 组 2g/kg 效果最好。
2.2.3 山楂麦芽颗粒对小鼠小肠推进减慢的影响
小鼠禁食不禁水 16h， 灌胃给受试药， 1h 后每只小鼠灌胃 10mg/kg 地芬诺酯水溶液 造成小肠推进减慢模型， 0.5h 后给 4％炭末灌胃每只 0.2mL， 20min 后处死， 取出小肠， 摊开 在纸上测量小肠全长及炭末前端至幽门的距离， 小肠推进率＝ ( 幽门至炭末前沿距离 / 幽 门至回盲部距离 )×100％。结果见表 5。
表 5 对减慢的小鼠小肠推进运动的影响
注： 各组与蒸馏水组比较均 P ＞ 0.05
表 5 可见， 以地芬诺酯造模后小肠推进率明显减慢， 但各用药组与蒸馏水组比较， 差异无显著性意义， 表明各受试药对减慢的小肠推进运动无明显影响。
2.2.4 对小鼠胃排空减慢的影响
小鼠禁食不禁水 16h 后， 灌胃给受试药， 1h 后每只小鼠灌胃 10mg/kg 地芬诺酯水溶 液造成胃排空减慢模型， 0.5h 后灌胃酚红 0.5mL( 含酚红 100μg)， 15min 后处死小鼠， 剖腹 取胃， 其余处理同实验 2。
表 6 对减慢的小鼠胃排空的作用
注： 各组与蒸馏水组比较均 P ＞ 0.05
以地芬诺酯造模后胃排空率明显减慢， 但各用药组与蒸馏水组比较， 差异无显著 性意义， 表明各受试药对减慢的胃排空无明显影响。
2.2.5 对大鼠体重、 进食量和食物利用率的实验
大鼠按体重分层随机分为 5 组， 每组雌雄各半， 每日灌胃给药 1 次， 记录体重， 同组 同性别大鼠进食量， 给药周期 28 天。结果见表 7-1、 表 7-2。
表 7-1 雄性大鼠给药 28 天体重变化
注： 各组与蒸馏水组比较均 P ＞ 0.05 表 7-2 雌性大鼠给药 28 天体重变化
注： 各组与蒸馏水组比较均 P ＞ 0.05
2.2.6 对大鼠胃液、 胃酸、 胃蛋白酶活性的检测
禁食不禁水 24h， 乙醚麻醉下开腹， 暴露胃和十二指肠， 结扎幽门， 由十二指肠分别 注受试药， 缝合腹腔， 禁食禁水， 4h 后处死大鼠， 收集胃液， 离心去渣后测量胃液量。然后取 0.2mL 胃液加 1％酚酞 2 滴， 以 0.02mol/L 氢氧化钠滴定胃酸浓度， 并计算胃酸流量。
胃蛋白酶测定 ： 取鸡蛋的蛋清， 准备一根内径为 1mm 的软性塑胶管， 用针头把蛋 清注入软管内， 捏住两端的口， 把软管放入 70℃的热水中， 使蛋白凝固， 再把软管剪成每段 2cm。取每个样本的胃液 1mL， 放入 50mL 的三角瓶中， 加 15mL0.01mol/L 盐酸， 每瓶放 2 个软 管段， 37℃孵育 24h， 取出， 测量 2 个软管四个端口透明部分的长度， 取其平均长度 2×16 为 作为胃蛋白酶活力的单位。结果见表 8。
表 8 对幽门结扎大鼠胃酸分泌的影响
注： 与蒸馏水组比较 *P ＜ 0.05
山楂麦芽颗粒 3 个批号的受试药均无促进胃液胃酸分泌的作用， 也不能提高胃酸 浓度， 吃得香 1110 组 4g/kg 剂量还能抑制胃液分泌， 降低胃酸浓度。山楂麦芽颗粒 0820 组 4g/kg 剂量也可以降低胃酸浓度 ； 各受试药对胃蛋白酶活性都没有影响。
药效学试验结果表明， 山楂麦芽颗粒 1114 可促进正常小鼠的胃排空和小肠推进 运动， 对减慢的小鼠胃排空和小肠推进没有作用 ； 从对大鼠体重、 进食量和食物利用率来 看， 也是山楂麦芽颗粒 1114 药效较好。但几个批次的山楂麦芽颗粒对幽门结扎大鼠胃液分 泌及胃酸浓度和胃蛋白酶都没有促进作用。
3. 结论
山楂麦芽颗粒的一系列药效学实验证实， 山楂麦芽颗粒 1114 组高剂量组能促进 正常小鼠的胃肠运动， 也有一定的改善食欲和增加体重的作用， 而对减慢的小鼠胃肠运动 没有作用， 这是很多中成药常见的药效学实验特点 ： 临床效果很好但动物实验往往不能得 到非常理想的结果， 该实验可以作为改进生产工艺， 提高药效的依据。
