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用于治疗糖尿病的调节 MG29 的组合物和方法
    相关申请的参考
     本申请要求提交于 2009 年 6 月 5 日， 题为 “用于治疗糖尿病的调节 MG29 的组合物 和方法 (Compositions and Methods Modulating MG29for the Treatment of Diabetes)” 的美国临时专利申请 No.61/217,926 的优先权权益， 该临时专利申请通过引用并入本文中 用于所有目的。
     关于联邦政府资助的研究的声明
     依据以下 ( 权利的 ) 授予 ： 由美国国立卫生研究院 (NIH) 授予 Jianjie Ma 博士的 RO1-AG15556， 美国政府享有本发明的某些权利。
     技术领域
     本发明涉及重组核酸和多肽组合物以及使用它们调节肌肉功能和治疗疾病的方 法。
     参考资料的并入
     随同本申请提交了计算机可读形式的序列表 ： 文件名称 ： MG29v2_seqlist_ST25. txt， 大小 68KB， 创建于 2010 年 6 月 3 日， 使用 PatentIn-3.5 和 Checker4.4.0 生成， 该文件 通过引用完整地合并在此。 背景技术
     骨骼肌三联体 (triad junction) 是由陷入细胞质中的质膜的单个凹陷部分 ( 横 管或 T 管 ) 组成， 该单个凹陷部分与肌质网 (SR) 终池的两个部分并置。通过免疫染色筛 查集中于三联体中的新蛋白质的抗体文库， 鉴定出参与兴奋 - 收缩 (E-C) 偶联和骨骼肌中 2+ Ca 调控其它方面的蛋白质。在筛查这个文库期间鉴定的一种蛋白质是新跨膜蛋白， 称为 mitsugumin 29(MG29)。
     MG29 几乎仅表达于骨骼肌纤维上， 在肾脏上观察到轻微的表达， 并包含使该蛋白 质集中于三联体横 (T-) 管膜和 SR 膜中的四个跨膜结构域。这种亚细胞分布提示 MG29 可 以介导 T- 管膜和连接 SR 膜之间的通讯。 MG29 蛋白质结构与神经递质释放所必需的跨膜蛋 白的突触素 (synaptophysin) 家族成员的氨基酸序列同源， 并与该突触素家族成员具有共 同的典型结构特征。
     突触素起初被鉴定为小突触囊泡中丰富的高度免疫原性膜蛋白， 也在致密核心的 嗜铬和神经分泌颗粒中发现。突触素及其同源物突触孔蛋白 ( 或突触素 II) 和泛有小泡蛋 白 (pantophysin) 与四个跨膜区具有共同的跨膜组织机构 (organization)， 并具有共同的 胞质氨基和羧基末端。
     突触素的独特特征在于它具有低聚结构， 因此有人提出突触素可能是在神经递质 释放期间形成的融合孔成分。而且 Alder 等人已证明与突触素 mRNA 互补的反义寡核苷酸 可以降低通过注射全脑 mRNA 诱导的爪蟾卵母细胞的 Ca2+- 依赖性谷氨酸盐分泌。显微注射 到运动神经元中的突触素抗体阻断了神经肌肉传导。 这些数据与突触素是神经递质分泌所必需的事实一致。 然而， 鉴定突触素功能的遗传途径尚未成功 ； 缺少突触素的突变小鼠表现 出正常的表型。这可以反映出突触孔蛋白或其它突触素家族成员的代偿作用。事实上， 突 触素和突触孔蛋白 (synaptogyrin) 都有缺陷的小鼠的突触可塑性存在缺陷。
     已提出突触素在囊泡形成中起结构作用。由于突触素具有强的结合胆固醇的能 力， 因而它与突触囊泡生物发生期间形成膜曲率有关。还已知突触素可以与突触囊泡膜 的其它蛋白质， 即， 小突触囊泡蛋白 (synaptobrevin) 和液泡膜 H+-ATPase 紧密相互作 用。据认为， 这些相互作用可以在 SNARE 复合物或融合孔形成的水平上调节胞吐膜融合 (exocytotic membrane fusion)。酵母液泡融合的研究支持后者的观点， 该研究暗示液泡 ATPase 直接参与膜融合。
     MG29 和突触素之间的相似性激起人们研究 MG29 是否对骨骼肌中膜结构的调节起 着重要作用。骨骼肌在性质上是最具可塑性的组织之一， 并且正常肌肉生理需要形成和维 持复合物膜结构。在整个发育过程中， 老化和包括疲劳在内的其它过程需要不断地改变骨 骼肌系统， 因而与骨骼肌膜结构可塑性相关的基因和蛋白质的鉴定和表征， 是理解肌肉生 理， 以及治疗和诊断与包括糖尿病在内的肌肉功能障碍相关的病状所必需的。
     骨骼肌是在躯体神经系统的控制下存在的横纹肌组织形式。它是三种主要肌肉 类型之一， 其它两种是心肌和平滑肌。对于人， 骨骼肌占据胰岛素敏感性葡萄糖代谢多达 80％， 以及占据整体葡萄糖代谢的大部分。骨骼肌的胰岛素抗性 (IR) 是代谢疾病的主要危 险因素， 并且是 2 型糖尿病、 肥胖症和高血压的特征。大量文献认同， 葡萄糖代谢的近端步 骤 (proximal steps)， 葡萄糖递送、 转运和磷酸化那些为健康中胰岛素作用的关键点以及 为骨骼肌胰岛素抗性的决定因素。
     因此， 要确定代谢性疾病如肥胖症和胰岛素抗性糖尿病中存在的缺陷性质， 就必 须理解肌肉葡萄糖利用的机制和调节过程。 葡萄糖转运， 葡萄糖利用的起始步骤， 通常被认 为是肌肉中葡萄糖利用的速率决定步骤。 评估决定葡萄糖利用的转运和磷酸化平衡的一种 途径是确定这些过程是如何在细胞水平上偶联的。
     糖尿病是代谢障碍， 其特征是由于胰脏朗格汉斯岛中生产胰岛素的 β 细胞减少 ( 其导致胰岛素缺乏 ( 即， I 型糖尿病 ))， 和 / 或由于胰岛素抗性 ( 即， II 型糖尿病或 NIDD) 而无法控制血糖水平。
     I 型糖尿病可以进一步分为免疫介导性或特发性 (idiopathic， 先天性 )。大多数 I 型糖尿病属于免疫介导性， 其中 β 细胞减少是 T 细胞介导的自身免疫攻击。目前还没有 对抗 1 型糖尿病的预防措施， 导致北美和欧洲近 10％的糖尿病病例。 疾病发作时， 大多数受 感染者在其它方面是健康的并具有健康的体重。对胰岛素的敏感性和反应通常是正常的， 尤其是在早期阶段。1 型糖尿病可以感染儿童或成人， 习惯上称为 “青少年糖尿病” ， 它表示 儿童糖尿病病例占多数。
     对于 II 型糖尿病， 据认为身体组织对胰岛素的缺陷性反应与胰岛素受体有关。但 目前还不清楚具体的缺陷。在 II 型糖尿病早期阶段， 突出的异常降低了胰岛素敏感度。在 这个阶段， 高血糖症一般可以通过提高胰岛素敏感度或降低肝脏产生的葡萄糖量的各种措 施和药物治疗逆转。 随着该疾病的进展， 胰岛素分泌开始受损， 而且有时某些患者可能需要 更换胰岛素治疗。
     如果可用的胰岛素量不足， 如果细胞对胰岛素的反应不佳 ( 胰岛素不敏感或胰岛素抵抗 )， 或者如果胰岛素本身有缺陷， 那么葡萄糖将无法发挥平常的作用， 致使葡萄糖不 能被需要它的那些机体细胞适当地吸收， 也不能适当地储存在肝脏和肌肉中。所产生的结 果就是血糖水平持续较高、 蛋白质合成不佳， 以及其它代谢扰乱如酸中毒。
     当血液中葡萄糖浓度升高到超出它的肾阈 (renal threshold)( 约 10mmol/L， 但 这个值在某些情况下可以变化， 如怀孕时 ) 时， 近端肾小管对葡萄糖的重吸收不完全， 部分 葡萄糖余留在尿 ( 糖尿 ) 中。这致使尿渗透压增高， 抑制肾脏对水的重吸收， 导致产尿量增 加 ( 尿频 )、 体液丧失量增多。 体细胞和其它身体分区中保持水将渗透性地补偿丢失的血容 量， 导致脱水和口渴增多。
     胰岛素治疗不充分可能会导致急性并发症， 包括低血糖、 糖尿病酮症酸中毒、 非酮 症性高血糖， 或非酮症高渗性昏迷。严重的长期并发症包括心血管疾病， 如心脏病发作、 中 风、 动脉疾病 ( 例如， 冠状动脉疾病 )， 神经病变， 肾衰竭， 视网膜损伤， 勃起功能障碍， 失明， 伤口愈合缓慢和截肢。
     截至 2000 年， 全世界至少 1.71 亿或 2.8 ％的人口罹患糖尿病。2 型糖尿病目前 为止是最常见的， 影响美国糖尿病人口的 90 ～ 95％ (Wild S， Roglic G， Green A， Sicree R， King H(May 2004). ″ Global prevalence of diabetes ： estimates for 2000and projections for 2030″ .Diabetes Care 27(5) ： 1047-53)。因此， 不断地需要研制用于 治疗与包括糖尿病在内的肌肉功能障碍相关的病症的肌肉功能药物调节剂。 发明内容 本发明涉及参与肌细胞葡萄糖代谢的基因、 蛋白质和过程的令人惊讶的意外发 现。特别地， 本发明提供了编码 MG29 多肽及其生物活性部分的核酸 ( 在此分别称为 “MG29 多肽” 和 “MG29 核酸” )、 与编码 MG29 多肽及其生物活性部分的核酸互补的核酸、 包含它们 的载体和 / 或宿主细胞、 MG29 多肽和融合蛋白、 对 MG29 表位具有特异性的抗体或抗原结合 结构域、 内源性 MG29 基因或外源性 MG29 转基因的表达被调节的宿主细胞和转基因生物。
     在另外的方面， 本发明提供了筛选调节 MG29 的活性、 转录和 / 或翻译 ( 即， 表达 ) 的化合物的诊断分析和方法， 以及使用其的方法。
     在进一步方面， 本发明提供了用作治疗和预防糖尿病的治疗剂的组合物。本发明 治疗组合物包含 MG29 多肽和融合蛋白、 编码 MG29 多肽的核酸， 以及与编码 MG29 的核酸互 补的核酸， 包括含核糖的核酸。本发明的这个方面也包括 MG29 突变体、 同源物、 片段、 截短 体 ( 截断体， truncations)、 假肽 ( 拟肽， pseudopeptides)、 肽类似物， 和模拟肽。
     在另一方面， 本发明提供了可调节 MG29 的活性、 转录和 / 或翻译 ( 即， 表达 ) 的 化合物。如本文所述的， MG29 是对包括葡萄糖代谢在内的正常肌肉功能至关重要的细胞结 构和生理过程的重要构成部分。因此， 靶向和调节 MG29 基因表达、 多肽合成、 活性或蛋白 质 - 蛋白质相互作用是治疗与包括例如糖尿病在内的肌肉功能障碍相关的病状的新治疗 干预。
     先前的研究结果表明， MG29 功能和 / 或基因表达异常导致肌肉功能障碍和老化。 如本文所述的， 我们已令人惊讶地意外发现， MG29 可以用作血糖调节剂， 因而它的调节对治 疗糖尿病有用。特别地， MG29 蛋白与作为该过程重要参与者的其它因素相互作用从而将葡 萄糖从血流吸收到骨骼肌中。因此， 本发明也提供了可以调节 MG29 在骨骼肌中的表达和 /
     或活性从而辅助治疗糖尿病的组合物和方法。如本文所述的调节 MG29 基因表达控制机制 提供了治疗糖尿病和其它肌肉疾病的有效工具。
     在某些另外的方面， 本发明提供了与糖尿病诊断、 治疗或改善相关的组合物和方 法。 在某些示例性实施方式中， 本发明包括， 例如， 给予有效量的本发明治疗组合物， 用于预 防和 / 或治疗糖尿病。在某些实施方式中， 该治疗组合物包含核酸， 包括调节 MG29 活性、 转 录和 / 或翻译的抑制性核酸 ( 例如， 反义和 / 或干扰核酸 )、 重组 MG29 多肽， 和 / 或能够调 节 MG29 活性、 转录和 / 或翻译的小分子。在其它实施方式中， 本发明涉及对诊断或监测与 肌肉功能相关的疾病或病症有用的诊断组合物， 该组合物包含与 MG29 编码核酸如 MG29 基 因或 RNA 的至少一部分互补或能够与其杂交的核酸。
     本发明进一步提供了本文所述的任何发明。
     前面的一般实用领域仅用于举例， 并不限制本公开内容以及所附权利要求的范 围。本领域技术人员根据本发明权利要求、 说明书和实施例， 可以理解与本发明组合物、 方 法和工艺关联的另外的目的和优点。例如， 本发明各个方面和实施方式可以许多组合形式 利用， 本说明书明确地考虑了所有这些组合。这些另外的优点、 目的和实施方式明确地包 括在本发明范围内。本文为了阐明本发明背景， 以及在特定情况下为了提供关于实施的另 外的细节而使用的出版物和其它资料通过引用合并在此， 并出于方便而列在所附文献目录 中。 附图说明
     合并在本发明书中， 并形成本说明书的一部分， 示出本发明多个实施方式的附图， 与本说明书一起解释本发明的原理。附图仅用于说明本发明的实施方式， 而不应解读为限 制本发明。
     图 1. 人的 MG29 蛋白仅表达在骨骼肌和肾脏上皮中。使用单克隆抗 -MG29 抗体 ( 底部 ) 或对照未免疫 IgG( 顶部 ) 对石蜡包埋的多组织微阵列 (MTA) 进行染色。暗紫色信 号表示 MG29(SEQ ID NO ： 3， 4) 的表达。虽然 MG29 大量地表达于骨骼肌 (A) 上， 但它也出现 在肾脏上皮层 (epithelial lining)(B、 C) 中。在心脏 (D) 和所测试的所有其它组织 ( 包 括肺、 睾丸、 肝、 脾、 脑等 ) 中无表达。
     图 2.MG29 主要表达在骨骼肌中。使用对 MG29(SEQ ID NO ： 1) 具有特异性的探针 对各种小鼠组织进行 Northern 印迹分析 (RNA 印迹分析 )。 在肾脏中观察到极小的表达， 而 在骨骼肌中观察到丰富的表达。
     图 3. 正常个体和 2 型糖尿病患者骨骼肌中的 MG29 增大。 从正常个体 (NGT) 和 2 型 糖尿病患者采集肌肉样品。(A) 执行 Western 印迹 ( 蛋白质印迹 ) 测量 MG29 和肌动蛋白的 表达水平从而使 MG29 表达水平标准化。 (B) 使用密度测定法 ( 密度计量学， densitometry) 量化并使用 ImageJ 软件分析蛋白质表达。该条形图表明更多的 MG29 显著表达于糖尿病人 患者骨骼肌中。结果表示为平均值 ±SEM.N ＝ 6.* ： P ＜ 0.05
     图 4. 人糖尿病骨骼肌上的 MG29 定位模式发生改变。示出正常人骨骼肌 ( 顶部 ) 和 2 型糖尿病患者骨骼肌 ( 底部 ) 中内源性 MG29 的定位。用 MG29 抗体 ( 左侧 ) 对多聚 甲醛固定石蜡包埋的切片进行免疫染色， 然后通过共聚焦显微镜检查。利用亮视野显微镜 ( 右侧 ) 确立肌纤维定位并确定组织切片质量。图 5.MG29 缺失 (mg29-/-) 小鼠对葡萄糖负荷 ( 葡萄糖挑战， glucose challenge) 的反应受损。在腹膜内推注葡萄糖溶液后， 测量小鼠的空腹血糖水平。(a) 雄性 mg29-/- 小 鼠在葡萄糖负荷后表现出显著较高的血糖水平。 时间 0 等于注射时间。 (b) 雌性 mg29-/- 小 鼠在葡萄糖负荷后表现出显著较高的血糖水平。(c) 汇总来自雄雌小鼠的平均数据。通过 ANOVA 分析， 其中 * ： P ＜ 0.05 ； ** ： P ＜ 0.01 ； ***P ＜ 0.001。
     图 6.MG29 缺失 (mg29-/-) 小鼠对胰岛素负荷的反应受损。在图表中的时间 0 时 腹膜内推注胰岛素后， 测量小鼠的空腹血糖水平。 MG29(mg29-/-) 小鼠的反应达不到与野生 型 (WT) 对照的反应相同的水平。这表明， mg29-/- 小鼠中骨骼肌摄取葡萄糖的能力受损。 示出平均值 ±SEM。利用 ANOVA 分析， 其中 ** ： P ＜ 0.01 ； ***P ＜ 0.001。
     图 7. 当用高脂食物饲喂时 MG29 缺失 (mg29-/-) 小鼠罹患糖尿病的速度较快。用 高脂食物饲喂几组小鼠， 然后测量它们的体重和血糖变化。 (a) 当在图表中的 0 周开始用高 脂食物饲喂时， MG29 和野生型 (WT) 小鼠的体重以相同速率增加。(b) 当通过腹膜内推注葡 萄糖进行负荷试验时， mg29-/- 小鼠不能如 WT 小鼠那样有效地清除葡萄糖， 表明 mg29-/- 小 鼠比 WT 小鼠更快地罹患糖尿病表型。利用 ANOVA 分析， 其中 * ： P ＜ 0.05。
     图 8. 在分离的小鼠肌肉中通过改变 MG29 表达水平调节葡萄糖摄取。从野生型 (WT) 小鼠、 mg29-/-(MG92KO) 小鼠或由于用重组 AAV(WT-MG29) 处理而过表达 MG29 的 wt 小鼠中切出比目鱼肌 (SOL) 或趾长伸肌 (extensor digitorum longus， EDL)。测试这些肌 肉在暴露于胰岛素 (200nM) 之前和之后摄取放射性标记的 2- 脱氧葡萄糖 (2-DG) 的能力。 mg29-/- 小鼠表现出较 wt 小鼠显著减小的 2-DG 摄取能力， 而 MG29 过表达小鼠表现出增大 的葡萄糖摄取能力。这些研究结果表明， MG29 是胰岛素刺激的葡萄糖摄取所必需的， 而且 在肌细胞内提供另外的 MG29 可以增大葡萄糖摄取。因而， 提高 MG29 表达是降低血糖水平 治疗糖尿病的可行途径。值为 5 ～ 10 块肌肉的平均值 ±SEM。*P ＜ 0.05 ； **P ＜ 0.01。 2+
     图 9.db/db 肌肉中的 Ca 火花活性 (spark activity) 受损依赖于高血糖病症。 (a) 用载体 ( 左侧 ) 或 GLP1( 右侧 ) 处理的 db/db 肌肉 ( 顶部 ) 或野生型肌肉 ( 底部 ) 中 Ca2+ 火花的代表性线扫描图像。注意， 通过使用 GLP1 可以逆转 db/db 肌肉中 Ca2+ 火花频率 的大幅降低。(b)GLP1 对表现出高的高血糖病症的 db/db 小鼠的发挥活性最大。结果为平 均值 ±SEM。 ANOVA 分析为 统计学上显著的 (p ＜ 0.01)。 高血糖是指测得血糖＞ 330mg/dL 的动物。低血糖是指测得血糖＜ 260mg/dL 的动物。未经处理的高血糖 (HBG) 组 n ＝ 534， 经处理的高血糖 (HBG) 组 n ＝ 851， 未经处理的低血糖 (LBG) 组 n ＝ 730， 经处理的低血糖 (LBG) 组 n ＝ 555。
     图 10. 糖尿病骨骼肌中的 Ca2+ 火花信号降低。 (a) 用低渗冲击 (hypotonic shock) 2+ 处理分离的 FDB 肌纤维从而产生 Ca 火花反应。示出渗透冲击 ( 左侧 ) 后的糖尿病 FDB 肌纤维的横截面线扫描图像。用 GLP1 迅速 ( 急剧， acutely) 处理的糖尿病 (db/db) 纤维 2+ 表现出显著增强的 Ca 火花活性 ( 右侧 )。(b)WT 纤维表现出强大的 Ca2+ 火花信号。(c) 使用定制的 IDL 数据处理软件程序确立火花的定位。糖尿病骨骼肌纤维表现出降低的外 周 Ca2+ 火花频率 ( 左侧 )。GLP1 对 db/db 纤维的处理没有改变外周肌膜下 ( 肌纤维膜下， subsarcolemmal)Ca2+ 火花分布， 暗示虽然糖尿病纤维中的 Ca2+ 信号级联发生改变， 但负责 2+ 维持该膜附近 Ca 火花定位的因素仍然是完整的 ( 右侧 )。伪彩色 (pseudocolor) 代表纤 维内每个点处 Ca2+ 释放事件的平均强度。图 11.GLP1 处理提高糖尿病 EDL 疲劳后的肌力。(a) 示出对照 ( 上部 ) 和经 GLP1 处理的 EDL 的力量与频率的关系的代表性迹线 (trace)。 首先以 30s 的间隔向糖尿病肌肉施 加一系列电场刺激 (5 ～ 140Hz)， 然后以 2ms 的间隔用 20Hz 刺激诱导疲劳 5 分钟。以 1min 的间隔用 20Hz 刺激使 EDL 糖尿病肌肉恢复， 持续 30 分钟， 将 100nM GLP1 加入到浸浴溶液 ( 浴溶液， bathing solution) 中 1 小时 ( 该迹线截短部分 )。紧接着， 利用相同范围的刺 激执行另一种力量与频率。黑箭头指定 Tmax， 空心箭头指出疲劳、 恢复和截短体的 GLP1 温 育部分。(b) 计算用 GLP1 处理之前和之后的糖尿病和 (c)WT 疲劳后的 Tmax( 最大力 ) 和颤 搐力 (twitch force)( 在 1Hz 下的力 ) 与疲劳前的力的比率。空白条表示未经处理的组， 填充条表示用 GLP1 处理的组。N ＝ 5， *P ＜ 0.05。(d) 该图组总结了未经处理组 ( 左侧 ) 和经 GLP1 处理组 ( 右侧 ) 中每块 EDL 肌肉的 5 对力量与频率关系。实心正方形表示疲劳 之前的力量与频率关系， 空心的正方形表示疲劳之后的力量与频率关系。所有数据都表示 为平均值 ±S.E。
     图 12. 糖尿病肌肉中的 MG29 表达发生改变， 自噬 ( 自体吞噬， autophagy) 作用增 强。Western 印记分析表明， I 型糖尿病小鼠 (akita) 或 II 型糖尿病小鼠 (db/db) 糖尿病 肌肉中 MG29 蛋白水平增大。这种增大的发生与每只小鼠血糖中的葡萄糖浓度直接相关。 这可以构成对糖尿病小鼠血糖水平增大的反应而产生的糖尿病肌肉代偿反应， 试图提高骨 骼肌摄取葡萄糖的能力。另外， 如自噬标记物微管相关蛋白轻链 3(LC3) 转换的增大所指示 的， 这两种糖尿病模型肌肉中的自噬作用都增强。 图 13.MG29 和 Glut4 发现于同一细胞内囊泡中。用 GFP-MG29 或 RFP-Glut4 荧光 融合蛋白共转染异源性 Hela 细胞 ( 顶部 ) 或同源 C2C12 细胞 ( 底部 )。用共聚焦显微镜发 现这两种蛋白质出现在这两种细胞类型的同一细胞内囊泡中。 这揭示这两种蛋白质可以在 体内发生物理相互作用。
     图 14. 用 GLUT4-EGFP 转染 C2C12 细胞， 然后用图中指示的不同量的 AAV 病毒感染 该细胞。随机检查每个器皿中的 25 个细胞， 将具有 GLUT4-EGFP 膜分配模式的细胞记为阳 性细胞。然后， 通过使用所检查的所有器皿中的细胞裂解液 (cell lyses) 执行 western 印 迹检测 MG29 水平。收集三个独立实验的数据， 对每组的共 75 个细胞进行计算。
     图 15. 重组 AAV 可以在天然骨骼肌中产生 MG29 表达。(a) 示出构建重组 AAV 构 建体的原理图， 该构建体设计用于产生肌肉特异性 MG29 表达。(b) 用 SSV9-FLAG-MG29 感 染 C2C12 肌管细胞或非肌肉 HEK293 细胞。Western 印迹分析表明时间依赖性 MG29 表达局 限于肌细胞。(c) 向腓肠肌 (gastronemius muscles) 注射 SSV9-FLAG-MG29 或 SSV9- 空载 体 ( 对照 )， 并在 5 天后取出肌肉。Western 印迹分析表明 MG29 表达与同一动物对照肌肉 相比增大， 重组 MG29 的 FLAG 标签存在于所注射肌肉中。病毒滴度和温育时间的优化应当 可以增大肌肉中的 MG29 表达水平。
     图 16. 通过运动上调 MG29 蛋白表达。使小鼠经受一次跑台运动 (treadmill exercise)， 然后解剖小鼠， 检查运动停止后各个时间点的 MG29 表达。MG29 表达立即增大， 在运动后持续增大并在 24 小时达到峰值。随着时间的推移 MG29 水平开始回到基线。肌动 蛋白水平用作负载变化的对照。
     图 17.mg29mRNA 的 3’ UTR 中 特 定 成 分 是 转 录 后 调 节 所 必 需 的。(a) 用 pFLAG-MG29( 仅 mg29cDNA 序列 ) 或 pCDNA-MG29(cDNA+3’ UTR) 转染 C2C12 成肌细胞。全细
     胞提取物用于 MG29 和 β- 肌动蛋白 ( 左侧 )Western 印记分析。还对来自这些经转染的 C2C12 细胞的样品进行半定量 RTPCR( 右侧 )。重复孔来自不同的实验。所有细胞中都存 在丰富的 mg29mRNA， 但仅在不存在 3’ UTR( 即， pFLAG-MG29) 时才观察到蛋白质， 表明 MG29 的转录后调节受 3’ UTR 控制。(b) 组装一系列全长鼠类 mg29mRNA 的 3’ UTR 的缺失构建 体。这些表达质粒包含编码 MG29 的序列和 3’ UTR 的各种缺失。(c) 将这些缺失构建体转 染到 C2C12 成肌细胞中， 3 天后将该细胞裂解用于 Western 印迹分析。虽然编码 mg29 的序 列 (Fg-MG29) 容易表达于 C2C12 细胞中， 但 C2C12 细胞中全长 (FL)mRNA 没有产生 MG29 蛋 白。缺失构建体 F1 和 F2 没有产生 MG29 蛋白， 但 F3 和 F4 构建体可以产生丰富的蛋白。这 表明， mg29mRNA 的 UTR 的 3’ 端的特定区域是转录后调节所需要的。 具体实施方式
     下面将描述与所述的令人惊讶的出乎预料的发现 ( 即， MG29 是控制骨骼肌调节血 糖的功能的过程中的重要结构和功能成分 ) 相关的组合物和方法。
     下面是本发明的详细描述， 为了便于本领域技术人员实施本发明而提供。本领域 技术人员在不背离本发明的精神或范围的情况下可以对本文描述的实施方式作出各种修 改和变更。除非另有限定， 否则本文使用的所有科学技术术语都具有与本发明所属领域技 术人员通常理解的相同的含义。本发明说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方式， 而 不是限制本发明。本文提及的所有出版物、 专利申请、 专利、 图和其它参考文献都通过引用 完整地明确合并在此。 如果提供了值范围， 应当理解， 除非在上下文中明确说明， 否则该范围上下限之间 的每个中间值均保留到下限单位的十分位 ( 十分之一 )， 并且任何其它说明的范围或该所 说明范围中的中间值均包括在本发明中。除非明确排除了所说明范围中的界限值， 否则这 些较小范围的上下限可以独立地包含在同样涵盖在本公开范围内的这些较小范围中。 如果 所说明的范围包含上下限中的一个或两个， 排除那些所包含的上下限中的一个或两个的范 围也包含在本发明中。
     虽然本文描述了优选的方法和材料， 但也可以在本发明的实施或测试中使用与本 文所述的方法和材料类似或等价的任何方法和材料。 本文所提到的所有出版物都通过引用 合并在此从而公开和描述与所引用的出版物有关的方法和 / 或材料。
     必须注意， 如在本文和在所附权利要求中使用的， 单数形式的″一个″、 ″一种″ 和″该″包括复数对象， 除非上下文中另外明确说明。本文使用的所有科学技术术语具有 相同的含义。
     除非另有限定， 否则本文使用的所有科学技术术语的含义都与本发明所属领域技 术人员通常理解的相同。 完整公开内容通过引用合并在此的下列参考文献为技术人员提供 了本发明中使用的许多术语的一般定义 ： Singleton 等人， Dictionary of Microbiology nd and Molecular Biology(2 ed.1994) ； The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.， 1988) ； The Glossary of Genetics， 5thEd.， R.Rieger 等 人 (eds.)， Springer Verlag(1991) ； 和 Hale&Marham， the Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有说明， 否则如本文使用的下列术语可以具有赋予它们的下面含 义。但是， 应当理解， 本领域技术人员已知或理解的其它含义也是可能的， 并包括在本发明
     范围内。 本文提到的所有出版物、 专利申请和其它参考文献都通过引用完整地合并在此。 如 有冲突， 以包括定义的说明书为准。另外， 材料、 方法和实例仅为了说明， 而不是限制。
     如本文使用的与数值或范围有关的术语 “约” ， 反映了这样一个事实， 即， 存在本领 域公认和容许的由实际和 / 或理论限制引起的一定水平的变化。例如， 允许由某些设备运 行方式和 / 或所采取的测量方式的固有变化引起的较小变化。根据上面所述， 术语 “约” 通 常用于包括标准偏差或标准误差范围内的值。
     如本文使用的 “衍 生 物”是 由 天 然 化 合 物 直 接、 通 过 修 饰， 或通过部分置换 (partial substitution) 形成的组合物。如本文使用的 “类似物” 是指具有与天然化合物 相似但不相同的结构的化合物。
     术语 “MG29” 以一般含义用于此处， 分别指 MG29 多核苷酸或多肽， 并包括它们的生 物活性片段、 部分、 拼接变异体 (splice variants) 和同源物。参见 SEQ ID NOs. ： 1-8， 26 和 20-25。
     术语 “MG29 拮抗剂” 或 “MG29 的拮抗剂” 一般用于指能够直接或间接抑制 MG29 表 达、 翻译和 / 或活性的试剂。术语 “MG29 激动剂” 或 “MG29 的激动剂” 一般用于指能够直接 或间接增大 MG29 表达、 翻译和 / 或活性的试剂。
     术语 “多肽” 可以表示， 但决不局限于， 重组全长的多肽前体 (pro-polypeptide) 或成熟多肽形式以及生物活性形式， 包括源自全长多肽的片段或拼接变异体， 或重组产生 的截短体或部分。此外， 本发明多肽可以包括氨基酸模拟物， 和类似物。嵌合多肽的重组形 式可以根据本领域技术人员熟知的标准方法和方案制得， 该标准方法和方案包括， 例如， 在 原核和 / 或真核细胞中表达重组蛋白， 接着执行一个或多个分离和纯化步骤， 和 / 或使用肽 合成器 (peptide sythesizer) 化学合成细胞因子多肽或其部分。
     术语 “生物学活性的” 或 “生物活性的” 可以表示， 但决不局限于药剂如本发明提 供的多肽完成生理变化或反应的能力。该反应可以， 例如在细胞水平上， 例如作为基因表 达、 蛋白质数量、 蛋白质修饰、 蛋白质活性的变化， 或其组合检测到， 也可以在组织水平上， 在系统水平上， 或在生物体水平上检测到。用于监测这些表型变化的技术包括， 例如， 测 量： 细胞中或细胞上配体与其受体的结合、 细胞信号通路的活化、 细胞反应的刺激或活化、 细胞中生物活性分子的分泌或释放、 细胞增殖和 / 或分化， 或其组合。在一个实例中， 由本 发明提供的嵌合多肽的生物活性可以通过检测它调节本发明所述的血细胞生成 ( 造血， hematopoiesis)、 胸腺细胞生成 (thymopoiesis)， 和 / 或胸腺细胞发育的能力确定。
     术语 “片段” 可以表示， 但决不局限于至少 6 个 ( 连续 ) 核酸或至少 4 个 ( 连续 ) 氨基酸的序列， 该序列的长度在核酸情况下足以允许特异性杂交， 或在氨基酸的情况下足 以允许特异性识别表位或保留期望生物活性， 并且至多为小于全长序列的一些部分。
     术语 “有效量 / 剂量” 、 “药学有效量 / 剂量” 、 “药学有效量 / 剂量” 或 “治疗有效量 / 剂量” 可以表示， 但决不局限于足以预防、 抑制病症、 障碍或疾病状态的发生， 改善、 延缓或 治疗 ( 将症状缓和至某种程度， 优选完全缓和 ) 病症、 障碍或疾病状态的症状的活性药物成 分的量 / 剂量。该有效量取决于疾病类型、 所使用的组合物、 给予途径、 受治疗哺乳动物类 型、 考虑中的特定哺乳动物的身体特征、 并行的药物治疗， 和医学领域技术人员可以意识到 的其它因素。一般地， 根据该药剂的效价， 给予在 0.1mg/kg 和 1000mg/kg 体重 / 天之间的 量的活性成分。 此种化合物的毒性和治疗功效可以通过例如确定 LD50( 致使 50％群体死亡的剂量 ) 和 ED50( 对 50％群体治疗有效的剂量 ) 的细胞培养物或实验动物的标准药物程序 确定。 毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数， 它可以表示成 LD50/ED50。 优选表现出较 大治疗指数的化合物。 虽然可以使用表现出有毒副作用的化合物， 但应当注意， 要设计使此 种化合物靶向受感染组织部位的递送系统以便将对未感染细胞的潜在损害减到最小， 从而 降低副作用。从细胞培养物分析和动物研究获得的数据可以用于调配人用剂量的范围。此 种化合物的剂量优选在毒性很小或无毒性的循环浓度范围内， 包括 ED50。该剂量在这个范 围内随所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。对于本发明方法中使用的任何化合物， 治疗有效量初始可以由细胞培养物分析估计。可以在动物模型中调配剂量从而获得包括 IC50( 即， 对症状半数抑制所需的测试化合物浓度 ) 的循环血浆浓度范围， 如在细胞培养物 中测定的。此种信息可以用于更准确地确定对人有用的剂量。血浆中的水平可以通过例如 高效液相色谱测量。
     术语 “药物组合物” 、 “治疗组合物” 、 “治疗制剂” 或 “药学可接受制剂” 可以表示， 但决不局限于使本发明提供的药剂能够有效分布的组合物或制剂， 该组合物或制剂为适合 于给予到对其期望活性最有利的身体部位中， 例如， 适合于全身给予。
     适合于与例如本发明提供的核酸一起调配的药剂非限制性实例包括 ： PEG 结 合 (conjugated) 的 核 酸、 磷 脂 结 合 的 核 酸、 含 有 亲 脂 部 分 的 核 酸、 硫代磷酸酯 (phosphorothioate)、 P- 糖蛋白抑制剂 ( 如 Pluronic P85)， 其可以增强药物进入各种组 织 如 CNS 的 能 力 (Jolliet-Riant and Tillement， 1999， Fundam.Clin.Pharmacol.， 13， 16-26) ； 生物可降解聚合物如在植入后持续释放递送的聚 (DL- 丙交酯 - 共 - 乙交酯 ) 微 球 (Emerich， DF 等 人， 1999， Cell Transplant， 8， 47-58， Alkermes， Inc.Cambridge， Mass.) ； 以及负载纳米颗粒， 如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些， 其可以递送药物穿过血 脑屏障并可以改变神经元摄取机制 (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 23， 941-949， 1999)。包括核酸分子 CNS 递送在内的递送策略的其它非限制性实例， 包括以下文 献中描述的材料 ： Boado 等人， 1998， J.Pharm.Sci.， 87， 1308-1315 ； Tyler 等人， 1999， FEBS Lett.， 421， 280-284 ； Pardridge 等人， 1995， PNAS USA.， 92， 5592-5596 ； Boado， 1995， Adv. Drug Delivery Rev.， 15， 73-107 ； Aldrian-Herrada 等人， 1998， Nucleic Acids Res.， 26， 4910-4916 ； 和 Tyler 等人， 1999， PNAS USA.， 96， 7053-7058。 所有这些文献都通过引用完整 地合并在此。
     术语 “药学可接受的” 或 “药理学可接受的” 可以表示， 但决不局限于， 当适当地给 予于动物， 或人时不产生不利、 过敏或其它不良反应的实体 ( 物质， entities) 和组合物。
     术语 “药学可接受载体”或 “药理学可接受载体”可以表示， 但决不局限于， 与 药物给予相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗真菌药剂、 等渗和吸收延 缓药剂等。合适的载体描述在本领域标准参考手册 《雷明顿药物科学》 (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences) 最新版中， 其通过引用合并在此。此种载体或稀释剂的优选实 例包括， 但不局限于， 水、 盐水、 林格氏溶液、 葡萄糖溶液， 和 5％人血清白蛋白。也可以使用 脂质体和非水媒剂 (vehicle) 如不挥发油。此种介质和试剂在药学有效物质中的应用是本 领域熟知的。考虑了任何常规介质或试剂在该组合物中的应用， 除了与该活性化合物不相 容的那些。补充的 (supplementary) 活性化合物也可以掺入到该组合物中。
     术语 “全身给予 ( 系统给予 )” 是指给予途径， 例如肠道内或肠道外给予途径， 该给予使药剂全身分布， 导致血流中的药物全身吸收或积累， 随后遍及全身分布。 合适的形式部 分地取决于用途或进入途径， 例如口服、 透皮或通过注射。 此种形式不应阻止组合物或制剂 到达靶细胞 ( 即， 带负电荷的聚合物期望被递送到的细胞 )。例如， 注射到血流中的药物组 合物应当是可溶的。其它因素在本领域中是已知的， 包括阻止该组合物或制剂发挥其作用 的考虑因素如毒性和形式。 导致全身吸收的给予途径包括， 但不局限于 ： 静脉内、 皮下、 腹膜 内、 吸入、 口服、 肺内和肌内。已证明药物进入循环的速率是分子量或分子大小的函数。应 用包含本发明化合物的脂质体或其它药物载体可以潜在地使该药物定位于例如某些组织 类型， 如网状内皮系统 (RES) 的组织中。能够促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞表面 结合的脂质体制剂也是有用的。
     术语 “核苷酸” 可以表示， 但决不局限于含有磷酸化糖的 N- 糖苷键中的杂环含氮 碱基。本领域中公认的核苷酸包括天然碱基 ( 标准 )， 和本领域熟知的修饰碱基。此种碱 基一般位于核苷酸糖部分的 1′位置处。核苷酸一般包含碱基、 糖和磷酸基团。核苷酸中 的糖、 磷酸基团和 / 或碱基部分可以是未修饰或修饰的， ( 也可互换地称作核苷酸类似物、 修饰核苷酸、 非天然核苷酸、 非标准核苷酸及其它 ； 参见例如， Usman and McSwiggen， ( 出处 同上 ) ； Eckstein 等人， 国际专利公开 WO92/07065 ； Usman 等人， 国际专利公开 WO93/15187 ； Uhlman&Peyman， ( 出处同上 )， 它们都通过引用合并在此 )。 如 Limbach 等人， 1994， Nucleic Acids Res.22， 2183 概述的， 本领域中已知数个修饰核酸碱基实例。可导入核酸中的化 学修饰和其它天然核酸碱基的一些非限制性实例包括， 例如， 肌苷、 嘌呤、 吡啶 -4- 酮、 吡 啶 -2- 酮、 苯基、 假尿嘧啶 (pseudouracil)、 2， 4， 6- 三甲氧基苯、 3- 甲基尿嘧啶、 二氢尿苷、 萘基、 氨基苯基、 5- 烷基胞苷 ( 例如， 5- 甲基胞苷 )、 5- 烷基尿苷 ( 例如， 核糖胸苷 )、 5- 卤 尿苷 ( 例如， 5- 溴尿苷 ) 或 6- 氮杂嘧啶或 6- 烷基嘧啶 ( 例如， 6- 甲基尿苷 )、 丙炔、 Q 核苷 (quesosine)、 2- 硫代尿苷、 4- 硫代尿苷、 怀丁苷 (wybutosine)、 wybutoxosine、 4- 乙酰胞苷 (4-acetyltidine)、 5-( 羧基羟甲基 ) 尿苷、 5′ - 羧甲基氨甲基 -2- 硫代尿苷、 5- 羧甲基氨 甲基尿苷、 β-D- 半乳糖基 Q 核苷、 1- 甲基腺苷、 1- 甲基肌苷、 2， 2- 二甲基鸟苷、 3- 甲基胞 苷、 2- 甲基腺苷、 2- 甲基鸟苷、 N6- 甲基腺苷、 7- 甲基鸟苷、 5- 甲氧基氨甲基 -2- 硫代尿苷、 5- 甲基氨甲基尿苷、 5- 甲基羰基甲基尿苷、 5- 甲氧基尿苷、 5- 甲基 -2- 硫代尿苷、 2- 甲基硫 代 -N6- 异戊烯基腺苷、 β-D- 甘露糖基 Q 核苷、 尿苷 -5- 氧乙酸、 2- 硫代胞苷、 苏氨酸衍生 物及其它 (Burgin 等人， 1996， Biochemistry， 35， 14090 ； Uhlman&Peyman， ( 出处同上 ))。
     术语 “核酸” 或 “多核苷酸” 可以表示， 但决不局限于， 具有多于一个的核苷酸的分 子， 旨在包括 DNA 分子 ( 例如， cDNA 或基因组 DNA)、 RNA 分子、 DNA 或 RNA 类似物， 包括锁核 酸和肽核酸， 及其衍生物。该核酸可以是单链体、 双链体和多链体， 并可以包含修饰或未修 饰的核苷酸或非核苷酸或其各种混合物和组合物。本发明核酸可以直接加入， 或可以与阳 离子脂质复合， 封装在脂质体中， 或以其它方式递送到靶细胞或组织中。 该核酸或核酸复合 物可以在掺入或不掺入到生物聚合物中的情况下， 通过注射或输液泵在体外、 离体或体内 局部给予到相关组织中。
     多核苷酸可以是 DNA 分子、 cDNA 分子、 基因组 DNA 分子， 或 RNA 分子。多核苷酸 如 DNA 或 RNA 可以包括这样的序列， 其中 T( 胸腺嘧啶 ) 也可以是 U( 尿嘧啶 )。如果多 核苷酸某个位置处的核苷酸能够形成与反平行 DNA 或 RNA 链中相同位置处的核苷酸形成 Watson-Crick 配对， 则该多核苷酸和 DNA 或 RNA 分子在那个位置处彼此互补。该多核苷酸和 DNA 或 RNA 分子在这样的情况下彼此基本互补， 即， 每个分子中足够多数目的相应位置被 可以彼此杂交从而实施期望过程的核苷酸占据时。
     术语 “修饰碱基” 可以表示， 但决不局限于， 不同于 1’ 位置处的腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胞 嘧啶和尿嘧啶的核苷酸碱基或其等效物 ； 此种碱基可以用于在， 例如， 酶核酸分子催化核心 内和 / 或核酸分子底物结合区域中的任何位置处。本发明核酸分子可以广泛地修饰， 从而 通过用抗核酸酶基团， 例如， 2 ′ - 氨基、′ -C- 烯丙基、 2 ′ - 氟、 2 ′ -O- 甲基、 2 ′ -H 修 饰来增强稳定性 ( 综述参见 Usman and Cedergren， 1992， TIBS 17， 34 ； Usman 等人， 1994， Nucleic Acids Symp.Ser.31， 163)。
     术语 “衍生物” 可以表示， 但决不局限于， 由天然化合物直接、 通过修饰或通过部分 置换形成的化学组合物， 例如核酸、 核苷酸、 多肽或氨基酸。术语 “类似物” 可以表示， 但决 不局限于， 具有与天然化合物相似但不相同的结构的化学组合物， 例如核酸、 核苷酸、 多肽 或氨基酸。
     术语 “杂交” 可以指， 但决不局限于， 分子仅在低等、 中等或高等严格条件下与特定 核苷酸序列结合、 双联 (duplexing) 或杂交， 包括当该序列存在于复合物混合物 ( 例如， 总 细胞 )DNA 或 RNA 中时发生的结合、 双联或杂交。 术语 “保守性突变” 是指在编码序列中改变、 添加或消除单个氨基酸或少量氨基酸 的核酸置换、 缺失或添加， 其中该核酸变化导致化学上类似的氨基酸发生置换。 彼此可以保 守性置换的氨基酸包括以下 ： 碱性氨基酸 ： 精氨酸 (R)、 赖氨酸 (K)、 组氨酸 (H) ； 酸性氨基 酸： 天门冬氨酸 (D)、 谷氨酸 (E)、 天冬酰胺 (N)、 谷氨酰胺 (Q) ； 亲水性氨基酸 ： 甘氨酸 (G)、 丙氨酸 (A)、 缬氨酸 (V)、 亮氨酸 (L)、 异亮氨酸 (I) ； 疏水性氨基酸 ： 苯丙氨酸 (F)、 酪氨酸 (Y)、 色氨酸 (W) ； 含硫氨基酸 ： 蛋氨酸 (M)、 半胱氨酸 (C)。此外， 彼此之间的差异在于保守 性变化的序列一般是同源的。
     术语 “下调” 可以指， 但决不局限于， 基因的表达， 或编码一种或多种蛋白质的 RNA 或等效 RNA 的水平， 或一种或多种蛋白质如 MG29 多肽基因的活性降低到低于在不存在本发 明提供的药剂的情况下所观察到的。例如， 可以降低基因表达以便治疗、 预防、 改善或调节 高水平基因表达引起或加剧的病理学病症。
     术语 “上调” 可以指， 但决不局限于， 基因的表达， 或编码一种或多种蛋白质亚基的 RNA 或等效 RNA 的水平， 或一种或多种蛋白质亚基如 MG29 的活性高于在不存在本发明提供 的药剂的情况下所观察到的。例如， 可以增大基因表达以便治疗、 预防、 改善或调节由缺少 基因表达或低水平基因表达引起或加剧的病理学病症。
     “调节” 是指基因的表达， 或编码一种或多种蛋白质的 RNA 或等效 RNA 的水平， 或一 种或多种蛋白质的活性被上调或下调， 以便该表达、 水平或活性高于或低于在不存在本发 明提供的药剂的情况下所观察到的。
     术语 “基因” 可以表示， 但决不局限于编码 RNA 的核酸， 例如核酸序列， 包括但不局 限于编码多肽的节段。
     术语 “互 补 的”可 以 表 示， 但 决 不 局 限 于 核 酸 与 另 一 个 RNA 序 列 通 过 传 统 Watson-Crick、 Hoogsteen 碱基配对或其它非传统型碱基配对形成一个氢键 ( 或多个氢键 ) 的能力。
     术语 “结合” 可以表示， 但决不局限于两个分子 ( 例如， 化合物、 氨基酸、 核苷酸、 多
     肽或核酸 ) 之间直接或间接的物理或化学相互作用。结合包括共价相互作用、 氢键相互作 用、 离子相互作用、 非离子相互作用、 范德华相互作用、 疏水性相互作用等。
     术语 “等效的” 或 “同源的” 可以指， 但决不局限于， 分别与 MG29 基因 (SEQ ID NO ： 20-25) 或蛋白质 (SEQ ID NO ： 1-8、 26) 具有同源性 ( 部分或完全同源 ) 的核酸或蛋白质， 包 括那些天然存在的 DNA、 RNA 或氨基酸分子， 它们在包括人类、 啮齿动物、 灵长类动物、 家兔、 猪、 原生动物、 真菌、 植物和其它微生物和寄生虫在内的各种生物中的功能与 MG29 相似。该 等效 RNA 序列除了包括编码区之外， 还可以包括诸如 5′ - 非翻译区、 3′ - 非翻译区、 内含 子、 内含子 - 外显子接合处 (junction) 等区域。 “同源性” 是指两种或多种核酸分子的核苷 酸序列， 或者两种或多种核酸或氨基酸序列部分或完全相同。 在某些实施方式中， 该同源的 核酸或氨基酸序列分别与人 MG29 基因 (SEQ ID NO ： 21 或 22) 或蛋白质 (SEQ ID NO ： 3或 4) 具有 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 或 95％的序列相似性或同一性。 在某些实 施方式中， 本发明提供了与编码选自 SEQ ID NO. ： 1-8 和 26 的 MG29 多肽或其生物活性部分 的核酸具有至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 或 95％的序列相似性或同一性 的核酸。在另外实施方式中， 本发明提供了与选自 SEQ ID NO. ： 1-8 和 26 的 MG29 多肽或其 生物活性部分具有 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 或 95％的序列相似性或同一 性的多肽。
     “同源物” 可以是天然存在的， 或者通过人工合成形成的一种或多种具有相关序列 的核酸， 或通过修饰一种或多种核酸制得的相关核酸。当核酸天然或人工地源自共同祖先 序列时， 它们是同源的 ( 例如直系同源物或旁系同源物 )。 如果两种核酸之间的同源性没有 明确说明， 则可以通过两个或多个序列之间的核酸比较推测出同源性。如果该序列在一级 氨基酸序列结构水平上表现出一定程度的序列相似性， 例如， 大于约 30％的序列相似性， 则 可以推断它们具有共同的祖先。对于本发明的目的， 如果核酸序列相似到足以允许在低等 严格条件下重组和 / 或杂交的程度， 则基因是同源的。 另外， 如果多肽提供了与野生型 MG29 相当的活性， 则该多肽视为同源的。
     如本文使用的 “杂交” 可以指分子仅在低等、 中等或高等严格条件下与特定核苷酸 序列结合、 双联或杂交， 包括当该序列存在于复合物混合物 ( 例如， 总细胞 )DNA 或 RNA 中时 发生的结合、 双联或杂交。
     术语 “RNA” 可以表示， 但决不局限于， 包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。 “核 糖核苷酸” 或 “2′ -OH” 是指 D- 核 - 呋喃糖部分的 2’ 位置上具有羟基的核苷酸。
     术语 “载体” 可以表示， 但决不局限于， 用于递送期望核酸的任何核酸类技术， 例 如， 用于基因克隆、 基因扩增和 / 或基因表达的细菌质粒、 病毒核酸、 HAC、 BAC 等。
     术语 “细胞” 可以表示， 但决不局限于， 其通常的生物学意义， 并不是指整个多细胞 生物。该细胞可以是， 例如， 体内、 体外或离体的， 例如在细胞培养物中， 或存在于多细胞生 物中， 该多细胞生物包括例如， 鸟类、 植物和哺乳动物如人、 牛、 羊、 猿、 猴、 猪、 狗和猫。该细 胞可以是原核细胞 ( 例如， 细菌细胞 ) 或真核细胞 ( 例如， 哺乳动物或植物细胞 )。
     术语 “宿主细胞” 可以表示， 但决不局限于， 可用于携载异源性核酸或者表达异源 性核酸编码的肽或蛋白质的细胞。宿主细胞可以包含不能在该细胞天然 ( 非重组 ) 形式 中找到的基因、 在该细胞天然形式中找到的基因， 其中该基因被修饰并由人工手段重导入 到该细胞中， 或者该细胞的内源性核酸， 该内源性核酸已被人工修饰， 但没有从该细胞中除去。宿主细胞可以是真核或原核的。细菌培养所需的一般生长条件可以在诸如 BERGEY′ S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY， Vol.1， N.R.Krieg， ed.， Williams and Wilkins， Baltimore/London(1984) 的文献中找到。 “宿主细胞” 也可以是这样的细胞， 其中内源性基 因或启动子或者二者都已被修饰从而产生本发明复合物中的一种或多种多肽组分。
     提交于 2009 年 7 月 16 日， 题为 Compositions comprising MG29Nucleic Acids， Polypeptides， and Associated Methods of Use 的美国专利申请 No. ： 12/504,331 的主题 通过引用完整地合并在此用于所有目的。
     糖尿病的主要标志是受感染患者血液中葡萄糖水平升高。 这个状态可能是由于胰 岛素分泌减少引起的， 如 I 型青少年糖尿病情况， 或者是由于身体对胰岛素的反应受损引 起的， 如 II 型胰岛素抵抗型糖尿病情况。骨骼肌是胰岛素的主要靶， 因为肌肉负责身体中 大部分的葡萄糖消耗， 因而可以在胰岛素的存在下吸收大量葡萄糖。 为了使此能发生， 含有 葡萄糖转运体 4 型 (Glut4) 的囊泡必须转移到质膜中。如本文所述的， MG29 不仅对骨骼肌 中的膜融合起着重要作用， 而且它也促进对胰岛素作出反应而控制质膜上 Glut4 增大的机 制。
     在年轻 mg29-/- 小鼠的葡萄糖负荷实验中， 发现在腹膜内 (IP) 推注葡萄糖之后， 雄性和雌性 mg29-/- 动物都无法有效地清除它们血流中的葡萄糖 ( 图 5)。然而， 其余的葡 萄糖水平保持不变， 表明缺少 MG29 不影响肝脏在葡萄糖代谢中的作用。因为 mg29-/- 葡 萄糖水平保持长时间较高， 所以似乎 mg29-/- 肌肉摄取葡萄糖的能力存在缺陷， 而不是胰 岛素分泌存在缺陷。这在对 mg29-/- 和对照动物执行的胰岛素负荷的进一步实验中得到证 实。当 IP 注射的胰岛素可以诱导野生型对照动物血糖显著降低时， 相同的胰岛素注射对 mg29-/- 小鼠血糖水平的影响小得多 ( 图 6)。这些研究结果表明， 导致 mg29-/- 小鼠血糖 升高的潜在缺陷是动物清除葡萄糖的能力， 而不是胰岛素生产受损， 与在 II 型糖尿病患者 中观察到的情况类似。因而， 骨骼肌中缺少 MG29 可以使动物容易患糖尿病症状。
     此 外， 通 过 用 高 脂 食 物 饲 喂 mg29-/- 动 物 和 年 龄 匹 配 的 野 生 型 对 照 小 鼠， 测 试 mg29-/- 动物是否更易于罹患糖尿病。已知这种途径可以诱导小鼠患糖尿病。虽然 mg29-/- 和对照小鼠体重增加的速率相似 ( 图 7a)， 但是 mg29-/- 小鼠在比对照小鼠小得多 的年龄表现出对糖尿病负荷实验有易感性 ( 图 7b)。这是骨骼肌从血流中吸收葡萄糖从而 维持肌肉中的能量供应和降低血糖水平从而阻止糖尿病需要 MG29 的另外证明。因为缺少 MG29 可以诱导糖尿病， 所以控制 MG29 表达 ( 即， 转录和 / 或翻译 ) 可以提供治疗 I 型和 II 型糖尿病的有效方法。
     而且， 如本文所述的， 内源性 MG29mRNA 的 UTR 序列包含用于转录后调节的许多共 有部位。实验观察发现， MG29UTR 序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 21、 23 或 24) 实际上是 MG29 基 因表达的转录后调节所需要的， 揭示 UTR 是控制 MG29 表达的肌肉调节途径的靶。因此， 调 制 MG29mRNA 的转录后调节是诊断、 治疗和预防糖尿病的另一种治疗干预方式。
     下面描述了本发明提供的各个示例方面和实施方式。如下面详细描述的， 本发明 提供了组合物， 例如多肽， 编码细胞质、 细胞核、 细胞膜结合和分泌的多肽的核酸 ； 以及载 体、 抗体、 重组蛋白、 假肽、 融合蛋白、 化学化合物、 宿主细胞、 转基因动物， 以及制造和使用 它们的方法。