实验 3 ： 山楂麦芽颗粒干预厌食症大鼠下丘脑及血浆 NPY 的研究
1. 实验材料
SD 大鼠， 雄性， 体重 300 克， 南方医科大学实验动物中心， 合格证号 0043870。
治疗组 ： 山楂麦芽颗粒 ( 商品名 “吃得香” )， 中山中智药业集团生产， 粤卫食证字 (2004) 第 2040A01521 号， 批号 20080604， 每包重 6g， 儿童临床用量每日 3 包。该药对小儿 脾胃虚弱， 脘腹胀满， 挑食厌食等有辅助改善作用， 由山楂、 麦芽、 生姜、 扁豆、 山药、 砂仁、 陈 皮、 鸡内金、 茯苓、 甘草等组成。经药效学实验 2 证明该药可促进动物胃肠运动， 并对食欲有 一定促进作用。
对照组 ： 香砂六君子汤药物组成包括 ： 人参 3 克， 白术 6 克， 茯苓 6 克， 甘草 2 克， 陈 皮 2.5 克， 半夏 3 克， 砂仁 2.5 克， 木香 2 克 ； 功效为 ： 补气健脾， 行气化痰 ； 主治脾胃气虚， 痰阻气滞， 可见恶心呕吐， 胸脘胀闷， 不思饮食， 消瘦倦怠， 或气虚肿满。该方是在六君子汤
方基础上加用木香和砂仁两味药物组成， 临床用于治疗脾胃气虚或有酿生湿痰， 痰阻气滞 的虚实夹杂患者的食欲不振， 腹胀满闷等有较好的效果。香砂六君子汤药材购自广州中医 药大学第一附属医院中药房。
LP 为 Sigma-aldrich 公司产品， Lot ： 108K1538， 1mg 溶于 2mL 生理盐水中， 分装 成 200μL 一个的小包装， -40℃保存。水合氯醛为国药集团化学试剂有限公司产品， 批号 20080325， 配成 10％溶液， 0.33mL/kg 腹腔注射用 ； 10％过氧化氢 ( 以蒸馏水配制 )， 庆大霉 素 0.72 万 U/kg/10mL。
小动物脑立体定位仪 (Cat No. ： MP8002， SN ： 06041714)、 套管针 ( 包括针套和针 芯 )、 注射内管、 注射软管、 锁紧螺帽和微量注射器均来自深圳市瑞沃德生命科技有限公司 ； 套管针进行如下改造 ： 把针灸针剪成 0.4cm 左右长度， 用 502 胶竖直黏在套管针针套金属部 位的上半部 ； 手表用直径为 0.8mm 小螺丝及配套用的螺丝刀， 购自广州火车站旁边站西钟 表配件市场 ； 针灸三棱针 ； 手术用刀片和镊子， 小药勺， 眼科镊子， 钳子等 ； 以上手术易耗品 用前在 75％酒精中浸泡 30min 以上， 用前从酒精中取出晾干， 待酒精挥发后使用。
NPY 采用放射免疫分析法， 检测厂家为解放军总医院科技开发中心放免所 ( 北 125 京) ； 试剂盒 ： 碘 [ I] 神经肽 Y 放射免疫分析药盒， 药盒批号 20090020， 生产厂家为解放军 总医院开发中心放免所 ； 检测仪器为 Sn-695B 型免疫分析仪。 2. 实验方法
2.1 造模方法及分组处理
SD 大鼠饲养至 300g 左右开始造模， 造模方法同 ( 实验 1)， 造模后大鼠单笼正常饲 养。1 周后给大鼠按体重分为 4 个组， 正常组、 模型组、 山楂麦芽颗粒组和香砂六君子汤组， 其中正常组每日 1 次侧脑室注射生理盐水， 其余 3 组大鼠每日 1 次侧脑室注射瘦素。侧脑 室注射瘦素后灌胃给受试药， 山楂麦芽颗粒组每日灌胃给山楂麦芽颗粒， 香砂六君子组每 日灌胃给香砂六君子汤水提液， 其他 2 组每日灌胃给蒸馏水。每日记录体重和进食量。