     核酸下面描述的各个方面和实施方式包括编码 MG29 多肽 (SEQ ID NO. ： 1-8 和 26) 和 / 或其生物活性部分和片段的核酸， 以及编码包括人 MG29 蛋白同源物、 直系同源物和旁系 同源物在内的 MG29 蛋白 ( 例如， SEQ ID NO ： 20-15) 的基因， 包括所有同种型、 拼接变异体 ( 例如， SEQ ID NO. ： 4)， 和多态性。可以使用本文描述的方法分析这些另外的基因的靶位。 因而， 可以如本文描述的对抑制作用和此种抑制对其它基因的影响进行分析。
     对实施本发明有用的， 包括诱变、 PCR 和克隆等在内的分子生物技术描述在以下 文 献 中， Berger and Kimmel， GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES， METHODS IN ENZYMOLOGY， volume 152， Academic Press， Inc.， San Diego， Calif.(Berger) ； Sambrook 等 人， MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL(2nd Ed.)， Vol.1-3， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， New York， 1989， and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， F.M.Ausubel 等 人， eds.， Current Protocols， a joint venture between Greene Publishing Associates， Inc.and John Wiley&Sons， Inc. ； Berger， Sambrook， and Ausubel， as well as Mullis 等人， U.S.Pat.No.4,683,202(1987) ； PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis 等人 eds)， Academic Press， Inc.， San Diego， Calif.(1990)(Innis) ； Arnheim&Levinson(Oct.1， 1990)C&EN36-47。 本发明提供的核酸组合物在本文可互换地总称为 “MG29 核酸” 或 “MG29 多核苷酸” 以及相应的编码的多肽称为 “MG29 多肽” 或 “MG29 蛋白” 。除非另有指明， 否则这些术语都 包括在氨基或羧基端或二者上的生物活性部分、 片段、 缺失或置换、 截短体、 基因融合， 及其 组合物。而且， 除非另有指明， 否则 “MG29” 一般用来指任何 MG29 相关的和 / 或 MG29 衍生 的生物聚合物， 如本文明确描述地、 暗示地或内在地描述的。而且， 如本文使用的， “MG29 核 酸” 或 “MG29 基因” 也可以指并包括该基因的 5’ UTR、 3’ UTR、 启动子序列、 增强子序列、 内含 子和外显子 DNA， 以及 mRNA 或 cDNA 序列。
     如上所述， 在某些方面本发明涉及核酸， 和核酸编码的本发明多肽， 其可以单独地 或与其它组分结合调节肌肉生理， 包括清除葡萄糖。
     在一方面， 本发明提供了编码 MG29 多肽的分离核酸， 该核酸与 SEQ ID NO ： 20-25 中公开的任何一种核酸具有至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 100％的同一 性。 在某些实施方式中， 本发明分离核酸分子将在严格条件下与这样的核酸序列杂交， 所述 的核酸序列与包括 MG29 核酸序列的蛋白质编码序列的核酸分子互补。本发明也包括编码 MG29 多肽， 或其片段、 同源物、 类似物、 融合蛋白、 假肽、 模拟肽或衍生物的分离核酸。例如， 该核酸可以编码与包含 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 的氨基酸序列的多肽具有至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 100％同一性的多肽。该核酸可以是， 例如， 包括 SEQ ID NO ： 20-25 中任何一个的核酸序列的基因组 DNA 片段或 cDNA 分子。
     在另一个实施方式中， 本发明包括编码如上所述或如 SEQ ID NO ： 1-8 或 26 中给 出的重组 MG29 多肽和 / 或其同源物或片段的分离或重组核酸， 其中该多肽可以调节肌肉功 能， 例如， 葡萄糖代谢。
     在另一方面， 本发明提供了如 SEQ ID NO ： 20-15 中给出的本发明 MG29 核酸， 和/或 如 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 中给出的本发明 MG29 蛋白的衍生物和 / 或类似物， 包括但不局限 于， 包含与本发明核酸或蛋白质基本同源的区域的分子， 该区域在各种实施方式中， 与相同 尺寸的核酸或氨基酸序列具有， 或者与通过本领域已知的计算机同源性程序完成比对的或
     者其编码核酸能够与编码本发明蛋白质的序列补体在严格、 中等严格或低等严格条件下杂 交的比对序列相比具有， 至少约 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％的同一性 ( 优选 80-95％的同一性 )。参见， 例如， Ausubel， 等人， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， John Wiley&Sons， New York， N.Y.， 1993。核酸衍生物和修饰包括通过基因替换、 部位特异性突变、 缺失、 插入、 重组、 修复、 改组 (shuffling)、 核酸内切酶消化、 PCR、 亚克隆， 和相关技术获得的那些。
     在另一方面， 本发明提供了编码 MG29 蛋白或其生物活性部分的分离和重组核酸， 所述的生物活性部分为， 例如仅编码突触素结构域或突触素样结构域或其部分， 和/或 marvel 结构域或 marvel 样结构域或其部分的截短部分。因此， 本发明这个方面提供的核 酸包括 MG29 缺失、 置换、 截短体、 融合蛋白等。在示例实施方式中， 提供了编码重组 MG29 多 肽的重组核酸， 所述的重组 MG29 多肽包含与人 MG29(SEQ ID NO ： 3 或 4) 突触素结构域多肽 (“突触素样结构域” ) 具有至少 30％同源性的第一区 ( 即， 部分或结构域 )， 和可选的， 与 人 MG29marvel 结构域多肽 ( 或 marvel 样结构域 ) 具有至少 30％同源性的第二区。在另外 的实施方式中， 本发明包括所得的重组 MG29 多肽。
     在另一方面， 提供了编码重组 MG29 多肽的重组核酸， 其中突触素结构域或突触素 样结构域与 marvel 结构域或 marvel 样结构域并置 (juxtaposed)。因此， 本发明包括重组 多肽， 其中突触素或突触素样结构域与 marvel 结构域或 marvel 样结构域并置。 在另外的方面， 本发明包括编码通过使基因表达形成的多肽， 或 cDNA 构建体的分 离或重组核酸， 所述的 cDNA 构建体通过将编码来自 MG29 家族其它成员的氨基酸或肽组分 的多核苷酸结合而形成， 所述的 MG29 家族其它成员为， 例如， 表 1 或 2 或者 SEQ ID NO ： 1、 2、 5-19 和 26 中指定的那些。编码各个氨基酸或肽结构域的核酸可以由任何期望的亲代基 因克隆并可以利用标准分子生物技术结合到单个连续 (contiguous) 核酸中。而且， 因为一 般可以意识到进化上保守的氨基酸序列作用类似， 所以， 本领域技术人员在其能力范围内， 可以根据本教导制取另外的蛋白质， 并可以按照本文所教导的评估重组蛋白促进蛋白清除 的能力， 无需进行过度的实验。因此， 明确考虑了由 MG29 家族成员结构域组装的重组蛋白， 例如上面鉴定的那些， 它们包括在本发明范围内。
     表 1.UniProtKB/Swiss-Prot MG29 基因 / 蛋白结构同源性数据
     表 2.MG29 同源物的 CLUSTAL W(1.82) 多重序列比对
     本发明提供的重组多肽也可以包含融合蛋白结构域， 和 / 或连接插入在多肽结构 域之间的序列的氨基酸， 其允许例如空间柔性 ( 空间灵活性， steric flexability) 和 / 或包含用于酶修饰 ( 例如， 磷酸化、 蛋白酶切割、 泛素化等 ) 的共有序列。该重组多肽可以使 用操控 DNA 序列的标准分子生物技术构建， 本文描述了其中的一些技术。
     在另外的方面， 本发明涉及诊断性寡核苷酸和一个诊断性寡核苷酸集合 ( 或多个 诊断性寡核苷酸集合 ) 或文库。例如， 在这个方面的实施方式中， 该诊断性寡核苷酸文库包 含多个能够与 MG29 基因或转录物杂交的寡核苷酸探针， 其中个体健康状态与该个体的对 应于寡核苷酸序列的 MG29RNA 表达之间有关联。在一些情况下， 仅一种寡核苷酸是此种检 测所必需的。诊断性寡核苷酸集合中的成员可以通过能够检测表达或 RNA 多态性或蛋白质 产物的任何方式鉴定， 包括但不局限于差异表达筛查、 PCR、 RT-PCR、 SAGE 分析、 高通量测序、 微阵列、 液体或其它阵列、 基于蛋白质的方法 ( 例如， western 印迹、 蛋白质组学、 质谱分析 以及本文描述的其它方法 )， 和数据挖掘方法， 如本文进一步讨论的。
     在本文所述的任何一个实施方式中， 本发明提供的核酸可以利用合适的载体扩 增和 / 或表达在宿主细胞， 如原核细胞， 例如细菌细胞， 或者真核细胞如哺乳动物细胞 中。对于原核细胞和真核细胞二者都合适的表达系统参见， 例如下面文献的 16 和 17 章 ： Sambrook， 等人， MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL， 第二版， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 1989。 在某些实施方式中， 本发明提供的核酸以可诱导和 / 或组织特异性方式表达。 例如， 重组哺乳动物表达载体能够指导优选特定细胞类型中的核酸表达 ( 例如， 组织特 异性调节元件用于表达该核酸 )。组织特异性调节元件在本领域中是已知的。合适的组 织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子 ( 肝脏特异性， Pinkert， 等人， 1987. Genes Dev.1 ： 268-277)、 淋巴特异性启动子 (Calame and Eaton， 1988.Adv.Immunol.43 ： 235-275)， 特别是 T 细胞受体启动子 (Winoto and Baltimore， 1989.EMBO J.8 ： 729-733) 和 免 疫 球 蛋 白 启 动 子 (Banerji， 等 人， 1983.Cell 33 ： 729-740 ； Queen and Baltimore， 1983.Cell 33 ： 741-748)、 神经元特异性启动子 ( 例如， 神经丝启动子， Byrne and Ruddle， 1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 5473-5477)、 胰腺特异性启动子 (Edlund， 等人， 1985. Science 230 ： 912-916)， 以及乳腺特异性启动子 ( 例如， 乳清启动子， 美国专利 4,873,316 和欧洲申请公开 No.264,166)。还包括发育调节启动子， 例如鼠类 hox 启动子 (Kessel and Gruss， 1990.Science 249 ： 374-379) 和 α- 胎蛋白启动子 (Campes and Tilghman， 1989. Genes Dev.3 ： 537-546)。
     本发明提供的核酸分子也可以插入到载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载 体可以通过例如静脉注射、 局部给予 ( 参见， 例如美国专利 No.5,328,470) 或通过定位注 射 (stereotactic injection)( 参见， 例如 Chen 等人， 1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 ： 3054-3057) 递送于主体。 该基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受稀释剂中的基因治 疗载体， 或者可以包含基因递送媒剂包埋在其中的缓释基质。 替换地， 如果完整的基因递送 例如逆转录病毒载体， 则该药物制剂可以包括产生该基 载体可以由重组细胞完整地生产， 因递送系统的一种或多种细胞。 该药物组合物可以与给予说明书一起包括在容器、 袋子， 或 分配器中。
     在本文所述的任何实施方式中， 编码 MG29 的核酸可以以下形式存在 ： 一种或多种 裸 (naked)DNA、 一种或多种布置在适当表达载体并独立 ( 作为附加体， episomally) 维持的 核酸、 一种或多种掺入在宿主细胞基因组中的核酸、 编码复合物组分的内源性基因的修饰
     形式、 一种或多种与一种或多种调节核酸序列结合的核酸， 或其组合。 该核酸可以可选地包 含位于 ORF 内 5’ 端、 3’ 端或任何位置处的接头肽 (linker peptide) 或融合蛋白组分， 例 如 His- 标签、 FLAG- 标签、 麦芽糖结合蛋白 (MBP)- 标签、 荧光蛋白、 GST、 TAT、 抗体部分、 信 号肽等。
     在另外的方面， 本发明提供了能够特异性地靶向 MG29 核酸 ( 例如， SEQ ID NO ： 20-25) 的反义和 / 或干扰核酸 ( 例如， RNAi)。例如， 本发明的特征在于下调编码 MG29 蛋白 的序列表达的核酸分子， 如诱骗 RNA(decoy RNA)、 dsRNA、 siRNA、 shRNA、 微 RNA(microRNA)、 适体 (aptamer)， 和 / 或反义核酸分子。在另一个实施方式中， 本发明核酸分子具有核酸内 切酶活性或者是核酸酶复合物的组分并可以切割具有 MG29 核酸序列的 RNA。
     在任何一个干扰核酸实施方式中， 该核酸分子包含与具有 MG29 核酸序列的 RNA 互 补的 12 ～ 100 个碱基。在另一个实施方式中， 该核酸分子包含与具有 MG29 核酸序列的 RNA 互补的 14 ～ 24 个碱基。在本文所述的任何实施方式中， 该核酸分子可以根据本领域中已 知的方法化学合成。许多参考文献描述了对制取 RNA 有用的方法和途径， 包括 ： 6900187、 6383808、 7101991、 7285541、 7368436、 7022828， 它们通过引用合并在此。
     在另一个实施方式中， 本发明提供了组合物， 该组合物包含药学可接受载体或赋 形剂， 以及有效量的至少一个选自由至少一种如 SEQ ID NO ： 1-8 或 26 中给出的 MG29 多肽、 至少一种抑制性核酸组成的组的成员， 所述的至少一种抑制性核酸可以与以下的至少一部 分杂交 ： (i) 编码 MG29 多肽的核酸、 (ii) 编码 MG29 多肽的核酸 3’ UTR、 (iii) 编码 MG29 多 肽的核酸 5’ UTR， 或 (iv) 编码 MG29 表达的翻译后调节剂 ( 调节子， modulator) 并调节 MG29 表达和 / 或蛋白活性的核酸。在某些实施方式中， 该抑制性核酸包含 RNA。在另一个实施方 式中， 该抑制性核酸是具有 10 ～ 100 个核苷酸的 RNA 寡核苷酸， 其中该寡核苷酸与以下的 至少一部分杂交 ： (i) 编码 MG29 多肽的核酸、 (ii) 编码 MG29 多肽的核酸 3’ UTR， 或 (iii) 编码 MG29 多肽并调节 MG29 蛋白和 / 或蛋白活性的核酸 5’ UTR。在另一个实施方式中， 该 抑制性 RNA 是反义 RNA、 干扰 RNA 或二者的组合中的至少一种。在又一个实施方式中， 该干 扰 RNA 是 siRNA、 miRNA 或二者的组合中的至少一种。在另一个方面， 本发明提供了包含任 何一种本文所述的抑制性核酸的核酸载体。在另外的方面， 本发明提供了包含任何一种本 文所述的抑制性核酸和 / 或任何一种本发明提供的载体的宿主细胞。
     寡核苷酸 ( 例如， 反义 GeneBlocs) 利用以下文献中描述的本领域已知的方案合 成： Caruthers 等人， 1992， Methods in Enzymology 211， 319， Thompson 等人， 国际 PCT 公开 No.WO99/54459， Wincot 等人， 1995， Nucleic Acids Res.23， 26772684， Wincott 等人， 1997， Methods Mol.Bio.， 74， 59， Brennan 等人， 1998， Biotechnol Bioeng.， 61， 3345， 和 Brennan， 美国专利 No.6,001,311。所有这些文献都通过引用合并在此。在非限制性实例中， 小规模 合成可以在 394Applied Biosystems 有限公司的合成器上进行。 替换地， 本发明核酸分子可 以单独合成， 并在合成后例如通过连接技术 (ligation)(Moore 等人， 1992， Science 256， 9923 ； Draper 等人， 国际 PCT 公开 No.WO93/23569 ； Shabarova 等人， 1991， Nucleic Acids Research 19， 4247 ； Bellon 等人， 1997， Nucleosides&Nucleotides， 16， 951 ； Bellon 等人， 1997， Bioconjugate Chem.8， 204) 结合在一起。
     “反义核酸” ， 是指通过 RNA-RNA 或 RNA-DNA 或 RNA-PNA( 蛋白质核酸， Egholm 等 人， 1993Nature 365， 566) 相互作用方式结合到靶 RNA 上并改变靶 RNA 活性 ( 综述参见Stein and Cheng， 1993Science 261， 1004 和 Woolf 等人， 美国专利 No.5,849,902) 的非酶 核酸分子。典型地， 反义分子沿着该反义分子的单个连续序列与靶序列互补。然而， 在某 些实施方式中， 反义分子可以结合到底物上， 以便该底物分子形成茎环或发夹结构， 和/或 反义分子可以结合以便该反义分子形成茎环或发夹结构。因而， 反义分子可以与两个 ( 或 甚至更多 ) 非连续底物序列互补， 或者反义分子的两个 ( 或甚至更多 ) 非连续序列部分可 以与靶序列互补， 或者二者。现行的反义策略的综述参见， Schmajuk 等人， 1999， J.Biol. Chem.， 274， 21783-21789 ； Delihas 等 人， 1997， Nature， 15， 751-753 ； Stein 等 人， 1997， Antisense N.A.Drug Dev.， 7， 151， Crooke， 2000， Methods Enzymol.， 313， 3-45 ； Crooke， 1998， Biotech.Genet.Eng.Rev.， 15， 121-157， Crooke， 1997， Ad.Pharmacol， 40， 1-49， 这些 文献通过引用完整地合并在此。另外， 反义 DNA 可以用于通过 DNA-RNA 相互作用靶向 RNA， 从而活化 RNase H， 该 RNase H 可以消化双联体中的靶 RNA。该反义寡核苷酸可以包含一个 或多个 RNase H 活化区， 该 RNase H 活化区能够活化 RNase H 切割靶 RNA。反义 DNA 可以化 学合成或通过利用单链 DNA 表达载体或其等效物表达。
     长双链 RNA(dsRNA， 典型地＞ 200nt) 可以用于使各种生物和细胞类型 ( 例如， 蠕 虫、 果蝇、 植物 ) 的靶基因表达沉默。导入后， 长 dsRNA 进入 RNA 干扰 (RNAi) 通路中。首 先， 该 dsRNA 被称为 Dicer 的类似于 RNase III 的酶加工成 20 ～ 25 个核苷酸 (nt) 的小干 扰 RNA(siRNA)。 然后， 该 siRNA 装配成含内切核糖核酸酶复合物， 称为 RNA 诱导沉默复合物 (RISC)， 该 siRNA 在该过程中解旋。该 siRNA 链随后将 RISC 引导到互补的 RNA 分子中， 在 此处该 RISC 切割并破坏同源 (cognate)RNA( 效应子 (effecter) 步骤 )。同源 RNA 的切割 发生在被 siRNA 链结合的区域中间附近。在哺乳动物细胞中， 长 dsRNA( ＞ 30nt) 的导入启 动了强有力的抗病毒反应， 例如蛋白质合成和 RNA 降解的非特异性抑制。然而， 该哺乳动物 抗病毒反应可以通过 siRNA 和 / 或微 RNA(miRNA) 的导入或表达绕开 ( 回避， bypass)。
     将 dsRNA 注入和转染到细胞或生物体中， 这已经是 siRNA 递送的主要方法。虽 然沉默效应持续数天并且确实似乎被转移到子细胞中， 但它确实最终会消失。然而， 最近 许多研究组已研发出在短暂转染和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达 siRNA 的表达 载体。( 参见， 例如， Brummelkamp TR， Bernards R， and Agami R.(2002).A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science 296 ： 550-553 ； Lee NS， Dohjima T， Bauer G， Li H， Li M-J， Ehsani A， Salvaterra P， and Rossi J.(2002).Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnol.20 ： 500-505 ； Miyagishi M， and Taira K.(2002).U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnol.20 ： 497-500 ； Paddison PJ， Caudy AA， Bernstein E， Hannon GJ， and Conklin DS.(2002).Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes&Dev.16 ： 948-958 ； Paul CP， Good PD， Winer I， and Engelke DR.(2002).Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nature Biotechnol.20 ： 505-508 ； Sui G， Soohoo C， Affar E-B， Gay F， Shi Y， Forrester WC， and Shi Y.(2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6) ： 5515-5520 ； Yu J-Y， DeRuiter SL， and TurnerDL.(2002).RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9) ： 6047-6052， 这些文献通过引 用完整地合并在此 )。
     多肽
     在另外的方面， 并且如上所述， 本发明也提供了分离和 / 或重组 MG29 多肽。
     本发明也包括具有如 SEQ ID NO ： 1-19 中给出的序列的基本纯化的 MG29 多肽， 或 其功能部分。在某些实施方式中， 本发明 MG29 多肽包括与人 MG29 多肽 (SEQ ID NO. ： 3) 的 氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
     MG29 多肽具有与其自身和许多其它细胞的蛋白质相互作用 ( 例如， 非共价结合 ) 和形成复合物的功能。在这个方面的实施方式中， 本发明包含分离或重组 MG29 多肽 ( 例 如， SEQ ID NO ： 1-8 或 26)， 其同源物、 片段或衍生物。在另外的实施方式中， 本发明提供了 包含与至少一种其它多肽结合的 MG29 多肽的复合物， 其中该结合形成蛋白质复合物， 并且 其中该复合物能够改进骨骼肌清除葡萄糖的功能。 本发明进一步包含治疗或预防肌肉相关 性病状的方法， 该方法包括向细胞给予有效量的分离和 / 或重组 MG29 多肽， 和 / 或分离和 / 或重组 MG29 多肽与至少一种其它蛋白质的蛋白质复合物， 其中该复合物能够改进骨骼肌 清除葡萄糖功能。该复合物的多肽可以例如使用肽合成器根据标准方法形成， 或者通过在 单个细胞中表达每个多肽形成 ； 或者单独地在细胞或细胞裂解系统中形成， 然后分离和纯 化该多肽。
     在另外的方面， 本发明涉及包含与至少一种能够调节骨骼肌清除葡萄糖功能的其 它药剂结合的本发明多肽的组合物。在另外的实施方式中， 本发明治疗剂可以包含一种或 多种生物活性成分如止痛剂、 抗酸剂、 抗焦虑药物、 抗心律失常剂、 抗细菌剂、 抗生素、 抗凝 血剂和溶栓剂 ( 溶解血栓剂， thrombolytic)、 抗惊厥剂、 抗抑郁剂、 止泻剂、 止吐剂、 抗真菌 剂、 抗组胺剂、 抗高血压剂、 消炎剂、 抗肿瘤剂、 抗精神病剂、 退热剂、 抗病毒剂、 巴比妥酸盐、 β- 阻断剂、 支气管扩张剂、 感冒药 (Cold Cures)、 皮质类固醇、 止咳剂、 细胞毒素、 减充血 剂、 利尿剂、 祛痰剂、 激素、 降糖药 ( 口服 )、 免疫抑制剂、 泻剂、 肌肉松弛剂、 镇静剂、 性激素、 睡眠药物 (sleeping drugs)、 镇定剂、 维生素或其组合。
     在另一方面， 本发明提供的组合物可以包括药学可接受载体。这个方面的某些实 施方式包括， 含有与药学可接受载体结合的本发明多肽例如 MG29 的治疗组合物， 其中该治 疗组合物全身给予， 并且其中该全身给予的组合物对治疗和 / 或预防糖尿病有效。
     在另外的方面， 本发明提供了包含 “标签” 或指示剂部分 (indicator portion) 和 MG29 部分的融合蛋白。在某些方面， 该标签或指示剂部分可以是适合于纯化目的肽， 例如， FLAG 标签、 6xHis 标签、 麦芽糖结合蛋白 (MBP) 标签等。在其它方面， 该标签肽包含适合于 提供诸如抗体表位的信号的肽或荧光肽。还有一些其它方面包括 MG29 与适合于介导亚细 胞定位或易位穿过细胞膜的肽的融合物， 例如促进细胞穿透的来自 HIV 病毒的 TAT 融合蛋 白， 或使 MG29 偶联到特定细胞的细胞器上的修饰细胞定位标签。
     本发明分子可以用作预防、 抑制、 改善和 / 或治疗主体 ( 对象、 受验者， subject) 疾病状态的药物药剂。许多有用的基于核酸的治疗途径是已知的， 讨论在 Patil 等人， AAPS Journal， 2005 ； 7(1) ： E61-77 中， 该文献通过引用完整地合并在此。
     本发明核酸分子可以， 单独地， 或者与其它药剂结合或一起用于治疗上面讨论的疾病或病症。如本领域技术人员可以明了的， 例如， 该主体， 或者其它适当的细胞可以被单 独治疗或在适合于该治疗的条件下结合一种或多种药物进行治疗。
     在另一方面， 本发明提供了包括治疗或预防有效量的治疗和药学可接受载体的药 物组合物， 其对治疗或预防个体的包括糖尿病在内的肌肉相关性疾病有效。本发明分子可 以用作预防、 抑制、 改善和 / 或治疗主体疾病状态的药物药剂。
     在某些实施方式中， 该治疗剂包含本发明核酸， 例如 MG29 核酸， 例如， SEQ ID NO ： 20-15 中的至少一个。在另外的实施方式中， 本发明提供的治疗核酸是肽核酸、 cDNA， 或 RNA， 例如小抑制性 RNA。许多有用的基于核酸的治疗途径是已知的， 讨论在 Patil 等人， AAPS Journal， 2005 ； 7(1) ： E61-77 中， 该文献通过引用完整地合并在此。
     在另外的实施方式中， 本发明提供的治疗剂是包含 MG29 多肽， 例如 SEQ ID NO ： 1-8 或 26 中至少一个， 或其生物活性部分， 或者对 MG29 多肽具有特异性的抗体的组合物。 在进一步方面， 本发明包括 ( 放置 ) 在一个或多个容器中的治疗或预防有效量的这种药物 组合物。本发明也包括寡核苷酸， 例如包括 MG 核酸的至少 6 个连续 ( 连续， contiguous) 核 苷酸的寡核苷酸或所述寡核苷酸的补体 (complement)。
     在某些实施方式中， 用抗核酸酶基团 ( 核酸酶抗性基团 ) 例如 2′ - 氨基、 ′ -C- 烯 丙基、 2 ′ - 氟、 2 ′ -O- 甲基、 2 ′ -H 修饰本发明提供的核酸分子从而增强稳定性 ( 综述 参见 Usman and Cedergren， 1992， TIBS 17， 34 ； Usman 等人， 1994， Nucleic Acids Symp. Ser.31， 163)。虽然用硫代磷酸酯、 硫代磷酸酯和 / 或 5′ - 甲基磷酸酯连键化学修饰寡核 苷酸的核苷酸间连键 (linkage) 可以提高稳定性， 但是这些修饰大多会引起一些毒性。所 以， 当设计核酸分子时， 应当使这些核苷酸间连键的量减到最少。 这些连键的密集度的降低 可以降低毒性， 使得这些分子的功效增强， 具有较高特异性。因此， 提供了具有维持或增强 活性的化学修饰的核酸分子。此种核酸对核酸酶的抗性一般也比未经修饰的核酸强。核酸 分子优选对核酸酶具有抗性以便可以用作有效的细胞内治疗剂。RNA 和 DNA 化学合成的改 进 (Wincott 等人， 1995Nucleic Acids Res.23， 2677 ； Caruthers 等人， 1992， Methods in Enzymology 211， 3-19( 通过引用合并在此 )) 已通过导入核苷酸修饰从而增强如上所述的 它们的核酸酶稳定性， 而扩大了修饰核酸分子的能力。本发明基于核酸的分子的使用通过 提供联合治疗的可能性 ( 例如， 靶向不同基因的多个反义或酶核酸分子、 与已知小分子抑 制剂偶联的核酸分子， 或者分子和 / 或其它化学或生物分子结合的间歇治疗 )， 可以对疾病 进展进行较好地治疗。用核酸分子治疗主体也可以包括不同类型的核酸分子的组合。
     在一个实施方式中， 本发明提供了包含磷酸 ( 磷酸酯、 或磷酸盐， phosphate) 骨 架修饰的修饰核酸分子， 所述磷酸骨架修饰包含一种或多种硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯 (phosphorodithioate)、 甲基磷酸酯、 吗啉代、 酰胺化氨基甲酸酯 (amidate carbamate)、 羧甲基、 乙酰酰胺化物 (acetamidate)、 聚酰胺、 磺酸酯 (sulfonate)、 磺酰胺、 氨基磺酸酯 (sulfamate)、 甲缩醛 (formacetal)、 硫甲缩醛 (thioformacetal)， 和 / 或烷基甲硅烷基取 代。 寡核苷酸骨架修饰的综述参见 Hunziker and Leumann， 1995， Nucleic Acid Analogues ： Synthesis and Properties， in Modern Synthetic Methods， VCH， 331417， 和 Mesmaeker 等 人， 1994， Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides， in Carbohydrate Modifications in Antisense Research， ACS， 24 39。这些参考文献通过引用合并在此。 可以对核酸 ( 例如， 反义和核糖酶 ) 结构进行各种修饰从而增强这些分子的实用性。例如，此种修饰可以增强存放期、 体外半衰期、 生物利用度、 稳定性， 并使得此种寡核苷酸容易导 入到靶位， 包括例如， 增强穿透细胞膜 ( 的能力 ) 和赋予识别并结合到靶向细胞的能力。
     核酸分子的给予。核酸分子递送方法描述在 Akhtar 等人， 1992， Trends Cell Bio.， 2， 139， 和 Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics， ed.Akhtar， 1995 中， 这两篇文献都通过引用合并在此。Sullivan 等人的 PCT WO94/02595 进一步描述了酶 RNA 分子递送的一般方法。这些方案实际上可以用于递送任何核酸分 子。核酸分子可以通过本领域熟练技术人员已知的各种方法给予细胞， 包括但不局限于， 封装在脂质体中、 通过离子电渗疗法， 或通过掺入到其它媒剂如水凝胶、 环糊精、 生物可降 解的纳米胶囊和生物粘附微球中。替换地， 该核酸 / 媒剂结合物通过直接注射或通过使用 输液泵局部递送。其它递送途径包括， 但不局限于口服 ( 片剂或丸剂形式 ) 和 / 或鞘内 递送 (Gold， 1997， Neuroscience， 76， 1153-1158)。其它途径包括使用各种运送和载体系 统， 例如， 通过使用结合物和生物可降解聚合物实现。包括 CNS 递送在内的药物递送策略 的 综 述， 参 见 Ho 等 人， 1999， Curr.Opin.Mol.Ther.， 1， 336-343， 和 Jain， Drug Delivery Systems ： Technologies and Commercial Opportunities， Decision Resources， 1998， 以及 Groothuis 等人， 1997， J.Neuro Virol.， 3， 387-400。 本发明带负电荷的多核苷酸可以在含有或不含有用于形成药物组合物的稳定剂、 缓冲剂等的情况下， 通过任何标准方式给予 ( 例如， RNA、 DNA 或蛋白质 ) 和导入主体中。当 期望使用脂质体递送机制时， 可以按照形成脂质体的标准方案进行。本发明组合物也可以 调配成和用作口服给予的片剂、 胶囊或酏剂， 用于直肠给予的栓剂， 无菌溶液， 可注射给予 的悬液， 以及本领域已知的其它组合物。
     本发明核酸分子也可以例如用于药物直肠给予的栓剂形式给予， 或者本身经由导 管直接给予于膀胱。这些组合物可以通过将该药物与合适的无刺激性赋形剂混合制备， 所 述赋形剂在常温下为固体但在直肠温度下为液体， 因而将在直肠中熔化从而释放该药物。 此种材料包括可可油和聚乙二醇。本发明核酸分子可以在无菌介质中肠道外给予。该药物 依据所使用的媒剂和浓度， 可以悬浮或溶解在该媒剂中。有利地， 可以将佐剂如局部麻醉 剂、 防腐剂和缓冲剂溶解在该媒剂中。可与载体材料结合从而形成单剂量形式的活性成分 的量随受治疗宿主和特定给予模式而变化。剂量单位形式一般包含约 1mg ～约 5000mg 的 活性成分。 应理解， 任何特定患者或主体的具体剂量水平随着多种因素变化， 包括所采用的 具体化合物的活性、 年龄、 体重、 总体健康状况、 性别、 饮食、 给予时间、 给予途径， 和排泄率、 药物组合以及经受治疗的特定疾病的严重性。
     替换地， 本发明某些核酸分子可以由真核启动子表达在细胞中 ( 例如， Izant and Weintraub， 1985， Science， 2 29， 345 ； McGarry and Lindquist， 1986， Proc.Natl. Acad.Sci.， USA 83， 399 ； Scanlon 等 人 .， 1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 88， 10591 5； Kashani-Sabet 等 人 .， 1992， Antisense Res.Dev.， 2， 315 ； Dropulic 等 人 .， 1992， J.Virol.， 66， 1432 41 ； Weerasinghe 等 人 .， 1991， J.Virol.， 65， 5531 4 ； Ojwang 等 人 .， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89， 10802 6 ； Chen 等人 .， 1992， Nucleic Acids Res.， 20， 4581 9 ； Sarver 等人 .， 1990Science， 247， 1222 1225 ； Thompson 等人， 1995， Nucleic Acids Res.， 23， 2259 ； Good 等人 .， 1997， Gene Therapy， 4， 45 ； 所有这些参考文献都通过引用合并 在此 )。 本领域技术人员可以意识到， 任何核酸都可以由适当 DNA/RNA 载体表达在真核细胞
     中。 在另一方面， 本发明提供了包含编码至少一种本发明核酸分子的核酸序列的表达 载体。编码本发明核酸分子的核酸序列以使该核酸分子可被表达的方式可操作地连接。在 另一个方面， 本发明的特征是包含编码至少一种本发明核酸分子的核酸序列的表达载体， 以使该核酸分子可被表达的方式包含。该表达载体在一个实施方式中包含 ： a) 转录起始 区、 b) 转录终止区、 c) 编码至少一种所述核酸分子的核酸序列 ； 其中所述序列以使该核酸 分子可被表达和 / 或递送的方式可操作地连接到所述起始区和所述终止区。
     核酸分子序列的转录由真核 RNA 聚合酶 I(pol I)、 RNA 聚合酶 II(pol II) 或 RNA 聚合酶 III(pol III) 的启动子驱动。来自 pol II 或 pol III 启动子的转录物高水平地 表达于所有细胞中 ； 给定 pol II 启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因 调节序列的性质 ( 增强子、 沉默子等 )。也可以使用原核 RNA 聚合酶启动子， 条件是该原 核 RNA 聚合酶可表达在适当的细胞中 (Elroy-Stein and Moss， 1990， Proc.Natl.Acad. Sci.USA， 87， 6743 7 ； Gao and Huang 1993， Nucleic Acids Res.， 21， 2867 72 ； Lieber 等 人， 1993， Methods Enzymol.， 217， 47 66 ； Zhou 等人， 1990， Mol.Cell.Biol.， 10， 4529 37)。 所有这些文献都通过引用合并在此。数位研究者已经证明， 核酸分子如由此种启动子表 达的核糖酶可以在哺乳动物细胞中起作用 ( 例如， Kashani-Sabet 等人， 1992， Antisense Res.Dev.， 2， 3 15 ； Ojwang 等 人， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89， 10802 6 ； Chen et al， 1992， Nucleic Acids Res.， 20， 4581 9 ； Yu 等人， 1993， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90， 6340 4 ； L ′ Huillier 等 人， 1992， EMBO J.， 11， 4411 8 ； Lisziewicz 等 人， 1993， Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A， 90， 8000 4 ； Thompson 等人， 1995， Nucleic Acids Res.， 23， 2259 ； Sullenger&Cech， 1993， Science， 262， 1566)。
     在另一个实施方式中， 本发明的分离核酸分子所包含的核酸分子是 MG29 核酸的 核苷酸序列的补体。
     应用
     在另外的方面， 本发明涉及与治疗包括糖尿病在内的肌肉相关性病状和病症有关 的组合物和方法。在某些示例实施方式中， 本发明包括， 例如， 向个体给予有效量的本发明 治疗组合物用于治疗和 / 或预防糖尿病。
     本发明治疗剂在制造用于治疗或预防肌肉相关性病状或病症、 障碍或症状的药 物中的用途也包括在本发明范围中， 所述的肌肉相关性病状或病症、 障碍或症状包括， 例 如， 肌肉疲劳或肌肉萎缩、 心血管病、 心肌病、 糖尿病、 动脉粥样硬化、 高血压、 先天性心脏缺 陷、 主动脉瓣狭窄 ( 主动脉缩窄， aortic stenosis)、 心房间隔缺损 ( 房间隔缺损， atrial septal defect， ASD)、 房室 (A-V) 管缺损、 动脉导管 (ductus arteriosus)、 肺动脉瓣狭 窄、 主动脉瓣下狭窄、 室间隔缺损 (VSD)、 瓣膜疾病、 氧化损伤、 肌肉无力、 肌肉萎缩、 心力衰 竭、 由心力衰竭和高血压引起的继发病状、 低血压、 心绞痛、 心肌梗塞、 心脏病、 心力衰竭、 糖尿病性溃疡、 肾动脉狭窄、 间质性肾炎、 肾小球肾炎、 多囊肾疾病、 全身酸中毒、 肾小管 性酸中毒、 IgA 肾病、 肾内科疾病、 高血钙 (hypercalceimia)、 肌肉障碍、 尿潴留 (urinary retention)、 神经保护、 中风、 无晶状体眼 (Aphakia)、 神经退行性障碍、 神经系统疾病， 和/ 或其它类似疾病和障碍。
     作为非限制性实例， 本发明组合物对治疗罹患上面公开的疾病和障碍和 / 或其它
     类似病症和障碍， 特别是糖尿病的患者有功效。 在某些方面， 本发明提供的多肽用作用于产 生对本发明具有特异性的抗体的免疫原、 用作疫苗， 和 / 或用于筛查潜在的激动剂和拮抗 剂化合物。另外， 所提供的编码本发明突触素样蛋白如 MG29 的 cDNA 用于基因治疗方法中， 以给予需要其的主体。
     在某些方面， 本发明提供了调节肌肉功能的组合物和方法， 包括调节 MG29 的转 录、 翻译 ( 即， 表达 )， 和 / 或活性。如本文所述的， 在一个示例实施方式中， MG29 的调节是 这样实现的 ： 例如通过给予与 MG29 核酸互补的核酸， 和 / 或 MG29 多肽结合伴侣 (binding partners)， 即， 调节结合到 MG29 核酸和 / 或 MG29 多肽上， 并抑制、 减弱或中和它们的生物 活性的因子， 如至少一种 MG29RNA 结合蛋白， 例如， HuR、 ARE 和 / 或 LOX-DICE， 和 / 或至少 一个 MG29 基因转录因子， 例如， GATA、 RUNX1、 SREBP1、 C/EBP 和 / 或 p300 ； 使用抑制性 RNA、 抗体、 假肽、 肽类似物或模拟肽， 或结合并抑制一种或多种靶核酸或多肽的小分子。在一个 实施方式中， 本发明涉及治疗或预防个体糖尿病的方法， 该方法包括上调 MG29 基因的转录 和 / 或翻译， 和 / 或 MG29 多肽的活性。在另一个实施方式中， 在本发明核酸分子存在的情 况下利用该核酸分子的 MG29 基因的抑制或下调大于在不存在该核酸分子的情况。
     在另外的实施方式中， 本发明提供了调节细胞葡萄糖摄取的方法， 该方法包括向 肌细胞给予包含有效量的调节 MG29 基因表达或调节 MG29 多肽活性或者二者的药剂的组合 物， 其中 MG29 的调节导致该细胞的葡萄糖摄取被调节。在某些实施方式中， 该细胞是肌细 胞， 例如， 骨骼肌细胞、 心肌细胞或平滑肌细胞。 在另外的实施方式中， 该组合物进一步包含 如本文所述的药学可接受载体或赋形剂。在某些另外的实施方式中， 该药剂包含编码与选 自由 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 组成的组的 MG29 多肽具有至少 85％序列同一性的多肽的核酸。 在优选实施方式中， 该核酸编码如 SEQ ID NO ： 3 中给出的 MG29 多肽。在替换实施方式中， 该药剂包含至少一种抑制性核酸， 所述的至少一种抑制性核酸与选自由编码 MG29 多肽的 核酸、 编码 MG29 多肽的核酸 UTR， 和编码 MG29 基因表达调节剂的核酸所组成的组的成员杂 交。在某些实施方式中， 该抑制性核酸是 RNA。在又一个实施方式中， 该抑制性 RNA 可以与 编码如 SEQ ID NO ： 20-25 的至少一个中给出的 MG29 多肽的核酸 UTR， 或编码 MG29 表达调 节剂的核酸杂交。在另一个实施方式中， 该抑制性 RNA 是反义 RNA、 干扰 RNA， 或者二者的组 合中的至少一个。在优选实施方式中， 该干扰 RNA 是 siRNA、 miRNA， 或者二者的组合中的至 少一个。
     在另外的方面， 本发明提供了向个体给予有效量的编码 MG29 多肽如 MG29， 其同源 物、 片段和衍生物的核酸， 以治疗和 / 或预防肌肉相关性病状或病症如糖尿病的方法。如本 文所证明的， 本发明 MG29 多肽能够调节肌肉和肌细胞中的各种过程， 并可以提供对抗涉及 肌肉功能受损的许多障碍的有效治疗途径。在一个实施方式中， 本发明提供了治疗和 / 或 预防糖尿病的方法， 该方法包括向个体给予包含有效量的与药学可接受赋形剂结合的本发 明核酸或多肽的组合物， 其中该组合物对治疗和 / 或预防糖尿病有效。
     在另外的方面， 本发明提供了调节 MG29 基因， 例如 SEQ ID NO ： 20-15 的表达， 或 者 MG29 蛋白， 例如 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 的活性的方法。在某些实施方式中， 该方法包括向 体外、 离体或体内细胞或组织给予编码 MG29 多肽的重组核酸， 其中该重组核酸对调节 MG29 表达或活性中的至少一个有效。在任何一个本文所述的实施方式中， 该重组 MG29 核酸可以 是顺反子 (cistronic)， 即在单一开放阅读框 (ORF) 内包含期望的编码序列 ； 或者它可以包含一个或多个内含子序列。 在某些其它实施方式中， 该方法包括向体外、 离体或体内细胞或 组织给予能够与编码 MG29 多肽的核酸特异性杂交的重组核酸。在某些实施方式中， 该重组 MG29 核酸掺入在核酸载体如质粒、 病毒载体、 人工染色体等中。在另外的实施方式中， 包含 重组 MG29 核酸的载体包含一个或多个转录或复制调节元件、 可操作地连接到 MG29 核酸上 的可选标记或翻译修饰序列。
     在另外的方面， 本发明提供了治疗糖尿病的方法， 该方法包括向个体给予包含有 效量的具有下面至少一种作用的药剂的组合物 ： 增大 MG29 基因表达、 提高 MG29 多肽活性， 或二者的组合， 其中该药剂对治疗糖尿病有效。在某些实施方式中， 该组合物全身给予。在 某些另外的实施方式中， 该药剂包含编码与选自 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 所组成的组的 MG29 多肽具有至少 85％序列同一性的多肽的核酸。在优选实施方式中， 该核酸编码如 SEQ ID NO ： 3 中给出的 MG29 多肽。在替换实施方式中， 该药剂包含至少一种抑制性核酸， 所述的至 少一种抑制性核酸可以与选自由编码 MG29 多肽的核酸、 编码 MG29 多肽的核酸 UTR， 和编码 MG29 表达调节剂的核酸所组成的组的成员杂交。在某些实施方式中， 该抑制性核酸是 RNA。 在又一个实施方式中， 该抑制性 RNA 与编码如 SEQ ID NO ： 20-25 的至少一个中给出的 MG29 多肽的核酸 UTR， 或编码 MG29 基因表达调节剂的核酸杂交。在另一个实施方式中， 该抑制 性 RNA 是反义 RNA、 干扰 RNA， 或二者的组合中的至少一个。在任何一个本文所述的实施方 式中， 本发明提供的干扰 RNA 是 siRNA、 miRNA， 或者二者的组合中的至少一个。
     在任何一个本文所述的方法中， 本发明核酸或多肽可以任何药学可接受形式， 按 照如下面进一步详细描述的任何药学可接受途径递送或给予。例如， 包含本发明核酸和 / 或多肽的组合物可以全身递送或直接递送到细胞或组织中。在某些另外的实施方式中， 本 发明核酸和 / 或多肽包含载体部分， 所述的载体部分可以提高生物利用度、 延长药物存放 期、 使该治疗剂靶向特定细胞或组织类型， 例如骨骼肌或横纹肌细胞或组织， 或其组合。
     在又一个方面， 本发明提供了确定主体 ( 例如， 人主体 ) 是否罹患或易患与肌肉相 关性病状或肌肉功能障碍关联的疾病。在一个实施方式中， 该方法包括从个体 ( 例如， 血 液、 肌肉或其它 ) 分离出生物样品、 通过对 MG29 多态性或突变具有特异性的可检测探针处 理来自个体的组织样品， 检测 MG29 基因的基因型， 和检测探针 / 靶复合物形成， 其中复合物 形成表示存在特定基因型。替换地， 测量来自主体的测试样品中 MG29 核酸或多肽的量， 并 将测试样品中多肽的量与对照样品中存在的 MG29 核酸或多肽量进行比较。测试样品中的 水平相比对照样品中的水平发生变化， 表示该主体罹患疾病或易患该疾病。 优选地， 易患病 体质 (predisposition) 包括例如糖尿病。而且， 本发明新多肽的表达水平可以用在筛查糖 尿病以及确定该疾病类型或程度的方法中。在另一个实施方式中， 该方法包括诊断或监测 障碍或疾病或进展的步骤， 该步骤包括从个体分离出生物样品， 检测如本文所述的 MG29 基 因中核苷酸多态性的存在， 其中 MG29 多态性与疾病或其严重性关联。
     在一种实施方式中， 本发明包括筛选调节 MG29 活性、 蛋白水平或基因表达中的至 少一种的药剂 ( 即， MG29 激动剂和 / 或拮抗剂 ) 的方法， 该方法包括提供细胞或组织， 测量 内源性 MG29 活性、 蛋白水平或基因表达中的至少一种的量从而确定对照值， 使测试药剂与 该细胞或组织接触， 测量或检测 MG29、 MG29 蛋白量， 或 MG29 基因表达量中至少一种的活性 从而确定测试值， 以及将对照值与测试值进行比较， 其中在测试值和对照值之间观察到变 化， 说明该药剂能够调节细胞或组织的 MG29 活性、 蛋白水平或基因表达中的至少一种。在另一个实施方式中， 本发明提供了筛选包括例如糖尿病在内的障碍或症状的调 节剂的方法。该方法包括使测试药剂与 MG29 核酸或多肽接触， 和确定测试化合物是否结合 到所述 MG29 核酸或多肽上的步骤。测试化合物与 MG29 核酸或多肽结合， 表 (latency) 或 易患病体质的调节剂。在另一个实施方式中， 本发明提供了筛选调节肌肉清除葡萄糖 ( 功 能 ) 的药剂的方法， 该方法包括使表达 MG29 的肌肉与调节 MG29 或 MG29 相互作用蛋白， 或 其组合的表达和 / 或活性的药剂接触， 以及测量对骨骼肌清除葡萄糖功能的影响， 其中葡 萄糖清除增强表示该药剂为 MG29 激动剂， 而葡萄糖清除降低表示该药剂为 MG29 拮抗剂。
     可用于本发明方法中的潜在化合物文库是众所周知且容易获得的。此外， 本文描 述了对测量药剂与 MG29 多肽的结合、 MG29 蛋白的量， 和 / 或 MG29 基因转录和 / 或翻译水 平有用的技术。对实施本发明有用的另外的方法也可按常规使用， 并可以利用本领域常规 实验修改用于要求保护的方法中。
     在另一个方面， 本发明提供了检测样品中 MG29 核酸或多肽的存在的方法， 该方法 包括以下步骤 ： 分离出生物样品， 在使该药剂和该核酸或多肽之间能够形成复合物的条件 下使该样品与分别选择性地结合到靶核酸或多肽上的可检测药剂 ( 例如， 核酸探针、 抗体 或小分子 ) 接触。然后， 若出现复合物， 则检测该复合物， 从而鉴定该样品内的 MG29 核酸或 多肽。本发明方法也可以用于鉴定特异性细胞或组织类型， 基于它们的 MG29 核酸或多肽表 达进行鉴定。
     在进一步方面， 本发明提供了生产多肽的方法， 该方法包括使宿主细胞或无细胞 系统表达编码 MG29 多肽的核酸。在某些实施方式中， MG29 核酸是内源性 MG29 基因。在另 外的实施方式中， MG29 核酸是外源性 MG29 核酸。期望时， 然后可以回收该多肽。例如， 在 某些实施方式中， 待表达的 MG29 核酸包含可将其分泌引导到周围介质中的前导序列或信 号序列。随后， 可以根据已知方法从该介质中分离和纯化出 MG29 多肽。在另外的实施方式 中， 本发明包括通过培养包含编码 MG29 核酸的内源性核酸的细胞生产多肽的方法， 所述的 内源性核酸布置在外源性调节元件例如启动子、 增强子或阻遏子序列上游或下游。在某些 实施方式中， 该外源性调节元件通过本领域众所周知的同源重组、 链断裂或错配修复机制 掺入到宿主细胞基因组中。