受试药剂量设置 ： 药效学研究证实山楂麦芽颗粒 8g/kg 组有效， 故本实验仍采用 该剂量， 药物用蒸馏水研磨后给大鼠灌胃。香砂六君子汤按传统药物配方比例， 第一次加 10 倍量水浸泡 4h 后煎煮， 水开后煮 40min 后将药液倒出， 再加 8 倍量直接煎煮， 水开后再 煮 30min 后将药液倒出， 两次水提液合并， 浓缩至药物含量为 13.6g/kg/10mL， 约为人体用 量的 15 倍， 灌胃给药。
给药共 7 天， 第 8 天上午乙醚麻醉大鼠后， 眼眶取血， 取血前离心管提前加 40μL 10 ％ EDTA·2Na 和 60μL 1μg/mL 抑肽酶 ( 每 2mL 血液 ) 混匀以抗凝血， 之后把血液在 4℃ 4000r/min 离心 10min， 取上清即血浆冷冻保存。取血后处死大鼠， 剪下头颅， 取出下丘 脑， 用来检测 NPY 含量， 方法为 ： 用滤纸稍微吸一下水分， 称重后用生理盐水手工研磨， 生理 盐水量为下丘脑重量的 20 倍， 如下丘脑重量为 50mg， 则加 1mL 生理盐水， 研磨后 4℃ 3000r/ min 离心 10min， 取上清， 冷冻保存。
神经肽 Y 检测方法 ： 分别提取血浆、 下丘脑离心上清液、 标准液 0.2mL， 加入抗血 清， 混匀， 置 4℃环境 48h ； 加入 125I 标记的 NPY， 4℃过夜 ； 然后加入分离剂， 分离结合与游 离的 125I 标记的 NPY ； 最后用 γ 计数器检测沉淀物的 “cpm” 数值， 根据标准曲线和样品管 B/B0 百分数计算血浆与下丘脑离心上清液 NPY 免疫活性物质浓度， 单位为 “pg/L” 。
2.2 统计学处理
用 SPSS13.0 统计软件包， 各组动物平均体重的分析采用单因素方差分析， 折线图 以 Powerpoint 绘制， 各组动物检测的下丘脑和血浆的 NPY 的含量也用单因素方差分析。
3. 结果
3.1 大鼠大体形态
4 个组的大鼠在实验期间整体状态比较稳定， 体质较好， 其中脑室埋针后至开始脑 室给药前， 大鼠死亡 1 只， 2 只套管针脱落， 在给药期间死亡 2 只大鼠， 有 7 只套管针脱落， 总 成功率为 83％。
3.2 大鼠食量的变化
见表 9 和图 1， 模型组、 山楂麦芽颗粒、 香砂六君子汤组大鼠进食量明显低于正常 组。
表 9 造模后大鼠食量变化注： 与模型组比较， *P ＜ 0.05
3.3 大鼠体重的变化
模型组、 山楂麦芽颗粒、 香砂六君子汤组大鼠造模第 2 天开始体重明显下降， 之后 一直呈下降趋势 ( 图 2)。
3.4 放免检测大鼠下丘脑和血浆 NPY
结果见表 10 和图 3-4。模型组下丘脑 NPY 含量明显低于正常组， 提示侧脑室注射 LP 后抑制了 NPY ； 香砂六君子汤组下丘脑 NPY 含量明显高于模型组， 说明该药对造模所致的 NPY 下降有改善作用 ； 但各组血浆 NPY 含量差异没有统计学意义。
表 10 大鼠下丘脑和血浆 NPY 含量 (ng/mL)
注： 与正常组比较， *P ＜ 0.05 ； 与模型组比较， **P ＜ 0.05
4. 结论
本实验中选择山楂麦芽颗粒和香砂六君子汤作为我们的受试药研究健脾消食类 中药对中枢性厌食动物模型的调控作用。 山楂麦芽颗粒以山楂、 麦芽为主药消食化积行滞， 山楂善消肉食， 麦芽善消面食， 鸡内金磨积化瘀， 健脾助运 ； 茯苓、 山药补脾养胃， 化湿止泻 ； 砂仁、 陈皮行气化湿、 补而不滞 ； 生姜开胃醒脾， 甘草调和诸药， 共成健脾和胃， 消食化积之 功。 该药由消食药、 健脾药和行气药配伍组成， 其配伍组成方法非常符合健脾消食类方药的 特点。香砂六君子汤出自 《太平惠民和剂局方》 ， 由党参、 白术、 茯苓、 木香、 砂仁、 炙甘草、 陈 皮、 法半夏等 8 味药组成， 是在四君子汤补气的基础上合用行气化痰之品， 具有益气健脾， 行气化痰之功效， 主治脾胃气虚， 痰阻气滞证所致的呕吐痞闷， 不思饮食， 脘腹胀痛， 消瘦倦 并能 怠， 或气虚肿满等。 香砂六君子汤临床广泛用于治疗功能性和部分器质性胃肠道疾病， 缓解其他原因导致的消化道功能障碍的症状。以这两个方作为健脾消食中药的代表方剂， 阐明其作用途径对于我们研究其他健脾消食中药的作用机理大有裨益。