     在进一步方面， 本发明提供了调节 MG29 多肽活性或表达的方法， 该方法通过使包 括 MG29 多肽的细胞样品与足以调节所述多肽活性的量的、 结合到 MG29 多肽、 MG29RNA 结合 蛋白和 / 或 MG29 蛋白相互作用因子 (interactor) 上的化合物接触而完成， 其中 MG29 的调 节对治疗或预防糖尿病或与其相关的病症有效。 该化合物可以是， 例如小分子， 如核酸、 肽、 多肽、 模拟肽、 碳水化合物、 脂质或其它有机 ( 含碳 ) 或无机分子， 如本文进一步描述的。
     在另一方面， 本发明提供了诊断个体中糖尿病的方法， 该方法包括从正常主体分 离出肌细胞并测量该肌细胞中的钙火花频率从而确定比较基础， 从测试主体分离出肌细胞 并测量测试主体肌细胞中的钙火花频率， 其中测试个体中钙火花频率的降低， 指示糖尿病 病状的存在和 / 或严重性。
     在另一方面， 本发明提供了调节 MG29 基因表达和 / 或调节 MG29 多肽活性的药剂， 其用在用于调节细胞葡萄糖摄取的方法中， 所述方法包括制备包含有效量的用于给予的药 剂的药物的步骤， 其中该药剂对调节该细胞葡萄糖摄取有效。 在某些实施方式中， 该细胞是 体外或体内细胞。在另外的实施方式中， 该细胞是肌细胞， 例如骨骼肌细胞。在某些另外实施方式中， 该药剂与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合。在进一步实施方式中， 该药剂包 含， 编码与选自由 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 所组成的组的 MG29 多肽具有至少 85％序列同一性 的多肽的核酸 ； 或者该药剂包含至少一种抑制性核酸， 所述的至少一种抑制性核酸与选自 由编码 MG29 多肽的核酸、 编码 MG29 多肽的核酸 UTR， 和编码 MG29 基因表达调节剂的核酸 所组成的组的成员杂交。如前面指出的， 在某些实施方式中， 该抑制性核酸包含 RNA。在另 外的实施方式中， 该抑制性核酸可以与编码如 SEQ ID NO ： 20-25 的至少一个中给出的 MG29 多肽的核酸 UTR 杂交。在任何一个本文所述的实施方式中， 该抑制性核酸是反义 RNA、 干扰 RNA 或二者的组合中的至少一个。
     在另一个方面， 本发明提供了与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合的调节 MG29 基因表达和 / 或调节 MG29 多肽活性的药剂在制造药物中的用途， 其中该药物制备用于以 0.1mg/kg ～约 1000mg/kg 的剂量给予， 在 1 天至 12 个月的时间段内至少给予一次。在另外 的方面， 本发明提供了与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合的调节 MG29 基因表达和 / 或调 节 MG29 多肽活性的药剂， 其用于治疗糖尿病的方法中。在又一个另外方面， 本发明提供了 与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合的调节 MG29 基因表达和 / 或调节 MG29 多肽活性的药 剂在制造用于治疗糖尿病的药物中的用途。 根据权利要求 14 限定的用途， 其中所述药剂是核酸。
     本发明某些方面包括用一种或多种 DNA 分子检测基因表达或多态性的方法， 其中 该一种或多种 DNA 分子具有检测与序列表 ( 参见表 1 和 2) 所给寡核苷酸对应的基因表达 的核苷酸序列。在一种形式下， 该寡核苷酸检测差异表达的基因的表达。该基因表达系统 可以是候选物文库、 诊断药剂、 诊断寡核苷酸集合或诊断探针集合。该 DNA 分子可以是基因 组 DNA、 RNA、 蛋白质核酸 (PNA)、 cDNA 或合成寡核苷酸。按照本文教导的程序， 可以鉴定用 于分析基因表达或多态性的感兴趣序列。此种序列可以预测糖尿病状态。已鉴定出与疾病 严重性关联的多态性 ( 参见， Zhong 等人， Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in the macrophage migration inhibitory factor gene by thin-film biosensor chips and application to rural field studies.Nucleic Acids Res.2005Aug 2 ； 33(13) ： e121 ； Donn 等人， A functional promoter haplotype of macrophage migration inhibitory factor is linked and associated with juvenile idiopathic arthritis.Arthritis Rheum.2004May ； 50(5) ： 1604-10) ； 这些文献都通过引 用完整地合并在此用于所有目的。)。如技术人员可以理解的， 与肌肉障碍关联， 因而可用 作根据本发明方法的诊断标记的 MG29 基因多态性， 可以出现在 MG29 基因或调节区的任何 一个核酸区中。鉴定和监测多态性的技术在本领域中是已知的， 并详细讨论在 Wohlgemuth 的美国专利 No ： 6,905,827 中， 该专利通过引用完整地合并在此用于所有目的。
     宿主细胞
     如本文使用的 “细胞” 是以其通常的生物学意义使用的， 并不是指整个多细胞生 物。该细胞可以是， 例如， 体内、 体外或离体的， 例如在细胞培养物中， 或存在于多细胞生物 中， 该多细胞生物包括例如， 鸟类、 植物和哺乳动物如灵长类动物、 人、 牛、 羊、 猿、 猴、 猪、 狗、 小鼠、 大鼠和猫。该细胞可以是原核细胞 ( 例如， 细菌细胞 ) 或真核细胞 ( 例如， 哺乳动物 或植物细胞 )。术语 “宿主细胞” 包括， 可用于携载异源性或外源性核酸， 或者表达异源性或 外源性 ( 即， 外来的 ) 核酸编码的肽或蛋白质的细胞。宿主细胞可以包含不能在该细胞天
     然 ( 未转化 ) 形式中找到的基因、 在该细胞天然形式中找到的基因， 其中该基因被修饰并由 人工手段重导入到该细胞中， 或者该细胞的内源性核酸， 该内源性核酸已被人工修饰， 但没 有从该细胞中除去。宿主细胞可以是真核或原核的。细菌培养所需的一般生长条件可以在 诸如 BERGEY′ S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY， Vol.1， N.R.Krieg， ed.， Williams and Wilkins， Baltimore/London(1984) 的文献中找到。 “宿主细胞” 也可以是这样的细胞， 其中内源性基因或启动子或者二者都已被修饰从而产生本发明的一种或多种多肽组分。
     可以通过本领域技术人员熟知的常规技术， 用重组 DNA 转化宿主细胞。 “转化” 是 指在导入、 修饰， 和 / 或提取核酸材料如 DNA 或 RNA 后， 在细胞中诱导的永久性或短暂性遗 传 ( 基因 ) 变化。
     如果宿主是原核的， 如大肠杆菌时， 则能够摄取 DNA 的感受态细胞可以由在指数 生长期之后收获的细胞制取， 随后按照本领域熟知的程序通过 CaCl2 法进行处理。替换地， 可以使用 MgCl2、 RbCl、 脂质体或脂质体 - 蛋白质结合物。转化也可以在形成宿主细胞原生 质体之后或通过电穿孔执行。这些实例并没有限制本发明， 在本发明范围内考虑了许多本 领域技术人员熟知的转染宿主细胞的技术。
     当宿主是真核的时， 此类用 DNA 转染的方法包括磷酸钙共沉淀、 常规机械程序如 显微注射、 电穿孔、 插入包覆在脂质体中的质粒， 或病毒载体， 以及本领域已知的其它方法。 该真核细胞可以是酵母细胞 ( 例如， 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)) 或可以是哺 乳动物细胞， 包括人细胞。为了长期高产率生产重组蛋白， 稳定的表达是优选的。 在另一个方面， 本发明包括包含任何一种本发明 MG29 核酸的宿主细胞。在某些实 施方式中， 该宿主细胞包含含有重组 MG29 核酸， 或与编码 MG29 的核酸互补的核酸， 或调节 内源性 MG29 基因表达的外源性或重组启动子的载体。
     在另一个方面， 本发明包括转基因生物， 例如， 小鼠， 其包含至少一种重组 MG29 等 位基因， 包括功能等位基因的缺失 ； 或包含 MG29 转基因 ； 或包含含有重组 MG29 核酸的载 体； 或包含 MG29 核酸或与 MG29 编码核酸或其部分互补的核酸前体。在某些实施方式中， 该 转基因生物可以包含可操作地连接到诱导型启动子 / 增强子， 和 / 或组织特异性启动子， 例 如肌肉特异性启动子上的重组 MG29 核酸。
     试剂盒
     在另一个方面， 本发明提供了包含合适的容器、 布置在其中的本发明提供的组合 物， 和使用说明书的试剂盒。 本发明的进一步目的在于提供包含合适的容器、 布置在其中的 药学可接受形式的本发明治疗剂， 和使用说明书的试剂盒。
     根据本发明还披露了利用本文所述的方法、 选择策略、 材料或组分中的任一种提 供了试剂盒或系统。根据本公开内容的示例试剂盒将可选地、 另外包括执行方法或分析的 说明书、 包装材料、 一个或多个包含分析 (assay)、 设备或系统元件的容器， 等等。
     抗体
     本发明的特征还在于， 免疫选择性地结合到 MG29 及其多肽、 片段、 同源物、 类似 物、 假肽、 模拟肽或衍生物上的抗体。因此， 在其它实施方式中， 本发明涉及编码 MG29 多肽 结合蛋白、 抗体多肽或其生物活性部分的分离核酸分子。
     如本文使用的术语 “抗体” 是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白 (Ig) 分子的免疫 活性部分， 即， 包含特异性地结合抗原 ( 与抗原免疫反应 ) 的抗原结合部位的分子， 其包含
     至少一个， 优选两个重 (H) 链可变区 ( 本文简称为 VH)， 和至少一个， 优选两个轻 (L) 链可变 区 ( 本文简称为 VL)。此种抗体包括， 但不局限于， 多克隆、 单克隆、 嵌合、 单链、 Fab、 Fab’ 和 F(ab’ )2 片段， 以及 Fab 表达文库。 该 VH 和 VL 区可以进一步细分为称为 “互补决定区” (CDR) 的高变区， 以及与其交替的较保守的称为 “构架区 ( 框架区， framework regions)” (FR) 的 区。构架区和 CDR 的范围已被精确界定 ( 参见， Kabat， E.A.， 等人 .(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition， U.S.Department of Health and Human Services， NIH Publication No.91-3242， and Chothia， C. 等 人 .(1987)J.Mol. Biol.196 ： 901-917， 这些文献通过引用合并在此 )。 每个 VH 和 VL 均由三个 CDR 和四个 FR 组 成， 该三个 CDR 和四个 FR 按下面的顺序从氨基末端向羧基末端布置 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。一般而言， 从人获得的抗体分子涉及 IgG、 IgM、 IgA、 IgE 和 IgD 类别中的 任何一种， 这些类别彼此之间的差异在于分子中存在的重链性质。 某些类别也具有子类， 如 IgG1、 IgG2 以及其它。此外， 在人中， 该轻链可以是 κ 链或 λ 链。本文提及抗体时包括提 及人抗体物种的所有这样的类别、 子类和类型。
     抗体可以由包含感兴趣的肽作为免疫剂的完整多肽或片段制备。 优选的抗原多肽 片段是 15 ～ 100 个连续氨基酸。在一个实施方式中， 该肽位于该多肽的非跨膜结构域中， 例如， 在细胞外或细胞内结构域中。示例抗体或抗体片段结合到可从细胞外环境接近的并 且改变蛋白质功能性的表位上。在某些实施方式中， 本发明包含识别 MG29， 和 / 或 MG29 受 体蛋白、 其变异体、 部分和 / 或其组合的一个或多个表位并对该表位具有特异性的抗体。在 替换实施方式中， 本发明抗体可以靶向和干扰 MG29/Glut4 相互作用。
     单 克 隆 抗 体 的 制 备 是 本 领 域 熟 知 的， 参 见， 例 如， Harlow 等 人， Antibodies ： A Laboratory Manual， page 726(Cold Spring Harbor Pub.1988)， USPNs ： Cabilly 的 6331415 ； Carter 的 6407213 和 6639055 ； 6562622 ； 6693176 ； 6881557 ； Morrison 的 5807715 ； Winter 的 5225539 ； Queen 的 5585089、 5693761、 6180370 和 7022500 ； Doyle 的 20070202105， 所有这些都通过引用合并在此。单克隆抗体可以通过以下操作获得 ： 给小鼠 或家兔注射包含抗原的组合物、 通过取出血清样品证实抗体的存在、 移出脾从而获得淋巴 细胞、 使该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而产生杂交瘤、 克隆杂交瘤、 选出对该抗原产生抗 体的阳性克隆， 和从杂交瘤培养物中分离出该抗体。可以通过本领域熟知的技术从杂交瘤 培养物中分离和纯化出单克隆抗体。
     在其它实施方式中， 该抗体可以通过重组生产， 例如， 通过噬菌体展示或通过组合 方法 (combinatorial methods) 生产。噬菌体展示和组合方法可以用于分离结合 MG29 多 肽或 MG29 结合蛋白或其片段的重组抗体 ( 如以下文献中所述的， 例如 Ladner 等人， 美国 专利 No.5,223,409 ； Fuchs 等人， (1991)Bio/Technology 9 ： 1370-1372 ； Hay 等人， (1992) Hum Antibod Hybridomas 3 ： 81-85 ； Huse 等人， (1989)Science 246 ： 1275-1281 ； Clackson 等人， (1991)Nature 352 ： 624-628 ； Gram 等人， (1992)PNAS 89 ： 3576-3580)。也可以利用 携载人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统 (mouse system) 的转基因小鼠制取人单克隆抗 体。利用这些用感兴趣抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞生产杂交瘤， 该杂交瘤分泌对来自 人蛋白的表位具有特异性亲和力的人 mAb( 参见， 例如， Wood 等人， 国际申请 WO91/00906 ； Lonberg， N. 等 人， 1994Nature 368 ： 856-859 ； Green， L.L. 等 人， 1994Nature Genet.7 ： 13-21 ； Morrison， S.L. 等人， 1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA81 ： 6851-6855)。 本发明复合物组分中治疗有用的抗体或者该复合物本身可以源自 “人源化” 或 “超人源化” 单克隆抗体。 通过将小鼠免疫球蛋白重和轻可变链的小鼠互补决定区 (CDR) 转染到人可变结构域中， 然 后将人残基 (residue) 替换到鼠类对应物的构架区中， 如此可以生产人源化单克隆抗体。
     使用源自人源化单克隆抗体的抗体组分消除了与鼠类恒定区免疫原性关联的 潜在问题。生产人源化单克隆抗体的技术可以在 Jones 等人， Nature 321 ： 522， 1986 ； 和 Singer 等 人， J.Immunol.150 ： 2844， 1993 ； Wu T.T.and Kabat， E.A.(1970)J.Exp.Med.， 132 ： ， 211-250 ； 和 Johnson G.， Wu， T.T.and Kabat， E.A.(1995)In Paul， S.(ed.)， Antibody Engineering Protocols.Humana Press， pp.1-15 中找到， 这些文献通过引用合并在此。该 抗体也可以源自从组合免疫球蛋白文库中分离的人抗体片段， 参见， 例如， Barbas 等人， Methods ： A Companion to Methods in Enzymology 2， 119， 1991。 另外， 通过将来自小鼠抗 体分子的具有适当抗原特异性的基因与来自人抗体分子的具有适当生物特异性的基因拼 接在一起， 获得嵌合抗体， 参见， 例如， Takeda 等人， Nature 314 ： 544-546， 1985。嵌合抗体 是这样的抗体， 其中不同的部分源自不同的动物物种。
     抗独特型技术 (anti-idiotype technology) 可以用于生产模拟表位的单克隆抗 体。针对第一单克隆抗体产生的抗独特型单克隆抗体在高变区中具有这样的结合结构域， 该结合结构域是被第一单克隆抗体结合的表位的 “映像 ( 镜像， image)” 。替换地， 可以利 用生产单链抗体的技术生产单链抗体。通过使 Fv 区的重链和轻链片段经由氨基酸桥连接 从而产生单链多肽而形成单链抗体。 可识别特异性表位如细胞外表位的抗体片段可以通过 本领域熟知的技术制取。此种片段包括由蛋白水解消化产生的 Fab 片段， 和通过还原二硫 桥产生的 Fab 片段。当用于免疫治疗时， 该单克隆抗体、 其片段或者二者可以没有标记或用 治疗剂标记。这些药剂可以通过本领域熟知的技术直接或间接偶联到单克隆抗体上， 并包 括这样的药剂， 如药物、 放射性同位素、 外源凝集素和毒素。
     给予单克隆抗体的剂量范围应大到足以产生期望的作用， 并随着年龄、 病症、 体 重、 性别、 年龄和待治疗病症的程度而变化， 可容易地由本领域技术人员确定。该剂量可以 为约 0.1mg/kg ～约 2000mg/kg。 该单克隆抗体可以静脉内、 腹膜内、 肌内， 和 / 或皮下给予。
     在本发明某些实施方式中， 抗原肽包括的至少一个表位是 MG29 多肽或 MG29 结合 蛋白区， 例如 Glut4， 其位于蛋白质表面上， 例如， 亲水性区域。蛋白质序列的疏水性分析将 指示多肽的哪个区特别亲水， 因而有可能编码对靶向抗体生产有用的表面残基。作为用于 靶向抗体生产的方式， 示出亲水性和疏水性区的亲水性图 (hydropathy plot) 可以通过本 领域熟知的任何方法制取， 包括， 例如， Kyte Doolittle 或 Hopp Woods 方法， 带有或不带有 傅里叶变换。参见， 例如， Hopp and Woods， 1981， Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78 ： 3824-3828 ； Kyte and Doolittle 1982， J.Mol.Biol.157 ： 105-142， 每篇文献都通过引用完整地合并在 此。本文也提供了对抗原蛋白， 或其衍生物、 片段、 类似物或同源物内的一个或多个结构域 具有特异性的抗体。在制取可免疫特异性地结合这些蛋白组分的抗体时， 可以利用本发明 蛋白质， 或其衍生物、 片段、 类似物、 同源物或直系同源物作为免疫原。
     人抗体
     全人抗体基本涉及这样的抗体分子， 其中包括 CDR 在内的轻链和重链的整个序列 都是由人基因产生。此种抗体在本文称为 “人抗体” 或 “全人抗体” 。人单克隆抗体可以通 过三源杂交瘤 (trioma) 技术、 人 B- 细胞杂交瘤技术 ( 参见， Kozbor， 等人， 1983ImmunolToday 4 ： 72) 和生产人单克隆抗体的 EBV 杂交瘤技术 ( 参见， Cole 等人， 1985， MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY， Alan R.Liss， Inc.， pp.77-96) 制备。人单克隆抗体可 以用于实施本发明， 并可以通过利用人杂交瘤生产 ( 参见， Cote 等人， 1983.Proc Natl Acad Sci USA 80 ： 2026-2030) 或通过用艾普斯登 - 巴尔病毒 (Epstein Barr Virus) 体外转化人 B- 细胞生产 ( 参见， Cole 等人， 1985， MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY， Alan R.Liss， Inc.， pp.77-96)。
     另外， 人抗体也可以利用另外的技术生产， 包括噬菌体展示文库 (Hoogenboom and Winter， J. Mol.Biol.227 ： 381(1991) ； Marks 等 人， J.Mol.Biol.， 222 ： 581(1991))。 类似地， 人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物， 例如， 内源性免疫球蛋 白基因已被部分或完全灭活的小鼠中制取。在攻击 ( 挑战， challenge) 后， 观察人抗体 的产生， 它在各个方面都非常类似于在人中观察到的， 包括基因重排 (rearrangement)、 组装 (assembly) 和抗体组库 (antibody repertoire)。这种途径描述在例如以下文献 中： 美 国 专 利 No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016 ； 以 及 Marks 等 人， (Bio/Technology， 10 ： 779-783(1992)) ； Lonberg 等 人， (Nature， 368 ： 856-859(1994)) ； Morrison(Nature， 368 ： 812-13(1994)) ； Fishwild 等 人， (Nature Biotechnology， 14 ： 845-51(1996)) ； Neuberger(Nature Biotechnology， 14 ： 826(1996)) ； 和 Lonberg and Huszar (Intern.Rev.Immunol.， 13 ： 65-93(1995))。
     人抗体另外可以利用转基因非人动物生产， 对该动物进行修饰以便反应于抗原攻 击而产生全人抗体而不是该动物的内源性抗体。使非人宿主中编码重和轻免疫球蛋白链 的内源性基因丧失能力 (incapacitated)， 并将编码人重和轻链免疫球蛋白的活性基因座 插入该宿主基因组中。例如， 利用包含需要的人 DNA 节段的酵母人工染色体， 掺入人基因。 然后， 通过使包含该修饰的不足完全的补体的中间转基因动物 (intermediate transgenic animals) 杂交， 获得提供所有期望修饰的动物子代。 此种非人动物的优选实施方式是小鼠， TM 称为 Xenomouse ， 如 PCT 公开 WO96/33735 和 WO96/34096 中公开的。
     本发明抗体的治疗有效量一般涉及达到治疗目的所需的量。如上所述， 这可以是 抗体与其靶抗原之间的结合相互作用， 该结合相互作用在某些情况下可干扰该靶的功能， 而在其它情况下， 可以促进生理反应。给予所需的量此外取决于抗体对其特异性抗原的结 合亲和力， 还将取决于给予的其他主体的自由体积 (free volume) 中所给予抗体的消耗速 率。本发明抗体或抗体片段治疗有效的给药剂量的常见范围 ( 作为非限制性实例 ) 可以为 约 0.1mg/kg 体重～约 500mg/kg 体重。常见的给药频率在， 例如从每日两次至一周一次的 范围内。
     特异性结合蛋白质的本发明抗体以及通过本文公开的筛选分析鉴定的其它分子， 可以以药物组合物形式给予用于治疗各种障碍。与制备此种组合物有关的原理和考虑因 素， 以及组分选择指导提供在例如下列文献中 ： Remington ： The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R.Gennaro， 等 人， editors)Mack Pub.Co.， Easton， Pa. ： 1995 ； Drug Absorption Enhancement ： Concepts， Possibilities， Limitations， And Trends， Harwood Academic Publishers， Langhome， Pa.， 1994 ； 和 Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences， Vol.4)， 1991， M.Dekker， 纽约。该 活性成分也可以包埋在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中， 例如， 羟基甲基纤维素或明胶 - 微胶囊和聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微胶囊， 在胶体药物递送系统 ( 例 如， 脂质体、 白蛋白微球、 微乳剂 (microemulsion)、 纳米颗粒和纳米胶囊 ) 中或在浓乳剂 (macroemulsion) 中。用于体内给予的制剂必须是无菌的。这容易通过无菌过滤膜过滤完 成。
     制剂
     在任何一个本文所述的实施方式中， 本发明提供的治疗剂可以与药学可接受载 体、 赋形剂， 和 / 或佐剂一起给予。在另外的实施方式中， 本发明提供了治疗组合物， 其包 含与至少一种另外的生物活性药剂和 / 或治疗药剂如氨基酸、 肽、 多肽、 化学化合物、 药物、 抗体等， 或其组合结合的本发明提供的组合物。例如， 在实施方式中， 该治疗组合物包含与 至少一种另外的生物活性药剂和 / 或治疗药剂如氨基酸、 肽、 多肽、 化学化合物、 药物、 抗体 等， 或其组合结合的 MG29 核酸和 / 或 MG29 多肽。本发明也提供了给予该治疗组合物用于 治疗或改善包括糖尿病在内的肌肉相关性病症的方法。
     可用在任何一个本文所述的实施方式中的生物有益成分的具体实例包括 ： 透明质 酸、 生长因子 ( 例如， VEGF、 TGF 家族 )、 治疗抗体 ( 例如， Humira)、 P 物质 (substance P)、 葡糖胺、 硫酸软骨素 (chondroitin sulphate)、 粘多糖、 疼痛控制剂 ( 例如吗啡 )、 滑液和 / 或它的组分、 类固醇和衍生物。 应当进一步理解， 包括在本发明中的组合是对它们的预期目 的有用的那些组合。下面给出的药剂仅为了说明目的， 而不是限制。作为本发明的一部分 的组合可以是本发明提供的组合物和至少一种另外的选自下面所列药剂的药剂。 如果该组 合使得所形成的组合物可以执行它的预期功能， 该组合也可以包括多于一种另外的药剂， 例如两种或三种另外的药剂。
     因而， 在另外的实施方式中， 本发明提供的组合物可以可选地进一步包含有效量 的至少一种化合物或蛋白质， 其选自以下药剂中的至少一种 ： 抗感染药物、 心血管 (CV) 系 统药物、 中枢神经系统 (CNS) 药物、 自主神经系统 (ANS) 药物、 呼吸道药物、 胃肠 (GI) 道药 物、 激素药物、 体液或电解质平衡药物、 血液药物 (hematologic drug)、 抗肿瘤药物、 免疫调 节药物、 眼耳鼻药物、 局部药物 (topical drug)、 营养药物等。这种药物， 包括本文提出的 每种药物的制剂、 适用症、 给药和给予， 是本领域熟知的 ( 参见例如 Nursing 2001Handbook of Drugs， 21.sup.st edition， Springhouse Corp.， Springhouse， Pa.， 2001 ； Health Professional′ s Drug Guide 2001， ed.， Shannon， Wilson， Stang， Prentice-Hall， Inc， Upper Saddle River， N.J. ； Pharmcotherapy Handbook， Wells 等人， ed.， Appleton&Lange， Stamford， Conn.， 每篇文献均通过引用完整地合并在此 )。
     抗感染药物可以是选自抗阿米巴药 (amebicides) 的至少一种或至少一种抗原虫 药、 抗蠕虫药 ( 驱肠虫剂， anthelmintics)、 抗真菌药、 抗疟疾药、 抗结核药或至少一种抗麻 风药、 氨基糖苷、 青霉素、 头孢菌素、 四环素、 磺胺、 氟喹诺酮、 抗病毒药、 大环内酯类抗感染 药和别类 ( 杂类， miscellaneous) 抗感染药。CV 药物可以是选自以下的至少一种 ： 正性 肌力药物 ( 促肌肉收缩剂， inotropics)、 抗心律失常药物、 抗心绞痛药物、 抗高血压药物、 抗血脂药物 (antilipemics) 和别类心血管药物。CNS 药物可以是选自非麻醉性镇痛药物 (normarcotic analgesics) 的至少一种或选自解热药物、 非甾体类抗炎药物、 麻醉性镇痛 药物的至少一种或至少一种阿片类镇痛药物、 镇静催眠药物、 抗惊厥药物、 抗抑郁药物、 抗 焦虑药物、 抗精神病药物、 中枢神经系统刺激药物、 抗帕金森病药物和别类中枢神经系统药物。ANS 药物可以是选自以下的至少一种 ： 胆碱能药物 ( 拟副交感神经药物 )、 抗胆碱能 药物、 肾腺素能药物 ( 拟交感神经药物 )、 肾上腺素能阻断剂 ( 交感神经抑制剂 )、 骨骼肌 松弛剂和神经肌肉阻断剂。呼吸道药物可以是选自以下的至少一种 ： 抗组胺药物、 支气管 扩张药物、 祛痰药物或至少一种镇咳药物及别类呼吸道药物。胃肠道药物可以是选自抗酸 药物的至少一种或至少一种吸附剂或至少一种排气药物、 消化酶或至少一种胆石溶解剂、 止泻药物、 轻泻药物、 止吐药物和抗溃疡药物。激素药物可以是选自皮质类固醇、 雄激素的 至少一种， 或至少一种合成代谢类甾醇、 雌激素或至少一种孕酮、 促性腺激素、 抗糖尿病药 物或至少一种胰高血糖素、 甲状腺激素、 甲状腺激素拮抗剂、 垂体激素和副甲状腺样药物 (parathyroid-like drug)。 液体和电解质平衡药物可以是选自利尿药物、 电解质的至少一 种， 或至少一种置换液 (replacement solution)、 酸化剂或至少一种碱化剂。血液药物可 以是选自补血剂、 抗凝血剂、 血液衍生物和溶栓酶的至少一种。 抗肿瘤药物可以是选自烷基 化药物、 抗代谢药物、 抗生素类抗肿瘤药物、 改变激素平衡的抗肿瘤药物和别类抗肿瘤药物 的至少一种。免疫调节药物可以是选自免疫抑制剂、 疫苗的至少一种， 或至少一种类毒素、 抗毒素或至少一种抗蛇毒素、 免疫血清和生物反应调节剂。眼耳鼻药物可以是选自眼用抗 感染药物、 眼用抗炎药物、 缩瞳剂、 散瞳剂、 眼用血管收缩剂、 别类眼耳鼻药物的至少一种。 局部药物可以是选自局部抗感染药物、 杀疥癣剂的至少一种， 或至少一种杀虱剂或局部皮 质类固醇。营养药可以是选自维生素、 矿物质或热质 (calorics) 的至少一种。参见例如， Nursing 2001Drug Handbook， ( 出处同上 ) 的内容。 所述至少一种抗阿米巴药或抗原虫药可以是选自以下的至少一种 ： 阿托伐醌、 盐 酸氯喹、 磷酸氯喹、 甲硝唑、 盐酸甲硝唑和依西酸喷他脒 (pentamidine isethionate)。所 述至少一种抗蠕虫药可以是选自以下的至少一种 ： 甲苯达唑、 双羟萘酸噻嘧啶和噻苯达唑。 所述至少一种抗真菌药物可以是选自以下的至少一种 ： 两性霉素 B、 两性霉素 B 硫酸胆甾醇 酯复合物、 两性霉素 B 脂质复合物、 两性霉素 B 脂质体、 氟康唑、 氟胞嘧啶、 微粉化灰黄霉素、 超微粉化灰黄霉素、 伊曲康唑、 酮康唑、 制霉菌素和盐酸特比萘芬。所述至少一种抗疟疾药 物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸氯喹、 磷酸氯喹、 多西环素、 硫酸羟氯喹、 盐酸甲氟喹、 磷酸伯氨喹、 乙胺嘧啶和乙胺嘧啶加磺胺多辛 (pyrimethamine with sulfadoxine)。所述 至少一种抗结核药物或抗麻风药物可以是选自以下的至少一种 ： 氯法齐明、 环丝氨酸、 氨苯 砜、 盐酸乙胺丁醇、 异烟肼、 吡嗪酰胺、 利福布汀、 利福平、 利福喷汀和硫酸链霉素。所述至 少一种氨基糖苷可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸阿米卡星、 硫酸庆大霉素、 硫酸新霉素、 硫酸链霉素和硫酸托普霉素。所述至少一种青霉素可以是选自以下的至少一种 ： 阿莫西林 / 克拉维酸钾、 三水阿莫西林、 氨苄青霉素、 氨苄青霉素钠、 三水氨苄青霉素、 氨苄青霉素钠 / 舒巴坦钠、 氯唑西林钠、 二氯唑西林钠、 美洛西林钠、 萘夫西林钠、 苯唑西林钠、 苄星青霉素 G、 青霉素 G 钾、 普鲁卡因青霉素 G、 青霉素 G 钠、 青霉素 V 钾、 哌拉西林钠、 哌拉西林钠 / 三唑 巴坦钠、 替卡西林二钠和替卡西林二钠 / 克拉维酸钾。
     所述至少一种头孢菌素可以是选自以下的至少一种 ： 头孢克洛、 头孢羟氨苄、 头孢 唑林钠、 头孢地尼、 盐酸头孢吡肟、 头孢克肟、 头孢美唑钠、 头孢尼西钠、 头孢哌酮钠、 头孢噻 肟钠、 头孢替坦二钠、 头孢西丁钠、 头孢泊肟普塞酯、 头孢丙烯、 头孢他啶、 头孢布烯、 头孢唑 肟钠、 头孢曲松钠、 头孢呋辛醋氧乙酯、 头孢呋辛钠、 盐酸头孢氨苄、 一水头孢氨苄、 头孢拉 定和氯碳头孢。所述至少一种四环素可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸地美环素、 多西环
     素钙、 海克多西环素、 盐酸多西环素、 一水多西环素、 盐酸米诺环素和盐酸四环素。 所述至少 一种磺胺可以是选自以下的至少一种 ： 复方新诺明、 磺胺嘧啶、 磺胺甲基噁唑、 硫代异噁唑 和乙酰硫代异噁唑。所述至少一种氟喹诺酮可以是选自以下的至少一种 ： 甲磺酸阿拉曲伐 沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 左氧氟沙星、 盐酸洛美沙星、 萘啶酸、 诺氟沙星、 氧氟沙星、 司帕 沙星和甲磺酸曲伐沙星。所述至少一种氟喹诺酮可以是选自以下的至少一种 ： 甲磺酸阿拉 曲伐沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 左氧氟沙星、 盐酸洛美沙星、 萘啶酸、 诺氟沙星、 氧氟沙星、 司帕沙星和甲磺酸曲伐沙星。所述至少一种抗病毒药物可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸 阿巴卡韦、 阿昔洛韦钠、 盐酸金刚烷胺、 氨普那韦、 西多福韦、 甲磺酸地位韦啶、 地达诺新、 依 法韦仑、 泛昔洛韦、 福米韦生钠、 膦甲酸钠、 更昔洛韦、 硫酸茚地那韦、 拉米夫定、 拉米夫定 / 齐多夫定、 甲磺酸奈非那韦、 奈韦拉平、 磷酸奥塞米韦、 利巴韦林、 盐酸金刚乙胺、 利托那韦、 沙奎那韦、 甲磺酸沙奎那韦、 司他夫定、 盐酸伐昔洛韦、 扎西他滨、 扎那米韦和齐多夫定。所 述至少一种大环内酯抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿奇霉素、 克拉霉素、 地红霉 素、 红霉素碱、 依托红霉素、 琥乙红霉素、 乳糖酸红霉素和硬脂酸红霉素。 所述至少一种别类 抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 氨曲南、 杆菌肽、 氯霉素琥珀酸钠、 盐酸克林霉素、 盐酸克林霉素棕榈酸酯、 磷酸克林霉素、 亚胺培南和西司他丁钠、 美罗培南、 粗晶呋喃妥因、 微晶呋喃妥因、 奎奴普丁 / 达福普汀、 盐酸壮观霉素、 甲氧苄氨嘧啶和盐酸万古霉素。 ( 参见 例如 Nursing 2001Drug Handbook 的第 24-214 页。)
     所述至少一种正性肌力药物可以是选自以下的至少一种 ： 乳酸氨利酮、 地高辛和 乳酸米利酮。所述至少一种抗心律失常药物可以是选自以下的至少一种 ： 腺苷、 盐酸胺碘 酮、 硫酸阿托品、 甲苯磺酸溴苄胺、 盐酸地尔硫卓、 丙吡胺、 磷酸双异丙吡胺、 盐酸艾司洛尔、 醋酸氟卡尼、 富马酸伊布利特、 盐酸利多卡因、 盐酸美西律、 盐酸莫里西嗪、 苯妥英、 苯妥英 钠、 盐酸普鲁卡因胺、 盐酸普罗帕酮、 盐酸普萘洛尔、 重硫酸奎尼丁、 葡糖酸奎尼丁、 聚半乳 糖醛酸奎尼丁、 硫酸奎尼丁、 索他洛尔、 盐酸妥卡胺和盐酸维拉帕米。所述至少一种抗心绞 痛药物可以是选自以下的至少一种 ： 苯磺酸阿罗地平、 亚硝酸戊酯、 盐酸苄普地尔、 盐酸地 尔硫卓、 二硝酸异山梨酯、 单硝酸异山梨酯、 纳多洛尔、 盐酸尼卡地平、 硝苯地平、 硝酸甘油、 盐酸普萘洛尔、 维拉帕米和盐酸维拉帕米。所述至少一种抗高血压药物可以是选自以下的 至少一种 ： 盐酸醋丁洛尔、 苯磺酸氨氯地平、 阿替洛尔、 盐酸贝那普利、 盐酸倍他洛尔、 富马 酸比索洛尔、 坎地沙坦西来替昔酯、 卡托普利、 盐酸卡替洛尔、 卡维地洛、 可乐定、 盐酸可乐 定、 二氮嗪、 盐酸地尔硫卓、 甲磺酸多沙唑嗪、 依那普利拉、 马来酸依那普利、 甲磺酸依普罗 沙坦、 非洛地平、 甲磺酸非诺多泮、 福辛普利钠、 乙酸氯压胍、 硫酸胍那决尔、 盐酸胍法辛、 盐 酸肼苯哒嗪、 依贝沙坦、 依拉地平、 盐酸拉贝洛尔、 赖诺普利、 氯沙坦钾、 甲基多巴、 盐酸甲基 多巴乙酯、 琥珀酸美托洛尔、 酒石酸美托洛尔、 米诺地尔、 盐酸莫西普利、 纳多洛尔、 盐酸尼 卡地平、 硝苯地平、 尼索地平、 硝普钠、 硫酸喷布洛尔、 哌道普利特丁胺、 甲磺酸酚妥拉明、 吲 哚洛尔、 盐酸哌唑嗪、 盐酸普萘洛尔、 盐酸喹那普利、 雷米普利、 替米沙坦、 盐酸特拉唑嗪、 马 来酸噻吗心安、 群多普利、 缬沙坦和盐酸维拉帕米。 所述至少一种抗血脂药物可以是选自以 下的至少一种 ： 阿托伐他汀钙、 西立伐他汀钠、 考来烯胺、 盐酸降脂宁、 非诺贝特 ( 微粉化 )、 氟伐他汀钠、 吉非贝齐、 洛伐他汀、 烟酸、 普伐他汀钠和辛伐他汀。 所述至少一种别类心血管 药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿昔单抗、 前列地尔、 盐酸阿布他明、 西洛他唑、 硫酸氢氯 吡格雷、 双嘧达莫、 依替巴肽、 盐酸米多君、 己酮可可碱、 盐酸噻氯匹定和盐酸替罗非班。 (参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的 215-336 页 )。
     所述至少一种非麻醉性镇痛药物或解热药物可以是选自以下的至少一种 ： 对乙 酰氨基酚、 阿司匹林、 三水杨酸胆碱镁、 二氟尼柳和水杨酸镁。所述至少一种非甾体类抗炎 药物可以是选自以下的至少一种 ： 塞来考昔、 双氯芬酸钾、 双氯芬酸钠、 依托度酸、 非诺洛 芬钙、 氟比洛芬、 布洛芬、 吲哚美辛、 三水吲哚美辛钠、 酮洛芬、 酮咯酸氨丁三醇、 萘丁美酮、 萘普生、 萘普生钠、 噁丙嗪、 吡罗昔康、 罗非考昔和舒林酸。所述至少一种麻醉性或阿片类 镇痛药物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸阿芬他尼、 盐酸叔丁啡、 酒石酸布托非诺、 磷酸 可待因、 硫酸可待因、 柠檬酸芬太尼、 芬太尼透皮系统、 芬太尼透粘膜剂、 盐酸氢吗啡酮、 盐 酸哌替啶、 盐酸美沙酮、 盐酸吗啡、 硫酸吗啡、 酒石酸吗啡、 盐酸纳布啡、 盐酸氧可酮、 果胶酸 氧可酮 (oxycodone pectinate)、 盐酸氧吗啡酮、 盐酸喷他佐辛、 盐酸喷他佐辛和盐酸纳洛 酮、 乳酸喷他佐辛、 盐酸丙氧芬、 萘磺酸丙氧芬、 盐酸雷米芬太尼、 柠檬酸舒芬太尼和盐酸曲 马多。所述至少一种镇静催眠药物可以是选自以下的至少一种 ： 水合氯醛、 艾司唑仑、 盐 酸氟西泮、 戊巴比妥、 戊巴比妥钠、 苯巴比妥钠、 司可巴比妥钠、 替马西泮、 三唑仑、 扎来普 隆和酒石酸扎来普隆。所述至少一种抗惊厥药物可以是选自以下的至少一种 ： 乙酰唑胺 钠、 卡马西平、 氯硝西泮、 氯氮卓二钾、 地西泮、 地伐雷司钠 (divalproex sodium)、 乙琥胺 (ethosuximde)、 磷苯妥英钠、 加巴喷丁、 拉莫三嗪、 硫酸镁、 苯巴比妥、 苯巴比妥钠、 苯妥英、 苯妥英钠、 苯妥英钠 ( 延伸型 )、 扑米酮、 硫加宾盐酸盐、 托吡酯、 丙戊酸钠和丙戊酸。所述 至少一种抗抑郁药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿米替林盐酸盐、 扑酸阿米替林、 阿莫沙 平、 盐酸安非他酮、 氢溴酸西酞普兰、 盐酸氯米帕明、 盐酸地昔帕明、 盐酸多塞平、 盐酸氟西 汀、 盐酸米帕明、 扑酸米帕明、 米尔塔扎平、 盐酸奈法唑酮、 盐酸去甲替林、 盐酸帕罗西汀、 硫 酸苯乙肼、 盐酸舍曲林、 硫酸反苯环丙胺、 马来酸曲米帕明和盐酸文拉法辛。所述至少一种 抗焦虑药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿普唑仑、 盐酸丁螺环酮、 利眠宁、 盐酸利眠宁、 氯氮卓二钾、 地西泮、 盐酸多塞平、 双羟萘酸羟嗪、 盐酸羟嗪、 扑酸羟嗪、 劳拉西泮、 甲丙氨酯 (mephrobamate)、 盐酸咪达唑仑和奥沙西泮。所述至少一种抗精神病药物可以是选自以下 的至少一种 ： 盐酸氯丙嗪、 氯氮平、 癸酸氟奋乃静、 庚酸氟奋乃静、 盐酸氟奋乃静、 氟哌啶醇、 癸酸氟哌啶醇、 乳酸氟哌啶醇、 盐酸洛沙平、 琥珀酸洛沙平、 苯磺酸美索达嗪、 盐酸吗茚酮、 奥氮平、 奋乃静、 匹莫齐特、 丙氯拉嗪、 富马酸喹硫平、 利哌利酮、 盐酸硫利达嗪、 替沃噻吨、 盐酸替沃噻吨和盐酸三氟拉嗪。 所述至少一种中枢神经系统刺激剂可以是选自以下的至少 一种 ： 硫酸苯丙胺、 咖啡因、 硫酸右苯丙胺、 盐酸多沙普仑、 盐酸甲基苯丙胺、 盐酸哌甲酯、 莫 达非尼、 匹莫林和盐酸芬特明。 所述至少一种抗帕金森病药物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸金刚烷胺、 甲磺酸苯托品、 盐酸比哌立登、 乳酸比哌立登、 甲磺酸溴隐亭、 卡比多巴 - 左 旋多巴、 恩他卡朋、 左旋多巴、 甲磺酸培高利特、 二盐酸普拉克索、 盐酸罗平尼咯、 盐酸司立 吉林、 托卡朋和盐酸苯海索。所述至少一种别类中枢神经系统药物可以是选自以下的至少 一种 ： 盐酸安非他酮、 盐酸多奈哌齐、 氟哌利多、 马来酸氟伏沙明、 碳酸锂、 柠檬酸锂、 盐酸那 拉曲坦、 尼古丁离子交换树脂、 尼古丁透皮系统、 丙泊酚、 苯甲酸利扎曲坦、 盐酸西布曲明一 水合物、 琥珀酸舒马曲坦、 盐酸他克林和佐米曲坦。 ( 参见例如 Nursing 2001DrugHand book 的第 337-530 页 )。
     所述至少一种胆碱能药物 ( 例如拟副交感神经药物 ) 可以是选自以下的至少一 种： 氯化氨甲酰甲胆碱、 依酚氯铵、 溴化新斯的明、 甲基硫酸新斯的明、 水杨酸毒扁豆碱和溴化吡啶新斯的明。所述至少一种抗胆碱能药物可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸阿托品、 盐酸双环胺、 吡咯糖 (glycopyrrolate)、 莨菪碱、 硫酸莨菪碱、 溴化普鲁本辛、 东莨菪碱、 丁 溴东莨菪碱和氢溴酸东莨菪碱。所述至少一种肾腺素能药物 ( 拟交感神经药物 ) 可以是选 自以下的至少一种 ： 盐酸多巴酚丁胺、 盐酸多巴胺、 重酒石酸间羟胺、 重酒石酸去甲肾上腺 素、 盐酸苯福林、 盐酸假麻黄碱， 和硫酸假麻黄碱。所述至少一种肾腺素能阻断剂 ( 交感神 经抑制剂 ) 可以是选自以下的至少一种 ： 甲磺酸二氢麦角胺、 酒石酸麦角胺、 马来酸美西麦 角和盐酸普萘洛尔。所述至少一种骨骼肌松弛剂可以是选自以下的至少一种 ： 巴氯芬、 卡 利普多、 氯唑沙宗、 盐酸环苯扎林、 单曲林钠、 美索巴莫和盐酸替扎尼定。 所述至少一种神经 肌肉阻断剂可以是选自以下的至少一种 ： 苯磺酸阿曲库铵、 苯磺酸顺阿曲库铵、 氯化杜什库 胺、 氯化米伐克龙、 泮库溴铵、 哌库溴铵、 雷帕库溴铵、 罗库溴铵、 氯化丁二酰胆碱、 氯化筒箭 毒碱和维库溴铵。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的第 531-84 页 )。
     所述至少一种抗组胺药物可以是选自以下的至少一种 ： 马来酸溴苯那敏、 盐酸西 替立嗪、 马来酸氯苯那敏、 富马酸氯马斯汀、 盐酸赛庚啶、 盐酸苯海拉明、 盐酸非索非那定、 氯雷他定、 盐酸异丙嗪、 茶氯酸异丙嗪和盐酸曲普利啶。 所述至少一种支气管扩张药物可以 是选自以下的至少一种 ： 沙丁胺醇、 硫酸沙丁胺醇、 氨茶碱、 硫酸阿托品、 硫酸麻黄碱、 肾上 腺素、 重酒石酸肾上腺素、 盐酸肾上腺素、 异丙托溴铵、 异丙肾上腺素、 盐酸异丙肾上腺素、 硫酸异丙肾上腺素、 盐酸左旋沙丁胺醇、 硫酸奥西那林、 胆茶碱 (oxtriphylline)、 乙酸吡布 特罗、 昔萘酸沙美特罗、 硫酸特布他林和茶碱。 所述至少一种祛痰药物或镇咳药物可以是选 自以下的至少一种 ： 苯佐那酯、 磷酸可待因、 硫酸可待因、 氢溴酸右美沙芬、 盐酸苯海拉明、 愈创甘油醚和盐酸氢吗啡酮。所述至少一种别类呼吸道药物可以是选自以下的至少一种 ： 乙酰半胱氨酸、 二丙酸倍氯米松、 贝拉康坦、 布地奈德、 小牛表面蛋白 (calfactant)、 色苷酸 钠、 阿法链道酶、 依前列醇钠、 氟尼缩松、 丙酸氟替卡松、 孟鲁斯特钠、 奈多罗米钠、 帕利珠单 抗、 曲安奈德、 扎鲁司特和弃白通。( 参 JI 例如 Nursing2001DrugHandbook 的第 585-642 页 )。
     所述至少一种抗酸药物、 吸附剂或排气药物可以是选自以下的至少一种 ： 碳酸铝、 氢氧化铝、 碳酸钙、 镁加铝、 氢氧化镁、 氧化镁、 西甲硅油和碳酸氢钠。所述至少一种消化酶 或胆石溶解剂可以是选自以下的至少一种 ： 胰酶、 胰脂肪酶和熊去氧胆酸 (ursodiol)。所 述至少一种止泻药物可以是选自以下的至少一种 ： 硅镁土、 碱式水杨酸铋、 聚卡波非钙、 盐 酸地芬诺酯和硫酸阿托品、 洛哌丁胺、 乙酸奥曲肽、 阿片酊和阿片酊 ( 含樟脑 )。所述至少 一种轻泻药物可以是选自以下的至少一种 ： 铋索多尔 (bisocodyl)、 聚卡波非钙、 药鼠李皮 (cascara sagrada)、 药鼠李皮芳香流浸膏、 药鼠李皮流浸膏、 蓖麻油、 多库酯钙、 多库酯钠、 甘油、 乳酮糖、 柠檬酸镁、 氢氧化镁、 硫酸镁、 甲基纤维素、 矿物油、 聚乙二醇或电解质溶液、 欧车前、 番泻叶和磷酸钠。所述至少一种止吐药物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸氯丙 嗪、 茶苯海明、 甲磺酸多拉司琼、 屈大麻酚、 盐酸格拉司琼、 盐酸麦克洛嗪、 盐酸加氧氯普胺、 盐酸昂丹司琼、 奋乃静、 丙氯拉嗪、 乙二磺酸普鲁氯嗪、 马来酸丙氯拉嗪、 盐酸异丙嗪、 东莨 菪碱、 马来酸硫乙拉嗪和盐酸曲美苄胺。所述至少一种抗溃疡药物可以是选自以下的至少 一种 ： 西咪替丁、 盐酸西咪替丁、 法莫替丁、 兰索拉唑、 米索前列醇、 尼扎替丁、 奥美拉唑、 雷 贝普拉唑钠、 雷尼替丁柠檬酸铋、 盐酸雷尼替丁和硫糖铝。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 第 643-95 页 )。所述至少一种皮质类固醇可以是选自以下的至少一种 ： 倍他米松、 乙酸倍他米松 或倍他米松磷酸钠、 倍他米松磷酸钠、 乙酸可的松、 地塞米松、 乙酸地塞米松、 地塞米松磷酸 钠、 乙酸氟氢可的松、 氢化可的松、 乙酸氢化可的松、 环戊丙酸氢化可的松、 氢化可的松磷酸 钠、 氢化可的松琥珀酸钠、 甲基泼尼松龙、 乙酸甲基泼尼松龙、 甲泼尼龙琥珀酸钠、 泼尼松 龙、 乙酸泼尼松龙、 氢化泼尼松磷酸钠、 叔丁乙酸氢化泼尼松、 泼尼松、 曲安西龙、 曲安奈德 和二乙酸曲安西龙。所述至少一种雄激素或合成代谢类甾醇可以是选自以下的至少一种 ： 达那唑、 氟甲睾酮、 甲基睾酮、 癸酸诺龙、 苯丙酸诺龙、 睾酮、 环戊丙酸睾酮、 庚酸睾酮、 丙酸 睾酮和睾酮透皮系统。所述至少一种雌激素或孕酮可以是选自以下的至少一种 ： 酯化雌激 素、 雌二醇、 环戊丙酸雌二醇、 雌二醇 / 乙酸炔诺酮透皮系统、 戊酸雌二醇、 雌激素 ( 结合 )、 哌嗪雌酮硫酯、 炔雌醇、 炔雌醇和去氧孕烯、 炔雌醇和二乙酸炔诺醇、 炔雌醇和去氧孕烯、 炔 雌醇和二乙酸炔诺醇、 炔雌醇和左炔诺孕酮、 炔雌醇和炔诺酮、 炔雌醇和乙酸炔诺酮、 炔雌 醇和炔诺肟酯、 炔雌醇和炔诺孕酮、 炔雌醇和炔诺酮和乙酸盐和富马酸亚铁、 左炔诺孕酮、 醋酸甲羟孕酮、 美雌醇和炔诺酮、 炔诺酮、 乙酸炔诺酮、 炔诺孕酮和孕酮。 所述至少一种促性 腺激素可以是选自以下的至少一种 ： 乙酸加尼瑞克、 乙酸促性腺激素释放素、 乙酸组氨瑞林 和促生育素。所述至少一种抗糖尿病药物或胰高血糖素可以是选自以下的至少一种 ： 阿卡 波糖、 氯磺丙脲、 格列美脲、 格列吡嗪、 胰高血糖素、 格列本脲、 胰岛素、 盐酸二甲双胍、 米格 列醇、 盐酸吡格列酮、 瑞格列奈、 马来酸罗西格列酮和曲格列酮。所述至少一种甲状腺激素 可以是选自以下的至少一种 ： 左旋甲状腺素钠、 碘塞罗宁钠、 复方甲状腺素和甲状腺剂。所 述至少一种甲状腺激素拮抗剂可以是选自以下的至少一种 ： 甲硫咪唑、 碘化钾、 碘化钾 ( 饱 和溶液 )、 丙硫氧嘧啶、 放射性碘 ( 碘化钠 131I) 和强碘溶液。所述至少一种垂体激素可以 是选自以下的至少一种 ： 促肾皮素、 促皮质素、 乙酸去氨加压素 (desmophressinacetate)、 乙酸亮丙立德、 储库型促肾皮素、 索吗托诺、 生长激素和血管加压素。所述至少一种副甲 状腺样药物可以是选自以下的至少一种 ： 骨化二醇 (calcifediol)、 降钙素 ( 人 )、 降钙 素 ( 鲑鱼 )、 钙三醇、 双氢速甾醇和依替膦酸二钠 (etidronate disodium)。( 参见例如 Nursing2001Drug Handbook 的第 696-796 页 )。
     所述至少一种利尿药物可以是选自以下的至少一种 ： 乙酰唑胺、 乙酰唑胺钠、 盐酸 阿米洛利、 布美他尼、 氯噻酮、 利尿酸钠、 依地尼酸、 呋塞米、 氢氯噻嗪、 吲哒帕胺、 甘露糖醇、 美扎拉宗、 螺内酯、 托赛米、 氨苯蝶吟和尿素。所述至少一种电解质或置换液可以是选自以 下的至少一种 ： 乙酸钙、 碳酸钙、 氯化钙、 柠檬酸钙、 葡乳醛酸钙、 葡庚糖酸钙、 葡糖酸钙、 乳 酸钙、 磷酸钙 ( 二元 )、 磷酸钙 ( 三元 )、 葡聚糖 ( 高分子量 )、 葡聚糖 ( 低分子量 )、 羟乙基 淀粉、 氯化镁、 硫酸镁、 乙酸钾、 碳酸氢钾、 氯化钾、 葡糖酸钾、 林格氏注射液、 林格氏注射液 ( 乳酸化 ) 和氯化钠。所述至少一种酸化剂或碱化剂可以是选自以下的至少一种 ： 碳酸氢 钠、 乳酸钠和氨丁三醇。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的 797-833 页 )。
     所述至少一种补血剂可以是选自以下的至少一种 ： 富马酸亚铁、 葡糖酸亚铁、 硫酸 亚铁、 硫酸亚铁 ( 干燥 )、 葡聚糖铁、 山梨醇铁、 多糖 - 铁复合物和复合葡萄糖酸钠铁。所述 至少一种抗凝血剂可以是选自以下的至少一种 ： 阿地肝素钠、 达特肝素钠、 达那肝素钠、 依 诺肝素钠、 肝素钙、 肝素钠和华法林钠。 所述至少一种血液衍生物可以是选自以下的至少一 种： 白蛋白 5％、 白蛋白 25％、 抗血友病因子、 抗抑制剂凝结剂复合物、 抗凝血酶 III( 人 )、 因子 IX( 人 )、 因子 IX 复合物和血浆蛋白成分。所述至少一种溶栓酶可以是选自以下的至少一种 ： 阿替普酶、 复合纤溶酶链激酶、 瑞替普酶 ( 重組 )、 链激酶和尿激酶。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的第 83-66 页 )。
     所述至少一种烷基化药物可以是选自以下的至少一种 ： 白消安、 卡铂、 卡莫司汀、 苯丁酸氮芥、 顺铂、 环磷酰胺、 异环磷酰胺、 洛莫司汀、 盐酸氮芥、 美法仑、 盐酸美法仑、 链佐 星、 替莫唑胺和塞替派。所述至少一种抗代谢药物可以是选自以下的至少一种 ： 卡培他滨、 克拉屈滨、 阿糖胞苷、 氟尿苷、 磷酸氟达拉滨、 氟尿嘧啶、 羟基脲、 巯嘌呤、 甲氨喋呤、 甲氨喋 呤钠和硫鸟嘌呤。所述至少一种抗生素类抗肿瘤药物可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸博 来霉素、 放线菌素、 柠檬酸柔红霉素脂质体、 盐酸柔红霉素、 盐酸多柔比星、 盐酸多柔比星脂 质体、 盐酸表柔比星、 盐酸伊达比星、 丝裂霉素、 喷司他丁、 普卡霉素和戊柔比星。所述至少 一种改变激素平衡的抗肿瘤药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿那曲唑、 比卡鲁胺、 雌莫司 汀磷酸钠、 依西美坦、 氟他胺、 醋酸戈舍瑞林、 来曲唑、 乙酸亮丙立德、 醋酸甲地孕酮、 尼鲁米 特、 柠檬酸他莫昔芬、 睾内酯和柠檬酸托瑞米芬。所述至少一种别类抗肿瘤药物可以是选 自以下的至少一种 ： 天冬酰胺酶、 卡介苗 (bacillus Calmette-Guerin)(BCG)( 活的膀胱内 的 (liveintravesical))、 达卡巴嗪、 多西他赛、 依托泊苷、 磷酸依托泊苷、 盐酸吉西他滨、 盐 酸伊立替康、 米托坦、 盐酸米托蒽醌、 紫杉醇、 培门冬酶、 卟吩姆钠、 盐酸丙卡巴肼、 利妥昔单 抗、 替尼泊苷、 盐酸托泊替康、 曲妥单抗、 维甲酸、 硫酸长春碱、 硫酸长春新碱和酒石酸长春 瑞滨。( 参见例如 Nursing 2001DrugHandbook 的第 867-963 页 )。 所述至少一种免疫抑制剂可以是选自以下的至少一种 ： 硫 唑 嘌 呤、 巴利昔 单抗、 环胞菌素、 达克珠单抗、 淋巴细胞免疫球蛋白、 莫罗单抗 -CD3、 麦考酚酸吗乙酯 (mycophenolate mofetil)、 盐酸麦考酚酸吗乙酯、 西罗莫司和他克莫司。所述至少一种 疫苗或类毒素可以是选自以下的至少一种 ： BCG 疫苗、 霍乱疫苗、 白喉和破伤风类毒素 ( 吸 附 )、 白喉和破伤风类毒素和非细胞型百日咳疫苗吸附的白喉和破伤风类毒素以及全细胞 百日咳疫苗、 B 型嗜血杆菌结合疫苗、 甲肝疫苗 ( 失活 )、 乙肝疫苗 ( 重组 )、 流感病毒疫苗 1999-2000 三价型 A&B( 纯化的表面抗原 )、 流感病毒疫苗 1999-2000 三价型 A&B( 亚病毒粒 子或纯化的亚病毒粒子 )、 流感病毒疫苗 1999-2000 三价型 A&B( 全病毒粒子 )、 日本脑炎病 毒疫苗 ( 失活 )、 莱姆病疫苗 ( 重组 OspA)、 麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗 ( 活 )、 麻疹和腮 腺炎和风疹病毒疫苗 ( 活、 减毒 )、 麻疹病毒疫苗 ( 活、 减毒 )、 脑膜炎球菌多糖疫苗、 腮腺 炎病毒疫苗 ( 活 )、 鼠疫疫苗、 肺炎球菌疫苗 ( 多价 )、 脊髓灰质炎病毒疫苗 ( 失活 )、 脊髓 灰质炎病毒疫苗 ( 活、 口服、 三价 )、 狂犬病疫苗 ( 吸附的 )、 狂犬病疫苗 ( 人二倍体细胞 )、 狂犬病和腮腺炎病毒疫苗 ( 活 )、 狂犬病疫苗 ( 活、 减毒 )、 破伤风类毒素 ( 吸附的 )、 破伤 风类毒素 ( 流体 )、 伤寒疫苗 ( 口服 )、 伤寒疫苗 ( 肠道外 )、 伤寒 Vi 多糖疫苗、 水痘病毒疫 苗和黄热病疫苗。所述至少一种抗毒素或抗蛇毒素可以是选自以下的至少一种 ： 黑寡妇蜘 蛛抗蛇毒素、 响尾蛇科抗蛇毒素 ( 多价 )、 白喉抗毒素 ( 马 ) 和抗珊斑眼镜蛇毒抗蛇毒素 (Micrurus fulvius antivenin)。所述至少一种免疫血清可以是选自以下的至少一种 ： 巨 细胞病毒免疫球蛋白 ( 静脉内 )、 乙型肝炎免疫球蛋白 ( 人 )、 免疫球蛋白肌内、 免疫球蛋白 静脉内、 狂犬病免疫球蛋白 ( 人 )、 呼吸道合胞病毒免疫球蛋白静脉内 ( 人 )、 Rh0(D) 免疫 球蛋白 ( 人 )、 Rh0(D) 免疫球蛋白静脉内 ( 人 )、 破伤风免疫球蛋白 ( 人 ) 和水痘 - 带状疱 疹免疫球蛋白。 所述至少一种生物反应调节剂可以是选自以下的至少一种 ： 阿地白介素、 α 红细胞生成素、 非格司亭、 注射用醋酸格拉替雷、 复合干扰素 (alfacon-1interferon)、 干扰
     素 α-2a( 重组 )、 干扰素 α-2b( 重组 )、 干扰素 β-1a、 干扰素 β-1b( 重组 )、 干扰素 γ-1b、 盐酸左旋咪唑、 奥普瑞白介素和沙格司亭。( 参见例如参见例如 Nursing2001DrugHandbook 的第 964-1040 页 )。
     所述至少一种眼用抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 杆菌肽素、 氯霉素、 盐 酸环丙沙星、 红霉素、 硫酸庆大霉素、 氧氟沙星 0.3 ％、 硫酸多粘菌素 B、 磺胺醋酰钠 10 ％、 磺胺醋酰钠 15％、 磺胺醋酰钠 30％、 托普霉素和阿糖腺苷。所述至少一种眼用抗炎药物可 以是选自以下的至少一种 ： 地塞米松、 地塞米松磷酸钠、 双氯芬酸钠 0.1％、 氟米龙、 氟比洛 芬钠、 酮咯酸氨丁三醇、 乙酸泼尼松龙 ( 混悬剂 ) 和泼尼松龙磷酸钠 ( 溶液剂 )。所述至少 一种缩瞳剂可以是选自以下的至少一种 ： 氯化乙酰胆碱、 卡巴胆碱 ( 眼内 )、 卡巴胆碱 ( 局 部 )、 碘磷灵、 匹鲁卡品、 盐酸匹鲁卡品和硝酸匹鲁卡品。所述至少一种散瞳剂可以是选自 以下的至少一种 ： 硫酸阿托品、 盐酸环喷托酯、 盐酸肾上腺素、 环硼肾上腺素、 氢溴酸后马托 品、 盐酸苯福林、 氢溴酸东莨菪碱和托品酰胺。 所述至少一种眼用血管收缩剂可以是选自以 下的至少一种 ： 盐酸萘唑啉、 盐酸羟甲唑啉和盐酸四氢唑啉。 所述至少一种别类眼用药物可 以是选自以下的至少一种 ： 盐酸阿拉可乐定、 盐酸倍他洛尔、 酒石酸溴莫尼定、 盐酸卡替洛 尔、 盐酸地匹福林、 盐酸多佐胺、 二富马酸依美斯汀、 荧光素钠、 富马酸酮替芬、 拉坦前列素、 盐酸左布诺洛尔、 盐酸美替洛尔、 氯化钠 ( 高渗 ) 和马来酸噻吗洛尔。所述至少一种耳用药 物可以是选自以下的至少一种 ： 硼酸、 过氧化脲、 氯霉素和三乙醇胺多肽油酸盐 - 浓缩物。 所述至少一种鼻用药物可以是选自以下的至少一种 ： 二丙酸倍氯米松、 布地奈德、 硫酸麻黄 碱、 盐酸肾上腺素、 氟尼缩松、 丙酸氟替卡松、 盐酸萘唑啉、 盐酸羟甲唑啉、 盐酸苯福林、 盐酸 四氢唑啉、 曲安奈德和盐酸赛洛唑啉。 ( 参见， 例如 Nursing 2001Drug Handbook 第 1041-97 页 )。
     所述至少一种局部抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿昔洛韦、 两性霉素 B、 壬二酸乳膏、 杆菌肽素、 硝酸布康唑、 磷酸克林霉素、 克霉唑、 硝酸益康唑、 红霉素、 硫酸庆 大霉素、 酮康唑、 乙酸磺胺米隆、 甲硝唑 ( 局部 )、 硝酸咪康唑、 莫匹罗星、 盐酸萘替芳、 硫酸 新霉素、 呋喃西林、 制霉菌素、 银磺胺嘧啶、 盐酸特比奈芬、 特康唑、 盐酸四环素、 噻康唑和托 萘酯。所述至少一种杀疥癖剂或杀虱剂可以是选自以下的至少一种 ： 克罗米通、 林丹、 扑灭 司林和除虫菊酯。所述至少一种局部皮质类固醇可以是选自以下的至少一种 ： 二丙酸倍他 米松、 戊酸倍他米松、 丙酸氯倍他索、 地奈德、 去羟米松、 地塞米松、 地塞米松磷酸钠、 二乙酸 二氟拉松、 醋酸氟氢松 (fluocinolone acetonide)、 氟氢松醋酸酯、 氟氢缩松、 丙酸氟替卡 松、 哈西缩松 (halcionide)、 氢化可的松、 乙酸氢化可的松、 丁酸氢化可的松、 戊酸氢化可的 松、 糠酸莫米松和曲安奈德。( 参见例如 Nursing 2001DrugHandbook 的第 1098-1136 页 )。
     所述至少一种维生素或矿物质可以是选自以下的至少一种 ： 维生素 A、 维生素 B 复合物、 氰钴胺、 叶酸、 羟钴胺、 亚叶酸钙、 烟酸、 烟酰胺、 盐酸吡多辛、 核黄素、 盐酸硫胺素、 维生素 C、 维生素 D、 胆骨化醇 (cholecalciferol)、 麦角骨化醇 (ergocalciferol)、 维生素 D 类似物、 度骨化醇、 帕立骨化醇、 维生素 E、 维生素 K 类似物、 植物甲萘醌、 氟化钠、 氟化钠 ( 局部 )、 痕量元素、 铬、 铜、 碘、 锰、 硒和锌。所述至少一种热质可以是选自以下的至少一种 ： 氨基酸输液剂 ( 晶体 )、 氨基酸葡萄糖溶液输液剂、 含电解质氨基酸输液剂、 含电解质氨基 酸葡萄糖溶液输液剂、 肝衰竭用氨基酸输液剂、 高代谢应激用氨基酸输液剂、 肾衰竭用氨基 酸输液剂、 葡聚糖、 脂肪乳剂， 和中链三甘油酯。( 参见例如 Nursing2001DrugHandbook 第1137-63 页 )。
     本发明提供的组合物可以进一步包含至少一种任何合适和有效量的组合物或药 物组合物， 所述组合物或药物组合物包含下面药剂中的至少一种 ： 与需要此种调节、 治疗 或疗法的细胞、 组织、 器官、 动物或患者接触或者给予至该细胞、 组织、 器官、 动物或患者的 抗 -IL-12 抗体， TNF 拮抗剂 ( 例如但不限于 TNF 化学或蛋白质拮抗剂、 TNF 单克隆或多克 隆抗体或片段、 可溶性 TNF 受体 ( 例如 p55、 p70 或 p85) 或片段、 其融合多肽， 或者小分子 TNF 拮抗剂， 例如 TNF 结合蛋白 I 或 II(TBP-1 或 TBP-II)、 奈瑞莫单抗、 英夫利昔单抗、 依 那西普、 CDP-571、 CDP-870、 阿非莫单抗、 来那西普等 )， 抗风湿药物 ( 例如甲氨喋吟、 金诺 芬、 金硫葡糖、 硫唑嘌呤、 依那西普、 硫代苹果酸金钠、 硫酸羟氯喹、 来氟米特、 柳氮磺胺吡啶 (sulfasalzine))、 肌肉松弛剂、 麻醉药物、 非甾类抗炎药物 (NSAID)、 止痛药物、 麻醉药物、 镇静药物、 局部麻醉药物、 神经肌肉阻断剂、 抗微生物药物 ( 例如氨基糖苷、 抗真菌药物、 抗 寄生虫药物、 抗病毒药物、 碳青霉烯、 头孢菌素、 氟喹诺酮、 大环内酯、 青霉素、 磺酰胺、 四环 素、 其它抗微生物药物 )， 抗牛皮癣药、 皮质类固醇、 合成代谢类甾醇、 糖尿病相关药物、 矿 物质、 营养剂、 甲状腺剂、 维生素、 钙相关激素、 止泻药物、 镇咳药物、 止吐药物、 抗溃疡药物、 轻泻药物、 抗凝血剂、 促红细胞生成素 ( 例如重组人肾红细胞生成素 α)， 非格司亭 ( 例如 G-CSF、 Neupogen)、 沙格司亭 (GM-CSF、 白细胞素 )、 免疫疗法 (immunization)、 免疫球蛋白、 免疫抑制剂 ( 例如巴利昔单抗、 环胞菌素、 达珠单抗 )、 生长激素、 激素替代药物、 雌激素受 体调节剂、 散瞳剂、 睫状肌麻痹剂、 烷基化剂、 抗代谢药物、 有丝分裂抑制剂、 放射药物、 抗抑 郁药物、 抗狂躁药、 安定药、 抗焦虑药、 催眠药、 拟交感神经药、 刺激剂、 多奈哌齐、 他克林、 哮 喘药物、 β 激动剂、 吸入类固醇、 白三烯抑制剂、 甲基黄嘌呤、 色甘酸、 肾上腺素或类似物、 阿法链道酶 (Pulmozyme)、 细胞因子或细胞因子拮抗剂。此种细胞因子的非限制性实例包 括但不限于 IL-1 至 IL-23 的任何一个 ( 例如 IL-1、 IL-2 等 )。合适的剂量是本领域熟知 的。参见例如 Wells 等人， eds.， Pharmacotherapy Handbook， 2.sup.nd Edition， Appleton and Lange， Stamford， Conn.(2000) ； PDR Pharmacopoeia， Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000， Deluxe Edition， Tarascon Publishing， Loma Linda， Calif.(2000)， 这些文献的每 一篇通过引用完整地合并在此。
     此种抗癌或抗感染药物还可以进一步包括与至少一种本发明抗体进行缔合、 结 合、 共配制或共给予的毒素分子。该毒素可以可选起到选择性杀灭病理性细胞或组织的作 用。该病理性细胞可以是癌细胞或其它细胞。此种毒素可以是但不限于纯化或重组的毒 素或包含毒素的至少一个功能性细胞毒性结构域的毒素片段， 例如选自以下的至少一种 ： 蓖麻毒蛋白、 白喉毒素、 蛇毒毒素 (venom toxin) 或细菌毒素。术语毒素还包括由可在人 或其它哺乳动物中引起包括可导致死亡的毒素休克在内的任何病理状况的、 任何天然存在 的突变或重组细菌或病毒产生的内毒素或外毒素。此种毒素可包括但不限于产肠毒素大 肠杆菌遇热不稳定肠毒素 (LT)、 热稳定肠毒素 (ST)、 志贺氏菌属细胞毒素、 气单胞菌属肠 毒素、 中毒性休克综合征毒素 -1(TSST-1)、 葡萄球菌肠毒素 A(SEA)、 B(SEB) 或 C(SEC)、 链 球菌肠毒素等。此种细菌包括但不限于产肠毒素大肠杆菌 (ETEC) 的菌株、 肠出血性大肠 杆菌 ( 例如血清型 0157:H7 的菌株 )、 葡萄球菌属 ( 例如金黄色葡萄球菌、 产脓葡萄球菌 (Staphylococcus pyogenes))、 志贺氏菌属 ( 例如痢疾志贺氏菌 (Shigella dysenteriae)、 弗氏志贺氏菌 (Shigella flexneri)、 鲍氏志贺氏菌 (Shigella boydii) 和宋内氏志贺氏菌 (Shigella sonnei))、 沙门氏菌属 ( 例如伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi)、 猪霍 乱沙门氏菌 (Salmonella cholera-suis)、 肠炎沙门氏菌 (Salmonella enteritidis))、 梭 菌 属 ( 例 如， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)、 艰 难 梭 菌 (Clostridium dificile)、 肉 毒 梭 菌 (Clostridium botulinum))、 弯 曲 杆 菌 属 ( 例 如， 空肠弯曲杆菌 (Camphlobacter jejuni)、 胚胎弯曲杆菌 (Camphlobacter fetus))、 螺杆菌属 ( 例如， 幽门 螺杆菌 (Heliobacter pylori)、 气单胞菌属 ( 例如温和气单胞菌 (Aeromonas sobria)、 嗜 水气单胞菌 (Aeromonas hydrophild)、 豚鼠气单胞菌 (Aeromonas caviae))、 类志贺邻单胞 菌 (Pleisomonas shigelloides)、 小肠结肠炎耶尔森菌 (Yersina enterocolitica)、 弧菌 属 ( 例如， 霍乱弧菌 (Vibrios cholerae)、 副溶血性弧菌 (Vibrios parahemolyticus))、 克雷伯氏菌属 (Klebsiella species)、 绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 和链 球菌 (Streptococci)。参见例如， Stein， ed.， INTERNAL MEDICINE， 3rd ed.， pp 1-13， Little， Brown and Co.， Boston， (1990) ； Evans 等人 .， eds.， Bacterial Infections of Humans ： Epidemiology and Control， 2d.Ed.， pp 239-254， Plenum Medical Book Co.， New York(1991) ； Mandell 等人， Principles and Practice of Infectious Diseases， 3d.Ed.， Churchill Livingstone， New York(1990) ； Berkow 等人， eds.， The Merck Manual， 16th edition， Merck and Co.， Rahway， N.J.， 1992 ； Wood 等人， FEMS Microbiology Immunology， 76 ： 121-134(1991) ； Marrack 等人， Science， 248 ： 705-711(1990)， 这些参考文献的内容通 过引用完整地合并在此。
     本发明治疗组合物在某些实施方式中包含例如， 编码 MG29 多肽的核酸、 MG29 核 酸； 与编码 MG29 多肽的核酸结合的核酸 ； MG29 编码核酸 ； 基于它们的 MG29 肽类似物、 假肽 或模拟肽 ； MG29 或 MG29 蛋白质 - 蛋白质相互作用的小分子调节剂 ； 或 MG29 特异性抗体或 其生物活性衍生物或片段。如本文所述的， MG29 对正常肌肉功能发挥着重要作用。所以， 靶向这些核酸、 多肽及其类似物的表达和 / 或活性， 将为各种急性和慢性疾病以及与肌肉 功能障碍和糖尿病相关的病症提供了新的治疗方法。
     在本发明任何方面中， 本发明治疗组合物可以为任何药学可接受形式， 并可以通 过任何药学可接受途径给予， 例如， 该治疗组合物可以以口服的每日单次剂量或单位剂量 形式给予， 用于治疗肌肉障碍或病症， 例如糖尿病。 此种药学可接载体和赋形剂以及给予方 法容易被本领域技术人员容易明了， 并包括如 USP-NF 2008( 美国药典 / 国家处方集 ) 中描 述的组合物和方法， USP-NF 2008 通过引用完整地合并在此。在某些方面， 本发明提供了所 述化合物的药学可接受制剂。 这些制剂包括上述化合物的盐， 例如， 酸加成盐， 例如盐酸盐、 氢溴酸盐、 乙酸盐和苯磺酸盐。
     该活性化合物一般可以调配用于肠道外给予， 例如， 调配用于经由静脉内、 关节 内、 鞘内、 肌内、 皮下、 病灶内或甚至腹膜内途径注射。 包含癌症标记抗体、 结合物、 抑制剂或 其它药剂作为活性组分或成分的水性组合物制剂是本领域技术人员根据本公开内容可以 理解的。 典型地， 此种组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬液， 也可以制备成适合于用 来在注射之前通过添加液体配制溶液或悬液的固体形式， 也可以使该制剂乳化。
     药物组合物或制剂是指适合于向细胞或主体， 优选人给予， 例如全身给予的形式 的组合物或制剂。 “全身给予” 是指药物体内全身吸收或积累在血流中， 随后遍及全身。合 适的形式部分地取决于用途或进入途径， 例如口服、 透皮或通过注射。 此种形式不应阻止该组合物或制剂到达靶细胞 ( 即， 带负电荷聚合物期望被递送到的细胞 )。例如， 注射到血流 中的药物组合物应当是可溶的。其它因素在本领域中是已知的， 包括阻止该组合物或制剂 发挥其作用的考虑因素如毒性和形式。
     用于给予本发明治疗剂的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、 悬液和乳液。非水性 溶剂的实例是丙二醇、 聚乙二醇、 植物油如橄榄油， 和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体 包括水、 醇溶液 / 水溶液、 乳液或悬液， 包括盐水和缓冲介质。媒剂包括氯化钠溶液、 林格 氏葡萄糖、 葡萄糖和氯化钠、 乳化林格氏静脉内媒剂， 该静脉内媒剂包括流体和营养物补充 剂、 电解质补充剂等。可以添加防腐剂和其它添加剂， 例如， 抗微生物药剂、 抗氧化剂、 螯合 药剂和惰性气体等。
     本发明药物组合物可被调配成与它的期望给予途径相容。 给予途径实例包括肠道 外， 例如， 静脉内、 真皮内、 皮下、 口服 ( 例如， 吸入 )、 透皮 ( 即， 局部 )、 经粘膜、 腹膜内， 和直 肠给予。 用于肠道外、 真皮内或皮下施用的溶液或悬液可以包括下面的组分 ： 无菌稀释剂如 注射用水、 盐溶液、 不挥发油、 聚乙二醇、 甘油、 丙二醇或其它合成溶剂， 抗细菌剂如苯甲醇 或对羟基苯甲酸甲酯 (methyl paraben)， 抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠， 螯合剂如乙 二胺四乙酸 (EDTA)， 缓冲剂如醋酸盐、 柠檬酸盐或磷酸盐， 以及调节张性 (tonicity) 的药 剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节 pH， 如盐酸或氢氧化钠。该肠道外制剂可以包覆 在由玻璃或塑料制成的安瓿、 一次性注射器或多剂量小瓶中。
     导致全身吸收的给予途径包括， 但不局限于 ： 静脉内、 皮下、 腹膜内、 吸入、 口服、 肺 内和肌内。药物进入循环的速率已被证明是分子量或分子大小的函数。包含本发明化合物 的脂质体或其它药物载体的应用可以潜在地使该药物定位于例如某些组织类型， 如网状内 皮系统 (RES) 的组织中。能够促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞表面结合的脂质体制 剂也是有用的。
     药学可接受制剂是指可以使本发明核酸分子有效地分布在最适合于期望活性 的身体位置中的组合物或制剂。适合于与本发明核酸分子一起调配的药剂的非限制性 实例包括 ： PEG 结合的核酸、 磷脂结合的核酸、 含有亲脂部分的核酸、 硫代磷酸酯、 P- 糖 蛋白抑制剂 ( 如 Pluronic P85)， 其可以增强药物进入各种组织如 CNS(Jolliet-Riant and Tillement， 1999， Fundam.Clin.Pharmacol.， 13， 16-26) ； 生物可降解聚合物如在 植 入 后 缓 释 递 送 的 聚 (DL- 丙 交 酯 - 共 - 乙 交 酯 ) 微 球 (Emerich， DF 等 人， 1999， Cell Transplant， 8， 47-58， Alkermes， Inc.Cambridge， Mass.) ； 以及负载纳米颗粒， 如由聚氰基 丙烯酸丁酯制成的那些， 其可以递送药物穿过血脑屏障并可以改变神经元摄取机制 (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 23， 941-949， 1999)。 包 括 核 酸 分 子 CNS 递 送 在内的递送策略的其它非限制性实例， 包括以下文献中描述的材料 ： Boado 等人， 1998， J.Pharm.Sci.， 87， 1308-1315 ； Tyler 等人， 1999， FEBS Lett.， 421， 280-284 ； Pardridge 等 人， 1995， PNAS USA.， 92， 5592-5596 ； Boado， 1995， Adv.Drug Delivery Rev.， 15， 73-107 ； Aldrian-Herrada 等人， 1998， Nucleic Acids Res.， 26， 4910-4916 ； 和 Tyler 等人， 1999， PNAS USA.， 96， 7053-7058。所有这些文献都通过引用完整地合并在此。
     本发明的特征还在于使用这样的组合物， 其包含含有聚乙二醇脂质的表面修饰的 脂质体 (PEG- 修饰的， 或长循环脂质体或隐形脂质体 (stealth liposomes))。本发明核酸 分子也可以包含具有各种分子量的共价连接的 PEG 分子。这些制剂提供了增大药物在靶组织中的积累的方法。这类药物载体可以对抗单核吞噬细胞系统 (MPS 或 RES) 的调理和清除 作用， 从而使血液循环时间较长， 并增强组织暴露于被包封药物的能力 (Lasic 等人， Chem. Rev.1995， 95， 2601-2627 ； Ishiwata 等人， Chem.Pharm.Bull.1995， 43， 1005-1011)。长循环 脂质体基于它们避免积累在代谢侵袭性 MPS 组织如肝脏和脾中的能力， 也可以在相比阳离 子脂质体较大的程度上保护药物不受核酸酶降解。所有这些文献都通过引用合并在此。
     本发明化合物、 核酸分子、 多肽和抗体 ( 也称作 “活性化合物” )， 及其衍生物、 片 段、 类似物和同源物也可以掺入在适合于给予的药物组合物中。此种组合物典型地包含 核酸分子、 蛋白质， 或抗体和药学可接受载体。如本文使用的， “药学可接受载体” 旨在包 括与药物给予相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗真菌药剂、 等渗和吸收 延缓药剂等。合适的载体描述在本领域标准参考手册 “雷明顿药物科学” (Remington′ s Pharmaceutical Sciences) 最新版中， 其通过引用合并在此。此种载体或稀释剂的优选实 例包括， 但不局限于， 水、 盐水、 林格氏溶液、 葡萄糖溶液， 和 5％人血清白蛋白。也可以使用 脂质体和非水媒剂如不挥发油。 此种介质和媒介物在药学活性物质中的应用是本领域是熟 知的。考虑了任何常规介质或试剂在该组合物中的应用， 除了与该活性化合物不相容的那 些。补充的 (supplementary) 活性化合物也可以掺入到该组合物中。
     本发明也包括制备用于储存或给予的组合物， 其在药学可接受载体或稀释剂中 包含药物有效量的期望化合物。对于治疗使用可接受的载体或稀释剂是药学领域熟知 的， 例如描述在 “雷 明 顿 药 物 科 学” (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences)， Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985) 中， 该文献通过引用合并在此。例如， 可以提供 防腐剂、 稳定剂、 染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、 山梨酸和对羟基苯甲酸酯。另外， 可以 使用抗氧化剂和悬浮剂。
     此种化合物的毒性和治疗功效可以通过例如确定 LD50( 致使 50％群体死亡的量 ) 和 ED50( 对 50％群体治疗有效的量 ) 的细胞培养物或实验动物标准药学程序确定。 毒性和 治疗效果之间的剂量比是治疗指数 (therapeutic index)， 它可以表示成比值 LD50/ED50。 优选表现出较大治疗指数的化合物。虽然可以使用表现出有毒副作用的化合物， 但应当注 意， 要设计使此种化合物靶向受感染组织部位的递送系统以便将对未感染细胞的潜在损害 减到最小， 从而减少副作用。从细胞培养物分析和动物研究获得的数据可以用于调配人用 剂量的范围。此种化合物的剂量优选在毒性很小或无毒性的循环浓度范围内， 包括 ED50。 该剂量在这个范围内随所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。 对于本发明方法中使用 的任何化合物， 治疗有效剂初始可以由细胞培养物分析估计。可以在动物模型中调配剂量 从而获得包括 IC50( 即， 实现症状半数抑制的测试化合物浓度 ) 的循环血浆浓度范围， 如在 细胞培养物中测定的。此种信息可以用于更准确地确定对人有用的剂量。血浆中的水平可 以通过例如高效液相色谱测量。
     该制剂可以以包含常规无毒的药学可接受载体、 佐剂和媒剂的单位剂量制剂 ( 形 式 )， 通过口服、 局部、 肠道外、 吸入或喷雾或直肠给予。如本文使用的术语肠道外包括， 经 皮、 皮下、 血管内 ( 例如， 静脉内 )、 肌内， 或鞘内注射或输注技术等。另外， 提供了包含本发 明核酸分子和药学可接受载体的药物制剂。 本发明一种或多种核酸分子可以与一种或多种 无毒的药学可接受载体和 / 或稀释剂和 / 或佐剂结合， 期望时， 与其它活性成分结合。本发 明药物组合物可以为适合于口服使用的形式， 例如， 片剂、 含片 (troche)、 锭剂、 水性或油性悬液、 可分散粉末或颗粒、 乳液、 硬胶囊或软胶囊， 或糖浆或酏剂。
     口服用组合物可以根据本领域中已知用于制造药物组合物的任何方法制备， 此种 组合物可以包含一种或多种这样的增甜剂、 调味剂、 着色剂或防腐剂， 以便提供药学上精美 的可口制剂。 对于口服给予， 该药物组合物可以采用例如， 与药学可接受赋形剂一起通过常 规方式制成的片剂或胶囊形式， 该药学可接受赋形剂为， 例如， 粘合剂 ( 例如， 预糊化玉米 淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素 )， 填料 ( 例如， 乳糖、 微晶纤维素或磷酸氢钙 )， 润滑剂 ( 例如， 硬脂酸镁、 滑石粉或二氧化硅 )， 崩解剂 ( 例如， 马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉 钠 )， 或润湿剂 ( 例如， 十二烷基硫酸钠 )。该片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。 用于口服给予的液体制剂可以采用， 例如， 溶液、 糖浆或悬液形式， 或者它们可以以适合于 在使用前用水或其它适合的媒剂配制 (constitution) 的干制品形式存在。此种液体制剂 可以利用药学可接受的添加剂通过常规方式制备， 该药学可接受的添加剂为， 例如， 悬浮剂 ( 例如， 山梨醇糖浆、 纤维素衍生物或氢化食用脂肪 )， 乳化剂 ( 例如， 卵磷脂或阿拉伯胶 )， 非水性媒剂 ( 例如， 杏仁油、 油性酯、 乙醇或分馏的植物油 )， 和防腐剂 ( 例如， 对羟基苯甲酸 甲酯或丙酯或山梨酸 )。 适当时， 该制剂也可以包含缓冲盐、 调味剂、 着色剂和增甜剂。 用于 口服给予的制剂可以适当地调配成可控制释放活性化合物。对于颊部给予， 该组合物可以 采用以常规方式调配成的片剂或锭剂形式。
     赋形剂可以为， 例如， 惰性稀释剂， 例如碳酸钙、 碳酸钠、 乳糖、 磷酸钙或磷酸钠 ； 造粒剂和崩解剂， 例如， 玉米淀粉或海藻酸 ； 粘合剂， 例如淀粉、 明胶或阿拉伯胶 ； 以及润滑 剂， 例如硬脂酸镁、 硬脂酸或滑石粉。该片剂可以是不包衣的， 或可以通过已知技术进行包 衣。在一些情况下， 此种包衣可以通过已知技术制备从而延缓在胃肠道中的崩解和吸收， 从而提供较长时间的持续作用。例如， 可以采用时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂 酸甘油酯。口服用制剂也可以制备成硬明胶胶囊形式， 其中活性成分与惰性固体稀释剂例 如碳酸钙、 磷酸钙或高岭土混合， 或者制备成软明胶胶囊形式， 其中活性成分与水或油性介 质， 例如花生油、 液体石蜡或橄榄油混合。
     水性悬液包含与适合于制造水性悬液的赋形剂混合的活性材料。 此种赋形剂是悬 浮剂， 例如， 羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 海藻酸钠、 聚乙烯吡咯烷酮、 黄蓍树胶和阿拉伯树胶 ； 分散或润湿剂可以是天然存在的磷脂， 例如卵磷脂， 或者环氧烷与 脂肪酸的缩合产物， 例如硬脂酸聚氧乙烯酯， 或者环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物， 例如 十六醇聚氧乙烯十七烷醚 (heptadecaethyleneoxycetanol)， 或者环氧乙烷与衍生自脂肪 酸和己糖醇的偏酯的缩合产物， 例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯， 或者环氧乙烷与衍生自脂 肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物， 例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性悬液也可以 包含一种或多种防腐剂， 例如， 对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯， 一种或多种着色剂， 一种或多 种调味剂， 以及一种或多种增甜剂， 如蔗糖或糖精。
     油性悬液可以通过将活性成分悬浮在植物油， 例如花生油、 橄榄油、 芝麻油或椰子 油中， 或者悬浮在矿物油如液体石蜡中调配而成。 该油性悬液可以包含增稠剂， 例如， 蜂蜡、 硬石蜡或十六醇。可以添加增甜剂和调味剂从而提供可口的口服制剂。这些组合物可以通 过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存 ( 防腐 )。
     适合于添加水制备水性悬液的可分散粉末和颗粒提供了与分散或润湿剂、 悬浮剂 和一种或多种防腐剂混合的活性成分。 上面所述的那些已列举了合适的分散或润湿剂或悬浮剂实例。也可以存在另外的赋形剂， 例如增甜剂、 调味剂和着色剂。本发明药物组合物也 可以为水包油乳液形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以 是天然存在的树胶， 例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶， 天然存在的磷脂， 例如大豆、 卵磷脂， 和衍 生自脂肪酸和己糖醇， 酐的酯或偏酯， 例如， 脱水山梨醇单油酸酯， 以及所述偏酯与环氧乙 烷的缩合产物， 例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。该乳液也可以包含增甜剂和调味剂。
     糖浆和酏剂可以与增甜剂， 例如， 甘油、 丙二醇、 山梨醇、 葡萄糖或蔗糖一起调配。 此种制剂也可以包含缓和剂、 防腐剂和调味剂以及着色剂。该药物组合物可以为无菌可注 射水性或油性悬液形式。 这种悬液可以根据已知技术利用前面已提及的那些适合的分散或 润湿剂和悬浮剂调配。 该无菌可注射制剂也可以是在无毒性肠道外可接受稀释剂或溶剂中 的无菌可注射溶液或悬液， 例如 1， 3- 丁二醇中的溶液。在可接受媒剂和溶剂当中， 可以采 用水、 林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外， 无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。对于 这个目的， 可以采用任何温和的不挥发油， 包括合成的单或双甘油酯。另外， 脂肪酸如油酸 可应用于可注射制剂中。
     对于吸入给予， 根据本发明使用的化合物方便地以气溶胶喷雾形式， 由利用合适 的推进剂例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷、 二氧化碳或其它合适的气体加压 的袋子或雾化器递送。在加压气溶胶的情况下， 剂量单位可以通过提供用于递送计量的量 的阀门确定。可以将， 例如用于吸入器或吹药器 (insufflator) 中的明胶的胶囊和药筒调 配成， 包含该化合物与合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。可以将该化合物调配 用于肠道外注射给予， 例如推注或连续输注。
     也可以将该化合物调配成， 例如含有传统栓剂基质如可可油或其它甘油酯的直肠 组合物， 如栓剂或保留灌肠剂 (retention enemas)。除了前述制剂之外， 还可以将该化合 物调配成积存制剂 (depot preparation)。此种长效制剂可以通过 ( 例如皮下或肌内 ) 植 入给予或通过肌内注射给予。 因而， 例如， 可以将该化合物与合适的聚合材料或疏水材料一 起调配 ( 例如在可接受的油中调配成乳液 )， 或与离子交换树脂一起调配， 或调配成难溶性 (sparingly soluble) 衍生物， 例如难溶性盐。
     适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液 ( 对于水可溶的情况 ) 或分散液和用 于临时配制无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。注射用制剂可以单位剂量形式呈现， 例 如， 在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。 该组合物可以采用这样的形式， 如在油性或水 性媒剂中的悬液、 溶液， 或乳液， 并可以包含配制剂 (formulatory agents) 如悬浮剂、 稳定 剂， 和 / 或分散剂。替换地， 该活性成分可以是粉末形式， 在使用前用合适的媒剂如无菌的 无热源水进行配制。对于静脉给予， 合适的载体包括生理盐水、 抑菌水、 CremophorTM(BASF， Parsippany， N.J.) 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在所有情况下， 该组合物必须是无菌的， 并且 应当被液化到具有方便注射性的程度。该组合物在制造和储存条件下必须稳定， 必须能够 防止微生物如细菌和真菌的污染作用。该载体可以是溶剂或悬浮介质， 包含例如水、 乙醇、 多元醇 (polyol， 多羟基化合物 )( 例如， 甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇等 )， 及其合适的混合 物。合适的流动性， 例如， 可以通过使用包衣材料例如卵磷脂、 在悬液的情况下通过维持所 需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂维持。 通过使用各种抗细菌和抗真菌剂， 例如， 对羟基 苯甲酸酯 (parabens)、 氯丁醇、 苯酚、 抗坏血酸、 硫柳汞 (thimerosa) 等， 可以实现预防微生 物的目的。在许多情况下， 优选在组合物中包括等渗剂， 例如， 糖、 多元醇如甘露醇、 山梨糖醇、 氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的药剂， 例如单硬脂酸铝和明胶， 可以延缓可注 射组合物的吸收。
     在一个实施方式中， 该活性化合物可以与能够防止该化合物从身体内快速排出的 载体一起制备， 例如， 控制释放制剂， 包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用生物可 降解的、 生物相容的聚合物， 如乙烯醋酸乙烯酯 (ethylene vinyl acetate)、 聚酐、 聚乙醇 酸、 胶原、 聚原酸酯和聚乳酸。 对于本领域技术人员而言， 制备此种制剂的方法是明显的。 该 材料也可以从 Alza 公司和诺华医药有限公司 (Nova Pharmaceuticals， Inc.) 购得。脂质 体悬液 ( 包括靶向于带有病毒抗原单克隆抗体的感染细胞的脂质体 ) 可以用作药学可接受 载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备， 例如美国 No.4,522,811 描述的。
     为了便于给予和 ( 保障 ) 剂量一致性， 调配剂量单位形式的口服或肠道外组合物 是特别有利的。 如本文使用的剂量单位形式是指适于作为单一剂量供被治疗主体用的物理 离散单元 ( 单位， unit) ； 每个单元均包含根据产生期望治疗效果计算出的预定量的活性化 合物， 其与所需药物载体结合。本发明剂量单位形式的规格 (specification) 由该活性化 合物的独特性质、 需要达到的特定治疗效果， 和混合 (compound) 此种活性化合物用于治疗 个体的领域固有的局限性决定， 且直接取决于这些因素。
     可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括含有该抗体的固体疏水性聚合 物的半透性基质， 该基质为成形物品形式， 例如， 膜或微胶囊。缓释基质的实例包括， 聚酯、 水凝胶 ( 例如， 聚 (2- 羟乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯基醇 ))、 聚交酯 ( 美国专利 No.3,773,919)、 L- 谷氨酸与 γ- 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物、 不可降解的乙烯 - 醋酸乙烯 TM 酯、 可降解的乳酸 - 乙醇酸共聚物如 LUPRON DEPOT ( 由乳酸 - 乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林组成的可注射微球 ) 和聚 -D-(-)-3- 羟基丁酸。虽然诸如乙烯 - 醋酸乙烯酯和乳酸 - 乙 醇酸的聚合物能够在超过 100 天的时间内释放分子， 但是某些水凝胶在较短的时间内释放 蛋白质。
     对于向非人动物给予， 本发明治疗组合物也可以添加到动物饲料或饮用水中。可 以方便地调配该动物饲料和饮用水组合物， 以便动物连同其食物一起摄入治疗上适当的量 的组合物。也可以方便地使该组合物以用于添加到饲料或饮用水中的预混合料 ( 形式 ) 存 在。该组合物也可以结合其它治疗化合物给予主体从而增强总体治疗效果。用于治疗适应 症的多种化合物的使用可以增强有益效果， 同时降低副作用的存在。
     实施例 ( 参考附图 )
     Mitsugumin 29(MG29) ： 分离出与肌肉特异性突触素有关的蛋白质。 骨骼肌三联体 是由陷入细胞质中的质膜的单个凹陷部分 ( 横管或 T 管 ) 组成， 该单个凹陷部分与肌质网 (SR) 终池的两个部分并置。鉴于三联体在诱导肌肉收缩中的重要性， 通过免疫染色筛查定 位于三联体中的新蛋白质的抗体文库， 鉴定调节兴奋 - 收缩 (E-C) 偶联和骨骼肌中 Ca2+ 调 控其它方面的其它蛋白质， 不足为奇。在筛查这个文库期间鉴定的最重要的蛋白质之一是 跨膜蛋白突触素家族的新成员， mitsugumin 29(MG29)。
     MG29 几乎仅表达于小鼠和人的骨骼肌纤维上， 但在肾脏上观察到少许表达 ( 参见 图 1、 图 2 和参考文献 8)， 并包含使该蛋白质定位于三联体横 (T-) 管膜和 SR 膜中的四个跨 膜结构域。这种亚细胞分布提示 MG29 可以介导 T- 管膜和连接 SR 膜之间的通讯。MG29 蛋 白质结构与神经递质释放所必需的跨膜家族， 突触素家族成员在氨基酸序列上是同源的，并与该突触素家族成员具有共同的典型结构特征。
     突触素 ： 突触形成、 释放和生物发生。 突触素起初被鉴定为小突触囊泡中丰富的高 度免疫原性膜蛋白， 也在致密核心的嗜铬和神经分泌颗粒中发现。突触素及其同源物突触 孔蛋白 ( 或突触素 II) 和泛有小泡蛋白 (pantophysin) 与四个跨膜区具有共同的跨膜组织 机构 (transmembrane organization)， 并具有共同的胞质氨基和羧基末端。
     突触素的独特特征在于它具有低聚结构， 导致突触素可能是在神经递质释放期间 形成的融合孔成分的观念的形成。而且， 已证明与突触素 mRNA 互补的反义寡核苷酸可以降 低通过注射全脑 mRNA 诱导的爪蟾卵母细胞的 Ca2+- 依赖性谷氨酸盐分泌。显微注射到运动 神经元中的突触素抗体阻断了神经肌肉传导。 这些数据与突触素是神经递质分泌所必需的 ( 这一事实 ) 一致。然而， 鉴定突触素功能的遗传途径尚未成功， 缺少突触素的突变小鼠表 现出正常的表型。 这可以反映出突触孔蛋白或其它突触素家族成员的代偿作用。 事实上， 突 触素和突触孔蛋白二者都有缺陷的小鼠的突触可塑性 (synaptic plasticity) 存在缺陷。
     已提出突触素在囊泡形成中起结构作用。由于突触素具有强的结合胆固醇的能 力， 因而它与突触囊泡生物发生期间形成膜曲率有关。还已知突触素可以与突触囊泡膜的 其它蛋白质， 即， 小突触囊泡蛋白 (synaptobrevin) 和液泡膜 H+-ATPase 紧密相互作用。据 认为， 这些相互作用可以在 SNARE 复合物或融合孔形成的水平上调节胞吐膜融合。酵母液 泡融合的研究支持后者的观点， 该研究暗示液泡 ATPase(ATP 酶 ) 直接参与膜融合。
     骨骼肌在性质上是最具可塑性的组织之一， 正常肌肉生理需要形成和维持复合物 膜结构。 在整个发育过程中， 老化和包括疲劳在内的其它过程需要不断地改变骨骼肌系统， 因而与骨骼肌膜结构可塑性相关的基因和蛋白质的鉴定和表征， 是理解肌肉生理所必需 的。因而， 在结构上， MG29 可以视为骨骼肌生物发生中的突触素对应物。
     MG29 在肌肉疲劳中的作用的发现。 鉴于 mg29(-/-) 动物中三联体膜超微结构的破 坏程度， 非应激动物中没有可鉴定的功能表型令人惊讶。 因而我们推测， 因为生理反应在应 激条件下会发生改变， 所以我们需要探究 mg29(-/-) 动物及其肌肉在此种条件下的反应。 最初， 我们测试了整个动物对跑台训练运动诱导的应激的体内反应。 我们发现， 基因敲除动 物无法维持较长时间的体力活动， 且跑动速度显著低于野生型同窝对照。这些研究给了我 们初步的线索 ： MG29 是生理相关性分子， 对肌肉性能具有直接的作用， 特别是在体力活动 增加期间。 因为缺乏体力活动可能会导致许多慢性退行性疾病、 肌肉功能降低和肌肉萎缩， 所以我们接着探究了 MG29 在肌肉疲劳中的作用。
     肌肉疲劳在广义上定义为肌肉产生力量的能力下降， 由于反复或连续活动引起。 疲劳是所有动物都会经历的现象， 被认为是限制长期肌肉收缩从而将劳倦过度引起的损伤 减到最小的生物控制过程的一部分。肌肉疲劳的潜在细胞机制的一些当前理论包括 ： a) 2+ T- 管和 SR 的 Ca 释放之间的有效通讯遭到破坏， b) 肌细胞中钠或其它离子浓度发生变化， 导致动作电位传播失败， c) 活性氧物质 (reactive oxygen species， ROS)/ 代谢物理论认 为， 肌肉活动增加导致可以直接改变蛋白质功能的过氧化物、 过氧化氢和游离基净增多。 这 个理论有时扩展至更广泛的概念中， 它假定诸如 ROS、 无机磷酸盐、 ADP、 AMP 等代谢物的总 2+ 积累量在疲劳期间增大， 并导致 SR 中的 Ca 释放量减少， 肌球蛋白 - 肌动蛋白相互作用的 2+ 功能受到抑制。d) 疲劳刺激导致细胞内 Ca 增多， 诱导 Ca2+ 激活的蛋白酶的产生， 随后导 致必需 E-C 偶联相关蛋白被清除。虽然在工作机制上没有明确地定义， 但肌肉生理研究一致认为最佳肌肉性能在细 胞内 Ca 稳态得以维持时出现， 因为 SR 中的 Ca2+ 释放不足会导致力量输出减小。在疲劳期 间， 这种缺陷的 Ca2+ 释放过程可能是由 T- 管和 SR 膜上鱼尼丁受体 (ryanodine receptor， RyR) 之间不适当的偶联、 SR Ca2+ 含量降低， RyR 功能直接变化以及钙池调控钙离子进入 (SOCE) 受损引起的。
     我们利用离体肌肉收缩分析探究了 mg29(-/-) 小鼠骨骼肌的易疲劳性， 我们发现 它们疲劳的程度较大， 疲劳后恢复的程度较小， 即使在咖啡因的存在下产生的力量也比野 生型对照小鼠产生的少。 这些研究结果明确地揭示， mg29(-/-) 骨骼肌中的 E-C 偶联遭到破 2+ 坏。当从细胞外介质中除去 Ca 时和 / 或当在药理学上阻断细胞外 Ca2+ 进入时， mg29(-/-) 2+ 和野生型小鼠肌肉之间的疲劳特性的这种差异减小， 表明细胞外 Ca 进入是 mg29(-/-) 肌 肉抗疲劳性降低的主要因素。
     MG29 是 与 老 化 相 关 的 骨 骼 肌 Ca 稳 态 功 能 异 常 的 前 哨 (sentinel)。 老 化 对 肌肉功能的影响与肌纤维去神经、 运动单元缺失， 和运动单元重塑关联。因为在显著 的 肌 肉 萎 缩 变 得 明 显 之 前 功 能 发 生 改 变， 所 以 E-C 偶 联 机 构 (machinery) 和 细 胞 内 Ca 稳态的变化充当肌肉老化的病因因素或对肌肉老化的适应性反应。已证明， 包括 DHPR 在 内 的 数 个 三 联 体 蛋 白 的 功 能 改 变 (Delbono， O.， O ′ Rourke， K.S.&Ettinger， W.H.Excitation-calcium release uncoupling in aged single human skeletal muscle fibers.J Membr Biol148 ， 211-22(1995) ； Renganathan ， M. ， Messi ， M.L.&Delbono ， O.Dihydropyridine receptor-ryanodine receptor uncoupling in aged skeletal muscle.J Membr Biol 157， 247-53(1997))， calsequestrin(Margreth， A.， Damiani， E.&Bortoloso， E.Sarcoplasmic reticulum in aged skeletal muscle.Acta Physiol Scand 167， 331-8(1999) ； Narayanan， N.， Jones， D.L.， Xu， A.&Yu， J.C.Effects of aging on sarcoplasmic reticulum function and contraction duration in skeletal muscles of the rat.Am J Physiol 271， C1032-40(1996))， and SERCA(Chen， B.， Jones， T.E.&Bigelow， D.J.The nucleotide-binding site of the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase is conformationally altered in aged skeletal muscle.Biochemistry 38 ， 14887-96(1999) ； Schoneich ，C. ，Viner ，R.I. ，Ferrington ，D.A.&Bigelow ， D.J.Age-related chemical modification of the skeletal muscle sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase of the rat.Mech Ageing Dev 107， 221-31(1999))， 导 致 老 化的骨骼肌中 Ca 稳态遭到破坏。已提出电压诱导的钙释放 (VICR) 过程的累积解偶 联 (uncoupling) 可 能 是 肌 肉 老 化 过 程 中 的 病 因 和 / 或 适 应 性 变 化 的 一 部 分 (Payne， A.M.&Delbono， O.Neurogenesis of excitation-contraction uncoupling in aging skeletal muscle.Exerc Sport Sci Rev 32， 36-40(2004))。肌肉老化的分子标记以及它 们对老化相关性肌肉功能障碍的贡献的鉴定最近已成为 E-C 偶联研究和一般老年病医疗 研究的主要焦点。
     我们将最初的 Ca 火花发现延伸到健康年轻肌肉中， 鉴定出老化骨骼肌中的 Ca 火 花信号的表型变化 (Weisleder， N. 等人， Muscle aging is associated with compromised Ca2+spark signaling and segregated intracellular Ca2+release.J Cell Biol 174， 639-45(2006) ； Melzer， W.When sparks get old.J Cell Biol 174， 613-4(2006))。 似2+乎年轻肌肉中 Ca 火花的可塑性在老化骨骼肌中受损， 其中 Ca 火花反应的持续时间减少 并且无法通过添加几轮渗透应力来再刺激。人们可以想到， 老化肌肉中 Ca 火花信号的 受损可能与 T- 管 /SR 膜结构的变化和 / 或 SR Ca 释放机构的改变有联系， 可能是由蛋 白表达中老化相关性变化引起的。利用生物化学分析， 我们发现 MG29 的表达在老化骨 骼肌中显著降低。MG29 是维持膜结构和骨骼肌中的 Ca 信号所必需的 (Takeshima， H. 等 人， Mitsugumin29， a novel Synaptophysin family member from the triad junction in skeletal muscle.Biochem J 331(Pt 1)， 317-22(1998) ； Brandt， N.R.&Caswell， A.H.Localization of mitsugumin 29to transverse tubules in rabbit skeletal muscle.Arch Biochem Biophys 371， 348-50(1999) ； Komazaki， S.， Nishi， M.， Takeshima， H.&Nakamura， H.Abnormal formation of sarcoplasmic reticulum networks and triads during early development of skeletal muscle cells in mitsugumin29-deficient mice.Dev Growth Differ43 ， 717-23(2001) ； Komazaki ，S. ，Nishi ，M. ，Kangawa ， K.&Takeshima， H.Immunolocalization of mitsugumin29in developing skeletal muscle and effects of the protein expressed in amphibian embryonic cells.Dev Dyn 215， 87-95(1999) ； Nishi， M.et al.Abnormal features in skeletal muscle from mice lacking mitsugumin29.J Cell Biol 147， 1473-80(1999))。 在 年 轻 mg29(-/-) 和 老 化 wt 小鼠骨骼肌中都检测到三联体周围的膜超微结构异常 ： T 管肿胀， 有时从 A-I 接合处消 失， 并且由有液泡且片段化的结构形成 SR 网络不佳， 导致三联体不重合 (misalignment， 未对准 )(Nishi， M. 等人， Abnormal features in skeletal muscle from mice lacking mitsugumin29.J Cell Biol 147， 1473-80(1999))。