在侧脑室注射瘦素致厌食症的动物模型上， 我们以香砂六君子汤和山楂麦芽颗粒 为受试药观察了中药对小儿厌食症的治疗作用。 与模型组比较两种药物都缓解了动物体重 下降的趋势， 但并没有提高动物进食量， 推测是药物提高了动物对食物的利用率所致。 山楂 麦芽颗粒和香砂六君子汤组都有提高下丘脑 NPY 含量的趋势， 香砂六君子汤组和模型组比 较有差异， 山楂麦芽颗粒组和模型组比虽没有统计学意义， 但相信增加样本量或调整用药 剂量可取得更好的效果 ； 两个药对血浆 NPY 含量都没有改变， 估计是血浆中的 NPY 于食欲中 枢作用比较有限， 也可能是取血时操作不慎造成血液溶血， 从而影响了 NPY 的检测。
瘦素是下丘脑中处于中枢地位的抑制食欲的脑肠肽， 可以抑制进食中枢中 NPY 的 表达， 而 NPY 是下丘脑中最重要的提高食欲的肽， 对其他很多脑肠肽都有调节作用。给中药 后动物厌食症的症状得到有效缓解， 同时提高了下丘脑中 NPY 的含量， 我们推测调节中枢 下丘脑 NPY 是健脾消食类中药治疗厌食症的主要药理作用机制之一。该研究方法也为我们 今后研究其他健脾消食中药的作用机理提供参考依据。
实验 4 ：
山楂麦芽颗粒干预厌食证大鼠 ghrelin、 leptin、 AGRP 及 α--MSH 的研究
下丘脑作为调节饮食和能量平衡的中枢， 应用脑区损伤或切除脑区的神经通路
的研究证实 ： 内侧区的弓状核 (arcuate nucleus， ARC)， 背内侧核 (dorsomedial nuclei， DMN)， 室旁核 (paraventricular nucleus， PVN)， 腹内侧核 (ventromedial nucleus， VMN) 和 外侧核 (lateral nucleus， LHA) 皆可影响摄食行为， 因而推断这些脑区中存在食欲调节通 路， 共同构成下丘脑食欲调节网络 (appetite regulation net， ARN)。 研究表明， ARN 通过各 种食欲调节因子的信号传递作用， 对摄食进行综合调节， 传递通路中的任何环节出现问题， 均可能影响摄食， 导致 EDS 的发生和发展。下丘脑分泌的食欲调节因子在这个复杂的 ARN 中充当重要的信使作用， 比如促进食欲的神经肽 Y(neuro peptide Y， NPY)、 刺鼠相关蛋白 (agouti-relatedprotein， AGRP)、 增食欲素 (hypocretin)、 甘丙肽 (galanin)、 Ghrelin 等 ； 抑制食欲的胆囊收缩素 (cholecystokinin， CCK)、 阿片黑皮素原 (proopiome lanocortin， POMC)、 α- 促黑激素 (α-MSH)、 胰岛素 (insulin)、 胰升糖素样肽 -1(GLP-1)、 Leptin 等。
1. 材料
同实验 1。
2. 方法
2.1 造模方法及分组给药
同实验 3
2.2 指标检测
下丘脑、 胃 ghrelin mRNA 及蛋白检测分别采用 Real-time PCR、 免疫组化法， Real-time PCR 委托广州达安基因公司检测， ghrelin 试剂盒购自武汉博士德公司， 检测仪 器为 ABI 3900 台式高通量 DNA 合成仪， 科大创新 HC-3018R 高速冷冻离心机， ABI 9700PCR 仪， ABI 7500 全自动荧光定量 PCR 仪。