     除了年轻 mg29(-/-) 和老化 wt 肌肉中膜结构的变化类似之外， 数个另外的研 究也提出 MG29 可以用作肌肉老化的分子标记。首先， mg29(-/-) 小鼠在 6 个月或更年 轻时表现出肌无力， 这类似于老化 wt 小鼠的萎缩表型 (Nagaraj， R.Y. 等人， Increased susceptibility to fatigue of slow-and fast-twitch muscles from mice lacking the MG29gene.Physiol Genomics 4， 43-9(2000))。其次， 老化肌肉中的钙池调控钙离子 进入 (SOCE) 显著下调 (Brotto， M.， Weisleder， N.&Ma， J.J.Store-Operated Ca2+Entry in Muscle Physiology.Curr Chem Biol 1(2007))， 这类似于在 mg29(-/-) 新生儿 (Pan， Z. 等人， Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.Nat Cell Biol 4， 379-83(2002)) 和 成 年 (Brotto， M.A. 等 人， Functional but reduced store-operated Ca entry in adult mg29(-/-)skeletal muscles.Biophs J 88， 633A(2005)) 肌肉中鉴定出的 SOCE 功能失调性。第三， 在 mg29(-/-) 和老化肌肉中 似乎都出现了对 EC- 偶联表现出微分灵敏度 ( 差异灵敏度 ) 的隔离的钙释放池的常见现 象。我们的研究说明， 年轻 mg29(-/-) 和老化 wt 肌纤维中都存在生理 VICR 机制无法动员 ( 调动， mobilize) 的隔离钙池 (Weisleder， N. 等人， Muscle aging is associated with compromised Ca2+spark signaling and segregated intracellular Ca2+release.J Cell Biol 174， 639-45(2006))。第四， 我们鉴定出年轻 mg29(-/-) 肌肉中的可塑性 Ca 火花信号 缺失， 缺失方式非常类似于在老化骨骼肌中看到的。 受损的 Ca 火花信号和隔离的细胞内 Ca 释放的鉴定可以为对抗老化对肌肉功能的影响的未来治疗干预提供独特的靶。
     mg29-/- 小鼠由于肌肉葡萄糖摄取的改变而血糖水平升高。糖尿病的主要标志是受感染患者血液中葡萄糖水平升高。这个状态可能是由于胰岛素分泌减少引起的， 如I型 青少年糖尿病情况， 或者是由于身体对胰岛素的反应受损引起的， 如 II 型胰岛素抗性糖尿 病情况。 骨骼肌是胰岛素的主要靶， 因为肌肉负责身体中大部分的葡萄糖消耗， 因而可以在 胰岛素的存在下吸收大量葡萄糖。为了使此能发生， 含有葡萄糖转运体 4 型 (Glut4) 的囊 泡必须移位到质膜中。因为 MG29 对骨骼肌中的膜融合起着重要作用， 所以有可能 MG29 也 促进对胰岛素作出反应而控制质膜上 Glut4 增大的机制。
     为了测试这种假设， 我们首先检查了人糖尿病患者肌肉中的 MG29 水平是怎样变 化的。如果 MG29 是骨骼肌中 Glut4 机构的重要组分， 那么可以预测糖尿病人患者骨骼肌中 MG29 的表达和 / 或 MG29 蛋白的亚细胞定位将会改变。证明情况确实是这样的。我们发现 MG29 蛋白的表达在糖尿病患者骨骼肌活组织检查中显著增大 ( 图 3)。这可能是这些糖尿 病肌肉中的代偿反应， 试图增大葡萄糖摄取。然而， 我们在糖尿病肌肉中检查 MG29 定位的 结果揭示， 这种另外的 MG29 表达无法提高葡萄糖摄取， 因为糖尿病肌肉中的 MG29 蛋白定位 发生改变 ( 图 4)。在糖尿病肌肉中， MG29 在细胞内间隙中较为常见， 而在正常肌肉中， 大部 分 MG29 发现于肌纤维膜中。这种定位错误可能会促使糖尿病病状的进展。
     为了直接测试 MG29 在糖尿病中的作用， 我们对年轻 mg29-/- 小鼠进行了葡萄糖负 荷实验。我们发现在腹膜内 (IP) 推注葡萄糖之后， 雄性和雌性 mg29-/- 动物都无法有效 地清除它们血流中的葡萄糖 ( 图 5)。注意到， 其余的葡萄糖水平保持不变， 表明缺少 MG29 不影响肝脏在葡萄糖代谢中的作用。因为 mg29-/- 葡萄糖水平保持长时间较高， 所以似乎 mg29-/- 肌肉摄取葡萄糖的能力存在缺陷， 而不是胰岛素分泌存在缺陷。 这在对 mg29-/- 和 对照动物执行的胰岛素负荷的进一步实验中得到证实。当 IP 注射胰岛素可以诱导野生型 对照动物血糖显著降低时， 相同的胰岛素注射对 mg29-/- 小鼠血糖水平的影响小得多 ( 图 6)。这些研究结果表明， 导致 mg29-/- 小鼠血糖升高的潜在缺陷是动物清除葡萄糖 ( 的能 力 )， 而不是胰岛素生产受损， 与在 II 型糖尿病患者中观察到的情况类似。因而， 骨骼肌中 缺少 MG29 可以使动物容易患糖尿病症状。
     我 们 通 过 用 高 脂 食 物 饲 喂 mg29-/- 动 物 和 年 龄 匹 配 的 野 生 型 对 照 小 鼠， 测 试 mg29-/- 动物是否更易于罹患糖尿病。已知这种途径可以诱导小鼠患糖尿病。虽然 mg29-/- 和对照小鼠体重增加的速率相似 ( 图 7a)， 但是 mg29-/- 小鼠在比对照小鼠小得多 的年龄表现出对糖尿病负荷实验有易感性 ( 图 7b)。这是骨骼肌从血流中吸收葡萄糖从而 维持肌肉中的能量供应和降低血糖水平从而阻止糖尿病需要 MG29 的另外证明。如果缺少 MG29 可以诱导糖尿病， 那么控制 MG29 表达可以提供治疗 I 型和 II 型糖尿病的有效方法。
     在另一系列实验中， 我们直接测试了这些假设， 即， MG29 表达的丧失将会阻止肌肉 中胰岛素诱导的葡萄糖摄取， 以及另外 MG29 的表达将会增大骨骼肌摄取葡萄糖的能力。这 里我们使用 2- 脱氧葡萄糖摄取分析来测量不同小鼠肌肉在静息状态和在暴露于胰岛素的 情况下吸收葡萄糖的能力 ( 图 8)。从野生型或 MG29 基因敲除 (mg29-/-) 小鼠中切出比目 鱼肌或趾长伸肌 (EDL)， 并测试它们的葡萄糖摄取。在这个分析中， 我们看到， mg29-/- 小鼠 相比 wt 小鼠表现出显著降低的 2-DG 摄取能力， 证实了我们早期的研究结果， 即， 这些小鼠 的葡萄糖摄取受损。在另一组实验中， 我们测量了由于用仅在骨骼肌中产生增大的 MG29 表 达 ( 参见图 15) 的重组 AAV 处理而过表达 MG29 的野生型小鼠的葡萄糖摄取。当测试这些 MG29 过表达肌肉的摄取能力时， 它们表现出增大的葡萄糖摄取能力。 这些研究表明 MG29 是胰岛素刺激的葡萄糖摄取所必需的， 在肌细胞内提供另外的 MG29 可以增大葡萄糖摄取。因 而， 增大 MG29 表达是降低血糖水平来治疗糖尿病的可行途径。
     骨骼肌的 Ca 火花反应在 mg29-/- 和糖尿病肌肉中受损。我们前面的工作已经证 明， mg29-/- 骨骼肌在渗透应力 8 之后表现出受损的 Ca 火花反应。考虑到在 mg29-/- 动物 和糖尿病患者之间看到有关葡萄糖操控的相似的功能表型， 我们测试了是否也可以在 Ca 信号中看到相似的缺陷。在 13 ～ 16 周龄的对照野生型、 I 型糖尿病小鼠 (akita) 或 II 型 糖尿病小鼠 (db/db) 中执行 Ca 火花测量。记录紧接在处死小鼠之前从其尾部静脉中取出 的血液样品的非禁食血清葡萄糖水平。按照我们实验室中确定的方案， 我们测量了从趾短 屈肌 (FDB) 分离的肌纤维中的 Ca 火花。我们观察到， db/db 肌纤维中自发性静息 Ca 火花 的频率未增大 ( 数据未给出 )。 我们实验室前面的研究表明， 在年轻和健康 WT 肌肉纤维中， 通过短暂地施加低渗 Tyrode 溶液而短暂地暴露于渗透应力中可以使肌纤维膜肿胀， 用等 渗 Tyrode 立即清洗可以使膜体积恢复， 接着产生外周强有力的 Ca 火花活性。利用这种途 径， 我们发现 db/db 肌纤维与 WT 肌纤维相比表现出数目大大减少的 Ca 火花事件 ( 图 9a)。 火花频率降低的程度可能与动物的血糖水平直接关联， 其中更严重的糖尿病动物与血糖水 平较低的这些动物相比表现出更少的火花 ( 图 9b)。当基于非禁食血糖水平对 db/db 小鼠 进行分类时， 我们发现存在这样的阈值， 即， 当血糖小于 260mg/dL( 较低的血糖 ) 时， 尽管 2+ 在这些小鼠中观察到明显的肥胖， 但 Ca 火花频率没有受损 (145±22 事件 /min) 的阈值。 此外， 我们发现 I 型糖尿病的 akita 模型中 Ca 火花减少。这些结果表明， Ca 火花减少是糖 尿病肌肉的共同特征， 而且这种表型可能归因于 MG29 表达或功能的变化， 因为它们非常像 mg29-/- 骨骼肌的已知表型。
     与提高葡萄糖水平关联的处理修复糖尿病的 Ca 火花反应。糖尿病治疗的最新 发现已集中于靶向肠促胰岛素 (incretins)， 膳食摄入之后活化的胃肠激素的活性， 其为 II 型糖尿病的治疗途径。胰高血糖素原 (pro-glucagon) 起源的胰高血糖素样肽 1(GLP1) 是一类肠促胰岛素激素。GLP1 的生理功能包括刺激胰腺 β 细胞释放胰岛素， 抑制胰高 血 糖 素 活 性， 从 而 使 它 成 为 治 疗 DM 的 治 疗 靶 (Gutniak， M.， Orskov， C.， Holst， J.J.， Ahren， B.&Efendic， S.Antidiabetogenic effect of glucagon-like peptide-1(7-36) amide in normal subjects and patients with diabetes mellitus.N Engl J Med326， 1316-22(1992))。Merck 发现的 Sitagliptin(Januvia) 的目标是抑制切割 GLP1 的二肽 基肽酶 4(DPP-4)， 从而延长人体中的 GLP1 的寿命。虽然用 Januvia 治疗的患者表现出血 糖正常化， 但此时还没有完全检查 Januvia 在骨骼肌中的生理影响。有趣地， 将 GLP1 与大 鼠比目鱼肌一起温育的离体研究发现， PKB 和糖原合成酶活性增大， 表明代谢和功能得到 改善 (Acitores， A.， Gonzalez， N.， Sancho， V.， Valverde， I.&Villanueva-Penacarrillo， M.L.Cell signalling of glucagon-like peptide-1action in rat skeletal muscle.J Endocrinol 180， 389-98(2004))。
     这里我们测试了是否 GLP1 处理不仅可以降低血糖水平， 而且还可以增大在糖尿 病骨骼肌中观察到的 Ca 火花数目。我们发现持续 1 小时的 GLP1 处理 (10nM) 显著增多了 db/db 肌纤维中的 Ca2+ 火花事件， 从而将 Ca2+ 火花频率恢复到类似于未经处理的 WT 中的水 平 (Fig.10a， b)。这暗示着， GLP1 处理可以激活信号级联， 该信号级联导致 RyR 开放概率 (Po) 增大， 而不是每根纤维中的 RyR 数目增多， 因为用 GLP1 处理 WT 肌肉导致 Ca2+ 火花频率仅微量增加。如 Ca2+ 火花定位的图表所示， 在 db/db 或 WT 纤维中 GLP1 处理都没有改变 2+ 外周肌膜下 Ca 火花分布 ( 图 1oc)， 暗示虽然糖尿病纤维中的 Ca2+ 信号级联发生改变， 但 2+ 负责维持该膜附近 Ca 火花定位的因素仍然是完整的。
     给予 GLP1 可以改善糖尿病小鼠骨骼肌的收缩性。我们的关于糖尿病骨骼肌 Ca 调控特性的数据揭示， 糖尿病动物中 Ca 火花反应受损可以通过施用 GLP1 逆转。这激起 我们测试增大的 Ca 火花活性是否可以转化为 (translated as) 增大的肌肉力量， 如通过 离体收缩性分析所测量的。将非禁食 db/db 小鼠的趾长伸肌 (EDL) 安装在测力器 (force transducer) 上， 并按照图 11 所示的方案进行电刺激。 在收缩性研究中给予 10 倍于 Ca2+ 火 花实验所用剂量的 GLP1(100nM) 从而将解剖肌肉相比分离的肌纤维增大的质量考虑进去。 测试了该肌肉在各种频率下产生的最大力量 (Tmax)， 然后利用电场的快速脉冲使该肌肉疲 劳， 然后再测量 Tmax。GLP1 施用 1 小时后， 对该肌肉重复执行这种刺激方案 ( 图 11a)。计 算在 GLP1 施用前后 Tmax 的比率， 将可以说明施用 GLP1 可以如何影响疲劳后肌肉功能的恢 复。
     在利用 db/db 肌肉进行的系列收缩性实验中， 我们发现 GLP1 处理可以增大 db/db 小鼠的 Tmax 恢复率。未经处理的 db/db 肌肉的恢复率 (0.6) 相比未经处理的 WT(1.1) 降 低。GLP1 暴露可以使 db/db 肌肉的恢复率重回到在 WT 肌肉中看到的水平 ( 图 11b， c)。这 个数据表明， GLP1 处理可以使肌肉从剧烈刺激引起的疲劳中更好地恢复。
     肌肉收缩方面的进一步检查表明， GLP1 处理没有显著改变 db/db 肌纤维的力量频 率关系 ( 图 11d)。另外， GLP1 处理后颤搐率没有显著变化。这揭示， GLP1 处理没有改变肌 肉收缩仪器对 Ca 的灵敏度。因而， 该肌肉制品是通过上游信号通路的作用而不是收缩蛋白 的变化的作用而对 GLP1 暴露作出反应的。
     糖尿病肌肉中 MG29 表达的变化和自噬标记。组织对疾病的病理生理学反应经常 包括特定基因的表达变化。因为我们已将 MG29 的缺乏与糖尿病表型如高血糖水平和 Ca 调 控缺陷的形成联系在一起， 所以我们测试了糖尿病肌肉中 MG29 表达将如何变化。在图 12 中， 我们发现糖尿病肌肉中 MG29 蛋白水平的增大与血液中葡萄糖的浓度直接关联。这可以 构成由对糖尿病小鼠血糖水平增大的反应而产生的糖尿病肌肉代偿反应， 试图增大骨骼肌 摄取葡萄糖的能力。
     有趣地， 我们也观察到糖尿病动物的自噬作用增强， 它也依赖于血液中的葡萄糖 浓度。自噬是在细胞的营养物除去后被诱导的细胞状态。在这些状态下， 细胞将消耗多种 细胞器， 试图产生另外的能量以便让细胞存活。这个过程对于细胞重塑以及在产生新细胞 时某些细胞器的再循环也很重要。 自噬已与包括肿瘤形成和糖尿病在内的数种致病状态有 关。如从图 12 中可以看出， 在糖尿病小鼠骨骼肌中微管相关蛋白轻链 3(LC3) 转换率增大， 这是自噬作用增强的标志。Akita 和 db/db 小鼠都表现出增大的 LC3 转换率， 该转换率与 血糖水平的升高直接关联。这些研究结果类似于在各种糖尿病模型中的胰腺 β 细胞中看 到的那些， 其中增强的自噬作用被认为可以促使糖尿病病状的进展。 因而， 这些研究结果表 明， 增强的自噬作用可能通过也影响骨骼肌功能而促使糖尿病的进展。如果骨骼肌中的自 噬反应可以通过操控 MG29 通路或通过其它方式调节， 那么这可以为糖尿病提供治疗途径。
     MG29 可以促进肌细胞中的 Glut4 活性。 考虑到在 mg29-/- 小鼠中观察到的糖尿病 易感性表型， 有必要确定是否 MG29 可以对与血液葡萄糖摄取有关的骨骼肌机构有直接影响。我们第一系列实验确定了， MG29 和 Glut4 可以在细胞中形成物理相互作用复合物。我 们发现， MG29 的荧光融合蛋白和同一细胞中表达的 Glut4 将共同定位于囊泡样结构中 ( 图 13a)。这为两种蛋白质之间存在物理相互作用提供了证据。
     我们继续研究从而确定在肌细胞中这种物理相互作用是否具有功能影响。C2C12 肌源性细胞系没有表达 MG29， 并在先前已被证明对胰岛素刺激不敏感。当荧光标记的 Glut4 表达在 C2C12 细胞中时， 我们发现改变的 Glut4 定位可以促进 C2C12 细胞对胰岛素 的不敏感性。Glut4 主要远离质膜定位， 在此处它将不能摄取葡萄糖 ( 图 14a)。为了确定 MG29 表达的缺少是否会促使 C2C12 细胞中的 Glut4 定位异常， 我们制取可以在肌细胞中特 异性表达 MG29 的腺相关病毒 (AAV)(AAV-fgMG29)( 图 15a)。当 C2C12 细胞受到这种病毒 感染时， 它们可以表达丰富的 MG29( 图 15b)， 而非肌肉 HEK293 细胞在受感染时不能表达 MG29， 证实病毒诱导的表达具有肌肉特异性。我们发现， 我们也可以利用这种病毒， 通过将 其注射到活小鼠肌肉中来增大天然骨骼肌中的基因表达 ( 图 15c)， 这可以被证明为增大肌 肉中 MG29 表达量的有效治疗途径。在 C2C12 细胞中， MG29 表达使得 Glut4 出现在质膜上的 频率似乎大得多 ( 图 14b)。我们发现， 这是剂量依赖性反应， 其中 MG29 水平的增大将直接 导致出现在质膜上的 Glut4 增多 ( 图 14c)。这些研究结果表明， MG29 表达是适当的 Glut4 功能所必需的， MG29 表达的增大可以增多定位于质膜上的 Glut4。如果 MG29 表达水平可以 增大， 可能通过施用 AAV-fgMG29 或其它药物或分子方式增大， 那么增强 Glut4 运输到质膜 ( 的能力 ) 可以增强肌细胞摄取葡萄糖 ( 的能力 )。
     MG29 表达随着运动增大。运动可以诱导肌肉摄取葡萄糖， 经常用作改变生活方式 辅助治疗 II 型糖尿病患者的方式。先前也已证明长期运动训练可以调节骨骼肌中许多基 因的表达， 特别是与生理性肥大期间收缩仪器的装配相关的那些。 然而， 在运动之后蛋白质 表达水平就立即显著增大的基因实例很少， 已知这种情况发生在 Glut4 移位到质膜上时。 在我们检查 MG29 在肌肉疲劳和肌肉减少症中的作用时， 我们对运动后小鼠骨骼肌中 MG29 表达是否改变进行测试。我们发现在一轮跑台运动之后 MG29 表达水平立即增大 ( 图 16)。 在跑台运动 24 小时后， 这种表达的增大达到峰值。 考虑 mg29-/- 小鼠或老化骨骼肌中 MG29 水平的降低与肌肉性能衰减和疲劳感增大相关， 这种 MG29 表达的短暂增大可能是骨骼肌 对急性运动的适应性反应。增大的 MG29 可以增强肌肉性能并将这些状况下的疲劳减到最 低。如果 MG29 上调是此种反应的一部分， 那么诱导 MG29 表达的进一步增大可能足以另外 地改进骨骼肌性能和增大肌肉摄取葡萄糖摄取。
     MG29 表达经受转录后调节。考虑到在短暂的一轮跑台运动之后 MG29 表达显著上 调， 我们试图更好地理解控制 MG29 表达的细胞机制。 在这个过程中， 我们观察到 C2C12 肌源 性细胞在成肌细胞阶段或分化的肌管阶段都不能不表达 MG29 蛋白 ( 图 17a)。当 C2C12 成 肌细胞分化成肌管并在不同时间点进行收获时， 通过 Western 印迹没有检测到蛋白表达， 然而通过实时 PCR 可以检测到丰富的 MG29mRNA 表达。这些研究结果高度揭示， 在 mRNA 水 平上发生了一定水平的 MG29 翻译控制。如果可以解析这种调节的分子机制， 那么可以提供 操控 MG29 表达的方法， 作为对抗糖尿病的治疗途径。
     为了理解控制 MG29 转录后调节的分子机制， 我们检查了 MG29mRNA 的结构。我们 发现小鼠和人 mg29mRNA 中的 3’ UTR 大大长于这些物种中的 mRNA 的平均 3’ UTR， 并且生物 信息学建模发现主要二级结构存在于 MG29 的 3’ UTR 区 ( 数据未给出 )。3’ UTR 的缺失分析确定了负责转录后调节的特异性区域 ( 图 17b)。这个区域含有增强或阻遏 mRNA 翻译的 补助因素 ( 辅助因子， accessory factors) 的数个结合位点。发现的三类特别有趣的序列 是 HuR、 ARE 和 15-LOX-DICE 位点。HuR 位点反应于应激如氧化应激而调节 mRNA 的稳定性 和翻译。ARE(AU 富含元件 ) 与 mRNA 失稳有关。15-LOX-DICE(15- 脂氧化酶分化控制元件 ) 与 hnRNP E1 和 K 结合从而抑制翻译开始。ARE(AU 富含元件 ) 与 mRNA 失稳有关。
     明显地， MG29 表达的转录后水平以依赖于天然 MG29mRNA 的 UTR 的存在的方式被 调节。调制这种调节通路可以增大骨骼肌中 MG29 的表达。这增大了 MG29 蛋白的表达， 因 而具有作为糖尿病治疗途径的潜在性。另一种潜在途径可以是增大细胞中 MG29 的功能， 而 不需增大 MG29 的表达。
     实验材料和方法
     细胞转染。C2C12 鼠类成肌细胞系购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)( 马纳萨斯 (Manassas)， VA)。使细胞在补充有 10％胎牛血清、 100 单 位 /ml 青霉素和 100ug/ml 链霉素的 C2C12 或 HEK293 细胞 DMEM 培养基中在 37℃和 5％ CO2 下的加湿环境中生长。为了诱导肌管分化， 使 C2C12 成肌细胞生长至汇合， 并将培养基更换 成含有 2％马血清、 青霉素 (100U/ml)、 链霉素 (100μg/ml) 的 DMEM。 对于短暂转染， 将 70％ 汇合的 C2C12 成肌细胞或 HEK293 细胞接种在玻璃底器皿中或塑料多孔组织培养皿中。24 小时之后， 按照制造商的指导， 使用 GeneJammer 试剂 (Stratagene) 用质粒转染细胞。在转 染后的 24 ～ 48 小时或独立实验指示的时间， 通过活细胞共焦成像使细胞可视化。其它细 胞用于分离 mRNA 或蛋白质从而执行 Western 印迹和其它生物化学实验。在一些实验中， 在 观察前使 C2C12 成肌细胞分化成肌管， 持续指示的时间。
     FDB 骨骼肌纤维分离。通过颈脱位法处死小鼠， 并手术除去后肢， 放入测得渗透 压为 290mOsm 的等渗 Tyrode 中。切出趾短屈肌 (FDB)， 并转移到补充有 0.2％ I 型胶原酶 (Sigma C-0310) 的 Tyrode 中， 在 37℃下放置 90 分钟。通过小直径移液器轻轻地将肌纤维 分成数代。将分离的 FDB 肌纤维涂布 ( 接种， plate) 在 ΔTC 玻璃底器皿 (Bioptech 有限 公司 ) 中的 1ml Tyrode 缓冲液中。
     共焦 Ca2+ 成像和火花分析。在单独的肌纤维分离后， 将该纤维涂布在含有等渗 tyrode 溶液 (290mOsm) 的器皿中。将 10μM Fluo4-AM， 膜渗透性细胞溶质 Ca2+ 指示剂染料 装到该器皿中， 放置在室温下温育 60 分钟， 同时进行不同的药物处理。用等渗 tyrode 替换 该器皿容积的 50％三次， 洗涤该器皿中多余的染料。 使用亮视野共焦显微术， 通过光学显微 术筛查完整肌纤维膜和规则条纹式的纤维。将符合这些标准的肌纤维浸浴在等渗溶液， 生 理静息条件下。在装配有氩激光器 (479nm)、 氦 - 氖激光器 (632nm) 和 40X， 1.3NA 油浸物镜 2+ 的 BioRad Radiance-2100 共焦显微镜上测量 SR Ca 的释放。以 2ms/ 线的采集速度进行 线扫描成像， 以 3.08s/ 帧 (512x512 像素 ) 采集系列 x-y 图像。 施加渗透性冲击来扰乱膜偶 联的并置 (juxtaposition)， 从而分析 Bin1 的敲低是否会改变 Ca2+ 火花活性。 首先， 用等渗 溶液灌注纤维 30 秒， 然后施加诱导膜肿胀 ( 膨胀， swell) 的低渗 Tyrode 溶液 (170mOsm)1 分钟。然后迅速地将溶液切换回等渗溶液 (290mOsm) 从而观察膜变形后的 Ca2+ 火花活性。 在这个记录过程中， 观察到 Ca2+ 火花的可逆性 / 可塑性， 不论它们的活性是否是短暂的以及 是否回到基线。对于每个动物， 通过渗透性冲击处理 3 ～ 4 根纤维， 并为每根纤维记录 2 个 图像 ( 由每 2ms 扫描 30000 线的 512 像素 (300002ms linescans of512pixels) 组成 )。使用为 IDL 软件定制的程序执行图像分析， 线性扫描强度针对所计算的静息荧光 (F0) 的标准 化， 和确定单个事件的幅度和持续时间。使用 OriginPro 6.0 软件进行统计学数据分析， 并 使用 ANOVA 完成不同处理组之间的比较。
     完整 EDL 和比目鱼肌分离。从小鼠切出完整 EDL 和比目鱼肌， 将其保存在补充有 12mM 葡萄糖， 不断地用 100％ O2 鼓泡的等渗 Tyrode 溶液中。EDL 肌肉平均长度为 12mm， 平 均质量为 80mg， 而比目鱼肌的平均长度为 10mm， 平均质量为 10mg。将肌肉垂直地安装在玻 璃刺激仪器 (Radnoti) 上， 该玻璃刺激仪器带有铂电极， 附接在可移动等长力测力器 ( 等长 测力器， isometric force transducer) 和固定锚定器上， 可以拉伸肌肉， 直至获得给定频 率和产生 Tmax 的频率下的最大力。
     疲劳期间的力量测量。PowerLab 计算机接口程序 (ADInstruments) 用于控制电 刺激方案， 记录、 数字化和储存力量输出数据。 用在完整肌肉两侧运行的铂电极完成场刺激 ( 方波电流持续 500ms， 300mA 使用频率 )。安装后， 将 EDL 肌肉平行安装， 并调节它们的静 息长度以便产生最大等长力 (Tmax)。然后使该肌肉经受力与频率关系 (1 ～ 120Hz)， 利用 产生 50％ Tmax 的频率进行疲劳刺激。在 50％ Tmax 频率 (1min 间隔， 0.83％频宽比 ( 占空 因数， duty cycle)) 下恢复 20min 之后， 将最终浓度为 100nM 的 GLP1 加入到处理室中， 并 温育 1 小时。然后执行另一组力量与频率、 疲劳和恢复。将 GLP1 处理之后的 Tmax 和颤搐 力值除以处理前的值， 从而计算对照组和 GLP1 处理组的力量下降百分比。对力量与频率关 系进行作图。校准后将力量标准化为克， 并通过 Origin 软件 (OriginLab) 分析所有数据。 在室温 (23±2℃ ) 下进行实验， 并使用学生 t 试验完成组之间的比较。
     溶 液。 该 等 渗 平 衡 盐 溶 液 由 ( 以 mM 计 )5.5 葡 萄 糖、 140NaCl、 5KCl、 2.5CaCl2、 2MgCl2 和 10HEPES(ph7.2) 组成， 测得的渗透压为 290mOsm。在该低渗溶液中， 将 NaCl 调节 到 70mM 从而将渗透压降低到 170mOsm。将 GLP17-36 酰胺溶解在水中从而获得 10nM 的最终 浓度用于火花测量， 和 100nM 的最终浓度用于收缩性实验。将渥曼青霉素 (wortmannin) 溶 解在 0.1％ DMSO 中， 得到 1uM 的最终浓度。所有化合物都从 Sigma 获得。
     Western 印迹。利用标准程序进行免疫印迹。简言之， 收获 C2C12 或 HEK293 细胞， 并在蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (cocktail)(Sigma) 的存在下用冰冷的改良 RIPA 缓冲液 (150mM NaCl， 5mM EDTA， 1％ NP40， 20mM Tris-HCl， pH7.5) 使其裂解。在 4-12％ SDS- 聚丙烯酰胺 凝胶上对 20μg 总蛋白进行分离。
     跑台运动 (treadmill running)。将组中的 6 只小鼠放在后面配备有电网的水平 Exer-6M 啮齿动物跑台 (Columbus Instruments) 上， 连续驯化它们四天。 在第 1 天， 使它们 以 38m/min 运动 5 分钟 ； 第二天以 48m/min 运动 5 分钟 ； 第 3 天以 58m/min 运动 5 分钟 ； 第 4 天以 68m/min 运动 5 分钟。在第 5 天， 使对照和实验小鼠同时以 88m/min 运动直至力竭， 如跌倒在电网上两次所指示的， 记录力竭之前的运动时间。对三个对照和实验小鼠各在每 个实验条件下进行三次试验。
     血糖测量。将雄性和雌性小鼠禁食过夜 (16 小时 )， 称重， 按照 2g/kg 体重给 小鼠腹腔内 (IP) 推注 20 ％ D- 葡萄糖溶液。在注射前， 和注射后的各个时间点 (15、 30、 45、 90、 120 分钟 ) 采集尾部静脉血 ( 约 10μL) 用于通过商业葡萄糖监测器 (OneTouch Ultramini(LifeScan， Johnson&Johnson)) 测量葡萄糖含量。
     2- 脱氧葡萄糖摄取 (2-DG) 分析。 小心地在肌腱处切出肌肉 ( 比目鱼肌和 EDL)， 然后立即将其转移到含有缺少葡萄糖的 2.0ml Kreb’ s 溶液， 和含有 2mM 丙酮酸盐 ( 酯 ) 的小 瓶中， 在振动的水浴 ( 每分钟振荡 60 次， 29℃， 在小瓶空气相中连续通气 95％ O2/5％ CO2) 中 温育 60min。平衡 35 分钟之后， 加入放射性标记的 2-DG(1mM) 和胰岛素 (200nM)， 将其温育 另外 25 分钟， 然后将该样品冻结在液氮中。为了分析 2-DG 摄取， 将肌肉加入到含有 0.5ml 1N NaOH 的 Eppendorf 管中， 在 55℃下加热 60min。 将该管子离心， 将上清液的等分试样加入 到闪烁鸡尾酒 (scintillation cocktail) 中， 并如别处描述的 (Shashkin P 等人， (1995). 14 3 J Biol Chem 270， 25613-25618.) 对 C 和 H 进行计数。葡萄糖摄取率以 umol/25min/ml 细胞内水的方式给出。 对全部肌肉的所有实验都是以成对方式进行的， 即， 一块肌肉没有胰 岛素， 对侧肌肉有胰岛素。
     通过引用合并 ( 的文献 )
     本申请通篇引用的所有参考文献、 专利、 未决的专利申请和公开专利的内容都通 过引用明确地合并在此。
     等同形式
     本领域技术人员将会意识到， 或者仅利用常规实验就可以确定本文描述的本发明 特定实施方式的许多等同形式。此种等同形式包括在所附权利要求中。
     本申请要求提交于 2009 年 6 月 5 日， 题为 “用于治疗糖尿病的调节 MG29 的组合物 和方法 (Compositions and Methods Modulating MG29for the Treatment of Diabetes)” 的美国临时专利申请 No.61/217,926 的优先权权益， 该临时专利申请通过引用并入本文中 用于所有目的。
     关于联邦政府资助的研究的声明
     依据以下 ( 权利的 ) 授予 ： 由美国国立卫生研究院 (NIH) 授予 Jianjie Ma 博士的 RO1-AG15556， 美国政府享有本发明的某些权利。
    【技术领域】
     本发明涉及重组核酸和多肽组合物以及使用它们调节肌肉功能和治疗疾病的方 法。
     参考资料的并入
     随同本申请提交了计算机可读形式的序列表 ： 文件名称 ： MG29v2_seqlist_ST25. txt， 大小 68KB， 创建于 2010 年 6 月 3 日， 使用 PatentIn-3.5 和 Checker4.4.0 生成， 该文件 通过引用完整地合并在此。 背景技术
     骨骼肌三联体 (triad junction) 是由陷入细胞质中的质膜的单个凹陷部分 ( 横 管或 T 管 ) 组成， 该单个凹陷部分与肌质网 (SR) 终池的两个部分并置。通过免疫染色筛 查集中于三联体中的新蛋白质的抗体文库， 鉴定出参与兴奋 - 收缩 (E-C) 偶联和骨骼肌中 2+ Ca 调控其它方面的蛋白质。在筛查这个文库期间鉴定的一种蛋白质是新跨膜蛋白， 称为 mitsugumin 29(MG29)。
     MG29 几乎仅表达于骨骼肌纤维上， 在肾脏上观察到轻微的表达， 并包含使该蛋白 质集中于三联体横 (T-) 管膜和 SR 膜中的四个跨膜结构域。这种亚细胞分布提示 MG29 可 以介导 T- 管膜和连接 SR 膜之间的通讯。 MG29 蛋白质结构与神经递质释放所必需的跨膜蛋 白的突触素 (synaptophysin) 家族成员的氨基酸序列同源， 并与该突触素家族成员具有共 同的典型结构特征。
     突触素起初被鉴定为小突触囊泡中丰富的高度免疫原性膜蛋白， 也在致密核心的 嗜铬和神经分泌颗粒中发现。突触素及其同源物突触孔蛋白 ( 或突触素 II) 和泛有小泡蛋 白 (pantophysin) 与四个跨膜区具有共同的跨膜组织机构 (organization)， 并具有共同的 胞质氨基和羧基末端。
     突触素的独特特征在于它具有低聚结构， 因此有人提出突触素可能是在神经递质 释放期间形成的融合孔成分。而且 Alder 等人已证明与突触素 mRNA 互补的反义寡核苷酸 可以降低通过注射全脑 mRNA 诱导的爪蟾卵母细胞的 Ca2+- 依赖性谷氨酸盐分泌。显微注射 到运动神经元中的突触素抗体阻断了神经肌肉传导。 这些数据与突触素是神经递质分泌所必需的事实一致。 然而， 鉴定突触素功能的遗传途径尚未成功 ； 缺少突触素的突变小鼠表现 出正常的表型。这可以反映出突触孔蛋白或其它突触素家族成员的代偿作用。事实上， 突 触素和突触孔蛋白 (synaptogyrin) 都有缺陷的小鼠的突触可塑性存在缺陷。
     已提出突触素在囊泡形成中起结构作用。由于突触素具有强的结合胆固醇的能 力， 因而它与突触囊泡生物发生期间形成膜曲率有关。还已知突触素可以与突触囊泡膜 的其它蛋白质， 即， 小突触囊泡蛋白 (synaptobrevin) 和液泡膜 H+-ATPase 紧密相互作 用。据认为， 这些相互作用可以在 SNARE 复合物或融合孔形成的水平上调节胞吐膜融合 (exocytotic membrane fusion)。酵母液泡融合的研究支持后者的观点， 该研究暗示液泡 ATPase 直接参与膜融合。
     MG29 和突触素之间的相似性激起人们研究 MG29 是否对骨骼肌中膜结构的调节起 着重要作用。骨骼肌在性质上是最具可塑性的组织之一， 并且正常肌肉生理需要形成和维 持复合物膜结构。在整个发育过程中， 老化和包括疲劳在内的其它过程需要不断地改变骨 骼肌系统， 因而与骨骼肌膜结构可塑性相关的基因和蛋白质的鉴定和表征， 是理解肌肉生 理， 以及治疗和诊断与包括糖尿病在内的肌肉功能障碍相关的病状所必需的。
     骨骼肌是在躯体神经系统的控制下存在的横纹肌组织形式。它是三种主要肌肉 类型之一， 其它两种是心肌和平滑肌。对于人， 骨骼肌占据胰岛素敏感性葡萄糖代谢多达 80％， 以及占据整体葡萄糖代谢的大部分。骨骼肌的胰岛素抗性 (IR) 是代谢疾病的主要危 险因素， 并且是 2 型糖尿病、 肥胖症和高血压的特征。大量文献认同， 葡萄糖代谢的近端步 骤 (proximal steps)， 葡萄糖递送、 转运和磷酸化那些为健康中胰岛素作用的关键点以及 为骨骼肌胰岛素抗性的决定因素。
     因此， 要确定代谢性疾病如肥胖症和胰岛素抗性糖尿病中存在的缺陷性质， 就必 须理解肌肉葡萄糖利用的机制和调节过程。 葡萄糖转运， 葡萄糖利用的起始步骤， 通常被认 为是肌肉中葡萄糖利用的速率决定步骤。 评估决定葡萄糖利用的转运和磷酸化平衡的一种 途径是确定这些过程是如何在细胞水平上偶联的。
     糖尿病是代谢障碍， 其特征是由于胰脏朗格汉斯岛中生产胰岛素的 β 细胞减少 ( 其导致胰岛素缺乏 ( 即， I 型糖尿病 ))， 和 / 或由于胰岛素抗性 ( 即， II 型糖尿病或 NIDD) 而无法控制血糖水平。
     I 型糖尿病可以进一步分为免疫介导性或特发性 (idiopathic， 先天性 )。大多数 I 型糖尿病属于免疫介导性， 其中 β 细胞减少是 T 细胞介导的自身免疫攻击。目前还没有 对抗 1 型糖尿病的预防措施， 导致北美和欧洲近 10％的糖尿病病例。 疾病发作时， 大多数受 感染者在其它方面是健康的并具有健康的体重。对胰岛素的敏感性和反应通常是正常的， 尤其是在早期阶段。1 型糖尿病可以感染儿童或成人， 习惯上称为 “青少年糖尿病” ， 它表示 儿童糖尿病病例占多数。
     对于 II 型糖尿病， 据认为身体组织对胰岛素的缺陷性反应与胰岛素受体有关。但 目前还不清楚具体的缺陷。在 II 型糖尿病早期阶段， 突出的异常降低了胰岛素敏感度。在 这个阶段， 高血糖症一般可以通过提高胰岛素敏感度或降低肝脏产生的葡萄糖量的各种措 施和药物治疗逆转。 随着该疾病的进展， 胰岛素分泌开始受损， 而且有时某些患者可能需要 更换胰岛素治疗。
     如果可用的胰岛素量不足， 如果细胞对胰岛素的反应不佳 ( 胰岛素不敏感或胰岛素抵抗 )， 或者如果胰岛素本身有缺陷， 那么葡萄糖将无法发挥平常的作用， 致使葡萄糖不 能被需要它的那些机体细胞适当地吸收， 也不能适当地储存在肝脏和肌肉中。所产生的结 果就是血糖水平持续较高、 蛋白质合成不佳， 以及其它代谢扰乱如酸中毒。
     当血液中葡萄糖浓度升高到超出它的肾阈 (renal threshold)( 约 10mmol/L， 但 这个值在某些情况下可以变化， 如怀孕时 ) 时， 近端肾小管对葡萄糖的重吸收不完全， 部分 葡萄糖余留在尿 ( 糖尿 ) 中。这致使尿渗透压增高， 抑制肾脏对水的重吸收， 导致产尿量增 加 ( 尿频 )、 体液丧失量增多。 体细胞和其它身体分区中保持水将渗透性地补偿丢失的血容 量， 导致脱水和口渴增多。
     胰岛素治疗不充分可能会导致急性并发症， 包括低血糖、 糖尿病酮症酸中毒、 非酮 症性高血糖， 或非酮症高渗性昏迷。严重的长期并发症包括心血管疾病， 如心脏病发作、 中 风、 动脉疾病 ( 例如， 冠状动脉疾病 )， 神经病变， 肾衰竭， 视网膜损伤， 勃起功能障碍， 失明， 伤口愈合缓慢和截肢。
     截至 2000 年， 全世界至少 1.71 亿或 2.8 ％的人口罹患糖尿病。2 型糖尿病目前 为止是最常见的， 影响美国糖尿病人口的 90 ～ 95％ (Wild S， Roglic G， Green A， Sicree R， King H(May 2004). ″ Global prevalence of diabetes ： estimates for 2000and projections for 2030″ .Diabetes Care 27(5) ： 1047-53)。因此， 不断地需要研制用于 治疗与包括糖尿病在内的肌肉功能障碍相关的病症的肌肉功能药物调节剂。 发明内容 本发明涉及参与肌细胞葡萄糖代谢的基因、 蛋白质和过程的令人惊讶的意外发 现。特别地， 本发明提供了编码 MG29 多肽及其生物活性部分的核酸 ( 在此分别称为 “MG29 多肽” 和 “MG29 核酸” )、 与编码 MG29 多肽及其生物活性部分的核酸互补的核酸、 包含它们 的载体和 / 或宿主细胞、 MG29 多肽和融合蛋白、 对 MG29 表位具有特异性的抗体或抗原结合 结构域、 内源性 MG29 基因或外源性 MG29 转基因的表达被调节的宿主细胞和转基因生物。
     在另外的方面， 本发明提供了筛选调节 MG29 的活性、 转录和 / 或翻译 ( 即， 表达 ) 的化合物的诊断分析和方法， 以及使用其的方法。
     在进一步方面， 本发明提供了用作治疗和预防糖尿病的治疗剂的组合物。本发明 治疗组合物包含 MG29 多肽和融合蛋白、 编码 MG29 多肽的核酸， 以及与编码 MG29 的核酸互 补的核酸， 包括含核糖的核酸。本发明的这个方面也包括 MG29 突变体、 同源物、 片段、 截短 体 ( 截断体， truncations)、 假肽 ( 拟肽， pseudopeptides)、 肽类似物， 和模拟肽。
     在另一方面， 本发明提供了可调节 MG29 的活性、 转录和 / 或翻译 ( 即， 表达 ) 的 化合物。如本文所述的， MG29 是对包括葡萄糖代谢在内的正常肌肉功能至关重要的细胞结 构和生理过程的重要构成部分。因此， 靶向和调节 MG29 基因表达、 多肽合成、 活性或蛋白 质 - 蛋白质相互作用是治疗与包括例如糖尿病在内的肌肉功能障碍相关的病状的新治疗 干预。
     先前的研究结果表明， MG29 功能和 / 或基因表达异常导致肌肉功能障碍和老化。 如本文所述的， 我们已令人惊讶地意外发现， MG29 可以用作血糖调节剂， 因而它的调节对治 疗糖尿病有用。特别地， MG29 蛋白与作为该过程重要参与者的其它因素相互作用从而将葡 萄糖从血流吸收到骨骼肌中。因此， 本发明也提供了可以调节 MG29 在骨骼肌中的表达和 /
     在另外的方面， 本发明提供了筛选调节 MG29 的活性、 转录和 / 或翻译 ( 即， 表达 ) 的化合物的诊断分析和方法， 以及使用其的方法。
     在进一步方面， 本发明提供了用作治疗和预防糖尿病的治疗剂的组合物。本发明 治疗组合物包含 MG29 多肽和融合蛋白、 编码 MG29 多肽的核酸， 以及与编码 MG29 的核酸互 补的核酸， 包括含核糖的核酸。本发明的这个方面也包括 MG29 突变体、 同源物、 片段、 截短 体 ( 截断体， truncations)、 假肽 ( 拟肽， pseudopeptides)、 肽类似物， 和模拟肽。
     在另一方面， 本发明提供了可调节 MG29 的活性、 转录和 / 或翻译 ( 即， 表达 ) 的 化合物。如本文所述的， MG29 是对包括葡萄糖代谢在内的正常肌肉功能至关重要的细胞结 构和生理过程的重要构成部分。因此， 靶向和调节 MG29 基因表达、 多肽合成、 活性或蛋白 质 - 蛋白质相互作用是治疗与包括例如糖尿病在内的肌肉功能障碍相关的病状的新治疗 干预。
     先前的研究结果表明， MG29 功能和 / 或基因表达异常导致肌肉功能障碍和老化。 如本文所述的， 我们已令人惊讶地意外发现， MG29 可以用作血糖调节剂， 因而它的调节对治 疗糖尿病有用。特别地， MG29 蛋白与作为该过程重要参与者的其它因素相互作用从而将葡 萄糖从血流吸收到骨骼肌中。因此， 本发明也提供了可以调节 MG29 在骨骼肌中的表达和 /
     或活性从而辅助治疗糖尿病的组合物和方法。如本文所述的调节 MG29 基因表达控制机制 提供了治疗糖尿病和其它肌肉疾病的有效工具。
     在某些另外的方面， 本发明提供了与糖尿病诊断、 治疗或改善相关的组合物和方 法。 在某些示例性实施方式中， 本发明包括， 例如， 给予有效量的本发明治疗组合物， 用于预 防和 / 或治疗糖尿病。在某些实施方式中， 该治疗组合物包含核酸， 包括调节 MG29 活性、 转 录和 / 或翻译的抑制性核酸 ( 例如， 反义和 / 或干扰核酸 )、 重组 MG29 多肽， 和 / 或能够调 节 MG29 活性、 转录和 / 或翻译的小分子。在其它实施方式中， 本发明涉及对诊断或监测与 肌肉功能相关的疾病或病症有用的诊断组合物， 该组合物包含与 MG29 编码核酸如 MG29 基 因或 RNA 的至少一部分互补或能够与其杂交的核酸。
     本发明进一步提供了本文所述的任何发明。
     前面的一般实用领域仅用于举例， 并不限制本公开内容以及所附权利要求的范 围。本领域技术人员根据本发明权利要求、 说明书和实施例， 可以理解与本发明组合物、 方 法和工艺关联的另外的目的和优点。例如， 本发明各个方面和实施方式可以许多组合形式 利用， 本说明书明确地考虑了所有这些组合。这些另外的优点、 目的和实施方式明确地包 括在本发明范围内。本文为了阐明本发明背景， 以及在特定情况下为了提供关于实施的另 外的细节而使用的出版物和其它资料通过引用合并在此， 并出于方便而列在所附文献目录 中。 附图说明
     合并在本发明书中， 并形成本说明书的一部分， 示出本发明多个实施方式的附图， 与本说明书一起解释本发明的原理。附图仅用于说明本发明的实施方式， 而不应解读为限 制本发明。
     图 1. 人的 MG29 蛋白仅表达在骨骼肌和肾脏上皮中。使用单克隆抗 -MG29 抗体 ( 底部 ) 或对照未免疫 IgG( 顶部 ) 对石蜡包埋的多组织微阵列 (MTA) 进行染色。暗紫色信 号表示 MG29(SEQ ID NO ： 3， 4) 的表达。虽然 MG29 大量地表达于骨骼肌 (A) 上， 但它也出现 在肾脏上皮层 (epithelial lining)(B、 C) 中。在心脏 (D) 和所测试的所有其它组织 ( 包 括肺、 睾丸、 肝、 脾、 脑等 ) 中无表达。
     图 2.MG29 主要表达在骨骼肌中。使用对 MG29(SEQ ID NO ： 1) 具有特异性的探针 对各种小鼠组织进行 Northern 印迹分析 (RNA 印迹分析 )。 在肾脏中观察到极小的表达， 而 在骨骼肌中观察到丰富的表达。
     图 3. 正常个体和 2 型糖尿病患者骨骼肌中的 MG29 增大。 从正常个体 (NGT) 和 2 型 糖尿病患者采集肌肉样品。(A) 执行 Western 印迹 ( 蛋白质印迹 ) 测量 MG29 和肌动蛋白的 表达水平从而使 MG29 表达水平标准化。 (B) 使用密度测定法 ( 密度计量学， densitometry) 量化并使用 ImageJ 软件分析蛋白质表达。该条形图表明更多的 MG29 显著表达于糖尿病人 患者骨骼肌中。结果表示为平均值 ±SEM.N ＝ 6.* ： P ＜ 0.05
     图 4. 人糖尿病骨骼肌上的 MG29 定位模式发生改变。示出正常人骨骼肌 ( 顶部 ) 和 2 型糖尿病患者骨骼肌 ( 底部 ) 中内源性 MG29 的定位。用 MG29 抗体 ( 左侧 ) 对多聚 甲醛固定石蜡包埋的切片进行免疫染色， 然后通过共聚焦显微镜检查。利用亮视野显微镜 ( 右侧 ) 确立肌纤维定位并确定组织切片质量。图 5.MG29 缺失 (mg29-/-) 小鼠对葡萄糖负荷 ( 葡萄糖挑战， glucose challenge) 的反应受损。在腹膜内推注葡萄糖溶液后， 测量小鼠的空腹血糖水平。(a) 雄性 mg29-/- 小 鼠在葡萄糖负荷后表现出显著较高的血糖水平。 时间 0 等于注射时间。 (b) 雌性 mg29-/- 小 鼠在葡萄糖负荷后表现出显著较高的血糖水平。(c) 汇总来自雄雌小鼠的平均数据。通过 ANOVA 分析， 其中 * ： P ＜ 0.05 ； ** ： P ＜ 0.01 ； ***P ＜ 0.001。
     图 6.MG29 缺失 (mg29-/-) 小鼠对胰岛素负荷的反应受损。在图表中的时间 0 时 腹膜内推注胰岛素后， 测量小鼠的空腹血糖水平。 MG29(mg29-/-) 小鼠的反应达不到与野生 型 (WT) 对照的反应相同的水平。这表明， mg29-/- 小鼠中骨骼肌摄取葡萄糖的能力受损。 示出平均值 ±SEM。利用 ANOVA 分析， 其中 ** ： P ＜ 0.01 ； ***P ＜ 0.001。
     图 7. 当用高脂食物饲喂时 MG29 缺失 (mg29-/-) 小鼠罹患糖尿病的速度较快。用 高脂食物饲喂几组小鼠， 然后测量它们的体重和血糖变化。 (a) 当在图表中的 0 周开始用高 脂食物饲喂时， MG29 和野生型 (WT) 小鼠的体重以相同速率增加。(b) 当通过腹膜内推注葡 萄糖进行负荷试验时， mg29-/- 小鼠不能如 WT 小鼠那样有效地清除葡萄糖， 表明 mg29-/- 小 鼠比 WT 小鼠更快地罹患糖尿病表型。利用 ANOVA 分析， 其中 * ： P ＜ 0.05。
     图 8. 在分离的小鼠肌肉中通过改变 MG29 表达水平调节葡萄糖摄取。从野生型 (WT) 小鼠、 mg29-/-(MG92KO) 小鼠或由于用重组 AAV(WT-MG29) 处理而过表达 MG29 的 wt 小鼠中切出比目鱼肌 (SOL) 或趾长伸肌 (extensor digitorum longus， EDL)。测试这些肌 肉在暴露于胰岛素 (200nM) 之前和之后摄取放射性标记的 2- 脱氧葡萄糖 (2-DG) 的能力。 mg29-/- 小鼠表现出较 wt 小鼠显著减小的 2-DG 摄取能力， 而 MG29 过表达小鼠表现出增大 的葡萄糖摄取能力。这些研究结果表明， MG29 是胰岛素刺激的葡萄糖摄取所必需的， 而且 在肌细胞内提供另外的 MG29 可以增大葡萄糖摄取。因而， 提高 MG29 表达是降低血糖水平 治疗糖尿病的可行途径。值为 5 ～ 10 块肌肉的平均值 ±SEM。*P ＜ 0.05 ； **P ＜ 0.01。 2+
     图 9.db/db 肌肉中的 Ca 火花活性 (spark activity) 受损依赖于高血糖病症。 (a) 用载体 ( 左侧 ) 或 GLP1( 右侧 ) 处理的 db/db 肌肉 ( 顶部 ) 或野生型肌肉 ( 底部 ) 中 Ca2+ 火花的代表性线扫描图像。注意， 通过使用 GLP1 可以逆转 db/db 肌肉中 Ca2+ 火花频率 的大幅降低。(b)GLP1 对表现出高的高血糖病症的 db/db 小鼠的发挥活性最大。结果为平 均值 ±SEM。 ANOVA 分析为 统计学上显著的 (p ＜ 0.01)。 高血糖是指测得血糖＞ 330mg/dL 的动物。低血糖是指测得血糖＜ 260mg/dL 的动物。未经处理的高血糖 (HBG) 组 n ＝ 534， 经处理的高血糖 (HBG) 组 n ＝ 851， 未经处理的低血糖 (LBG) 组 n ＝ 730， 经处理的低血糖 (LBG) 组 n ＝ 555。
     图 10. 糖尿病骨骼肌中的 Ca2+ 火花信号降低。 (a) 用低渗冲击 (hypotonic shock) 2+ 处理分离的 FDB 肌纤维从而产生 Ca 火花反应。示出渗透冲击 ( 左侧 ) 后的糖尿病 FDB 肌纤维的横截面线扫描图像。用 GLP1 迅速 ( 急剧， acutely) 处理的糖尿病 (db/db) 纤维 2+ 表现出显著增强的 Ca 火花活性 ( 右侧 )。(b)WT 纤维表现出强大的 Ca2+ 火花信号。(c) 使用定制的 IDL 数据处理软件程序确立火花的定位。糖尿病骨骼肌纤维表现出降低的外 周 Ca2+ 火花频率 ( 左侧 )。GLP1 对 db/db 纤维的处理没有改变外周肌膜下 ( 肌纤维膜下， subsarcolemmal)Ca2+ 火花分布， 暗示虽然糖尿病纤维中的 Ca2+ 信号级联发生改变， 但负责 2+ 维持该膜附近 Ca 火花定位的因素仍然是完整的 ( 右侧 )。伪彩色 (pseudocolor) 代表纤 维内每个点处 Ca2+ 释放事件的平均强度。图 11.GLP1 处理提高糖尿病 EDL 疲劳后的肌力。(a) 示出对照 ( 上部 ) 和经 GLP1 处理的 EDL 的力量与频率的关系的代表性迹线 (trace)。 首先以 30s 的间隔向糖尿病肌肉施 加一系列电场刺激 (5 ～ 140Hz)， 然后以 2ms 的间隔用 20Hz 刺激诱导疲劳 5 分钟。以 1min 的间隔用 20Hz 刺激使 EDL 糖尿病肌肉恢复， 持续 30 分钟， 将 100nM GLP1 加入到浸浴溶液 ( 浴溶液， bathing solution) 中 1 小时 ( 该迹线截短部分 )。紧接着， 利用相同范围的刺 激执行另一种力量与频率。黑箭头指定 Tmax， 空心箭头指出疲劳、 恢复和截短体的 GLP1 温 育部分。(b) 计算用 GLP1 处理之前和之后的糖尿病和 (c)WT 疲劳后的 Tmax( 最大力 ) 和颤 搐力 (twitch force)( 在 1Hz 下的力 ) 与疲劳前的力的比率。空白条表示未经处理的组， 填充条表示用 GLP1 处理的组。N ＝ 5， *P ＜ 0.05。(d) 该图组总结了未经处理组 ( 左侧 ) 和经 GLP1 处理组 ( 右侧 ) 中每块 EDL 肌肉的 5 对力量与频率关系。实心正方形表示疲劳 之前的力量与频率关系， 空心的正方形表示疲劳之后的力量与频率关系。所有数据都表示 为平均值 ±S.E。
     图 12. 糖尿病肌肉中的 MG29 表达发生改变， 自噬 ( 自体吞噬， autophagy) 作用增 强。Western 印记分析表明， I 型糖尿病小鼠 (akita) 或 II 型糖尿病小鼠 (db/db) 糖尿病 肌肉中 MG29 蛋白水平增大。这种增大的发生与每只小鼠血糖中的葡萄糖浓度直接相关。 这可以构成对糖尿病小鼠血糖水平增大的反应而产生的糖尿病肌肉代偿反应， 试图提高骨 骼肌摄取葡萄糖的能力。另外， 如自噬标记物微管相关蛋白轻链 3(LC3) 转换的增大所指示 的， 这两种糖尿病模型肌肉中的自噬作用都增强。 图 13.MG29 和 Glut4 发现于同一细胞内囊泡中。用 GFP-MG29 或 RFP-Glut4 荧光 融合蛋白共转染异源性 Hela 细胞 ( 顶部 ) 或同源 C2C12 细胞 ( 底部 )。用共聚焦显微镜发 现这两种蛋白质出现在这两种细胞类型的同一细胞内囊泡中。 这揭示这两种蛋白质可以在 体内发生物理相互作用。
     图 14. 用 GLUT4-EGFP 转染 C2C12 细胞， 然后用图中指示的不同量的 AAV 病毒感染 该细胞。随机检查每个器皿中的 25 个细胞， 将具有 GLUT4-EGFP 膜分配模式的细胞记为阳 性细胞。然后， 通过使用所检查的所有器皿中的细胞裂解液 (cell lyses) 执行 western 印 迹检测 MG29 水平。收集三个独立实验的数据， 对每组的共 75 个细胞进行计算。
     图 15. 重组 AAV 可以在天然骨骼肌中产生 MG29 表达。(a) 示出构建重组 AAV 构 建体的原理图， 该构建体设计用于产生肌肉特异性 MG29 表达。(b) 用 SSV9-FLAG-MG29 感 染 C2C12 肌管细胞或非肌肉 HEK293 细胞。Western 印迹分析表明时间依赖性 MG29 表达局 限于肌细胞。(c) 向腓肠肌 (gastronemius muscles) 注射 SSV9-FLAG-MG29 或 SSV9- 空载 体 ( 对照 )， 并在 5 天后取出肌肉。Western 印迹分析表明 MG29 表达与同一动物对照肌肉 相比增大， 重组 MG29 的 FLAG 标签存在于所注射肌肉中。病毒滴度和温育时间的优化应当 可以增大肌肉中的 MG29 表达水平。
     图 16. 通过运动上调 MG29 蛋白表达。使小鼠经受一次跑台运动 (treadmill exercise)， 然后解剖小鼠， 检查运动停止后各个时间点的 MG29 表达。MG29 表达立即增大， 在运动后持续增大并在 24 小时达到峰值。随着时间的推移 MG29 水平开始回到基线。肌动 蛋白水平用作负载变化的对照。
     图 17.mg29mRNA 的 3’ UTR 中 特 定 成 分 是 转 录 后 调 节 所 必 需 的。(a) 用 pFLAG-MG29( 仅 mg29cDNA 序列 ) 或 pCDNA-MG29(cDNA+3’ UTR) 转染 C2C12 成肌细胞。全细
     胞提取物用于 MG29 和 β- 肌动蛋白 ( 左侧 )Western 印记分析。还对来自这些经转染的 C2C12 细胞的样品进行半定量 RTPCR( 右侧 )。重复孔来自不同的实验。所有细胞中都存 在丰富的 mg29mRNA， 但仅在不存在 3’ UTR( 即， pFLAG-MG29) 时才观察到蛋白质， 表明 MG29 的转录后调节受 3’ UTR 控制。(b) 组装一系列全长鼠类 mg29mRNA 的 3’ UTR 的缺失构建 体。这些表达质粒包含编码 MG29 的序列和 3’ UTR 的各种缺失。(c) 将这些缺失构建体转 染到 C2C12 成肌细胞中， 3 天后将该细胞裂解用于 Western 印迹分析。虽然编码 mg29 的序 列 (Fg-MG29) 容易表达于 C2C12 细胞中， 但 C2C12 细胞中全长 (FL)mRNA 没有产生 MG29 蛋 白。缺失构建体 F1 和 F2 没有产生 MG29 蛋白， 但 F3 和 F4 构建体可以产生丰富的蛋白。这 表明， mg29mRNA 的 UTR 的 3’ 端的特定区域是转录后调节所需要的。 具体实施方式
     下面将描述与所述的令人惊讶的出乎预料的发现 ( 即， MG29 是控制骨骼肌调节血 糖的功能的过程中的重要结构和功能成分 ) 相关的组合物和方法。
     下面是本发明的详细描述， 为了便于本领域技术人员实施本发明而提供。本领域 技术人员在不背离本发明的精神或范围的情况下可以对本文描述的实施方式作出各种修 改和变更。除非另有限定， 否则本文使用的所有科学技术术语都具有与本发明所属领域技 术人员通常理解的相同的含义。本发明说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方式， 而 不是限制本发明。本文提及的所有出版物、 专利申请、 专利、 图和其它参考文献都通过引用 完整地明确合并在此。 如果提供了值范围， 应当理解， 除非在上下文中明确说明， 否则该范围上下限之间 的每个中间值均保留到下限单位的十分位 ( 十分之一 )， 并且任何其它说明的范围或该所 说明范围中的中间值均包括在本发明中。除非明确排除了所说明范围中的界限值， 否则这 些较小范围的上下限可以独立地包含在同样涵盖在本公开范围内的这些较小范围中。 如果 所说明的范围包含上下限中的一个或两个， 排除那些所包含的上下限中的一个或两个的范 围也包含在本发明中。
     虽然本文描述了优选的方法和材料， 但也可以在本发明的实施或测试中使用与本 文所述的方法和材料类似或等价的任何方法和材料。 本文所提到的所有出版物都通过引用 合并在此从而公开和描述与所引用的出版物有关的方法和 / 或材料。
     必须注意， 如在本文和在所附权利要求中使用的， 单数形式的″一个″、 ″一种″ 和″该″包括复数对象， 除非上下文中另外明确说明。本文使用的所有科学技术术语具有 相同的含义。
     除非另有限定， 否则本文使用的所有科学技术术语的含义都与本发明所属领域技 术人员通常理解的相同。 完整公开内容通过引用合并在此的下列参考文献为技术人员提供 了本发明中使用的许多术语的一般定义 ： Singleton 等人， Dictionary of Microbiology nd and Molecular Biology(2 ed.1994) ； The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.， 1988) ； The Glossary of Genetics， 5thEd.， R.Rieger 等 人 (eds.)， Springer Verlag(1991) ； 和 Hale&Marham， the Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有说明， 否则如本文使用的下列术语可以具有赋予它们的下面含 义。但是， 应当理解， 本领域技术人员已知或理解的其它含义也是可能的， 并包括在本发明
     范围内。 本文提到的所有出版物、 专利申请和其它参考文献都通过引用完整地合并在此。 如 有冲突， 以包括定义的说明书为准。另外， 材料、 方法和实例仅为了说明， 而不是限制。
     如本文使用的与数值或范围有关的术语 “约” ， 反映了这样一个事实， 即， 存在本领 域公认和容许的由实际和 / 或理论限制引起的一定水平的变化。例如， 允许由某些设备运 行方式和 / 或所采取的测量方式的固有变化引起的较小变化。根据上面所述， 术语 “约” 通 常用于包括标准偏差或标准误差范围内的值。
     如本文使用的 “衍 生 物”是 由 天 然 化 合 物 直 接、 通 过 修 饰， 或通过部分置换 (partial substitution) 形成的组合物。如本文使用的 “类似物” 是指具有与天然化合物 相似但不相同的结构的化合物。
     术语 “MG29” 以一般含义用于此处， 分别指 MG29 多核苷酸或多肽， 并包括它们的生 物活性片段、 部分、 拼接变异体 (splice variants) 和同源物。参见 SEQ ID NOs. ： 1-8， 26 和 20-25。
     术语 “MG29 拮抗剂” 或 “MG29 的拮抗剂” 一般用于指能够直接或间接抑制 MG29 表 达、 翻译和 / 或活性的试剂。术语 “MG29 激动剂” 或 “MG29 的激动剂” 一般用于指能够直接 或间接增大 MG29 表达、 翻译和 / 或活性的试剂。
     术语 “多肽” 可以表示， 但决不局限于， 重组全长的多肽前体 (pro-polypeptide) 或成熟多肽形式以及生物活性形式， 包括源自全长多肽的片段或拼接变异体， 或重组产生 的截短体或部分。此外， 本发明多肽可以包括氨基酸模拟物， 和类似物。嵌合多肽的重组形 式可以根据本领域技术人员熟知的标准方法和方案制得， 该标准方法和方案包括， 例如， 在 原核和 / 或真核细胞中表达重组蛋白， 接着执行一个或多个分离和纯化步骤， 和 / 或使用肽 合成器 (peptide sythesizer) 化学合成细胞因子多肽或其部分。
     术语 “生物学活性的” 或 “生物活性的” 可以表示， 但决不局限于药剂如本发明提 供的多肽完成生理变化或反应的能力。该反应可以， 例如在细胞水平上， 例如作为基因表 达、 蛋白质数量、 蛋白质修饰、 蛋白质活性的变化， 或其组合检测到， 也可以在组织水平上， 在系统水平上， 或在生物体水平上检测到。用于监测这些表型变化的技术包括， 例如， 测 量： 细胞中或细胞上配体与其受体的结合、 细胞信号通路的活化、 细胞反应的刺激或活化、 细胞中生物活性分子的分泌或释放、 细胞增殖和 / 或分化， 或其组合。在一个实例中， 由本 发明提供的嵌合多肽的生物活性可以通过检测它调节本发明所述的血细胞生成 ( 造血， hematopoiesis)、 胸腺细胞生成 (thymopoiesis)， 和 / 或胸腺细胞发育的能力确定。
     术语 “片段” 可以表示， 但决不局限于至少 6 个 ( 连续 ) 核酸或至少 4 个 ( 连续 ) 氨基酸的序列， 该序列的长度在核酸情况下足以允许特异性杂交， 或在氨基酸的情况下足 以允许特异性识别表位或保留期望生物活性， 并且至多为小于全长序列的一些部分。
     术语 “有效量 / 剂量” 、 “药学有效量 / 剂量” 、 “药学有效量 / 剂量” 或 “治疗有效量 / 剂量” 可以表示， 但决不局限于足以预防、 抑制病症、 障碍或疾病状态的发生， 改善、 延缓或 治疗 ( 将症状缓和至某种程度， 优选完全缓和 ) 病症、 障碍或疾病状态的症状的活性药物成 分的量 / 剂量。该有效量取决于疾病类型、 所使用的组合物、 给予途径、 受治疗哺乳动物类 型、 考虑中的特定哺乳动物的身体特征、 并行的药物治疗， 和医学领域技术人员可以意识到 的其它因素。一般地， 根据该药剂的效价， 给予在 0.1mg/kg 和 1000mg/kg 体重 / 天之间的 量的活性成分。 此种化合物的毒性和治疗功效可以通过例如确定 LD50( 致使 50％群体死亡的剂量 ) 和 ED50( 对 50％群体治疗有效的剂量 ) 的细胞培养物或实验动物的标准药物程序 确定。 毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数， 它可以表示成 LD50/ED50。 优选表现出较 大治疗指数的化合物。 虽然可以使用表现出有毒副作用的化合物， 但应当注意， 要设计使此 种化合物靶向受感染组织部位的递送系统以便将对未感染细胞的潜在损害减到最小， 从而 降低副作用。从细胞培养物分析和动物研究获得的数据可以用于调配人用剂量的范围。此 种化合物的剂量优选在毒性很小或无毒性的循环浓度范围内， 包括 ED50。该剂量在这个范 围内随所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。对于本发明方法中使用的任何化合物， 治疗有效量初始可以由细胞培养物分析估计。可以在动物模型中调配剂量从而获得包括 IC50( 即， 对症状半数抑制所需的测试化合物浓度 ) 的循环血浆浓度范围， 如在细胞培养物 中测定的。此种信息可以用于更准确地确定对人有用的剂量。血浆中的水平可以通过例如 高效液相色谱测量。
     术语 “药物组合物” 、 “治疗组合物” 、 “治疗制剂” 或 “药学可接受制剂” 可以表示， 但决不局限于使本发明提供的药剂能够有效分布的组合物或制剂， 该组合物或制剂为适合 于给予到对其期望活性最有利的身体部位中， 例如， 适合于全身给予。
     适合于与例如本发明提供的核酸一起调配的药剂非限制性实例包括 ： PEG 结 合 (conjugated) 的 核 酸、 磷 脂 结 合 的 核 酸、 含 有 亲 脂 部 分 的 核 酸、 硫代磷酸酯 (phosphorothioate)、 P- 糖蛋白抑制剂 ( 如 Pluronic P85)， 其可以增强药物进入各种组 织 如 CNS 的 能 力 (Jolliet-Riant and Tillement， 1999， Fundam.Clin.Pharmacol.， 13， 16-26) ； 生物可降解聚合物如在植入后持续释放递送的聚 (DL- 丙交酯 - 共 - 乙交酯 ) 微 球 (Emerich， DF 等 人， 1999， Cell Transplant， 8， 47-58， Alkermes， Inc.Cambridge， Mass.) ； 以及负载纳米颗粒， 如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些， 其可以递送药物穿过血 脑屏障并可以改变神经元摄取机制 (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 23， 941-949， 1999)。包括核酸分子 CNS 递送在内的递送策略的其它非限制性实例， 包括以下文 献中描述的材料 ： Boado 等人， 1998， J.Pharm.Sci.， 87， 1308-1315 ； Tyler 等人， 1999， FEBS Lett.， 421， 280-284 ； Pardridge 等人， 1995， PNAS USA.， 92， 5592-5596 ； Boado， 1995， Adv. Drug Delivery Rev.， 15， 73-107 ； Aldrian-Herrada 等人， 1998， Nucleic Acids Res.， 26， 4910-4916 ； 和 Tyler 等人， 1999， PNAS USA.， 96， 7053-7058。 所有这些文献都通过引用完整 地合并在此。
     术语 “药学可接受的” 或 “药理学可接受的” 可以表示， 但决不局限于， 当适当地给 予于动物， 或人时不产生不利、 过敏或其它不良反应的实体 ( 物质， entities) 和组合物。
     术语 “药学可接受载体”或 “药理学可接受载体”可以表示， 但决不局限于， 与 药物给予相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗真菌药剂、 等渗和吸收延 缓药剂等。合适的载体描述在本领域标准参考手册 《雷明顿药物科学》 (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences) 最新版中， 其通过引用合并在此。此种载体或稀释剂的优选实 例包括， 但不局限于， 水、 盐水、 林格氏溶液、 葡萄糖溶液， 和 5％人血清白蛋白。也可以使用 脂质体和非水媒剂 (vehicle) 如不挥发油。此种介质和试剂在药学有效物质中的应用是本 领域熟知的。考虑了任何常规介质或试剂在该组合物中的应用， 除了与该活性化合物不相 容的那些。补充的 (supplementary) 活性化合物也可以掺入到该组合物中。
     术语 “全身给予 ( 系统给予 )” 是指给予途径， 例如肠道内或肠道外给予途径， 该给予使药剂全身分布， 导致血流中的药物全身吸收或积累， 随后遍及全身分布。 合适的形式部 分地取决于用途或进入途径， 例如口服、 透皮或通过注射。 此种形式不应阻止组合物或制剂 到达靶细胞 ( 即， 带负电荷的聚合物期望被递送到的细胞 )。例如， 注射到血流中的药物组 合物应当是可溶的。其它因素在本领域中是已知的， 包括阻止该组合物或制剂发挥其作用 的考虑因素如毒性和形式。 导致全身吸收的给予途径包括， 但不局限于 ： 静脉内、 皮下、 腹膜 内、 吸入、 口服、 肺内和肌内。已证明药物进入循环的速率是分子量或分子大小的函数。应 用包含本发明化合物的脂质体或其它药物载体可以潜在地使该药物定位于例如某些组织 类型， 如网状内皮系统 (RES) 的组织中。能够促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞表面 结合的脂质体制剂也是有用的。
     术语 “核苷酸” 可以表示， 但决不局限于含有磷酸化糖的 N- 糖苷键中的杂环含氮 碱基。本领域中公认的核苷酸包括天然碱基 ( 标准 )， 和本领域熟知的修饰碱基。此种碱 基一般位于核苷酸糖部分的 1′位置处。核苷酸一般包含碱基、 糖和磷酸基团。核苷酸中 的糖、 磷酸基团和 / 或碱基部分可以是未修饰或修饰的， ( 也可互换地称作核苷酸类似物、 修饰核苷酸、 非天然核苷酸、 非标准核苷酸及其它 ； 参见例如， Usman and McSwiggen， ( 出处 同上 ) ； Eckstein 等人， 国际专利公开 WO92/07065 ； Usman 等人， 国际专利公开 WO93/15187 ； Uhlman&Peyman， ( 出处同上 )， 它们都通过引用合并在此 )。 如 Limbach 等人， 1994， Nucleic Acids Res.22， 2183 概述的， 本领域中已知数个修饰核酸碱基实例。可导入核酸中的化 学修饰和其它天然核酸碱基的一些非限制性实例包括， 例如， 肌苷、 嘌呤、 吡啶 -4- 酮、 吡 啶 -2- 酮、 苯基、 假尿嘧啶 (pseudouracil)、 2， 4， 6- 三甲氧基苯、 3- 甲基尿嘧啶、 二氢尿苷、 萘基、 氨基苯基、 5- 烷基胞苷 ( 例如， 5- 甲基胞苷 )、 5- 烷基尿苷 ( 例如， 核糖胸苷 )、 5- 卤 尿苷 ( 例如， 5- 溴尿苷 ) 或 6- 氮杂嘧啶或 6- 烷基嘧啶 ( 例如， 6- 甲基尿苷 )、 丙炔、 Q 核苷 (quesosine)、 2- 硫代尿苷、 4- 硫代尿苷、 怀丁苷 (wybutosine)、 wybutoxosine、 4- 乙酰胞苷 (4-acetyltidine)、 5-( 羧基羟甲基 ) 尿苷、 5′ - 羧甲基氨甲基 -2- 硫代尿苷、 5- 羧甲基氨 甲基尿苷、 β-D- 半乳糖基 Q 核苷、 1- 甲基腺苷、 1- 甲基肌苷、 2， 2- 二甲基鸟苷、 3- 甲基胞 苷、 2- 甲基腺苷、 2- 甲基鸟苷、 N6- 甲基腺苷、 7- 甲基鸟苷、 5- 甲氧基氨甲基 -2- 硫代尿苷、 5- 甲基氨甲基尿苷、 5- 甲基羰基甲基尿苷、 5- 甲氧基尿苷、 5- 甲基 -2- 硫代尿苷、 2- 甲基硫 代 -N6- 异戊烯基腺苷、 β-D- 甘露糖基 Q 核苷、 尿苷 -5- 氧乙酸、 2- 硫代胞苷、 苏氨酸衍生 物及其它 (Burgin 等人， 1996， Biochemistry， 35， 14090 ； Uhlman&Peyman， ( 出处同上 ))。
     术语 “核酸” 或 “多核苷酸” 可以表示， 但决不局限于， 具有多于一个的核苷酸的分 子， 旨在包括 DNA 分子 ( 例如， cDNA 或基因组 DNA)、 RNA 分子、 DNA 或 RNA 类似物， 包括锁核 酸和肽核酸， 及其衍生物。该核酸可以是单链体、 双链体和多链体， 并可以包含修饰或未修 饰的核苷酸或非核苷酸或其各种混合物和组合物。本发明核酸可以直接加入， 或可以与阳 离子脂质复合， 封装在脂质体中， 或以其它方式递送到靶细胞或组织中。 该核酸或核酸复合 物可以在掺入或不掺入到生物聚合物中的情况下， 通过注射或输液泵在体外、 离体或体内 局部给予到相关组织中。
     多核苷酸可以是 DNA 分子、 cDNA 分子、 基因组 DNA 分子， 或 RNA 分子。多核苷酸 如 DNA 或 RNA 可以包括这样的序列， 其中 T( 胸腺嘧啶 ) 也可以是 U( 尿嘧啶 )。如果多 核苷酸某个位置处的核苷酸能够形成与反平行 DNA 或 RNA 链中相同位置处的核苷酸形成 Watson-Crick 配对， 则该多核苷酸和 DNA 或 RNA 分子在那个位置处彼此互补。该多核苷酸和 DNA 或 RNA 分子在这样的情况下彼此基本互补， 即， 每个分子中足够多数目的相应位置被 可以彼此杂交从而实施期望过程的核苷酸占据时。
     术语 “修饰碱基” 可以表示， 但决不局限于， 不同于 1’ 位置处的腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胞 嘧啶和尿嘧啶的核苷酸碱基或其等效物 ； 此种碱基可以用于在， 例如， 酶核酸分子催化核心 内和 / 或核酸分子底物结合区域中的任何位置处。本发明核酸分子可以广泛地修饰， 从而 通过用抗核酸酶基团， 例如， 2 ′ - 氨基、′ -C- 烯丙基、 2 ′ - 氟、 2 ′ -O- 甲基、 2 ′ -H 修 饰来增强稳定性 ( 综述参见 Usman and Cedergren， 1992， TIBS 17， 34 ； Usman 等人， 1994， Nucleic Acids Symp.Ser.31， 163)。
     术语 “衍生物” 可以表示， 但决不局限于， 由天然化合物直接、 通过修饰或通过部分 置换形成的化学组合物， 例如核酸、 核苷酸、 多肽或氨基酸。术语 “类似物” 可以表示， 但决 不局限于， 具有与天然化合物相似但不相同的结构的化学组合物， 例如核酸、 核苷酸、 多肽 或氨基酸。
     术语 “杂交” 可以指， 但决不局限于， 分子仅在低等、 中等或高等严格条件下与特定 核苷酸序列结合、 双联 (duplexing) 或杂交， 包括当该序列存在于复合物混合物 ( 例如， 总 细胞 )DNA 或 RNA 中时发生的结合、 双联或杂交。 术语 “保守性突变” 是指在编码序列中改变、 添加或消除单个氨基酸或少量氨基酸 的核酸置换、 缺失或添加， 其中该核酸变化导致化学上类似的氨基酸发生置换。 彼此可以保 守性置换的氨基酸包括以下 ： 碱性氨基酸 ： 精氨酸 (R)、 赖氨酸 (K)、 组氨酸 (H) ； 酸性氨基 酸： 天门冬氨酸 (D)、 谷氨酸 (E)、 天冬酰胺 (N)、 谷氨酰胺 (Q) ； 亲水性氨基酸 ： 甘氨酸 (G)、 丙氨酸 (A)、 缬氨酸 (V)、 亮氨酸 (L)、 异亮氨酸 (I) ； 疏水性氨基酸 ： 苯丙氨酸 (F)、 酪氨酸 (Y)、 色氨酸 (W) ； 含硫氨基酸 ： 蛋氨酸 (M)、 半胱氨酸 (C)。此外， 彼此之间的差异在于保守 性变化的序列一般是同源的。
     术语 “下调” 可以指， 但决不局限于， 基因的表达， 或编码一种或多种蛋白质的 RNA 或等效 RNA 的水平， 或一种或多种蛋白质如 MG29 多肽基因的活性降低到低于在不存在本发 明提供的药剂的情况下所观察到的。例如， 可以降低基因表达以便治疗、 预防、 改善或调节 高水平基因表达引起或加剧的病理学病症。
     术语 “上调” 可以指， 但决不局限于， 基因的表达， 或编码一种或多种蛋白质亚基的 RNA 或等效 RNA 的水平， 或一种或多种蛋白质亚基如 MG29 的活性高于在不存在本发明提供 的药剂的情况下所观察到的。例如， 可以增大基因表达以便治疗、 预防、 改善或调节由缺少 基因表达或低水平基因表达引起或加剧的病理学病症。
     “调节” 是指基因的表达， 或编码一种或多种蛋白质的 RNA 或等效 RNA 的水平， 或一 种或多种蛋白质的活性被上调或下调， 以便该表达、 水平或活性高于或低于在不存在本发 明提供的药剂的情况下所观察到的。
     术语 “基因” 可以表示， 但决不局限于编码 RNA 的核酸， 例如核酸序列， 包括但不局 限于编码多肽的节段。
     术语 “互 补 的”可 以 表 示， 但 决 不 局 限 于 核 酸 与 另 一 个 RNA 序 列 通 过 传 统 Watson-Crick、 Hoogsteen 碱基配对或其它非传统型碱基配对形成一个氢键 ( 或多个氢键 ) 的能力。
     术语 “结合” 可以表示， 但决不局限于两个分子 ( 例如， 化合物、 氨基酸、 核苷酸、 多
     肽或核酸 ) 之间直接或间接的物理或化学相互作用。结合包括共价相互作用、 氢键相互作 用、 离子相互作用、 非离子相互作用、 范德华相互作用、 疏水性相互作用等。
     术语 “等效的” 或 “同源的” 可以指， 但决不局限于， 分别与 MG29 基因 (SEQ ID NO ： 20-25) 或蛋白质 (SEQ ID NO ： 1-8、 26) 具有同源性 ( 部分或完全同源 ) 的核酸或蛋白质， 包 括那些天然存在的 DNA、 RNA 或氨基酸分子， 它们在包括人类、 啮齿动物、 灵长类动物、 家兔、 猪、 原生动物、 真菌、 植物和其它微生物和寄生虫在内的各种生物中的功能与 MG29 相似。该 等效 RNA 序列除了包括编码区之外， 还可以包括诸如 5′ - 非翻译区、 3′ - 非翻译区、 内含 子、 内含子 - 外显子接合处 (junction) 等区域。 “同源性” 是指两种或多种核酸分子的核苷 酸序列， 或者两种或多种核酸或氨基酸序列部分或完全相同。 在某些实施方式中， 该同源的 核酸或氨基酸序列分别与人 MG29 基因 (SEQ ID NO ： 21 或 22) 或蛋白质 (SEQ ID NO ： 3或 4) 具有 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 或 95％的序列相似性或同一性。 在某些实 施方式中， 本发明提供了与编码选自 SEQ ID NO. ： 1-8 和 26 的 MG29 多肽或其生物活性部分 的核酸具有至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 或 95％的序列相似性或同一性 的核酸。在另外实施方式中， 本发明提供了与选自 SEQ ID NO. ： 1-8 和 26 的 MG29 多肽或其 生物活性部分具有 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 或 95％的序列相似性或同一 性的多肽。
     “同源物” 可以是天然存在的， 或者通过人工合成形成的一种或多种具有相关序列 的核酸， 或通过修饰一种或多种核酸制得的相关核酸。当核酸天然或人工地源自共同祖先 序列时， 它们是同源的 ( 例如直系同源物或旁系同源物 )。 如果两种核酸之间的同源性没有 明确说明， 则可以通过两个或多个序列之间的核酸比较推测出同源性。如果该序列在一级 氨基酸序列结构水平上表现出一定程度的序列相似性， 例如， 大于约 30％的序列相似性， 则 可以推断它们具有共同的祖先。对于本发明的目的， 如果核酸序列相似到足以允许在低等 严格条件下重组和 / 或杂交的程度， 则基因是同源的。 另外， 如果多肽提供了与野生型 MG29 相当的活性， 则该多肽视为同源的。
     如本文使用的 “杂交” 可以指分子仅在低等、 中等或高等严格条件下与特定核苷酸 序列结合、 双联或杂交， 包括当该序列存在于复合物混合物 ( 例如， 总细胞 )DNA 或 RNA 中时 发生的结合、 双联或杂交。
     术语 “RNA” 可以表示， 但决不局限于， 包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。 “核 糖核苷酸” 或 “2′ -OH” 是指 D- 核 - 呋喃糖部分的 2’ 位置上具有羟基的核苷酸。
     术语 “载体” 可以表示， 但决不局限于， 用于递送期望核酸的任何核酸类技术， 例 如， 用于基因克隆、 基因扩增和 / 或基因表达的细菌质粒、 病毒核酸、 HAC、 BAC 等。
     术语 “细胞” 可以表示， 但决不局限于， 其通常的生物学意义， 并不是指整个多细胞 生物。该细胞可以是， 例如， 体内、 体外或离体的， 例如在细胞培养物中， 或存在于多细胞生 物中， 该多细胞生物包括例如， 鸟类、 植物和哺乳动物如人、 牛、 羊、 猿、 猴、 猪、 狗和猫。该细 胞可以是原核细胞 ( 例如， 细菌细胞 ) 或真核细胞 ( 例如， 哺乳动物或植物细胞 )。
     术语 “宿主细胞” 可以表示， 但决不局限于， 可用于携载异源性核酸或者表达异源 性核酸编码的肽或蛋白质的细胞。宿主细胞可以包含不能在该细胞天然 ( 非重组 ) 形式 中找到的基因、 在该细胞天然形式中找到的基因， 其中该基因被修饰并由人工手段重导入 到该细胞中， 或者该细胞的内源性核酸， 该内源性核酸已被人工修饰， 但没有从该细胞中除去。宿主细胞可以是真核或原核的。细菌培养所需的一般生长条件可以在诸如 BERGEY′ S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY， Vol.1， N.R.Krieg， ed.， Williams and Wilkins， Baltimore/London(1984) 的文献中找到。 “宿主细胞” 也可以是这样的细胞， 其中内源性基 因或启动子或者二者都已被修饰从而产生本发明复合物中的一种或多种多肽组分。
     提交于 2009 年 7 月 16 日， 题为 Compositions comprising MG29Nucleic Acids， Polypeptides， and Associated Methods of Use 的美国专利申请 No. ： 12/504,331 的主题 通过引用完整地合并在此用于所有目的。
     糖尿病的主要标志是受感染患者血液中葡萄糖水平升高。 这个状态可能是由于胰 岛素分泌减少引起的， 如 I 型青少年糖尿病情况， 或者是由于身体对胰岛素的反应受损引 起的， 如 II 型胰岛素抵抗型糖尿病情况。骨骼肌是胰岛素的主要靶， 因为肌肉负责身体中 大部分的葡萄糖消耗， 因而可以在胰岛素的存在下吸收大量葡萄糖。 为了使此能发生， 含有 葡萄糖转运体 4 型 (Glut4) 的囊泡必须转移到质膜中。如本文所述的， MG29 不仅对骨骼肌 中的膜融合起着重要作用， 而且它也促进对胰岛素作出反应而控制质膜上 Glut4 增大的机 制。
     在年轻 mg29-/- 小鼠的葡萄糖负荷实验中， 发现在腹膜内 (IP) 推注葡萄糖之后， 雄性和雌性 mg29-/- 动物都无法有效地清除它们血流中的葡萄糖 ( 图 5)。然而， 其余的葡 萄糖水平保持不变， 表明缺少 MG29 不影响肝脏在葡萄糖代谢中的作用。因为 mg29-/- 葡 萄糖水平保持长时间较高， 所以似乎 mg29-/- 肌肉摄取葡萄糖的能力存在缺陷， 而不是胰 岛素分泌存在缺陷。这在对 mg29-/- 和对照动物执行的胰岛素负荷的进一步实验中得到证 实。当 IP 注射的胰岛素可以诱导野生型对照动物血糖显著降低时， 相同的胰岛素注射对 mg29-/- 小鼠血糖水平的影响小得多 ( 图 6)。这些研究结果表明， 导致 mg29-/- 小鼠血糖 升高的潜在缺陷是动物清除葡萄糖的能力， 而不是胰岛素生产受损， 与在 II 型糖尿病患者 中观察到的情况类似。因而， 骨骼肌中缺少 MG29 可以使动物容易患糖尿病症状。
     此 外， 通 过 用 高 脂 食 物 饲 喂 mg29-/- 动 物 和 年 龄 匹 配 的 野 生 型 对 照 小 鼠， 测 试 mg29-/- 动物是否更易于罹患糖尿病。已知这种途径可以诱导小鼠患糖尿病。虽然 mg29-/- 和对照小鼠体重增加的速率相似 ( 图 7a)， 但是 mg29-/- 小鼠在比对照小鼠小得多 的年龄表现出对糖尿病负荷实验有易感性 ( 图 7b)。这是骨骼肌从血流中吸收葡萄糖从而 维持肌肉中的能量供应和降低血糖水平从而阻止糖尿病需要 MG29 的另外证明。因为缺少 MG29 可以诱导糖尿病， 所以控制 MG29 表达 ( 即， 转录和 / 或翻译 ) 可以提供治疗 I 型和 II 型糖尿病的有效方法。
     而且， 如本文所述的， 内源性 MG29mRNA 的 UTR 序列包含用于转录后调节的许多共 有部位。实验观察发现， MG29UTR 序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 21、 23 或 24) 实际上是 MG29 基 因表达的转录后调节所需要的， 揭示 UTR 是控制 MG29 表达的肌肉调节途径的靶。因此， 调 制 MG29mRNA 的转录后调节是诊断、 治疗和预防糖尿病的另一种治疗干预方式。
     下面描述了本发明提供的各个示例方面和实施方式。如下面详细描述的， 本发明 提供了组合物， 例如多肽， 编码细胞质、 细胞核、 细胞膜结合和分泌的多肽的核酸 ； 以及载 体、 抗体、 重组蛋白、 假肽、 融合蛋白、 化学化合物、 宿主细胞、 转基因动物， 以及制造和使用 它们的方法。
     核酸下面描述的各个方面和实施方式包括编码 MG29 多肽 (SEQ ID NO. ： 1-8 和 26) 和 / 或其生物活性部分和片段的核酸， 以及编码包括人 MG29 蛋白同源物、 直系同源物和旁系 同源物在内的 MG29 蛋白 ( 例如， SEQ ID NO ： 20-15) 的基因， 包括所有同种型、 拼接变异体 ( 例如， SEQ ID NO. ： 4)， 和多态性。可以使用本文描述的方法分析这些另外的基因的靶位。 因而， 可以如本文描述的对抑制作用和此种抑制对其它基因的影响进行分析。
     对实施本发明有用的， 包括诱变、 PCR 和克隆等在内的分子生物技术描述在以下 文 献 中， Berger and Kimmel， GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES， METHODS IN ENZYMOLOGY， volume 152， Academic Press， Inc.， San Diego， Calif.(Berger) ； Sambrook 等 人， MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL(2nd Ed.)， Vol.1-3， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， New York， 1989， and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， F.M.Ausubel 等 人， eds.， Current Protocols， a joint venture between Greene Publishing Associates， Inc.and John Wiley&Sons， Inc. ； Berger， Sambrook， and Ausubel， as well as Mullis 等人， U.S.Pat.No.4,683,202(1987) ； PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis 等人 eds)， Academic Press， Inc.， San Diego， Calif.(1990)(Innis) ； Arnheim&Levinson(Oct.1， 1990)C&EN36-47。 本发明提供的核酸组合物在本文可互换地总称为 “MG29 核酸” 或 “MG29 多核苷酸” 以及相应的编码的多肽称为 “MG29 多肽” 或 “MG29 蛋白” 。除非另有指明， 否则这些术语都 包括在氨基或羧基端或二者上的生物活性部分、 片段、 缺失或置换、 截短体、 基因融合， 及其 组合物。而且， 除非另有指明， 否则 “MG29” 一般用来指任何 MG29 相关的和 / 或 MG29 衍生 的生物聚合物， 如本文明确描述地、 暗示地或内在地描述的。而且， 如本文使用的， “MG29 核 酸” 或 “MG29 基因” 也可以指并包括该基因的 5’ UTR、 3’ UTR、 启动子序列、 增强子序列、 内含 子和外显子 DNA， 以及 mRNA 或 cDNA 序列。
     如上所述， 在某些方面本发明涉及核酸， 和核酸编码的本发明多肽， 其可以单独地 或与其它组分结合调节肌肉生理， 包括清除葡萄糖。
     在一方面， 本发明提供了编码 MG29 多肽的分离核酸， 该核酸与 SEQ ID NO ： 20-25 中公开的任何一种核酸具有至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 100％的同一 性。 在某些实施方式中， 本发明分离核酸分子将在严格条件下与这样的核酸序列杂交， 所述 的核酸序列与包括 MG29 核酸序列的蛋白质编码序列的核酸分子互补。本发明也包括编码 MG29 多肽， 或其片段、 同源物、 类似物、 融合蛋白、 假肽、 模拟肽或衍生物的分离核酸。例如， 该核酸可以编码与包含 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 的氨基酸序列的多肽具有至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 100％同一性的多肽。该核酸可以是， 例如， 包括 SEQ ID NO ： 20-25 中任何一个的核酸序列的基因组 DNA 片段或 cDNA 分子。
     在另一个实施方式中， 本发明包括编码如上所述或如 SEQ ID NO ： 1-8 或 26 中给 出的重组 MG29 多肽和 / 或其同源物或片段的分离或重组核酸， 其中该多肽可以调节肌肉功 能， 例如， 葡萄糖代谢。
     在另一方面， 本发明提供了如 SEQ ID NO ： 20-15 中给出的本发明 MG29 核酸， 和/或 如 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 中给出的本发明 MG29 蛋白的衍生物和 / 或类似物， 包括但不局限 于， 包含与本发明核酸或蛋白质基本同源的区域的分子， 该区域在各种实施方式中， 与相同 尺寸的核酸或氨基酸序列具有， 或者与通过本领域已知的计算机同源性程序完成比对的或
     者其编码核酸能够与编码本发明蛋白质的序列补体在严格、 中等严格或低等严格条件下杂 交的比对序列相比具有， 至少约 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％的同一性 ( 优选 80-95％的同一性 )。参见， 例如， Ausubel， 等人， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， John Wiley&Sons， New York， N.Y.， 1993。核酸衍生物和修饰包括通过基因替换、 部位特异性突变、 缺失、 插入、 重组、 修复、 改组 (shuffling)、 核酸内切酶消化、 PCR、 亚克隆， 和相关技术获得的那些。
     在另一方面， 本发明提供了编码 MG29 蛋白或其生物活性部分的分离和重组核酸， 所述的生物活性部分为， 例如仅编码突触素结构域或突触素样结构域或其部分， 和/或 marvel 结构域或 marvel 样结构域或其部分的截短部分。因此， 本发明这个方面提供的核 酸包括 MG29 缺失、 置换、 截短体、 融合蛋白等。在示例实施方式中， 提供了编码重组 MG29 多 肽的重组核酸， 所述的重组 MG29 多肽包含与人 MG29(SEQ ID NO ： 3 或 4) 突触素结构域多肽 (“突触素样结构域” ) 具有至少 30％同源性的第一区 ( 即， 部分或结构域 )， 和可选的， 与 人 MG29marvel 结构域多肽 ( 或 marvel 样结构域 ) 具有至少 30％同源性的第二区。在另外 的实施方式中， 本发明包括所得的重组 MG29 多肽。
     在另一方面， 提供了编码重组 MG29 多肽的重组核酸， 其中突触素结构域或突触素 样结构域与 marvel 结构域或 marvel 样结构域并置 (juxtaposed)。因此， 本发明包括重组 多肽， 其中突触素或突触素样结构域与 marvel 结构域或 marvel 样结构域并置。 在另外的方面， 本发明包括编码通过使基因表达形成的多肽， 或 cDNA 构建体的分 离或重组核酸， 所述的 cDNA 构建体通过将编码来自 MG29 家族其它成员的氨基酸或肽组分 的多核苷酸结合而形成， 所述的 MG29 家族其它成员为， 例如， 表 1 或 2 或者 SEQ ID NO ： 1、 2、 5-19 和 26 中指定的那些。编码各个氨基酸或肽结构域的核酸可以由任何期望的亲代基 因克隆并可以利用标准分子生物技术结合到单个连续 (contiguous) 核酸中。而且， 因为一 般可以意识到进化上保守的氨基酸序列作用类似， 所以， 本领域技术人员在其能力范围内， 可以根据本教导制取另外的蛋白质， 并可以按照本文所教导的评估重组蛋白促进蛋白清除 的能力， 无需进行过度的实验。因此， 明确考虑了由 MG29 家族成员结构域组装的重组蛋白， 例如上面鉴定的那些， 它们包括在本发明范围内。
     表 1.UniProtKB/Swiss-Prot MG29 基因 / 蛋白结构同源性数据
    
    
    
    
    表 2.MG29 同源物的 CLUSTAL W(1.82) 多重序列比对
    本发明提供的重组多肽也可以包含融合蛋白结构域， 和 / 或连接插入在多肽结构 域之间的序列的氨基酸， 其允许例如空间柔性 ( 空间灵活性， steric flexability) 和 / 或包含用于酶修饰 ( 例如， 磷酸化、 蛋白酶切割、 泛素化等 ) 的共有序列。该重组多肽可以使 用操控 DNA 序列的标准分子生物技术构建， 本文描述了其中的一些技术。
     在另外的方面， 本发明涉及诊断性寡核苷酸和一个诊断性寡核苷酸集合 ( 或多个 诊断性寡核苷酸集合 ) 或文库。例如， 在这个方面的实施方式中， 该诊断性寡核苷酸文库包 含多个能够与 MG29 基因或转录物杂交的寡核苷酸探针， 其中个体健康状态与该个体的对 应于寡核苷酸序列的 MG29RNA 表达之间有关联。在一些情况下， 仅一种寡核苷酸是此种检 测所必需的。诊断性寡核苷酸集合中的成员可以通过能够检测表达或 RNA 多态性或蛋白质 产物的任何方式鉴定， 包括但不局限于差异表达筛查、 PCR、 RT-PCR、 SAGE 分析、 高通量测序、 微阵列、 液体或其它阵列、 基于蛋白质的方法 ( 例如， western 印迹、 蛋白质组学、 质谱分析 以及本文描述的其它方法 )， 和数据挖掘方法， 如本文进一步讨论的。
     在本文所述的任何一个实施方式中， 本发明提供的核酸可以利用合适的载体扩 增和 / 或表达在宿主细胞， 如原核细胞， 例如细菌细胞， 或者真核细胞如哺乳动物细胞 中。对于原核细胞和真核细胞二者都合适的表达系统参见， 例如下面文献的 16 和 17 章 ： Sambrook， 等人， MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL， 第二版， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 1989。 在某些实施方式中， 本发明提供的核酸以可诱导和 / 或组织特异性方式表达。 例如， 重组哺乳动物表达载体能够指导优选特定细胞类型中的核酸表达 ( 例如， 组织特 异性调节元件用于表达该核酸 )。组织特异性调节元件在本领域中是已知的。合适的组 织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子 ( 肝脏特异性， Pinkert， 等人， 1987. Genes Dev.1 ： 268-277)、 淋巴特异性启动子 (Calame and Eaton， 1988.Adv.Immunol.43 ： 235-275)， 特别是 T 细胞受体启动子 (Winoto and Baltimore， 1989.EMBO J.8 ： 729-733) 和 免 疫 球 蛋 白 启 动 子 (Banerji， 等 人， 1983.Cell 33 ： 729-740 ； Queen and Baltimore， 1983.Cell 33 ： 741-748)、 神经元特异性启动子 ( 例如， 神经丝启动子， Byrne and Ruddle， 1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 5473-5477)、 胰腺特异性启动子 (Edlund， 等人， 1985. Science 230 ： 912-916)， 以及乳腺特异性启动子 ( 例如， 乳清启动子， 美国专利 4,873,316 和欧洲申请公开 No.264,166)。还包括发育调节启动子， 例如鼠类 hox 启动子 (Kessel and Gruss， 1990.Science 249 ： 374-379) 和 α- 胎蛋白启动子 (Campes and Tilghman， 1989. Genes Dev.3 ： 537-546)。
     本发明提供的核酸分子也可以插入到载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载 体可以通过例如静脉注射、 局部给予 ( 参见， 例如美国专利 No.5,328,470) 或通过定位注 射 (stereotactic injection)( 参见， 例如 Chen 等人， 1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 ： 3054-3057) 递送于主体。 该基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受稀释剂中的基因治 疗载体， 或者可以包含基因递送媒剂包埋在其中的缓释基质。 替换地， 如果完整的基因递送 例如逆转录病毒载体， 则该药物制剂可以包括产生该基 载体可以由重组细胞完整地生产， 因递送系统的一种或多种细胞。 该药物组合物可以与给予说明书一起包括在容器、 袋子， 或 分配器中。
     在本文所述的任何实施方式中， 编码 MG29 的核酸可以以下形式存在 ： 一种或多种 裸 (naked)DNA、 一种或多种布置在适当表达载体并独立 ( 作为附加体， episomally) 维持的 核酸、 一种或多种掺入在宿主细胞基因组中的核酸、 编码复合物组分的内源性基因的修饰
     形式、 一种或多种与一种或多种调节核酸序列结合的核酸， 或其组合。 该核酸可以可选地包 含位于 ORF 内 5’ 端、 3’ 端或任何位置处的接头肽 (linker peptide) 或融合蛋白组分， 例 如 His- 标签、 FLAG- 标签、 麦芽糖结合蛋白 (MBP)- 标签、 荧光蛋白、 GST、 TAT、 抗体部分、 信 号肽等。
     在另外的方面， 本发明提供了能够特异性地靶向 MG29 核酸 ( 例如， SEQ ID NO ： 20-25) 的反义和 / 或干扰核酸 ( 例如， RNAi)。例如， 本发明的特征在于下调编码 MG29 蛋白 的序列表达的核酸分子， 如诱骗 RNA(decoy RNA)、 dsRNA、 siRNA、 shRNA、 微 RNA(microRNA)、 适体 (aptamer)， 和 / 或反义核酸分子。在另一个实施方式中， 本发明核酸分子具有核酸内 切酶活性或者是核酸酶复合物的组分并可以切割具有 MG29 核酸序列的 RNA。
     在任何一个干扰核酸实施方式中， 该核酸分子包含与具有 MG29 核酸序列的 RNA 互 补的 12 ～ 100 个碱基。在另一个实施方式中， 该核酸分子包含与具有 MG29 核酸序列的 RNA 互补的 14 ～ 24 个碱基。在本文所述的任何实施方式中， 该核酸分子可以根据本领域中已 知的方法化学合成。许多参考文献描述了对制取 RNA 有用的方法和途径， 包括 ： 6900187、 6383808、 7101991、 7285541、 7368436、 7022828， 它们通过引用合并在此。
     在另一个实施方式中， 本发明提供了组合物， 该组合物包含药学可接受载体或赋 形剂， 以及有效量的至少一个选自由至少一种如 SEQ ID NO ： 1-8 或 26 中给出的 MG29 多肽、 至少一种抑制性核酸组成的组的成员， 所述的至少一种抑制性核酸可以与以下的至少一部 分杂交 ： (i) 编码 MG29 多肽的核酸、 (ii) 编码 MG29 多肽的核酸 3’ UTR、 (iii) 编码 MG29 多 肽的核酸 5’ UTR， 或 (iv) 编码 MG29 表达的翻译后调节剂 ( 调节子， modulator) 并调节 MG29 表达和 / 或蛋白活性的核酸。在某些实施方式中， 该抑制性核酸包含 RNA。在另一个实施方 式中， 该抑制性核酸是具有 10 ～ 100 个核苷酸的 RNA 寡核苷酸， 其中该寡核苷酸与以下的 至少一部分杂交 ： (i) 编码 MG29 多肽的核酸、 (ii) 编码 MG29 多肽的核酸 3’ UTR， 或 (iii) 编码 MG29 多肽并调节 MG29 蛋白和 / 或蛋白活性的核酸 5’ UTR。在另一个实施方式中， 该 抑制性 RNA 是反义 RNA、 干扰 RNA 或二者的组合中的至少一种。在又一个实施方式中， 该干 扰 RNA 是 siRNA、 miRNA 或二者的组合中的至少一种。在另一个方面， 本发明提供了包含任 何一种本文所述的抑制性核酸的核酸载体。在另外的方面， 本发明提供了包含任何一种本 文所述的抑制性核酸和 / 或任何一种本发明提供的载体的宿主细胞。
     寡核苷酸 ( 例如， 反义 GeneBlocs) 利用以下文献中描述的本领域已知的方案合 成： Caruthers 等人， 1992， Methods in Enzymology 211， 319， Thompson 等人， 国际 PCT 公开 No.WO99/54459， Wincot 等人， 1995， Nucleic Acids Res.23， 26772684， Wincott 等人， 1997， Methods Mol.Bio.， 74， 59， Brennan 等人， 1998， Biotechnol Bioeng.， 61， 3345， 和 Brennan， 美国专利 No.6,001,311。所有这些文献都通过引用合并在此。在非限制性实例中， 小规模 合成可以在 394Applied Biosystems 有限公司的合成器上进行。 替换地， 本发明核酸分子可 以单独合成， 并在合成后例如通过连接技术 (ligation)(Moore 等人， 1992， Science 256， 9923 ； Draper 等人， 国际 PCT 公开 No.WO93/23569 ； Shabarova 等人， 1991， Nucleic Acids Research 19， 4247 ； Bellon 等人， 1997， Nucleosides&Nucleotides， 16， 951 ； Bellon 等人， 1997， Bioconjugate Chem.8， 204) 结合在一起。
     “反义核酸” ， 是指通过 RNA-RNA 或 RNA-DNA 或 RNA-PNA( 蛋白质核酸， Egholm 等 人， 1993Nature 365， 566) 相互作用方式结合到靶 RNA 上并改变靶 RNA 活性 ( 综述参见Stein and Cheng， 1993Science 261， 1004 和 Woolf 等人， 美国专利 No.5,849,902) 的非酶 核酸分子。典型地， 反义分子沿着该反义分子的单个连续序列与靶序列互补。然而， 在某 些实施方式中， 反义分子可以结合到底物上， 以便该底物分子形成茎环或发夹结构， 和/或 反义分子可以结合以便该反义分子形成茎环或发夹结构。因而， 反义分子可以与两个 ( 或 甚至更多 ) 非连续底物序列互补， 或者反义分子的两个 ( 或甚至更多 ) 非连续序列部分可 以与靶序列互补， 或者二者。现行的反义策略的综述参见， Schmajuk 等人， 1999， J.Biol. Chem.， 274， 21783-21789 ； Delihas 等 人， 1997， Nature， 15， 751-753 ； Stein 等 人， 1997， Antisense N.A.Drug Dev.， 7， 151， Crooke， 2000， Methods Enzymol.， 313， 3-45 ； Crooke， 1998， Biotech.Genet.Eng.Rev.， 15， 121-157， Crooke， 1997， Ad.Pharmacol， 40， 1-49， 这些 文献通过引用完整地合并在此。另外， 反义 DNA 可以用于通过 DNA-RNA 相互作用靶向 RNA， 从而活化 RNase H， 该 RNase H 可以消化双联体中的靶 RNA。该反义寡核苷酸可以包含一个 或多个 RNase H 活化区， 该 RNase H 活化区能够活化 RNase H 切割靶 RNA。反义 DNA 可以化 学合成或通过利用单链 DNA 表达载体或其等效物表达。