血浆 AGRP、 α-MSH 检测采用酶联免疫分析法， 检测厂家为上海钰森生物技术有限 公司 ( 上海 ) ； 试剂盒 ： AGRP、 α-MSH 酶联免疫分析试剂盒 (R&D 公司 )， 检测仪器为酶标仪 MK3 赛默飞世尔 ( 上海 ) 仪器有限公司。
2.3 实验步骤
2.3.1 荧光定量 PCR 实验步骤
(1). 引物设计合成 ： GenBank 上查找目的基因 mRNA 序列， 在 CDS 区设计特异性引 物
i. 设计引物所用软件名称 Primer express 2.0 软件， 序列如下
I.Sequence Name ： R-ghrelin( 扩增片段长度 103bp)
Forward Primer ： 5’ -AAACTGCAGCCACGAGCTCT-3’
Reverse Primer ： 5’ -CGAAGGGAGCATTGAACCTG-3’
II.Sequence Name ： R-GAPDH( 扩增片段长度 134bp) 内参基因
Forward Primer ： 5’ -TGG TCT ACA TGT TCC AGT ATG ACT-3’
Reverse Primer ： 5’ -CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC-3’
ii. 合成引物所用合成仪型号及公司。
ABI 3900 台式高通量 DNA 合成仪。
(2) 组织总 RNA 的提取 ：
i 组织置于 1.5ml Eppendorf 管， 充分研磨， 加 Trizol 1ml。
ii 加入氯仿 0.2ml， 盖紧盖子， 用力摇动 15s， 15-30℃孵育 2-3min， 4℃ 12000r/min离心 15min， 取上清液至新的 1.5Ml Eppendorf 管
iii 加与上清液等体积的异丙醇， 15-30 ℃孵育样品 10min， 4 ℃ 12000r/min 离心 10min， 弃上清液
iv75％乙醇 ( 含 DEPC 水 )800ul 洗涤沉淀一次， 4℃ 7500r/min 离心 5min， 弃乙醇。
v 空气或真空干燥 5-10min( 不要完全干燥 )， 加 DEPC 处理水溶解 RNA， -80℃保存 备用。
表 11 下丘脑及胃 RNA 质量鉴定
(3) 逆转录反应
i 取 4μl RNA 模板做逆转录反应， 仪器为 ABI 9700 仪 ( 美国 ABI 公司 )， 反应体 系如下 ：
逆转录 buffer 成分 ： 50mM Tris-HCl(pH8.0)， 50mM KCl， 4mM MgCl2， 10mMDTT
ii 反应条件 ： 37℃ 1h， 然后 95℃ 3 分钟。
(4) 荧光定量 PCR 反应
i 阳性标准品及其梯度的制备 ： ( 标准曲线定量法 )
I 阳性标准品的制备 ： 预试验 PCR 扩增的阳性产物经过 2％低熔点琼脂糖凝胶电泳 ( 含溴乙啶， 用 TAE 缓冲液配制 )， 在长波紫外下， 割下目的条带。用回收试剂盒 (QIAquick Gel Extraction Kit) 回收纯化。测定 OD 260/280 ＞ 1.8， 表明纯度合格。用 OD260 测定 值和片段长度数据换算出浓度 (copy/μl)， 即为阳性标准品。
II 阳性标准品梯度的制备 ： 取阳性标准品 5μl 按 10 倍稀释 ( 加水 45μl 并充分 混匀 )， 依次稀释下去， 制备成阳性定量标准品梯度， 倍比稀释一定要准确， 否则影响定量结 果。每次上机必须新鲜配制阳性定量标准品梯度， 正式上机时以包含所有样本的五个梯度 上机即可。
III 阴性质控标准品采用灭菌双蒸水
ii 待测样本和阳性标准品按以下反应体系进行 ：