     长双链 RNA(dsRNA， 典型地＞ 200nt) 可以用于使各种生物和细胞类型 ( 例如， 蠕 虫、 果蝇、 植物 ) 的靶基因表达沉默。导入后， 长 dsRNA 进入 RNA 干扰 (RNAi) 通路中。首 先， 该 dsRNA 被称为 Dicer 的类似于 RNase III 的酶加工成 20 ～ 25 个核苷酸 (nt) 的小干 扰 RNA(siRNA)。 然后， 该 siRNA 装配成含内切核糖核酸酶复合物， 称为 RNA 诱导沉默复合物 (RISC)， 该 siRNA 在该过程中解旋。该 siRNA 链随后将 RISC 引导到互补的 RNA 分子中， 在 此处该 RISC 切割并破坏同源 (cognate)RNA( 效应子 (effecter) 步骤 )。同源 RNA 的切割 发生在被 siRNA 链结合的区域中间附近。在哺乳动物细胞中， 长 dsRNA( ＞ 30nt) 的导入启 动了强有力的抗病毒反应， 例如蛋白质合成和 RNA 降解的非特异性抑制。然而， 该哺乳动物 抗病毒反应可以通过 siRNA 和 / 或微 RNA(miRNA) 的导入或表达绕开 ( 回避， bypass)。
     将 dsRNA 注入和转染到细胞或生物体中， 这已经是 siRNA 递送的主要方法。虽 然沉默效应持续数天并且确实似乎被转移到子细胞中， 但它确实最终会消失。然而， 最近 许多研究组已研发出在短暂转染和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达 siRNA 的表达 载体。( 参见， 例如， Brummelkamp TR， Bernards R， and Agami R.(2002).A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science 296 ： 550-553 ； Lee NS， Dohjima T， Bauer G， Li H， Li M-J， Ehsani A， Salvaterra P， and Rossi J.(2002).Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnol.20 ： 500-505 ； Miyagishi M， and Taira K.(2002).U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnol.20 ： 497-500 ； Paddison PJ， Caudy AA， Bernstein E， Hannon GJ， and Conklin DS.(2002).Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes&Dev.16 ： 948-958 ； Paul CP， Good PD， Winer I， and Engelke DR.(2002).Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nature Biotechnol.20 ： 505-508 ； Sui G， Soohoo C， Affar E-B， Gay F， Shi Y， Forrester WC， and Shi Y.(2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6) ： 5515-5520 ； Yu J-Y， DeRuiter SL， and TurnerDL.(2002).RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9) ： 6047-6052， 这些文献通过引 用完整地合并在此 )。
     多肽
     在另外的方面， 并且如上所述， 本发明也提供了分离和 / 或重组 MG29 多肽。
     本发明也包括具有如 SEQ ID NO ： 1-19 中给出的序列的基本纯化的 MG29 多肽， 或 其功能部分。在某些实施方式中， 本发明 MG29 多肽包括与人 MG29 多肽 (SEQ ID NO. ： 3) 的 氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
     MG29 多肽具有与其自身和许多其它细胞的蛋白质相互作用 ( 例如， 非共价结合 ) 和形成复合物的功能。在这个方面的实施方式中， 本发明包含分离或重组 MG29 多肽 ( 例 如， SEQ ID NO ： 1-8 或 26)， 其同源物、 片段或衍生物。在另外的实施方式中， 本发明提供了 包含与至少一种其它多肽结合的 MG29 多肽的复合物， 其中该结合形成蛋白质复合物， 并且 其中该复合物能够改进骨骼肌清除葡萄糖的功能。 本发明进一步包含治疗或预防肌肉相关 性病状的方法， 该方法包括向细胞给予有效量的分离和 / 或重组 MG29 多肽， 和 / 或分离和 / 或重组 MG29 多肽与至少一种其它蛋白质的蛋白质复合物， 其中该复合物能够改进骨骼肌 清除葡萄糖功能。该复合物的多肽可以例如使用肽合成器根据标准方法形成， 或者通过在 单个细胞中表达每个多肽形成 ； 或者单独地在细胞或细胞裂解系统中形成， 然后分离和纯 化该多肽。
     在另外的方面， 本发明涉及包含与至少一种能够调节骨骼肌清除葡萄糖功能的其 它药剂结合的本发明多肽的组合物。在另外的实施方式中， 本发明治疗剂可以包含一种或 多种生物活性成分如止痛剂、 抗酸剂、 抗焦虑药物、 抗心律失常剂、 抗细菌剂、 抗生素、 抗凝 血剂和溶栓剂 ( 溶解血栓剂， thrombolytic)、 抗惊厥剂、 抗抑郁剂、 止泻剂、 止吐剂、 抗真菌 剂、 抗组胺剂、 抗高血压剂、 消炎剂、 抗肿瘤剂、 抗精神病剂、 退热剂、 抗病毒剂、 巴比妥酸盐、 β- 阻断剂、 支气管扩张剂、 感冒药 (Cold Cures)、 皮质类固醇、 止咳剂、 细胞毒素、 减充血 剂、 利尿剂、 祛痰剂、 激素、 降糖药 ( 口服 )、 免疫抑制剂、 泻剂、 肌肉松弛剂、 镇静剂、 性激素、 睡眠药物 (sleeping drugs)、 镇定剂、 维生素或其组合。
     在另一方面， 本发明提供的组合物可以包括药学可接受载体。这个方面的某些实 施方式包括， 含有与药学可接受载体结合的本发明多肽例如 MG29 的治疗组合物， 其中该治 疗组合物全身给予， 并且其中该全身给予的组合物对治疗和 / 或预防糖尿病有效。
     在另外的方面， 本发明提供了包含 “标签” 或指示剂部分 (indicator portion) 和 MG29 部分的融合蛋白。在某些方面， 该标签或指示剂部分可以是适合于纯化目的肽， 例如， FLAG 标签、 6xHis 标签、 麦芽糖结合蛋白 (MBP) 标签等。在其它方面， 该标签肽包含适合于 提供诸如抗体表位的信号的肽或荧光肽。还有一些其它方面包括 MG29 与适合于介导亚细 胞定位或易位穿过细胞膜的肽的融合物， 例如促进细胞穿透的来自 HIV 病毒的 TAT 融合蛋 白， 或使 MG29 偶联到特定细胞的细胞器上的修饰细胞定位标签。
     本发明分子可以用作预防、 抑制、 改善和 / 或治疗主体 ( 对象、 受验者， subject) 疾病状态的药物药剂。许多有用的基于核酸的治疗途径是已知的， 讨论在 Patil 等人， AAPS Journal， 2005 ； 7(1) ： E61-77 中， 该文献通过引用完整地合并在此。
     本发明核酸分子可以， 单独地， 或者与其它药剂结合或一起用于治疗上面讨论的疾病或病症。如本领域技术人员可以明了的， 例如， 该主体， 或者其它适当的细胞可以被单 独治疗或在适合于该治疗的条件下结合一种或多种药物进行治疗。
     在另一方面， 本发明提供了包括治疗或预防有效量的治疗和药学可接受载体的药 物组合物， 其对治疗或预防个体的包括糖尿病在内的肌肉相关性疾病有效。本发明分子可 以用作预防、 抑制、 改善和 / 或治疗主体疾病状态的药物药剂。
     在某些实施方式中， 该治疗剂包含本发明核酸， 例如 MG29 核酸， 例如， SEQ ID NO ： 20-15 中的至少一个。在另外的实施方式中， 本发明提供的治疗核酸是肽核酸、 cDNA， 或 RNA， 例如小抑制性 RNA。许多有用的基于核酸的治疗途径是已知的， 讨论在 Patil 等人， AAPS Journal， 2005 ； 7(1) ： E61-77 中， 该文献通过引用完整地合并在此。
     在另外的实施方式中， 本发明提供的治疗剂是包含 MG29 多肽， 例如 SEQ ID NO ： 1-8 或 26 中至少一个， 或其生物活性部分， 或者对 MG29 多肽具有特异性的抗体的组合物。 在进一步方面， 本发明包括 ( 放置 ) 在一个或多个容器中的治疗或预防有效量的这种药物 组合物。本发明也包括寡核苷酸， 例如包括 MG 核酸的至少 6 个连续 ( 连续， contiguous) 核 苷酸的寡核苷酸或所述寡核苷酸的补体 (complement)。
     在某些实施方式中， 用抗核酸酶基团 ( 核酸酶抗性基团 ) 例如 2′ - 氨基、 ′ -C- 烯 丙基、 2 ′ - 氟、 2 ′ -O- 甲基、 2 ′ -H 修饰本发明提供的核酸分子从而增强稳定性 ( 综述 参见 Usman and Cedergren， 1992， TIBS 17， 34 ； Usman 等人， 1994， Nucleic Acids Symp. Ser.31， 163)。虽然用硫代磷酸酯、 硫代磷酸酯和 / 或 5′ - 甲基磷酸酯连键化学修饰寡核 苷酸的核苷酸间连键 (linkage) 可以提高稳定性， 但是这些修饰大多会引起一些毒性。所 以， 当设计核酸分子时， 应当使这些核苷酸间连键的量减到最少。 这些连键的密集度的降低 可以降低毒性， 使得这些分子的功效增强， 具有较高特异性。因此， 提供了具有维持或增强 活性的化学修饰的核酸分子。此种核酸对核酸酶的抗性一般也比未经修饰的核酸强。核酸 分子优选对核酸酶具有抗性以便可以用作有效的细胞内治疗剂。RNA 和 DNA 化学合成的改 进 (Wincott 等人， 1995Nucleic Acids Res.23， 2677 ； Caruthers 等人， 1992， Methods in Enzymology 211， 3-19( 通过引用合并在此 )) 已通过导入核苷酸修饰从而增强如上所述的 它们的核酸酶稳定性， 而扩大了修饰核酸分子的能力。本发明基于核酸的分子的使用通过 提供联合治疗的可能性 ( 例如， 靶向不同基因的多个反义或酶核酸分子、 与已知小分子抑 制剂偶联的核酸分子， 或者分子和 / 或其它化学或生物分子结合的间歇治疗 )， 可以对疾病 进展进行较好地治疗。用核酸分子治疗主体也可以包括不同类型的核酸分子的组合。
     在一个实施方式中， 本发明提供了包含磷酸 ( 磷酸酯、 或磷酸盐， phosphate) 骨 架修饰的修饰核酸分子， 所述磷酸骨架修饰包含一种或多种硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯 (phosphorodithioate)、 甲基磷酸酯、 吗啉代、 酰胺化氨基甲酸酯 (amidate carbamate)、 羧甲基、 乙酰酰胺化物 (acetamidate)、 聚酰胺、 磺酸酯 (sulfonate)、 磺酰胺、 氨基磺酸酯 (sulfamate)、 甲缩醛 (formacetal)、 硫甲缩醛 (thioformacetal)， 和 / 或烷基甲硅烷基取 代。 寡核苷酸骨架修饰的综述参见 Hunziker and Leumann， 1995， Nucleic Acid Analogues ： Synthesis and Properties， in Modern Synthetic Methods， VCH， 331417， 和 Mesmaeker 等 人， 1994， Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides， in Carbohydrate Modifications in Antisense Research， ACS， 24 39。这些参考文献通过引用合并在此。 可以对核酸 ( 例如， 反义和核糖酶 ) 结构进行各种修饰从而增强这些分子的实用性。例如，此种修饰可以增强存放期、 体外半衰期、 生物利用度、 稳定性， 并使得此种寡核苷酸容易导 入到靶位， 包括例如， 增强穿透细胞膜 ( 的能力 ) 和赋予识别并结合到靶向细胞的能力。
     核酸分子的给予。核酸分子递送方法描述在 Akhtar 等人， 1992， Trends Cell Bio.， 2， 139， 和 Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics， ed.Akhtar， 1995 中， 这两篇文献都通过引用合并在此。Sullivan 等人的 PCT WO94/02595 进一步描述了酶 RNA 分子递送的一般方法。这些方案实际上可以用于递送任何核酸分 子。核酸分子可以通过本领域熟练技术人员已知的各种方法给予细胞， 包括但不局限于， 封装在脂质体中、 通过离子电渗疗法， 或通过掺入到其它媒剂如水凝胶、 环糊精、 生物可降 解的纳米胶囊和生物粘附微球中。替换地， 该核酸 / 媒剂结合物通过直接注射或通过使用 输液泵局部递送。其它递送途径包括， 但不局限于口服 ( 片剂或丸剂形式 ) 和 / 或鞘内 递送 (Gold， 1997， Neuroscience， 76， 1153-1158)。其它途径包括使用各种运送和载体系 统， 例如， 通过使用结合物和生物可降解聚合物实现。包括 CNS 递送在内的药物递送策略 的 综 述， 参 见 Ho 等 人， 1999， Curr.Opin.Mol.Ther.， 1， 336-343， 和 Jain， Drug Delivery Systems ： Technologies and Commercial Opportunities， Decision Resources， 1998， 以及 Groothuis 等人， 1997， J.Neuro Virol.， 3， 387-400。 本发明带负电荷的多核苷酸可以在含有或不含有用于形成药物组合物的稳定剂、 缓冲剂等的情况下， 通过任何标准方式给予 ( 例如， RNA、 DNA 或蛋白质 ) 和导入主体中。当 期望使用脂质体递送机制时， 可以按照形成脂质体的标准方案进行。本发明组合物也可以 调配成和用作口服给予的片剂、 胶囊或酏剂， 用于直肠给予的栓剂， 无菌溶液， 可注射给予 的悬液， 以及本领域已知的其它组合物。
     本发明核酸分子也可以例如用于药物直肠给予的栓剂形式给予， 或者本身经由导 管直接给予于膀胱。这些组合物可以通过将该药物与合适的无刺激性赋形剂混合制备， 所 述赋形剂在常温下为固体但在直肠温度下为液体， 因而将在直肠中熔化从而释放该药物。 此种材料包括可可油和聚乙二醇。本发明核酸分子可以在无菌介质中肠道外给予。该药物 依据所使用的媒剂和浓度， 可以悬浮或溶解在该媒剂中。有利地， 可以将佐剂如局部麻醉 剂、 防腐剂和缓冲剂溶解在该媒剂中。可与载体材料结合从而形成单剂量形式的活性成分 的量随受治疗宿主和特定给予模式而变化。剂量单位形式一般包含约 1mg ～约 5000mg 的 活性成分。 应理解， 任何特定患者或主体的具体剂量水平随着多种因素变化， 包括所采用的 具体化合物的活性、 年龄、 体重、 总体健康状况、 性别、 饮食、 给予时间、 给予途径， 和排泄率、 药物组合以及经受治疗的特定疾病的严重性。
     替换地， 本发明某些核酸分子可以由真核启动子表达在细胞中 ( 例如， Izant and Weintraub， 1985， Science， 2 29， 345 ； McGarry and Lindquist， 1986， Proc.Natl. Acad.Sci.， USA 83， 399 ； Scanlon 等 人 .， 1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 88， 10591 5； Kashani-Sabet 等 人 .， 1992， Antisense Res.Dev.， 2， 315 ； Dropulic 等 人 .， 1992， J.Virol.， 66， 1432 41 ； Weerasinghe 等 人 .， 1991， J.Virol.， 65， 5531 4 ； Ojwang 等 人 .， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89， 10802 6 ； Chen 等人 .， 1992， Nucleic Acids Res.， 20， 4581 9 ； Sarver 等人 .， 1990Science， 247， 1222 1225 ； Thompson 等人， 1995， Nucleic Acids Res.， 23， 2259 ； Good 等人 .， 1997， Gene Therapy， 4， 45 ； 所有这些参考文献都通过引用合并 在此 )。 本领域技术人员可以意识到， 任何核酸都可以由适当 DNA/RNA 载体表达在真核细胞
     中。 在另一方面， 本发明提供了包含编码至少一种本发明核酸分子的核酸序列的表达 载体。编码本发明核酸分子的核酸序列以使该核酸分子可被表达的方式可操作地连接。在 另一个方面， 本发明的特征是包含编码至少一种本发明核酸分子的核酸序列的表达载体， 以使该核酸分子可被表达的方式包含。该表达载体在一个实施方式中包含 ： a) 转录起始 区、 b) 转录终止区、 c) 编码至少一种所述核酸分子的核酸序列 ； 其中所述序列以使该核酸 分子可被表达和 / 或递送的方式可操作地连接到所述起始区和所述终止区。
     核酸分子序列的转录由真核 RNA 聚合酶 I(pol I)、 RNA 聚合酶 II(pol II) 或 RNA 聚合酶 III(pol III) 的启动子驱动。来自 pol II 或 pol III 启动子的转录物高水平地 表达于所有细胞中 ； 给定 pol II 启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因 调节序列的性质 ( 增强子、 沉默子等 )。也可以使用原核 RNA 聚合酶启动子， 条件是该原 核 RNA 聚合酶可表达在适当的细胞中 (Elroy-Stein and Moss， 1990， Proc.Natl.Acad. Sci.USA， 87， 6743 7 ； Gao and Huang 1993， Nucleic Acids Res.， 21， 2867 72 ； Lieber 等 人， 1993， Methods Enzymol.， 217， 47 66 ； Zhou 等人， 1990， Mol.Cell.Biol.， 10， 4529 37)。 所有这些文献都通过引用合并在此。数位研究者已经证明， 核酸分子如由此种启动子表 达的核糖酶可以在哺乳动物细胞中起作用 ( 例如， Kashani-Sabet 等人， 1992， Antisense Res.Dev.， 2， 3 15 ； Ojwang 等 人， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89， 10802 6 ； Chen et al， 1992， Nucleic Acids Res.， 20， 4581 9 ； Yu 等人， 1993， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90， 6340 4 ； L ′ Huillier 等 人， 1992， EMBO J.， 11， 4411 8 ； Lisziewicz 等 人， 1993， Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A， 90， 8000 4 ； Thompson 等人， 1995， Nucleic Acids Res.， 23， 2259 ； Sullenger&Cech， 1993， Science， 262， 1566)。
     在另一个实施方式中， 本发明的分离核酸分子所包含的核酸分子是 MG29 核酸的 核苷酸序列的补体。
     应用
     在另外的方面， 本发明涉及与治疗包括糖尿病在内的肌肉相关性病状和病症有关 的组合物和方法。在某些示例实施方式中， 本发明包括， 例如， 向个体给予有效量的本发明 治疗组合物用于治疗和 / 或预防糖尿病。
     本发明治疗剂在制造用于治疗或预防肌肉相关性病状或病症、 障碍或症状的药 物中的用途也包括在本发明范围中， 所述的肌肉相关性病状或病症、 障碍或症状包括， 例 如， 肌肉疲劳或肌肉萎缩、 心血管病、 心肌病、 糖尿病、 动脉粥样硬化、 高血压、 先天性心脏缺 陷、 主动脉瓣狭窄 ( 主动脉缩窄， aortic stenosis)、 心房间隔缺损 ( 房间隔缺损， atrial septal defect， ASD)、 房室 (A-V) 管缺损、 动脉导管 (ductus arteriosus)、 肺动脉瓣狭 窄、 主动脉瓣下狭窄、 室间隔缺损 (VSD)、 瓣膜疾病、 氧化损伤、 肌肉无力、 肌肉萎缩、 心力衰 竭、 由心力衰竭和高血压引起的继发病状、 低血压、 心绞痛、 心肌梗塞、 心脏病、 心力衰竭、 糖尿病性溃疡、 肾动脉狭窄、 间质性肾炎、 肾小球肾炎、 多囊肾疾病、 全身酸中毒、 肾小管 性酸中毒、 IgA 肾病、 肾内科疾病、 高血钙 (hypercalceimia)、 肌肉障碍、 尿潴留 (urinary retention)、 神经保护、 中风、 无晶状体眼 (Aphakia)、 神经退行性障碍、 神经系统疾病， 和/ 或其它类似疾病和障碍。
     作为非限制性实例， 本发明组合物对治疗罹患上面公开的疾病和障碍和 / 或其它
     类似病症和障碍， 特别是糖尿病的患者有功效。 在某些方面， 本发明提供的多肽用作用于产 生对本发明具有特异性的抗体的免疫原、 用作疫苗， 和 / 或用于筛查潜在的激动剂和拮抗 剂化合物。另外， 所提供的编码本发明突触素样蛋白如 MG29 的 cDNA 用于基因治疗方法中， 以给予需要其的主体。
     在某些方面， 本发明提供了调节肌肉功能的组合物和方法， 包括调节 MG29 的转 录、 翻译 ( 即， 表达 )， 和 / 或活性。如本文所述的， 在一个示例实施方式中， MG29 的调节是 这样实现的 ： 例如通过给予与 MG29 核酸互补的核酸， 和 / 或 MG29 多肽结合伴侣 (binding partners)， 即， 调节结合到 MG29 核酸和 / 或 MG29 多肽上， 并抑制、 减弱或中和它们的生物 活性的因子， 如至少一种 MG29RNA 结合蛋白， 例如， HuR、 ARE 和 / 或 LOX-DICE， 和 / 或至少 一个 MG29 基因转录因子， 例如， GATA、 RUNX1、 SREBP1、 C/EBP 和 / 或 p300 ； 使用抑制性 RNA、 抗体、 假肽、 肽类似物或模拟肽， 或结合并抑制一种或多种靶核酸或多肽的小分子。在一个 实施方式中， 本发明涉及治疗或预防个体糖尿病的方法， 该方法包括上调 MG29 基因的转录 和 / 或翻译， 和 / 或 MG29 多肽的活性。在另一个实施方式中， 在本发明核酸分子存在的情 况下利用该核酸分子的 MG29 基因的抑制或下调大于在不存在该核酸分子的情况。
     在另外的实施方式中， 本发明提供了调节细胞葡萄糖摄取的方法， 该方法包括向 肌细胞给予包含有效量的调节 MG29 基因表达或调节 MG29 多肽活性或者二者的药剂的组合 物， 其中 MG29 的调节导致该细胞的葡萄糖摄取被调节。在某些实施方式中， 该细胞是肌细 胞， 例如， 骨骼肌细胞、 心肌细胞或平滑肌细胞。 在另外的实施方式中， 该组合物进一步包含 如本文所述的药学可接受载体或赋形剂。在某些另外的实施方式中， 该药剂包含编码与选 自由 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 组成的组的 MG29 多肽具有至少 85％序列同一性的多肽的核酸。 在优选实施方式中， 该核酸编码如 SEQ ID NO ： 3 中给出的 MG29 多肽。在替换实施方式中， 该药剂包含至少一种抑制性核酸， 所述的至少一种抑制性核酸与选自由编码 MG29 多肽的 核酸、 编码 MG29 多肽的核酸 UTR， 和编码 MG29 基因表达调节剂的核酸所组成的组的成员杂 交。在某些实施方式中， 该抑制性核酸是 RNA。在又一个实施方式中， 该抑制性 RNA 可以与 编码如 SEQ ID NO ： 20-25 的至少一个中给出的 MG29 多肽的核酸 UTR， 或编码 MG29 表达调 节剂的核酸杂交。在另一个实施方式中， 该抑制性 RNA 是反义 RNA、 干扰 RNA， 或者二者的组 合中的至少一个。在优选实施方式中， 该干扰 RNA 是 siRNA、 miRNA， 或者二者的组合中的至 少一个。
     在另外的方面， 本发明提供了向个体给予有效量的编码 MG29 多肽如 MG29， 其同源 物、 片段和衍生物的核酸， 以治疗和 / 或预防肌肉相关性病状或病症如糖尿病的方法。如本 文所证明的， 本发明 MG29 多肽能够调节肌肉和肌细胞中的各种过程， 并可以提供对抗涉及 肌肉功能受损的许多障碍的有效治疗途径。在一个实施方式中， 本发明提供了治疗和 / 或 预防糖尿病的方法， 该方法包括向个体给予包含有效量的与药学可接受赋形剂结合的本发 明核酸或多肽的组合物， 其中该组合物对治疗和 / 或预防糖尿病有效。
     在另外的方面， 本发明提供了调节 MG29 基因， 例如 SEQ ID NO ： 20-15 的表达， 或 者 MG29 蛋白， 例如 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 的活性的方法。在某些实施方式中， 该方法包括向 体外、 离体或体内细胞或组织给予编码 MG29 多肽的重组核酸， 其中该重组核酸对调节 MG29 表达或活性中的至少一个有效。在任何一个本文所述的实施方式中， 该重组 MG29 核酸可以 是顺反子 (cistronic)， 即在单一开放阅读框 (ORF) 内包含期望的编码序列 ； 或者它可以包含一个或多个内含子序列。 在某些其它实施方式中， 该方法包括向体外、 离体或体内细胞或 组织给予能够与编码 MG29 多肽的核酸特异性杂交的重组核酸。在某些实施方式中， 该重组 MG29 核酸掺入在核酸载体如质粒、 病毒载体、 人工染色体等中。在另外的实施方式中， 包含 重组 MG29 核酸的载体包含一个或多个转录或复制调节元件、 可操作地连接到 MG29 核酸上 的可选标记或翻译修饰序列。
     在另外的方面， 本发明提供了治疗糖尿病的方法， 该方法包括向个体给予包含有 效量的具有下面至少一种作用的药剂的组合物 ： 增大 MG29 基因表达、 提高 MG29 多肽活性， 或二者的组合， 其中该药剂对治疗糖尿病有效。在某些实施方式中， 该组合物全身给予。在 某些另外的实施方式中， 该药剂包含编码与选自 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 所组成的组的 MG29 多肽具有至少 85％序列同一性的多肽的核酸。在优选实施方式中， 该核酸编码如 SEQ ID NO ： 3 中给出的 MG29 多肽。在替换实施方式中， 该药剂包含至少一种抑制性核酸， 所述的至 少一种抑制性核酸可以与选自由编码 MG29 多肽的核酸、 编码 MG29 多肽的核酸 UTR， 和编码 MG29 表达调节剂的核酸所组成的组的成员杂交。在某些实施方式中， 该抑制性核酸是 RNA。 在又一个实施方式中， 该抑制性 RNA 与编码如 SEQ ID NO ： 20-25 的至少一个中给出的 MG29 多肽的核酸 UTR， 或编码 MG29 基因表达调节剂的核酸杂交。在另一个实施方式中， 该抑制 性 RNA 是反义 RNA、 干扰 RNA， 或二者的组合中的至少一个。在任何一个本文所述的实施方 式中， 本发明提供的干扰 RNA 是 siRNA、 miRNA， 或者二者的组合中的至少一个。
     在任何一个本文所述的方法中， 本发明核酸或多肽可以任何药学可接受形式， 按 照如下面进一步详细描述的任何药学可接受途径递送或给予。例如， 包含本发明核酸和 / 或多肽的组合物可以全身递送或直接递送到细胞或组织中。在某些另外的实施方式中， 本 发明核酸和 / 或多肽包含载体部分， 所述的载体部分可以提高生物利用度、 延长药物存放 期、 使该治疗剂靶向特定细胞或组织类型， 例如骨骼肌或横纹肌细胞或组织， 或其组合。
     在又一个方面， 本发明提供了确定主体 ( 例如， 人主体 ) 是否罹患或易患与肌肉相 关性病状或肌肉功能障碍关联的疾病。在一个实施方式中， 该方法包括从个体 ( 例如， 血 液、 肌肉或其它 ) 分离出生物样品、 通过对 MG29 多态性或突变具有特异性的可检测探针处 理来自个体的组织样品， 检测 MG29 基因的基因型， 和检测探针 / 靶复合物形成， 其中复合物 形成表示存在特定基因型。替换地， 测量来自主体的测试样品中 MG29 核酸或多肽的量， 并 将测试样品中多肽的量与对照样品中存在的 MG29 核酸或多肽量进行比较。测试样品中的 水平相比对照样品中的水平发生变化， 表示该主体罹患疾病或易患该疾病。 优选地， 易患病 体质 (predisposition) 包括例如糖尿病。而且， 本发明新多肽的表达水平可以用在筛查糖 尿病以及确定该疾病类型或程度的方法中。在另一个实施方式中， 该方法包括诊断或监测 障碍或疾病或进展的步骤， 该步骤包括从个体分离出生物样品， 检测如本文所述的 MG29 基 因中核苷酸多态性的存在， 其中 MG29 多态性与疾病或其严重性关联。
     在一种实施方式中， 本发明包括筛选调节 MG29 活性、 蛋白水平或基因表达中的至 少一种的药剂 ( 即， MG29 激动剂和 / 或拮抗剂 ) 的方法， 该方法包括提供细胞或组织， 测量 内源性 MG29 活性、 蛋白水平或基因表达中的至少一种的量从而确定对照值， 使测试药剂与 该细胞或组织接触， 测量或检测 MG29、 MG29 蛋白量， 或 MG29 基因表达量中至少一种的活性 从而确定测试值， 以及将对照值与测试值进行比较， 其中在测试值和对照值之间观察到变 化， 说明该药剂能够调节细胞或组织的 MG29 活性、 蛋白水平或基因表达中的至少一种。在另一个实施方式中， 本发明提供了筛选包括例如糖尿病在内的障碍或症状的调 节剂的方法。该方法包括使测试药剂与 MG29 核酸或多肽接触， 和确定测试化合物是否结合 到所述 MG29 核酸或多肽上的步骤。测试化合物与 MG29 核酸或多肽结合， 表 (latency) 或 易患病体质的调节剂。在另一个实施方式中， 本发明提供了筛选调节肌肉清除葡萄糖 ( 功 能 ) 的药剂的方法， 该方法包括使表达 MG29 的肌肉与调节 MG29 或 MG29 相互作用蛋白， 或 其组合的表达和 / 或活性的药剂接触， 以及测量对骨骼肌清除葡萄糖功能的影响， 其中葡 萄糖清除增强表示该药剂为 MG29 激动剂， 而葡萄糖清除降低表示该药剂为 MG29 拮抗剂。
     可用于本发明方法中的潜在化合物文库是众所周知且容易获得的。此外， 本文描 述了对测量药剂与 MG29 多肽的结合、 MG29 蛋白的量， 和 / 或 MG29 基因转录和 / 或翻译水 平有用的技术。对实施本发明有用的另外的方法也可按常规使用， 并可以利用本领域常规 实验修改用于要求保护的方法中。
     在另一个方面， 本发明提供了检测样品中 MG29 核酸或多肽的存在的方法， 该方法 包括以下步骤 ： 分离出生物样品， 在使该药剂和该核酸或多肽之间能够形成复合物的条件 下使该样品与分别选择性地结合到靶核酸或多肽上的可检测药剂 ( 例如， 核酸探针、 抗体 或小分子 ) 接触。然后， 若出现复合物， 则检测该复合物， 从而鉴定该样品内的 MG29 核酸或 多肽。本发明方法也可以用于鉴定特异性细胞或组织类型， 基于它们的 MG29 核酸或多肽表 达进行鉴定。
     在进一步方面， 本发明提供了生产多肽的方法， 该方法包括使宿主细胞或无细胞 系统表达编码 MG29 多肽的核酸。在某些实施方式中， MG29 核酸是内源性 MG29 基因。在另 外的实施方式中， MG29 核酸是外源性 MG29 核酸。期望时， 然后可以回收该多肽。例如， 在 某些实施方式中， 待表达的 MG29 核酸包含可将其分泌引导到周围介质中的前导序列或信 号序列。随后， 可以根据已知方法从该介质中分离和纯化出 MG29 多肽。在另外的实施方式 中， 本发明包括通过培养包含编码 MG29 核酸的内源性核酸的细胞生产多肽的方法， 所述的 内源性核酸布置在外源性调节元件例如启动子、 增强子或阻遏子序列上游或下游。在某些 实施方式中， 该外源性调节元件通过本领域众所周知的同源重组、 链断裂或错配修复机制 掺入到宿主细胞基因组中。
     在进一步方面， 本发明提供了调节 MG29 多肽活性或表达的方法， 该方法通过使包 括 MG29 多肽的细胞样品与足以调节所述多肽活性的量的、 结合到 MG29 多肽、 MG29RNA 结合 蛋白和 / 或 MG29 蛋白相互作用因子 (interactor) 上的化合物接触而完成， 其中 MG29 的调 节对治疗或预防糖尿病或与其相关的病症有效。 该化合物可以是， 例如小分子， 如核酸、 肽、 多肽、 模拟肽、 碳水化合物、 脂质或其它有机 ( 含碳 ) 或无机分子， 如本文进一步描述的。
     在另一方面， 本发明提供了诊断个体中糖尿病的方法， 该方法包括从正常主体分 离出肌细胞并测量该肌细胞中的钙火花频率从而确定比较基础， 从测试主体分离出肌细胞 并测量测试主体肌细胞中的钙火花频率， 其中测试个体中钙火花频率的降低， 指示糖尿病 病状的存在和 / 或严重性。
     在另一方面， 本发明提供了调节 MG29 基因表达和 / 或调节 MG29 多肽活性的药剂， 其用在用于调节细胞葡萄糖摄取的方法中， 所述方法包括制备包含有效量的用于给予的药 剂的药物的步骤， 其中该药剂对调节该细胞葡萄糖摄取有效。 在某些实施方式中， 该细胞是 体外或体内细胞。在另外的实施方式中， 该细胞是肌细胞， 例如骨骼肌细胞。在某些另外实施方式中， 该药剂与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合。在进一步实施方式中， 该药剂包 含， 编码与选自由 SEQ ID NO ： 1-8 和 26 所组成的组的 MG29 多肽具有至少 85％序列同一性 的多肽的核酸 ； 或者该药剂包含至少一种抑制性核酸， 所述的至少一种抑制性核酸与选自 由编码 MG29 多肽的核酸、 编码 MG29 多肽的核酸 UTR， 和编码 MG29 基因表达调节剂的核酸 所组成的组的成员杂交。如前面指出的， 在某些实施方式中， 该抑制性核酸包含 RNA。在另 外的实施方式中， 该抑制性核酸可以与编码如 SEQ ID NO ： 20-25 的至少一个中给出的 MG29 多肽的核酸 UTR 杂交。在任何一个本文所述的实施方式中， 该抑制性核酸是反义 RNA、 干扰 RNA 或二者的组合中的至少一个。
     在另一个方面， 本发明提供了与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合的调节 MG29 基因表达和 / 或调节 MG29 多肽活性的药剂在制造药物中的用途， 其中该药物制备用于以 0.1mg/kg ～约 1000mg/kg 的剂量给予， 在 1 天至 12 个月的时间段内至少给予一次。在另外 的方面， 本发明提供了与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合的调节 MG29 基因表达和 / 或调 节 MG29 多肽活性的药剂， 其用于治疗糖尿病的方法中。在又一个另外方面， 本发明提供了 与药学可接受载体和 / 或赋形剂结合的调节 MG29 基因表达和 / 或调节 MG29 多肽活性的药 剂在制造用于治疗糖尿病的药物中的用途。 根据权利要求 14 限定的用途， 其中所述药剂是核酸。
     本发明某些方面包括用一种或多种 DNA 分子检测基因表达或多态性的方法， 其中 该一种或多种 DNA 分子具有检测与序列表 ( 参见表 1 和 2) 所给寡核苷酸对应的基因表达 的核苷酸序列。在一种形式下， 该寡核苷酸检测差异表达的基因的表达。该基因表达系统 可以是候选物文库、 诊断药剂、 诊断寡核苷酸集合或诊断探针集合。该 DNA 分子可以是基因 组 DNA、 RNA、 蛋白质核酸 (PNA)、 cDNA 或合成寡核苷酸。按照本文教导的程序， 可以鉴定用 于分析基因表达或多态性的感兴趣序列。此种序列可以预测糖尿病状态。已鉴定出与疾病 严重性关联的多态性 ( 参见， Zhong 等人， Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in the macrophage migration inhibitory factor gene by thin-film biosensor chips and application to rural field studies.Nucleic Acids Res.2005Aug 2 ； 33(13) ： e121 ； Donn 等人， A functional promoter haplotype of macrophage migration inhibitory factor is linked and associated with juvenile idiopathic arthritis.Arthritis Rheum.2004May ； 50(5) ： 1604-10) ； 这些文献都通过引 用完整地合并在此用于所有目的。)。如技术人员可以理解的， 与肌肉障碍关联， 因而可用 作根据本发明方法的诊断标记的 MG29 基因多态性， 可以出现在 MG29 基因或调节区的任何 一个核酸区中。鉴定和监测多态性的技术在本领域中是已知的， 并详细讨论在 Wohlgemuth 的美国专利 No ： 6,905,827 中， 该专利通过引用完整地合并在此用于所有目的。
     宿主细胞
     如本文使用的 “细胞” 是以其通常的生物学意义使用的， 并不是指整个多细胞生 物。该细胞可以是， 例如， 体内、 体外或离体的， 例如在细胞培养物中， 或存在于多细胞生物 中， 该多细胞生物包括例如， 鸟类、 植物和哺乳动物如灵长类动物、 人、 牛、 羊、 猿、 猴、 猪、 狗、 小鼠、 大鼠和猫。该细胞可以是原核细胞 ( 例如， 细菌细胞 ) 或真核细胞 ( 例如， 哺乳动物 或植物细胞 )。术语 “宿主细胞” 包括， 可用于携载异源性或外源性核酸， 或者表达异源性或 外源性 ( 即， 外来的 ) 核酸编码的肽或蛋白质的细胞。宿主细胞可以包含不能在该细胞天
     然 ( 未转化 ) 形式中找到的基因、 在该细胞天然形式中找到的基因， 其中该基因被修饰并由 人工手段重导入到该细胞中， 或者该细胞的内源性核酸， 该内源性核酸已被人工修饰， 但没 有从该细胞中除去。宿主细胞可以是真核或原核的。细菌培养所需的一般生长条件可以在 诸如 BERGEY′ S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY， Vol.1， N.R.Krieg， ed.， Williams and Wilkins， Baltimore/London(1984) 的文献中找到。 “宿主细胞” 也可以是这样的细胞， 其中内源性基因或启动子或者二者都已被修饰从而产生本发明的一种或多种多肽组分。
     可以通过本领域技术人员熟知的常规技术， 用重组 DNA 转化宿主细胞。 “转化” 是 指在导入、 修饰， 和 / 或提取核酸材料如 DNA 或 RNA 后， 在细胞中诱导的永久性或短暂性遗 传 ( 基因 ) 变化。
     如果宿主是原核的， 如大肠杆菌时， 则能够摄取 DNA 的感受态细胞可以由在指数 生长期之后收获的细胞制取， 随后按照本领域熟知的程序通过 CaCl2 法进行处理。替换地， 可以使用 MgCl2、 RbCl、 脂质体或脂质体 - 蛋白质结合物。转化也可以在形成宿主细胞原生 质体之后或通过电穿孔执行。这些实例并没有限制本发明， 在本发明范围内考虑了许多本 领域技术人员熟知的转染宿主细胞的技术。
     当宿主是真核的时， 此类用 DNA 转染的方法包括磷酸钙共沉淀、 常规机械程序如 显微注射、 电穿孔、 插入包覆在脂质体中的质粒， 或病毒载体， 以及本领域已知的其它方法。 该真核细胞可以是酵母细胞 ( 例如， 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)) 或可以是哺 乳动物细胞， 包括人细胞。为了长期高产率生产重组蛋白， 稳定的表达是优选的。 在另一个方面， 本发明包括包含任何一种本发明 MG29 核酸的宿主细胞。在某些实 施方式中， 该宿主细胞包含含有重组 MG29 核酸， 或与编码 MG29 的核酸互补的核酸， 或调节 内源性 MG29 基因表达的外源性或重组启动子的载体。
     在另一个方面， 本发明包括转基因生物， 例如， 小鼠， 其包含至少一种重组 MG29 等 位基因， 包括功能等位基因的缺失 ； 或包含 MG29 转基因 ； 或包含含有重组 MG29 核酸的载 体； 或包含 MG29 核酸或与 MG29 编码核酸或其部分互补的核酸前体。在某些实施方式中， 该 转基因生物可以包含可操作地连接到诱导型启动子 / 增强子， 和 / 或组织特异性启动子， 例 如肌肉特异性启动子上的重组 MG29 核酸。
     试剂盒
     在另一个方面， 本发明提供了包含合适的容器、 布置在其中的本发明提供的组合 物， 和使用说明书的试剂盒。 本发明的进一步目的在于提供包含合适的容器、 布置在其中的 药学可接受形式的本发明治疗剂， 和使用说明书的试剂盒。
     根据本发明还披露了利用本文所述的方法、 选择策略、 材料或组分中的任一种提 供了试剂盒或系统。根据本公开内容的示例试剂盒将可选地、 另外包括执行方法或分析的 说明书、 包装材料、 一个或多个包含分析 (assay)、 设备或系统元件的容器， 等等。
     抗体
     本发明的特征还在于， 免疫选择性地结合到 MG29 及其多肽、 片段、 同源物、 类似 物、 假肽、 模拟肽或衍生物上的抗体。因此， 在其它实施方式中， 本发明涉及编码 MG29 多肽 结合蛋白、 抗体多肽或其生物活性部分的分离核酸分子。
    如本文使用的术语 “抗体” 是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白 (Ig) 分子的免疫 活性部分， 即， 包含特异性地结合抗原 ( 与抗原免疫反应 ) 的抗原结合部位的分子， 其包含
     至少一个， 优选两个重 (H) 链可变区 ( 本文简称为 VH)， 和至少一个， 优选两个轻 (L) 链可变 区 ( 本文简称为 VL)。此种抗体包括， 但不局限于， 多克隆、 单克隆、 嵌合、 单链、 Fab、 Fab’ 和 F(ab’ )2 片段， 以及 Fab 表达文库。 该 VH 和 VL 区可以进一步细分为称为 “互补决定区” (CDR) 的高变区， 以及与其交替的较保守的称为 “构架区 ( 框架区， framework regions)” (FR) 的 区。构架区和 CDR 的范围已被精确界定 ( 参见， Kabat， E.A.， 等人 .(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition， U.S.Department of Health and Human Services， NIH Publication No.91-3242， and Chothia， C. 等 人 .(1987)J.Mol. Biol.196 ： 901-917， 这些文献通过引用合并在此 )。 每个 VH 和 VL 均由三个 CDR 和四个 FR 组 成， 该三个 CDR 和四个 FR 按下面的顺序从氨基末端向羧基末端布置 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。一般而言， 从人获得的抗体分子涉及 IgG、 IgM、 IgA、 IgE 和 IgD 类别中的 任何一种， 这些类别彼此之间的差异在于分子中存在的重链性质。 某些类别也具有子类， 如 IgG1、 IgG2 以及其它。此外， 在人中， 该轻链可以是 κ 链或 λ 链。本文提及抗体时包括提 及人抗体物种的所有这样的类别、 子类和类型。
     抗体可以由包含感兴趣的肽作为免疫剂的完整多肽或片段制备。 优选的抗原多肽 片段是 15 ～ 100 个连续氨基酸。在一个实施方式中， 该肽位于该多肽的非跨膜结构域中， 例如， 在细胞外或细胞内结构域中。示例抗体或抗体片段结合到可从细胞外环境接近的并 且改变蛋白质功能性的表位上。在某些实施方式中， 本发明包含识别 MG29， 和 / 或 MG29 受 体蛋白、 其变异体、 部分和 / 或其组合的一个或多个表位并对该表位具有特异性的抗体。在 替换实施方式中， 本发明抗体可以靶向和干扰 MG29/Glut4 相互作用。
     单 克 隆 抗 体 的 制 备 是 本 领 域 熟 知 的， 参 见， 例 如， Harlow 等 人， Antibodies ： A Laboratory Manual， page 726(Cold Spring Harbor Pub.1988)， USPNs ： Cabilly 的 6331415 ； Carter 的 6407213 和 6639055 ； 6562622 ； 6693176 ； 6881557 ； Morrison 的 5807715 ； Winter 的 5225539 ； Queen 的 5585089、 5693761、 6180370 和 7022500 ； Doyle 的 20070202105， 所有这些都通过引用合并在此。单克隆抗体可以通过以下操作获得 ： 给小鼠 或家兔注射包含抗原的组合物、 通过取出血清样品证实抗体的存在、 移出脾从而获得淋巴 细胞、 使该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而产生杂交瘤、 克隆杂交瘤、 选出对该抗原产生抗 体的阳性克隆， 和从杂交瘤培养物中分离出该抗体。可以通过本领域熟知的技术从杂交瘤 培养物中分离和纯化出单克隆抗体。
     在其它实施方式中， 该抗体可以通过重组生产， 例如， 通过噬菌体展示或通过组合 方法 (combinatorial methods) 生产。噬菌体展示和组合方法可以用于分离结合 MG29 多 肽或 MG29 结合蛋白或其片段的重组抗体 ( 如以下文献中所述的， 例如 Ladner 等人， 美国 专利 No.5,223,409 ； Fuchs 等人， (1991)Bio/Technology 9 ： 1370-1372 ； Hay 等人， (1992) Hum Antibod Hybridomas 3 ： 81-85 ； Huse 等人， (1989)Science 246 ： 1275-1281 ； Clackson 等人， (1991)Nature 352 ： 624-628 ； Gram 等人， (1992)PNAS 89 ： 3576-3580)。也可以利用 携载人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统 (mouse system) 的转基因小鼠制取人单克隆抗 体。利用这些用感兴趣抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞生产杂交瘤， 该杂交瘤分泌对来自 人蛋白的表位具有特异性亲和力的人 mAb( 参见， 例如， Wood 等人， 国际申请 WO91/00906 ； Lonberg， N. 等 人， 1994Nature 368 ： 856-859 ； Green， L.L. 等 人， 1994Nature Genet.7 ： 13-21 ； Morrison， S.L. 等人， 1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA81 ： 6851-6855)。 本发明复合物组分中治疗有用的抗体或者该复合物本身可以源自 “人源化” 或 “超人源化” 单克隆抗体。 通过将小鼠免疫球蛋白重和轻可变链的小鼠互补决定区 (CDR) 转染到人可变结构域中， 然 后将人残基 (residue) 替换到鼠类对应物的构架区中， 如此可以生产人源化单克隆抗体。
     使用源自人源化单克隆抗体的抗体组分消除了与鼠类恒定区免疫原性关联的 潜在问题。生产人源化单克隆抗体的技术可以在 Jones 等人， Nature 321 ： 522， 1986 ； 和 Singer 等 人， J.Immunol.150 ： 2844， 1993 ； Wu T.T.and Kabat， E.A.(1970)J.Exp.Med.， 132 ： ， 211-250 ； 和 Johnson G.， Wu， T.T.and Kabat， E.A.(1995)In Paul， S.(ed.)， Antibody Engineering Protocols.Humana Press， pp.1-15 中找到， 这些文献通过引用合并在此。该 抗体也可以源自从组合免疫球蛋白文库中分离的人抗体片段， 参见， 例如， Barbas 等人， Methods ： A Companion to Methods in Enzymology 2， 119， 1991。 另外， 通过将来自小鼠抗 体分子的具有适当抗原特异性的基因与来自人抗体分子的具有适当生物特异性的基因拼 接在一起， 获得嵌合抗体， 参见， 例如， Takeda 等人， Nature 314 ： 544-546， 1985。嵌合抗体 是这样的抗体， 其中不同的部分源自不同的动物物种。
     抗独特型技术 (anti-idiotype technology) 可以用于生产模拟表位的单克隆抗 体。针对第一单克隆抗体产生的抗独特型单克隆抗体在高变区中具有这样的结合结构域， 该结合结构域是被第一单克隆抗体结合的表位的 “映像 ( 镜像， image)” 。替换地， 可以利 用生产单链抗体的技术生产单链抗体。通过使 Fv 区的重链和轻链片段经由氨基酸桥连接 从而产生单链多肽而形成单链抗体。 可识别特异性表位如细胞外表位的抗体片段可以通过 本领域熟知的技术制取。此种片段包括由蛋白水解消化产生的 Fab 片段， 和通过还原二硫 桥产生的 Fab 片段。当用于免疫治疗时， 该单克隆抗体、 其片段或者二者可以没有标记或用 治疗剂标记。这些药剂可以通过本领域熟知的技术直接或间接偶联到单克隆抗体上， 并包 括这样的药剂， 如药物、 放射性同位素、 外源凝集素和毒素。
     给予单克隆抗体的剂量范围应大到足以产生期望的作用， 并随着年龄、 病症、 体 重、 性别、 年龄和待治疗病症的程度而变化， 可容易地由本领域技术人员确定。该剂量可以 为约 0.1mg/kg ～约 2000mg/kg。 该单克隆抗体可以静脉内、 腹膜内、 肌内， 和 / 或皮下给予。
     在本发明某些实施方式中， 抗原肽包括的至少一个表位是 MG29 多肽或 MG29 结合 蛋白区， 例如 Glut4， 其位于蛋白质表面上， 例如， 亲水性区域。蛋白质序列的疏水性分析将 指示多肽的哪个区特别亲水， 因而有可能编码对靶向抗体生产有用的表面残基。作为用于 靶向抗体生产的方式， 示出亲水性和疏水性区的亲水性图 (hydropathy plot) 可以通过本 领域熟知的任何方法制取， 包括， 例如， Kyte Doolittle 或 Hopp Woods 方法， 带有或不带有 傅里叶变换。参见， 例如， Hopp and Woods， 1981， Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78 ： 3824-3828 ； Kyte and Doolittle 1982， J.Mol.Biol.157 ： 105-142， 每篇文献都通过引用完整地合并在 此。本文也提供了对抗原蛋白， 或其衍生物、 片段、 类似物或同源物内的一个或多个结构域 具有特异性的抗体。在制取可免疫特异性地结合这些蛋白组分的抗体时， 可以利用本发明 蛋白质， 或其衍生物、 片段、 类似物、 同源物或直系同源物作为免疫原。
     人抗体