PCR buffer 成分 ： 10mM Tris-HCl(pH8.0)， 50mM KCl， 2mM MgCl2iii 反应条件为 ： 93℃ 3 分钟， 然后 93℃ 30 秒， 55℃ 45 秒， 72℃ 45 秒， 共 40 循环。
2.3.2 免疫组化 (SABC) 法实验步骤
(1) 石蜡切片常规脱蜡至水 ： 二甲苯 I ； 二甲苯 II ； ( 提前一天的下午 5 点将标本 放入过夜， 脱蜡务求干净 ) 无水乙醇 I ： 2min， 无水乙醇 II ： 2min ； 95％乙醇 I ： 2min ； 95％乙 醇 II ： 2min ； 85％乙醇 2min ； 60％乙醇 2min ； 自来水洗 3 遍。
(2) 蒸馏水洗 3 遍， PBS 洗 2 次 ； 双氧水 15min 浸泡， 灭活内源性酶。注意保持组 织湿润， 双氧水配置 (194 毫升甲醇加上 6ml 30％ H2O21 份 ) ； 蒸馏水洗 3 次， 水缸不用刷。 PBS 泡 5min， 1 次。
(3) 热修复抗原 (0.01M 枸橼酸缓冲液浸没切片组织， 先用微波高火第 1 遍 2.5min 煮沸， 第 2 遍是 1.5min 煮沸， 第 3 遍是 1min。中间间隔 15 分钟。最后自然冷却至室温 ； 蒸 馏水洗 2 次， PBS 冲洗 2 次。
(4) 滴加 5％ BSA 封闭液， 室温 20min， 甩去多余液体， 用卷筒纸擦干波片， 注意正反 面。
(5) 滴加 ghrelin 一抗 ( 工作浓度均为 1 ： 100)， 4℃过夜。PBS 冲洗 2min3 次。PBS I 稍短时间冲洗 1 次， PBS II 略微冲洗一次， PBS III 冲洗浸泡 2min。
(6) 滴加二抗 37℃ 20min ； PBS 洗涤 2min 4 次。
(7) 滴加三抗 SABC， 放入恒温箱 37℃ 20min。湿盒在烤箱中稍错开
(8)PBS 洗 5min 4 次， 标本放在 PBS 液中。加入 DAB 显色液 ( 先抽吸 1ml 蒸馏水， 再加入 DAB 显色液各一滴 )， 加 20 微升至标本上完全覆盖， 显色 5min 后。光镜下观察染色。 以减少非特异性染色 )， 防反应过度， 在 2 瓶蒸馏水中稍微冲洗 ( 最好冲洗 10min，
(9) 自来水冲洗 4 遍， 蒸馏水洗一次， 苏木素复染 2min， 自来水 4 瓶冲洗即可， 90％ 盐酸冲洗 10s， 分化胞浆中的苏木素， 自来水 4 瓶洗净。 60％乙醇 2 分 ； 85％乙醇 2min ； 95％ 乙醇 II ： 2min ； 95％乙醇 I ： 2min ； 无水乙醇 II ： 2min ； 无水乙醇 I ： 2min， 二甲苯 I ； 二甲苯 II。
(10) 中性树胶封片。滴 1 滴在标本边上， 盖玻片覆盖， 防气泡。
2.3.3ELISA 实验步骤
(1) 建立标准曲线， 设标准孔 8 孔， 每孔加入样品稀释液 100μl， 第一孔加标准品 100μl， 混匀后用加样器吸出 100μl， 移至第二孔， 如此反复作对倍稀释至第七孔， 最后， 从
第七孔中吸出 100μl 弃去， 使之体积均为 100μl。第八孔为空孔对照。
(2) 加样 ： 待测品孔中每孔加入待测样品 100μl。
(3) 将反应板置 37℃反应 120min。
(4) 洗板 ： 洗涤液充分洗涤 4-6 次， 滤纸上印干。
(5) 每孔加入一抗 (AGRP/MSH) 工作液 50μl， 反应板充分混匀后置 37℃ 60min。
(6) 洗板 ： 洗涤液充分洗涤 4-6 次， 滤纸上印干。
(7) 每孔加酶标抗体工作液 50μl， 反应板充分混匀后置 37℃ 30min。
(8) 洗板 ： 洗涤液充分洗涤 4-6 次， 滤纸上印干。
(9) 每孔加入底物工作液 100μl， 置 37℃暗处反应 5-10min。
(10) 每孔加入 1 滴终止液混匀。
(11) 在 450nm 处测吸光值。
2.4 统计学分析
实验数据以均数 ± 标准差 表示， 用 SPSS11.5for Windows 软件进行数据处 理与分析。One-way Analysis Of Variance(One-way ANOVA) 进行各组间方差分析， 方差 齐同时用 LSD 法， 方差不齐时用 Tambane’ S T2 法， P ＜ 0.05 为有统计学意义。检验水准为 α ＝ 0.05。
3. 结果
3.1 下丘脑、 胃 ghrelin mRNA 表达
图 5ghrelin、 GAPDH 溶解曲线， 图 6 下丘脑及胃 ghrelin 扩增曲线
表 12 下丘脑及胃 ghrelin mRNA 表达
· 注： 吃得香组与模型组比较， P ＞ 0.05。 3.2 胃 ghrelin 蛋白表达 图7： 模型组大鼠 Ghrelin 蛋白表达减少， 吃得香组 Ghrelin 蛋白表达增加。 3.3 血浆 AGRP、 α-MSH 表达表 13 血浆 AGRP、 α-MSH 表达
· 注： 吃得香组与模型组相比， P ＜ 0.05。
4. 讨论
Ghrelin 是 1999 年由日本科学家 Kojima 等人利用免疫组化方法， 在大鼠和人体 的胃黏膜 X/A 样内分泌细胞和下丘脑弓状核中发现的一种脑肠肽， 它由 28 个氨基酸组成， 是目前所知的生长激素促分泌素受体的唯一内源性配体。Ghrelin 是第一个已知的由脂肪 酸修饰的肽类， 其 N 端第 3 位丝氨酸被 n- 辛酰基修饰， 此辛酰基是 ghrelin 的发挥作用的 必需基团。在人类及大鼠体内， 24h 内 Ghrelin 浓度波动范围较大， 在摄入食物后浓度达峰 值， 夜间 Ghrelin 浓度在肥胖个体和失眠人群中较低。
Ghrelin 分布于人体多种组织器官， 如胃 ( 浓度最高， 约占全身的 20％左右 )、 大小 肠、 胰腺、 肾脏、 肝脏以及下丘脑、 垂体、 弓状核、 免疫细胞等处。Ghrelin 受体 (GHS-R) 也广 泛存在于中枢和外周组织。 GHS-R mRNA 主要在弓状核 (ARC)、 腹内侧核 (VMH) 以及海马等处 表达， 也存在于黑质、 腹侧被盖区、 背缝核及中缝核。 研究发现， 小鼠脑室和外周静脉内注射 ghrelin， 可强烈刺激小鼠食欲， 减少能量消耗， 通过减少脂肪利用而引起体重增加， 甚至可 增强生长激素缺乏小鼠的食欲。Ghrelin 通过与下丘脑 GHS-R 结合， 增加 AgRP 和 NPY 表达， 产生促进摄食效应。研究表明， 给予大鼠胰岛素及瘦素后大鼠胃内 Ghrelin 的 mRNA 增加。 存在瘦素受体缺陷的 db/db 小鼠 Ghrelin 的 mRNA 水平很低， 给予瘦素后也没有 Ghrelin 表 达增加， 提示 Ghrelin 的表达和分泌需要瘦素及其受体存在。
本研究发现侧脑室注射瘦素后， ghrelin 蛋白阳性表达减少， 予不同剂量山楂麦 芽颗粒 ( 吃得香 ) 干预后 ghrelin 蛋白阳性表达增加， 与模型组比较有统计学意义 ； 但 ghrelin mRNA 下丘脑及胃黏膜表达变化不明显。同时， 模型组中枢抑制食欲因子促黑色素 表达增加， 而促进食欲因子刺鼠相关蛋白表达减少 ； 治疗组予不同剂量山楂麦芽颗粒干预 后促黑色素表达下降， 刺鼠相关蛋白表达增加， 两组比较有统计学意义。结合现有结果， 项 目组推测山楂麦芽颗粒具有健脾和胃， 促进食欲的效应， 其效应可能是通过调控外周促进 食欲因子 ghrelin 表达， ghrelin 与其受体结合后， 透过血脑屏障， 介导下丘脑食欲调控中 枢， 调控 NPY/AGRP-MSH 系统有关 ( 图 8)。