     全人抗体基本涉及这样的抗体分子， 其中包括 CDR 在内的轻链和重链的整个序列 都是由人基因产生。此种抗体在本文称为 “人抗体” 或 “全人抗体” 。人单克隆抗体可以通 过三源杂交瘤 (trioma) 技术、 人 B- 细胞杂交瘤技术 ( 参见， Kozbor， 等人， 1983ImmunolToday 4 ： 72) 和生产人单克隆抗体的 EBV 杂交瘤技术 ( 参见， Cole 等人， 1985， MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY， Alan R.Liss， Inc.， pp.77-96) 制备。人单克隆抗体可 以用于实施本发明， 并可以通过利用人杂交瘤生产 ( 参见， Cote 等人， 1983.Proc Natl Acad Sci USA 80 ： 2026-2030) 或通过用艾普斯登 - 巴尔病毒 (Epstein Barr Virus) 体外转化人 B- 细胞生产 ( 参见， Cole 等人， 1985， MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY， Alan R.Liss， Inc.， pp.77-96)。
     另外， 人抗体也可以利用另外的技术生产， 包括噬菌体展示文库 (Hoogenboom and Winter， J. Mol.Biol.227 ： 381(1991) ； Marks 等 人， J.Mol.Biol.， 222 ： 581(1991))。 类似地， 人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物， 例如， 内源性免疫球蛋 白基因已被部分或完全灭活的小鼠中制取。在攻击 ( 挑战， challenge) 后， 观察人抗体 的产生， 它在各个方面都非常类似于在人中观察到的， 包括基因重排 (rearrangement)、 组装 (assembly) 和抗体组库 (antibody repertoire)。这种途径描述在例如以下文献 中： 美 国 专 利 No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016 ； 以 及 Marks 等 人， (Bio/Technology， 10 ： 779-783(1992)) ； Lonberg 等 人， (Nature， 368 ： 856-859(1994)) ； Morrison(Nature， 368 ： 812-13(1994)) ； Fishwild 等 人， (Nature Biotechnology， 14 ： 845-51(1996)) ； Neuberger(Nature Biotechnology， 14 ： 826(1996)) ； 和 Lonberg and Huszar (Intern.Rev.Immunol.， 13 ： 65-93(1995))。
     人抗体另外可以利用转基因非人动物生产， 对该动物进行修饰以便反应于抗原攻 击而产生全人抗体而不是该动物的内源性抗体。使非人宿主中编码重和轻免疫球蛋白链 的内源性基因丧失能力 (incapacitated)， 并将编码人重和轻链免疫球蛋白的活性基因座 插入该宿主基因组中。例如， 利用包含需要的人 DNA 节段的酵母人工染色体， 掺入人基因。 然后， 通过使包含该修饰的不足完全的补体的中间转基因动物 (intermediate transgenic animals) 杂交， 获得提供所有期望修饰的动物子代。 此种非人动物的优选实施方式是小鼠， TM 称为 Xenomouse ， 如 PCT 公开 WO96/33735 和 WO96/34096 中公开的。
     本发明抗体的治疗有效量一般涉及达到治疗目的所需的量。如上所述， 这可以是 抗体与其靶抗原之间的结合相互作用， 该结合相互作用在某些情况下可干扰该靶的功能， 而在其它情况下， 可以促进生理反应。给予所需的量此外取决于抗体对其特异性抗原的结 合亲和力， 还将取决于给予的其他主体的自由体积 (free volume) 中所给予抗体的消耗速 率。本发明抗体或抗体片段治疗有效的给药剂量的常见范围 ( 作为非限制性实例 ) 可以为 约 0.1mg/kg 体重～约 500mg/kg 体重。常见的给药频率在， 例如从每日两次至一周一次的 范围内。
     特异性结合蛋白质的本发明抗体以及通过本文公开的筛选分析鉴定的其它分子， 可以以药物组合物形式给予用于治疗各种障碍。与制备此种组合物有关的原理和考虑因 素， 以及组分选择指导提供在例如下列文献中 ： Remington ： The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R.Gennaro， 等 人， editors)Mack Pub.Co.， Easton， Pa. ： 1995 ； Drug Absorption Enhancement ： Concepts， Possibilities， Limitations， And Trends， Harwood Academic Publishers， Langhome， Pa.， 1994 ； 和 Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences， Vol.4)， 1991， M.Dekker， 纽约。该 活性成分也可以包埋在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中， 例如， 羟基甲基纤维素或明胶 - 微胶囊和聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微胶囊， 在胶体药物递送系统 ( 例 如， 脂质体、 白蛋白微球、 微乳剂 (microemulsion)、 纳米颗粒和纳米胶囊 ) 中或在浓乳剂 (macroemulsion) 中。用于体内给予的制剂必须是无菌的。这容易通过无菌过滤膜过滤完 成。
     制剂
     在任何一个本文所述的实施方式中， 本发明提供的治疗剂可以与药学可接受载 体、 赋形剂， 和 / 或佐剂一起给予。在另外的实施方式中， 本发明提供了治疗组合物， 其包 含与至少一种另外的生物活性药剂和 / 或治疗药剂如氨基酸、 肽、 多肽、 化学化合物、 药物、 抗体等， 或其组合结合的本发明提供的组合物。例如， 在实施方式中， 该治疗组合物包含与 至少一种另外的生物活性药剂和 / 或治疗药剂如氨基酸、 肽、 多肽、 化学化合物、 药物、 抗体 等， 或其组合结合的 MG29 核酸和 / 或 MG29 多肽。本发明也提供了给予该治疗组合物用于 治疗或改善包括糖尿病在内的肌肉相关性病症的方法。
     可用在任何一个本文所述的实施方式中的生物有益成分的具体实例包括 ： 透明质 酸、 生长因子 ( 例如， VEGF、 TGF 家族 )、 治疗抗体 ( 例如， Humira)、 P 物质 (substance P)、 葡糖胺、 硫酸软骨素 (chondroitin sulphate)、 粘多糖、 疼痛控制剂 ( 例如吗啡 )、 滑液和 / 或它的组分、 类固醇和衍生物。 应当进一步理解， 包括在本发明中的组合是对它们的预期目 的有用的那些组合。下面给出的药剂仅为了说明目的， 而不是限制。作为本发明的一部分 的组合可以是本发明提供的组合物和至少一种另外的选自下面所列药剂的药剂。 如果该组 合使得所形成的组合物可以执行它的预期功能， 该组合也可以包括多于一种另外的药剂， 例如两种或三种另外的药剂。
     因而， 在另外的实施方式中， 本发明提供的组合物可以可选地进一步包含有效量 的至少一种化合物或蛋白质， 其选自以下药剂中的至少一种 ： 抗感染药物、 心血管 (CV) 系 统药物、 中枢神经系统 (CNS) 药物、 自主神经系统 (ANS) 药物、 呼吸道药物、 胃肠 (GI) 道药 物、 激素药物、 体液或电解质平衡药物、 血液药物 (hematologic drug)、 抗肿瘤药物、 免疫调 节药物、 眼耳鼻药物、 局部药物 (topical drug)、 营养药物等。这种药物， 包括本文提出的 每种药物的制剂、 适用症、 给药和给予， 是本领域熟知的 ( 参见例如 Nursing 2001Handbook of Drugs， 21.sup.st edition， Springhouse Corp.， Springhouse， Pa.， 2001 ； Health Professional′ s Drug Guide 2001， ed.， Shannon， Wilson， Stang， Prentice-Hall， Inc， Upper Saddle River， N.J. ； Pharmcotherapy Handbook， Wells 等人， ed.， Appleton&Lange， Stamford， Conn.， 每篇文献均通过引用完整地合并在此 )。
     抗感染药物可以是选自抗阿米巴药 (amebicides) 的至少一种或至少一种抗原虫 药、 抗蠕虫药 ( 驱肠虫剂， anthelmintics)、 抗真菌药、 抗疟疾药、 抗结核药或至少一种抗麻 风药、 氨基糖苷、 青霉素、 头孢菌素、 四环素、 磺胺、 氟喹诺酮、 抗病毒药、 大环内酯类抗感染 药和别类 ( 杂类， miscellaneous) 抗感染药。CV 药物可以是选自以下的至少一种 ： 正性 肌力药物 ( 促肌肉收缩剂， inotropics)、 抗心律失常药物、 抗心绞痛药物、 抗高血压药物、 抗血脂药物 (antilipemics) 和别类心血管药物。CNS 药物可以是选自非麻醉性镇痛药物 (normarcotic analgesics) 的至少一种或选自解热药物、 非甾体类抗炎药物、 麻醉性镇痛 药物的至少一种或至少一种阿片类镇痛药物、 镇静催眠药物、 抗惊厥药物、 抗抑郁药物、 抗 焦虑药物、 抗精神病药物、 中枢神经系统刺激药物、 抗帕金森病药物和别类中枢神经系统药物。ANS 药物可以是选自以下的至少一种 ： 胆碱能药物 ( 拟副交感神经药物 )、 抗胆碱能 药物、 肾腺素能药物 ( 拟交感神经药物 )、 肾上腺素能阻断剂 ( 交感神经抑制剂 )、 骨骼肌 松弛剂和神经肌肉阻断剂。呼吸道药物可以是选自以下的至少一种 ： 抗组胺药物、 支气管 扩张药物、 祛痰药物或至少一种镇咳药物及别类呼吸道药物。胃肠道药物可以是选自抗酸 药物的至少一种或至少一种吸附剂或至少一种排气药物、 消化酶或至少一种胆石溶解剂、 止泻药物、 轻泻药物、 止吐药物和抗溃疡药物。激素药物可以是选自皮质类固醇、 雄激素的 至少一种， 或至少一种合成代谢类甾醇、 雌激素或至少一种孕酮、 促性腺激素、 抗糖尿病药 物或至少一种胰高血糖素、 甲状腺激素、 甲状腺激素拮抗剂、 垂体激素和副甲状腺样药物 (parathyroid-like drug)。 液体和电解质平衡药物可以是选自利尿药物、 电解质的至少一 种， 或至少一种置换液 (replacement solution)、 酸化剂或至少一种碱化剂。血液药物可 以是选自补血剂、 抗凝血剂、 血液衍生物和溶栓酶的至少一种。 抗肿瘤药物可以是选自烷基 化药物、 抗代谢药物、 抗生素类抗肿瘤药物、 改变激素平衡的抗肿瘤药物和别类抗肿瘤药物 的至少一种。免疫调节药物可以是选自免疫抑制剂、 疫苗的至少一种， 或至少一种类毒素、 抗毒素或至少一种抗蛇毒素、 免疫血清和生物反应调节剂。眼耳鼻药物可以是选自眼用抗 感染药物、 眼用抗炎药物、 缩瞳剂、 散瞳剂、 眼用血管收缩剂、 别类眼耳鼻药物的至少一种。 局部药物可以是选自局部抗感染药物、 杀疥癣剂的至少一种， 或至少一种杀虱剂或局部皮 质类固醇。营养药可以是选自维生素、 矿物质或热质 (calorics) 的至少一种。参见例如， Nursing 2001Drug Handbook， ( 出处同上 ) 的内容。 所述至少一种抗阿米巴药或抗原虫药可以是选自以下的至少一种 ： 阿托伐醌、 盐 酸氯喹、 磷酸氯喹、 甲硝唑、 盐酸甲硝唑和依西酸喷他脒 (pentamidine isethionate)。所 述至少一种抗蠕虫药可以是选自以下的至少一种 ： 甲苯达唑、 双羟萘酸噻嘧啶和噻苯达唑。 所述至少一种抗真菌药物可以是选自以下的至少一种 ： 两性霉素 B、 两性霉素 B 硫酸胆甾醇 酯复合物、 两性霉素 B 脂质复合物、 两性霉素 B 脂质体、 氟康唑、 氟胞嘧啶、 微粉化灰黄霉素、 超微粉化灰黄霉素、 伊曲康唑、 酮康唑、 制霉菌素和盐酸特比萘芬。所述至少一种抗疟疾药 物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸氯喹、 磷酸氯喹、 多西环素、 硫酸羟氯喹、 盐酸甲氟喹、 磷酸伯氨喹、 乙胺嘧啶和乙胺嘧啶加磺胺多辛 (pyrimethamine with sulfadoxine)。所述 至少一种抗结核药物或抗麻风药物可以是选自以下的至少一种 ： 氯法齐明、 环丝氨酸、 氨苯 砜、 盐酸乙胺丁醇、 异烟肼、 吡嗪酰胺、 利福布汀、 利福平、 利福喷汀和硫酸链霉素。所述至 少一种氨基糖苷可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸阿米卡星、 硫酸庆大霉素、 硫酸新霉素、 硫酸链霉素和硫酸托普霉素。所述至少一种青霉素可以是选自以下的至少一种 ： 阿莫西林 / 克拉维酸钾、 三水阿莫西林、 氨苄青霉素、 氨苄青霉素钠、 三水氨苄青霉素、 氨苄青霉素钠 / 舒巴坦钠、 氯唑西林钠、 二氯唑西林钠、 美洛西林钠、 萘夫西林钠、 苯唑西林钠、 苄星青霉素 G、 青霉素 G 钾、 普鲁卡因青霉素 G、 青霉素 G 钠、 青霉素 V 钾、 哌拉西林钠、 哌拉西林钠 / 三唑 巴坦钠、 替卡西林二钠和替卡西林二钠 / 克拉维酸钾。
     所述至少一种头孢菌素可以是选自以下的至少一种 ： 头孢克洛、 头孢羟氨苄、 头孢 唑林钠、 头孢地尼、 盐酸头孢吡肟、 头孢克肟、 头孢美唑钠、 头孢尼西钠、 头孢哌酮钠、 头孢噻 肟钠、 头孢替坦二钠、 头孢西丁钠、 头孢泊肟普塞酯、 头孢丙烯、 头孢他啶、 头孢布烯、 头孢唑 肟钠、 头孢曲松钠、 头孢呋辛醋氧乙酯、 头孢呋辛钠、 盐酸头孢氨苄、 一水头孢氨苄、 头孢拉 定和氯碳头孢。所述至少一种四环素可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸地美环素、 多西环
     素钙、 海克多西环素、 盐酸多西环素、 一水多西环素、 盐酸米诺环素和盐酸四环素。 所述至少 一种磺胺可以是选自以下的至少一种 ： 复方新诺明、 磺胺嘧啶、 磺胺甲基噁唑、 硫代异噁唑 和乙酰硫代异噁唑。所述至少一种氟喹诺酮可以是选自以下的至少一种 ： 甲磺酸阿拉曲伐 沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 左氧氟沙星、 盐酸洛美沙星、 萘啶酸、 诺氟沙星、 氧氟沙星、 司帕 沙星和甲磺酸曲伐沙星。所述至少一种氟喹诺酮可以是选自以下的至少一种 ： 甲磺酸阿拉 曲伐沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 左氧氟沙星、 盐酸洛美沙星、 萘啶酸、 诺氟沙星、 氧氟沙星、 司帕沙星和甲磺酸曲伐沙星。所述至少一种抗病毒药物可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸 阿巴卡韦、 阿昔洛韦钠、 盐酸金刚烷胺、 氨普那韦、 西多福韦、 甲磺酸地位韦啶、 地达诺新、 依 法韦仑、 泛昔洛韦、 福米韦生钠、 膦甲酸钠、 更昔洛韦、 硫酸茚地那韦、 拉米夫定、 拉米夫定 / 齐多夫定、 甲磺酸奈非那韦、 奈韦拉平、 磷酸奥塞米韦、 利巴韦林、 盐酸金刚乙胺、 利托那韦、 沙奎那韦、 甲磺酸沙奎那韦、 司他夫定、 盐酸伐昔洛韦、 扎西他滨、 扎那米韦和齐多夫定。所 述至少一种大环内酯抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿奇霉素、 克拉霉素、 地红霉 素、 红霉素碱、 依托红霉素、 琥乙红霉素、 乳糖酸红霉素和硬脂酸红霉素。 所述至少一种别类 抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 氨曲南、 杆菌肽、 氯霉素琥珀酸钠、 盐酸克林霉素、 盐酸克林霉素棕榈酸酯、 磷酸克林霉素、 亚胺培南和西司他丁钠、 美罗培南、 粗晶呋喃妥因、 微晶呋喃妥因、 奎奴普丁 / 达福普汀、 盐酸壮观霉素、 甲氧苄氨嘧啶和盐酸万古霉素。 ( 参见 例如 Nursing 2001Drug Handbook 的第 24-214 页。)
     所述至少一种正性肌力药物可以是选自以下的至少一种 ： 乳酸氨利酮、 地高辛和 乳酸米利酮。所述至少一种抗心律失常药物可以是选自以下的至少一种 ： 腺苷、 盐酸胺碘 酮、 硫酸阿托品、 甲苯磺酸溴苄胺、 盐酸地尔硫卓、 丙吡胺、 磷酸双异丙吡胺、 盐酸艾司洛尔、 醋酸氟卡尼、 富马酸伊布利特、 盐酸利多卡因、 盐酸美西律、 盐酸莫里西嗪、 苯妥英、 苯妥英 钠、 盐酸普鲁卡因胺、 盐酸普罗帕酮、 盐酸普萘洛尔、 重硫酸奎尼丁、 葡糖酸奎尼丁、 聚半乳 糖醛酸奎尼丁、 硫酸奎尼丁、 索他洛尔、 盐酸妥卡胺和盐酸维拉帕米。所述至少一种抗心绞 痛药物可以是选自以下的至少一种 ： 苯磺酸阿罗地平、 亚硝酸戊酯、 盐酸苄普地尔、 盐酸地 尔硫卓、 二硝酸异山梨酯、 单硝酸异山梨酯、 纳多洛尔、 盐酸尼卡地平、 硝苯地平、 硝酸甘油、 盐酸普萘洛尔、 维拉帕米和盐酸维拉帕米。所述至少一种抗高血压药物可以是选自以下的 至少一种 ： 盐酸醋丁洛尔、 苯磺酸氨氯地平、 阿替洛尔、 盐酸贝那普利、 盐酸倍他洛尔、 富马 酸比索洛尔、 坎地沙坦西来替昔酯、 卡托普利、 盐酸卡替洛尔、 卡维地洛、 可乐定、 盐酸可乐 定、 二氮嗪、 盐酸地尔硫卓、 甲磺酸多沙唑嗪、 依那普利拉、 马来酸依那普利、 甲磺酸依普罗 沙坦、 非洛地平、 甲磺酸非诺多泮、 福辛普利钠、 乙酸氯压胍、 硫酸胍那决尔、 盐酸胍法辛、 盐 酸肼苯哒嗪、 依贝沙坦、 依拉地平、 盐酸拉贝洛尔、 赖诺普利、 氯沙坦钾、 甲基多巴、 盐酸甲基 多巴乙酯、 琥珀酸美托洛尔、 酒石酸美托洛尔、 米诺地尔、 盐酸莫西普利、 纳多洛尔、 盐酸尼 卡地平、 硝苯地平、 尼索地平、 硝普钠、 硫酸喷布洛尔、 哌道普利特丁胺、 甲磺酸酚妥拉明、 吲 哚洛尔、 盐酸哌唑嗪、 盐酸普萘洛尔、 盐酸喹那普利、 雷米普利、 替米沙坦、 盐酸特拉唑嗪、 马 来酸噻吗心安、 群多普利、 缬沙坦和盐酸维拉帕米。 所述至少一种抗血脂药物可以是选自以 下的至少一种 ： 阿托伐他汀钙、 西立伐他汀钠、 考来烯胺、 盐酸降脂宁、 非诺贝特 ( 微粉化 )、 氟伐他汀钠、 吉非贝齐、 洛伐他汀、 烟酸、 普伐他汀钠和辛伐他汀。 所述至少一种别类心血管 药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿昔单抗、 前列地尔、 盐酸阿布他明、 西洛他唑、 硫酸氢氯 吡格雷、 双嘧达莫、 依替巴肽、 盐酸米多君、 己酮可可碱、 盐酸噻氯匹定和盐酸替罗非班。 (参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的 215-336 页 )。
     所述至少一种非麻醉性镇痛药物或解热药物可以是选自以下的至少一种 ： 对乙 酰氨基酚、 阿司匹林、 三水杨酸胆碱镁、 二氟尼柳和水杨酸镁。所述至少一种非甾体类抗炎 药物可以是选自以下的至少一种 ： 塞来考昔、 双氯芬酸钾、 双氯芬酸钠、 依托度酸、 非诺洛 芬钙、 氟比洛芬、 布洛芬、 吲哚美辛、 三水吲哚美辛钠、 酮洛芬、 酮咯酸氨丁三醇、 萘丁美酮、 萘普生、 萘普生钠、 噁丙嗪、 吡罗昔康、 罗非考昔和舒林酸。所述至少一种麻醉性或阿片类 镇痛药物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸阿芬他尼、 盐酸叔丁啡、 酒石酸布托非诺、 磷酸 可待因、 硫酸可待因、 柠檬酸芬太尼、 芬太尼透皮系统、 芬太尼透粘膜剂、 盐酸氢吗啡酮、 盐 酸哌替啶、 盐酸美沙酮、 盐酸吗啡、 硫酸吗啡、 酒石酸吗啡、 盐酸纳布啡、 盐酸氧可酮、 果胶酸 氧可酮 (oxycodone pectinate)、 盐酸氧吗啡酮、 盐酸喷他佐辛、 盐酸喷他佐辛和盐酸纳洛 酮、 乳酸喷他佐辛、 盐酸丙氧芬、 萘磺酸丙氧芬、 盐酸雷米芬太尼、 柠檬酸舒芬太尼和盐酸曲 马多。所述至少一种镇静催眠药物可以是选自以下的至少一种 ： 水合氯醛、 艾司唑仑、 盐 酸氟西泮、 戊巴比妥、 戊巴比妥钠、 苯巴比妥钠、 司可巴比妥钠、 替马西泮、 三唑仑、 扎来普 隆和酒石酸扎来普隆。所述至少一种抗惊厥药物可以是选自以下的至少一种 ： 乙酰唑胺 钠、 卡马西平、 氯硝西泮、 氯氮卓二钾、 地西泮、 地伐雷司钠 (divalproex sodium)、 乙琥胺 (ethosuximde)、 磷苯妥英钠、 加巴喷丁、 拉莫三嗪、 硫酸镁、 苯巴比妥、 苯巴比妥钠、 苯妥英、 苯妥英钠、 苯妥英钠 ( 延伸型 )、 扑米酮、 硫加宾盐酸盐、 托吡酯、 丙戊酸钠和丙戊酸。所述 至少一种抗抑郁药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿米替林盐酸盐、 扑酸阿米替林、 阿莫沙 平、 盐酸安非他酮、 氢溴酸西酞普兰、 盐酸氯米帕明、 盐酸地昔帕明、 盐酸多塞平、 盐酸氟西 汀、 盐酸米帕明、 扑酸米帕明、 米尔塔扎平、 盐酸奈法唑酮、 盐酸去甲替林、 盐酸帕罗西汀、 硫 酸苯乙肼、 盐酸舍曲林、 硫酸反苯环丙胺、 马来酸曲米帕明和盐酸文拉法辛。所述至少一种 抗焦虑药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿普唑仑、 盐酸丁螺环酮、 利眠宁、 盐酸利眠宁、 氯氮卓二钾、 地西泮、 盐酸多塞平、 双羟萘酸羟嗪、 盐酸羟嗪、 扑酸羟嗪、 劳拉西泮、 甲丙氨酯 (mephrobamate)、 盐酸咪达唑仑和奥沙西泮。所述至少一种抗精神病药物可以是选自以下 的至少一种 ： 盐酸氯丙嗪、 氯氮平、 癸酸氟奋乃静、 庚酸氟奋乃静、 盐酸氟奋乃静、 氟哌啶醇、 癸酸氟哌啶醇、 乳酸氟哌啶醇、 盐酸洛沙平、 琥珀酸洛沙平、 苯磺酸美索达嗪、 盐酸吗茚酮、 奥氮平、 奋乃静、 匹莫齐特、 丙氯拉嗪、 富马酸喹硫平、 利哌利酮、 盐酸硫利达嗪、 替沃噻吨、 盐酸替沃噻吨和盐酸三氟拉嗪。 所述至少一种中枢神经系统刺激剂可以是选自以下的至少 一种 ： 硫酸苯丙胺、 咖啡因、 硫酸右苯丙胺、 盐酸多沙普仑、 盐酸甲基苯丙胺、 盐酸哌甲酯、 莫 达非尼、 匹莫林和盐酸芬特明。 所述至少一种抗帕金森病药物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸金刚烷胺、 甲磺酸苯托品、 盐酸比哌立登、 乳酸比哌立登、 甲磺酸溴隐亭、 卡比多巴 - 左 旋多巴、 恩他卡朋、 左旋多巴、 甲磺酸培高利特、 二盐酸普拉克索、 盐酸罗平尼咯、 盐酸司立 吉林、 托卡朋和盐酸苯海索。所述至少一种别类中枢神经系统药物可以是选自以下的至少 一种 ： 盐酸安非他酮、 盐酸多奈哌齐、 氟哌利多、 马来酸氟伏沙明、 碳酸锂、 柠檬酸锂、 盐酸那 拉曲坦、 尼古丁离子交换树脂、 尼古丁透皮系统、 丙泊酚、 苯甲酸利扎曲坦、 盐酸西布曲明一 水合物、 琥珀酸舒马曲坦、 盐酸他克林和佐米曲坦。 ( 参见例如 Nursing 2001DrugHand book 的第 337-530 页 )。
     所述至少一种胆碱能药物 ( 例如拟副交感神经药物 ) 可以是选自以下的至少一 种： 氯化氨甲酰甲胆碱、 依酚氯铵、 溴化新斯的明、 甲基硫酸新斯的明、 水杨酸毒扁豆碱和溴化吡啶新斯的明。所述至少一种抗胆碱能药物可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸阿托品、 盐酸双环胺、 吡咯糖 (glycopyrrolate)、 莨菪碱、 硫酸莨菪碱、 溴化普鲁本辛、 东莨菪碱、 丁 溴东莨菪碱和氢溴酸东莨菪碱。所述至少一种肾腺素能药物 ( 拟交感神经药物 ) 可以是选 自以下的至少一种 ： 盐酸多巴酚丁胺、 盐酸多巴胺、 重酒石酸间羟胺、 重酒石酸去甲肾上腺 素、 盐酸苯福林、 盐酸假麻黄碱， 和硫酸假麻黄碱。所述至少一种肾腺素能阻断剂 ( 交感神 经抑制剂 ) 可以是选自以下的至少一种 ： 甲磺酸二氢麦角胺、 酒石酸麦角胺、 马来酸美西麦 角和盐酸普萘洛尔。所述至少一种骨骼肌松弛剂可以是选自以下的至少一种 ： 巴氯芬、 卡 利普多、 氯唑沙宗、 盐酸环苯扎林、 单曲林钠、 美索巴莫和盐酸替扎尼定。 所述至少一种神经 肌肉阻断剂可以是选自以下的至少一种 ： 苯磺酸阿曲库铵、 苯磺酸顺阿曲库铵、 氯化杜什库 胺、 氯化米伐克龙、 泮库溴铵、 哌库溴铵、 雷帕库溴铵、 罗库溴铵、 氯化丁二酰胆碱、 氯化筒箭 毒碱和维库溴铵。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的第 531-84 页 )。
     所述至少一种抗组胺药物可以是选自以下的至少一种 ： 马来酸溴苯那敏、 盐酸西 替立嗪、 马来酸氯苯那敏、 富马酸氯马斯汀、 盐酸赛庚啶、 盐酸苯海拉明、 盐酸非索非那定、 氯雷他定、 盐酸异丙嗪、 茶氯酸异丙嗪和盐酸曲普利啶。 所述至少一种支气管扩张药物可以 是选自以下的至少一种 ： 沙丁胺醇、 硫酸沙丁胺醇、 氨茶碱、 硫酸阿托品、 硫酸麻黄碱、 肾上 腺素、 重酒石酸肾上腺素、 盐酸肾上腺素、 异丙托溴铵、 异丙肾上腺素、 盐酸异丙肾上腺素、 硫酸异丙肾上腺素、 盐酸左旋沙丁胺醇、 硫酸奥西那林、 胆茶碱 (oxtriphylline)、 乙酸吡布 特罗、 昔萘酸沙美特罗、 硫酸特布他林和茶碱。 所述至少一种祛痰药物或镇咳药物可以是选 自以下的至少一种 ： 苯佐那酯、 磷酸可待因、 硫酸可待因、 氢溴酸右美沙芬、 盐酸苯海拉明、 愈创甘油醚和盐酸氢吗啡酮。所述至少一种别类呼吸道药物可以是选自以下的至少一种 ： 乙酰半胱氨酸、 二丙酸倍氯米松、 贝拉康坦、 布地奈德、 小牛表面蛋白 (calfactant)、 色苷酸 钠、 阿法链道酶、 依前列醇钠、 氟尼缩松、 丙酸氟替卡松、 孟鲁斯特钠、 奈多罗米钠、 帕利珠单 抗、 曲安奈德、 扎鲁司特和弃白通。( 参 JI 例如 Nursing2001DrugHandbook 的第 585-642 页 )。
     所述至少一种抗酸药物、 吸附剂或排气药物可以是选自以下的至少一种 ： 碳酸铝、 氢氧化铝、 碳酸钙、 镁加铝、 氢氧化镁、 氧化镁、 西甲硅油和碳酸氢钠。所述至少一种消化酶 或胆石溶解剂可以是选自以下的至少一种 ： 胰酶、 胰脂肪酶和熊去氧胆酸 (ursodiol)。所 述至少一种止泻药物可以是选自以下的至少一种 ： 硅镁土、 碱式水杨酸铋、 聚卡波非钙、 盐 酸地芬诺酯和硫酸阿托品、 洛哌丁胺、 乙酸奥曲肽、 阿片酊和阿片酊 ( 含樟脑 )。所述至少 一种轻泻药物可以是选自以下的至少一种 ： 铋索多尔 (bisocodyl)、 聚卡波非钙、 药鼠李皮 (cascara sagrada)、 药鼠李皮芳香流浸膏、 药鼠李皮流浸膏、 蓖麻油、 多库酯钙、 多库酯钠、 甘油、 乳酮糖、 柠檬酸镁、 氢氧化镁、 硫酸镁、 甲基纤维素、 矿物油、 聚乙二醇或电解质溶液、 欧车前、 番泻叶和磷酸钠。所述至少一种止吐药物可以是选自以下的至少一种 ： 盐酸氯丙 嗪、 茶苯海明、 甲磺酸多拉司琼、 屈大麻酚、 盐酸格拉司琼、 盐酸麦克洛嗪、 盐酸加氧氯普胺、 盐酸昂丹司琼、 奋乃静、 丙氯拉嗪、 乙二磺酸普鲁氯嗪、 马来酸丙氯拉嗪、 盐酸异丙嗪、 东莨 菪碱、 马来酸硫乙拉嗪和盐酸曲美苄胺。所述至少一种抗溃疡药物可以是选自以下的至少 一种 ： 西咪替丁、 盐酸西咪替丁、 法莫替丁、 兰索拉唑、 米索前列醇、 尼扎替丁、 奥美拉唑、 雷 贝普拉唑钠、 雷尼替丁柠檬酸铋、 盐酸雷尼替丁和硫糖铝。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 第 643-95 页 )。所述至少一种皮质类固醇可以是选自以下的至少一种 ： 倍他米松、 乙酸倍他米松 或倍他米松磷酸钠、 倍他米松磷酸钠、 乙酸可的松、 地塞米松、 乙酸地塞米松、 地塞米松磷酸 钠、 乙酸氟氢可的松、 氢化可的松、 乙酸氢化可的松、 环戊丙酸氢化可的松、 氢化可的松磷酸 钠、 氢化可的松琥珀酸钠、 甲基泼尼松龙、 乙酸甲基泼尼松龙、 甲泼尼龙琥珀酸钠、 泼尼松 龙、 乙酸泼尼松龙、 氢化泼尼松磷酸钠、 叔丁乙酸氢化泼尼松、 泼尼松、 曲安西龙、 曲安奈德 和二乙酸曲安西龙。所述至少一种雄激素或合成代谢类甾醇可以是选自以下的至少一种 ： 达那唑、 氟甲睾酮、 甲基睾酮、 癸酸诺龙、 苯丙酸诺龙、 睾酮、 环戊丙酸睾酮、 庚酸睾酮、 丙酸 睾酮和睾酮透皮系统。所述至少一种雌激素或孕酮可以是选自以下的至少一种 ： 酯化雌激 素、 雌二醇、 环戊丙酸雌二醇、 雌二醇 / 乙酸炔诺酮透皮系统、 戊酸雌二醇、 雌激素 ( 结合 )、 哌嗪雌酮硫酯、 炔雌醇、 炔雌醇和去氧孕烯、 炔雌醇和二乙酸炔诺醇、 炔雌醇和去氧孕烯、 炔 雌醇和二乙酸炔诺醇、 炔雌醇和左炔诺孕酮、 炔雌醇和炔诺酮、 炔雌醇和乙酸炔诺酮、 炔雌 醇和炔诺肟酯、 炔雌醇和炔诺孕酮、 炔雌醇和炔诺酮和乙酸盐和富马酸亚铁、 左炔诺孕酮、 醋酸甲羟孕酮、 美雌醇和炔诺酮、 炔诺酮、 乙酸炔诺酮、 炔诺孕酮和孕酮。 所述至少一种促性 腺激素可以是选自以下的至少一种 ： 乙酸加尼瑞克、 乙酸促性腺激素释放素、 乙酸组氨瑞林 和促生育素。所述至少一种抗糖尿病药物或胰高血糖素可以是选自以下的至少一种 ： 阿卡 波糖、 氯磺丙脲、 格列美脲、 格列吡嗪、 胰高血糖素、 格列本脲、 胰岛素、 盐酸二甲双胍、 米格 列醇、 盐酸吡格列酮、 瑞格列奈、 马来酸罗西格列酮和曲格列酮。所述至少一种甲状腺激素 可以是选自以下的至少一种 ： 左旋甲状腺素钠、 碘塞罗宁钠、 复方甲状腺素和甲状腺剂。所 述至少一种甲状腺激素拮抗剂可以是选自以下的至少一种 ： 甲硫咪唑、 碘化钾、 碘化钾 ( 饱 和溶液 )、 丙硫氧嘧啶、 放射性碘 ( 碘化钠 131I) 和强碘溶液。所述至少一种垂体激素可以 是选自以下的至少一种 ： 促肾皮素、 促皮质素、 乙酸去氨加压素 (desmophressinacetate)、 乙酸亮丙立德、 储库型促肾皮素、 索吗托诺、 生长激素和血管加压素。所述至少一种副甲 状腺样药物可以是选自以下的至少一种 ： 骨化二醇 (calcifediol)、 降钙素 ( 人 )、 降钙 素 ( 鲑鱼 )、 钙三醇、 双氢速甾醇和依替膦酸二钠 (etidronate disodium)。( 参见例如 Nursing2001Drug Handbook 的第 696-796 页 )。
     所述至少一种利尿药物可以是选自以下的至少一种 ： 乙酰唑胺、 乙酰唑胺钠、 盐酸 阿米洛利、 布美他尼、 氯噻酮、 利尿酸钠、 依地尼酸、 呋塞米、 氢氯噻嗪、 吲哒帕胺、 甘露糖醇、 美扎拉宗、 螺内酯、 托赛米、 氨苯蝶吟和尿素。所述至少一种电解质或置换液可以是选自以 下的至少一种 ： 乙酸钙、 碳酸钙、 氯化钙、 柠檬酸钙、 葡乳醛酸钙、 葡庚糖酸钙、 葡糖酸钙、 乳 酸钙、 磷酸钙 ( 二元 )、 磷酸钙 ( 三元 )、 葡聚糖 ( 高分子量 )、 葡聚糖 ( 低分子量 )、 羟乙基 淀粉、 氯化镁、 硫酸镁、 乙酸钾、 碳酸氢钾、 氯化钾、 葡糖酸钾、 林格氏注射液、 林格氏注射液 ( 乳酸化 ) 和氯化钠。所述至少一种酸化剂或碱化剂可以是选自以下的至少一种 ： 碳酸氢 钠、 乳酸钠和氨丁三醇。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的 797-833 页 )。
     所述至少一种补血剂可以是选自以下的至少一种 ： 富马酸亚铁、 葡糖酸亚铁、 硫酸 亚铁、 硫酸亚铁 ( 干燥 )、 葡聚糖铁、 山梨醇铁、 多糖 - 铁复合物和复合葡萄糖酸钠铁。所述 至少一种抗凝血剂可以是选自以下的至少一种 ： 阿地肝素钠、 达特肝素钠、 达那肝素钠、 依 诺肝素钠、 肝素钙、 肝素钠和华法林钠。 所述至少一种血液衍生物可以是选自以下的至少一 种： 白蛋白 5％、 白蛋白 25％、 抗血友病因子、 抗抑制剂凝结剂复合物、 抗凝血酶 III( 人 )、 因子 IX( 人 )、 因子 IX 复合物和血浆蛋白成分。所述至少一种溶栓酶可以是选自以下的至少一种 ： 阿替普酶、 复合纤溶酶链激酶、 瑞替普酶 ( 重組 )、 链激酶和尿激酶。( 参见例如 Nursing 2001Drug Handbook 的第 83-66 页 )。
     所述至少一种烷基化药物可以是选自以下的至少一种 ： 白消安、 卡铂、 卡莫司汀、 苯丁酸氮芥、 顺铂、 环磷酰胺、 异环磷酰胺、 洛莫司汀、 盐酸氮芥、 美法仑、 盐酸美法仑、 链佐 星、 替莫唑胺和塞替派。所述至少一种抗代谢药物可以是选自以下的至少一种 ： 卡培他滨、 克拉屈滨、 阿糖胞苷、 氟尿苷、 磷酸氟达拉滨、 氟尿嘧啶、 羟基脲、 巯嘌呤、 甲氨喋呤、 甲氨喋 呤钠和硫鸟嘌呤。所述至少一种抗生素类抗肿瘤药物可以是选自以下的至少一种 ： 硫酸博 来霉素、 放线菌素、 柠檬酸柔红霉素脂质体、 盐酸柔红霉素、 盐酸多柔比星、 盐酸多柔比星脂 质体、 盐酸表柔比星、 盐酸伊达比星、 丝裂霉素、 喷司他丁、 普卡霉素和戊柔比星。所述至少 一种改变激素平衡的抗肿瘤药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿那曲唑、 比卡鲁胺、 雌莫司 汀磷酸钠、 依西美坦、 氟他胺、 醋酸戈舍瑞林、 来曲唑、 乙酸亮丙立德、 醋酸甲地孕酮、 尼鲁米 特、 柠檬酸他莫昔芬、 睾内酯和柠檬酸托瑞米芬。所述至少一种别类抗肿瘤药物可以是选 自以下的至少一种 ： 天冬酰胺酶、 卡介苗 (bacillus Calmette-Guerin)(BCG)( 活的膀胱内 的 (liveintravesical))、 达卡巴嗪、 多西他赛、 依托泊苷、 磷酸依托泊苷、 盐酸吉西他滨、 盐 酸伊立替康、 米托坦、 盐酸米托蒽醌、 紫杉醇、 培门冬酶、 卟吩姆钠、 盐酸丙卡巴肼、 利妥昔单 抗、 替尼泊苷、 盐酸托泊替康、 曲妥单抗、 维甲酸、 硫酸长春碱、 硫酸长春新碱和酒石酸长春 瑞滨。( 参见例如 Nursing 2001DrugHandbook 的第 867-963 页 )。 所述至少一种免疫抑制剂可以是选自以下的至少一种 ： 硫 唑 嘌 呤、 巴利昔 单抗、 环胞菌素、 达克珠单抗、 淋巴细胞免疫球蛋白、 莫罗单抗 -CD3、 麦考酚酸吗乙酯 (mycophenolate mofetil)、 盐酸麦考酚酸吗乙酯、 西罗莫司和他克莫司。所述至少一种 疫苗或类毒素可以是选自以下的至少一种 ： BCG 疫苗、 霍乱疫苗、 白喉和破伤风类毒素 ( 吸 附 )、 白喉和破伤风类毒素和非细胞型百日咳疫苗吸附的白喉和破伤风类毒素以及全细胞 百日咳疫苗、 B 型嗜血杆菌结合疫苗、 甲肝疫苗 ( 失活 )、 乙肝疫苗 ( 重组 )、 流感病毒疫苗 1999-2000 三价型 A&B( 纯化的表面抗原 )、 流感病毒疫苗 1999-2000 三价型 A&B( 亚病毒粒 子或纯化的亚病毒粒子 )、 流感病毒疫苗 1999-2000 三价型 A&B( 全病毒粒子 )、 日本脑炎病 毒疫苗 ( 失活 )、 莱姆病疫苗 ( 重组 OspA)、 麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗 ( 活 )、 麻疹和腮 腺炎和风疹病毒疫苗 ( 活、 减毒 )、 麻疹病毒疫苗 ( 活、 减毒 )、 脑膜炎球菌多糖疫苗、 腮腺 炎病毒疫苗 ( 活 )、 鼠疫疫苗、 肺炎球菌疫苗 ( 多价 )、 脊髓灰质炎病毒疫苗 ( 失活 )、 脊髓 灰质炎病毒疫苗 ( 活、 口服、 三价 )、 狂犬病疫苗 ( 吸附的 )、 狂犬病疫苗 ( 人二倍体细胞 )、 狂犬病和腮腺炎病毒疫苗 ( 活 )、 狂犬病疫苗 ( 活、 减毒 )、 破伤风类毒素 ( 吸附的 )、 破伤 风类毒素 ( 流体 )、 伤寒疫苗 ( 口服 )、 伤寒疫苗 ( 肠道外 )、 伤寒 Vi 多糖疫苗、 水痘病毒疫 苗和黄热病疫苗。所述至少一种抗毒素或抗蛇毒素可以是选自以下的至少一种 ： 黑寡妇蜘 蛛抗蛇毒素、 响尾蛇科抗蛇毒素 ( 多价 )、 白喉抗毒素 ( 马 ) 和抗珊斑眼镜蛇毒抗蛇毒素 (Micrurus fulvius antivenin)。所述至少一种免疫血清可以是选自以下的至少一种 ： 巨 细胞病毒免疫球蛋白 ( 静脉内 )、 乙型肝炎免疫球蛋白 ( 人 )、 免疫球蛋白肌内、 免疫球蛋白 静脉内、 狂犬病免疫球蛋白 ( 人 )、 呼吸道合胞病毒免疫球蛋白静脉内 ( 人 )、 Rh0(D) 免疫 球蛋白 ( 人 )、 Rh0(D) 免疫球蛋白静脉内 ( 人 )、 破伤风免疫球蛋白 ( 人 ) 和水痘 - 带状疱 疹免疫球蛋白。 所述至少一种生物反应调节剂可以是选自以下的至少一种 ： 阿地白介素、 α 红细胞生成素、 非格司亭、 注射用醋酸格拉替雷、 复合干扰素 (alfacon-1interferon)、 干扰
     素 α-2a( 重组 )、 干扰素 α-2b( 重组 )、 干扰素 β-1a、 干扰素 β-1b( 重组 )、 干扰素 γ-1b、 盐酸左旋咪唑、 奥普瑞白介素和沙格司亭。( 参见例如参见例如 Nursing2001DrugHandbook 的第 964-1040 页 )。
     所述至少一种眼用抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 杆菌肽素、 氯霉素、 盐 酸环丙沙星、 红霉素、 硫酸庆大霉素、 氧氟沙星 0.3 ％、 硫酸多粘菌素 B、 磺胺醋酰钠 10 ％、 磺胺醋酰钠 15％、 磺胺醋酰钠 30％、 托普霉素和阿糖腺苷。所述至少一种眼用抗炎药物可 以是选自以下的至少一种 ： 地塞米松、 地塞米松磷酸钠、 双氯芬酸钠 0.1％、 氟米龙、 氟比洛 芬钠、 酮咯酸氨丁三醇、 乙酸泼尼松龙 ( 混悬剂 ) 和泼尼松龙磷酸钠 ( 溶液剂 )。所述至少 一种缩瞳剂可以是选自以下的至少一种 ： 氯化乙酰胆碱、 卡巴胆碱 ( 眼内 )、 卡巴胆碱 ( 局 部 )、 碘磷灵、 匹鲁卡品、 盐酸匹鲁卡品和硝酸匹鲁卡品。所述至少一种散瞳剂可以是选自 以下的至少一种 ： 硫酸阿托品、 盐酸环喷托酯、 盐酸肾上腺素、 环硼肾上腺素、 氢溴酸后马托 品、 盐酸苯福林、 氢溴酸东莨菪碱和托品酰胺。 所述至少一种眼用血管收缩剂可以是选自以 下的至少一种 ： 盐酸萘唑啉、 盐酸羟甲唑啉和盐酸四氢唑啉。 所述至少一种别类眼用药物可 以是选自以下的至少一种 ： 盐酸阿拉可乐定、 盐酸倍他洛尔、 酒石酸溴莫尼定、 盐酸卡替洛 尔、 盐酸地匹福林、 盐酸多佐胺、 二富马酸依美斯汀、 荧光素钠、 富马酸酮替芬、 拉坦前列素、 盐酸左布诺洛尔、 盐酸美替洛尔、 氯化钠 ( 高渗 ) 和马来酸噻吗洛尔。所述至少一种耳用药 物可以是选自以下的至少一种 ： 硼酸、 过氧化脲、 氯霉素和三乙醇胺多肽油酸盐 - 浓缩物。 所述至少一种鼻用药物可以是选自以下的至少一种 ： 二丙酸倍氯米松、 布地奈德、 硫酸麻黄 碱、 盐酸肾上腺素、 氟尼缩松、 丙酸氟替卡松、 盐酸萘唑啉、 盐酸羟甲唑啉、 盐酸苯福林、 盐酸 四氢唑啉、 曲安奈德和盐酸赛洛唑啉。 ( 参见， 例如 Nursing 2001Drug Handbook 第 1041-97 页 )。
     所述至少一种局部抗感染药物可以是选自以下的至少一种 ： 阿昔洛韦、 两性霉素 B、 壬二酸乳膏、 杆菌肽素、 硝酸布康唑、 磷酸克林霉素、 克霉唑、 硝酸益康唑、 红霉素、 硫酸庆 大霉素、 酮康唑、 乙酸磺胺米隆、 甲硝唑 ( 局部 )、 硝酸咪康唑、 莫匹罗星、 盐酸萘替芳、 硫酸 新霉素、 呋喃西林、 制霉菌素、 银磺胺嘧啶、 盐酸特比奈芬、 特康唑、 盐酸四环素、 噻康唑和托 萘酯。所述至少一种杀疥癖剂或杀虱剂可以是选自以下的至少一种 ： 克罗米通、 林丹、 扑灭 司林和除虫菊酯。所述至少一种局部皮质类固醇可以是选自以下的至少一种 ： 二丙酸倍他 米松、 戊酸倍他米松、 丙酸氯倍他索、 地奈德、 去羟米松、 地塞米松、 地塞米松磷酸钠、 二乙酸 二氟拉松、 醋酸氟氢松 (fluocinolone acetonide)、 氟氢松醋酸酯、 氟氢缩松、 丙酸氟替卡 松、 哈西缩松 (halcionide)、 氢化可的松、 乙酸氢化可的松、 丁酸氢化可的松、 戊酸氢化可的 松、 糠酸莫米松和曲安奈德。( 参见例如 Nursing 2001DrugHandbook 的第 1098-1136 页 )。
     所述至少一种维生素或矿物质可以是选自以下的至少一种 ： 维生素 A、 维生素 B 复合物、 氰钴胺、 叶酸、 羟钴胺、 亚叶酸钙、 烟酸、 烟酰胺、 盐酸吡多辛、 核黄素、 盐酸硫胺素、 维生素 C、 维生素 D、 胆骨化醇 (cholecalciferol)、 麦角骨化醇 (ergocalciferol)、 维生素 D 类似物、 度骨化醇、 帕立骨化醇、 维生素 E、 维生素 K 类似物、 植物甲萘醌、 氟化钠、 氟化钠 ( 局部 )、 痕量元素、 铬、 铜、 碘、 锰、 硒和锌。所述至少一种热质可以是选自以下的至少一种 ： 氨基酸输液剂 ( 晶体 )、 氨基酸葡萄糖溶液输液剂、 含电解质氨基酸输液剂、 含电解质氨基 酸葡萄糖溶液输液剂、 肝衰竭用氨基酸输液剂、 高代谢应激用氨基酸输液剂、 肾衰竭用氨基 酸输液剂、 葡聚糖、 脂肪乳剂， 和中链三甘油酯。( 参见例如 Nursing2001DrugHandbook 第1137-63 页 )。
     本发明提供的组合物可以进一步包含至少一种任何合适和有效量的组合物或药 物组合物， 所述组合物或药物组合物包含下面药剂中的至少一种 ： 与需要此种调节、 治疗 或疗法的细胞、 组织、 器官、 动物或患者接触或者给予至该细胞、 组织、 器官、 动物或患者的 抗 -IL-12 抗体， TNF 拮抗剂 ( 例如但不限于 TNF 化学或蛋白质拮抗剂、 TNF 单克隆或多克 隆抗体或片段、 可溶性 TNF 受体 ( 例如 p55、 p70 或 p85) 或片段、 其融合多肽， 或者小分子 TNF 拮抗剂， 例如 TNF 结合蛋白 I 或 II(TBP-1 或 TBP-II)、 奈瑞莫单抗、 英夫利昔单抗、 依 那西普、 CDP-571、 CDP-870、 阿非莫单抗、 来那西普等 )， 抗风湿药物 ( 例如甲氨喋吟、 金诺 芬、 金硫葡糖、 硫唑嘌呤、 依那西普、 硫代苹果酸金钠、 硫酸羟氯喹、 来氟米特、 柳氮磺胺吡啶 (sulfasalzine))、 肌肉松弛剂、 麻醉药物、 非甾类抗炎药物 (NSAID)、 止痛药物、 麻醉药物、 镇静药物、 局部麻醉药物、 神经肌肉阻断剂、 抗微生物药物 ( 例如氨基糖苷、 抗真菌药物、 抗 寄生虫药物、 抗病毒药物、 碳青霉烯、 头孢菌素、 氟喹诺酮、 大环内酯、 青霉素、 磺酰胺、 四环 素、 其它抗微生物药物 )， 抗牛皮癣药、 皮质类固醇、 合成代谢类甾醇、 糖尿病相关药物、 矿 物质、 营养剂、 甲状腺剂、 维生素、 钙相关激素、 止泻药物、 镇咳药物、 止吐药物、 抗溃疡药物、 轻泻药物、 抗凝血剂、 促红细胞生成素 ( 例如重组人肾红细胞生成素 α)， 非格司亭 ( 例如 G-CSF、 Neupogen)、 沙格司亭 (GM-CSF、 白细胞素 )、 免疫疗法 (immunization)、 免疫球蛋白、 免疫抑制剂 ( 例如巴利昔单抗、 环胞菌素、 达珠单抗 )、 生长激素、 激素替代药物、 雌激素受 体调节剂、 散瞳剂、 睫状肌麻痹剂、 烷基化剂、 抗代谢药物、 有丝分裂抑制剂、 放射药物、 抗抑 郁药物、 抗狂躁药、 安定药、 抗焦虑药、 催眠药、 拟交感神经药、 刺激剂、 多奈哌齐、 他克林、 哮 喘药物、 β 激动剂、 吸入类固醇、 白三烯抑制剂、 甲基黄嘌呤、 色甘酸、 肾上腺素或类似物、 阿法链道酶 (Pulmozyme)、 细胞因子或细胞因子拮抗剂。此种细胞因子的非限制性实例包 括但不限于 IL-1 至 IL-23 的任何一个 ( 例如 IL-1、 IL-2 等 )。合适的剂量是本领域熟知 的。参见例如 Wells 等人， eds.， Pharmacotherapy Handbook， 2.sup.nd Edition， Appleton and Lange， Stamford， Conn.(2000) ； PDR Pharmacopoeia， Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000， Deluxe Edition， Tarascon Publishing， Loma Linda， Calif.(2000)， 这些文献的每 一篇通过引用完整地合并在此。
     此种抗癌或抗感染药物还可以进一步包括与至少一种本发明抗体进行缔合、 结 合、 共配制或共给予的毒素分子。该毒素可以可选起到选择性杀灭病理性细胞或组织的作 用。该病理性细胞可以是癌细胞或其它细胞。此种毒素可以是但不限于纯化或重组的毒 素或包含毒素的至少一个功能性细胞毒性结构域的毒素片段， 例如选自以下的至少一种 ： 蓖麻毒蛋白、 白喉毒素、 蛇毒毒素 (venom toxin) 或细菌毒素。术语毒素还包括由可在人 或其它哺乳动物中引起包括可导致死亡的毒素休克在内的任何病理状况的、 任何天然存在 的突变或重组细菌或病毒产生的内毒素或外毒素。此种毒素可包括但不限于产肠毒素大 肠杆菌遇热不稳定肠毒素 (LT)、 热稳定肠毒素 (ST)、 志贺氏菌属细胞毒素、 气单胞菌属肠 毒素、 中毒性休克综合征毒素 -1(TSST-1)、 葡萄球菌肠毒素 A(SEA)、 B(SEB) 或 C(SEC)、 链 球菌肠毒素等。此种细菌包括但不限于产肠毒素大肠杆菌 (ETEC) 的菌株、 肠出血性大肠 杆菌 ( 例如血清型 0157:H7 的菌株 )、 葡萄球菌属 ( 例如金黄色葡萄球菌、 产脓葡萄球菌 (Staphylococcus pyogenes))、 志贺氏菌属 ( 例如痢疾志贺氏菌 (Shigella dysenteriae)、 弗氏志贺氏菌 (Shigella flexneri)、 鲍氏志贺氏菌 (Shigella boydii) 和宋内氏志贺氏菌 (Shigella sonnei))、 沙门氏菌属 ( 例如伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi)、 猪霍 乱沙门氏菌 (Salmonella cholera-suis)、 肠炎沙门氏菌 (Salmonella enteritidis))、 梭 菌 属 ( 例 如， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)、 艰 难 梭 菌 (Clostridium dificile)、 肉 毒 梭 菌 (Clostridium botulinum))、 弯 曲 杆 菌 属 ( 例 如， 空肠弯曲杆菌 (Camphlobacter jejuni)、 胚胎弯曲杆菌 (Camphlobacter fetus))、 螺杆菌属 ( 例如， 幽门 螺杆菌 (Heliobacter pylori)、 气单胞菌属 ( 例如温和气单胞菌 (Aeromonas sobria)、 嗜 水气单胞菌 (Aeromonas hydrophild)、 豚鼠气单胞菌 (Aeromonas caviae))、 类志贺邻单胞 菌 (Pleisomonas shigelloides)、 小肠结肠炎耶尔森菌 (Yersina enterocolitica)、 弧菌 属 ( 例如， 霍乱弧菌 (Vibrios cholerae)、 副溶血性弧菌 (Vibrios parahemolyticus))、 克雷伯氏菌属 (Klebsiella species)、 绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 和链 球菌 (Streptococci)。参见例如， Stein， ed.， INTERNAL MEDICINE， 3rd ed.， pp 1-13， Little， Brown and Co.， Boston， (1990) ； Evans 等人 .， eds.， Bacterial Infections of Humans ： Epidemiology and Control， 2d.Ed.， pp 239-254， Plenum Medical Book Co.， New York(1991) ； Mandell 等人， Principles and Practice of Infectious Diseases， 3d.Ed.， Churchill Livingstone， New York(1990) ； Berkow 等人， eds.， The Merck Manual， 16th edition， Merck and Co.， Rahway， N.J.， 1992 ； Wood 等人， FEMS Microbiology Immunology， 76 ： 121-134(1991) ； Marrack 等人， Science， 248 ： 705-711(1990)， 这些参考文献的内容通 过引用完整地合并在此。
     本发明治疗组合物在某些实施方式中包含例如， 编码 MG29 多肽的核酸、 MG29 核 酸； 与编码 MG29 多肽的核酸结合的核酸 ； MG29 编码核酸 ； 基于它们的 MG29 肽类似物、 假肽 或模拟肽 ； MG29 或 MG29 蛋白质 - 蛋白质相互作用的小分子调节剂 ； 或 MG29 特异性抗体或 其生物活性衍生物或片段。如本文所述的， MG29 对正常肌肉功能发挥着重要作用。所以， 靶向这些核酸、 多肽及其类似物的表达和 / 或活性， 将为各种急性和慢性疾病以及与肌肉 功能障碍和糖尿病相关的病症提供了新的治疗方法。
     在本发明任何方面中， 本发明治疗组合物可以为任何药学可接受形式， 并可以通 过任何药学可接受途径给予， 例如， 该治疗组合物可以以口服的每日单次剂量或单位剂量 形式给予， 用于治疗肌肉障碍或病症， 例如糖尿病。 此种药学可接载体和赋形剂以及给予方 法容易被本领域技术人员容易明了， 并包括如 USP-NF 2008( 美国药典 / 国家处方集 ) 中描 述的组合物和方法， USP-NF 2008 通过引用完整地合并在此。在某些方面， 本发明提供了所 述化合物的药学可接受制剂。 这些制剂包括上述化合物的盐， 例如， 酸加成盐， 例如盐酸盐、 氢溴酸盐、 乙酸盐和苯磺酸盐。
     该活性化合物一般可以调配用于肠道外给予， 例如， 调配用于经由静脉内、 关节 内、 鞘内、 肌内、 皮下、 病灶内或甚至腹膜内途径注射。 包含癌症标记抗体、 结合物、 抑制剂或 其它药剂作为活性组分或成分的水性组合物制剂是本领域技术人员根据本公开内容可以 理解的。 典型地， 此种组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬液， 也可以制备成适合于用 来在注射之前通过添加液体配制溶液或悬液的固体形式， 也可以使该制剂乳化。
     药物组合物或制剂是指适合于向细胞或主体， 优选人给予， 例如全身给予的形式 的组合物或制剂。 “全身给予” 是指药物体内全身吸收或积累在血流中， 随后遍及全身。合 适的形式部分地取决于用途或进入途径， 例如口服、 透皮或通过注射。 此种形式不应阻止该组合物或制剂到达靶细胞 ( 即， 带负电荷聚合物期望被递送到的细胞 )。例如， 注射到血流 中的药物组合物应当是可溶的。其它因素在本领域中是已知的， 包括阻止该组合物或制剂 发挥其作用的考虑因素如毒性和形式。
     用于给予本发明治疗剂的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、 悬液和乳液。非水性 溶剂的实例是丙二醇、 聚乙二醇、 植物油如橄榄油， 和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体 包括水、 醇溶液 / 水溶液、 乳液或悬液， 包括盐水和缓冲介质。媒剂包括氯化钠溶液、 林格 氏葡萄糖、 葡萄糖和氯化钠、 乳化林格氏静脉内媒剂， 该静脉内媒剂包括流体和营养物补充 剂、 电解质补充剂等。可以添加防腐剂和其它添加剂， 例如， 抗微生物药剂、 抗氧化剂、 螯合 药剂和惰性气体等。
     本发明药物组合物可被调配成与它的期望给予途径相容。 给予途径实例包括肠道 外， 例如， 静脉内、 真皮内、 皮下、 口服 ( 例如， 吸入 )、 透皮 ( 即， 局部 )、 经粘膜、 腹膜内， 和直 肠给予。 用于肠道外、 真皮内或皮下施用的溶液或悬液可以包括下面的组分 ： 无菌稀释剂如 注射用水、 盐溶液、 不挥发油、 聚乙二醇、 甘油、 丙二醇或其它合成溶剂， 抗细菌剂如苯甲醇 或对羟基苯甲酸甲酯 (methyl paraben)， 抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠， 螯合剂如乙 二胺四乙酸 (EDTA)， 缓冲剂如醋酸盐、 柠檬酸盐或磷酸盐， 以及调节张性 (tonicity) 的药 剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节 pH， 如盐酸或氢氧化钠。该肠道外制剂可以包覆 在由玻璃或塑料制成的安瓿、 一次性注射器或多剂量小瓶中。
     导致全身吸收的给予途径包括， 但不局限于 ： 静脉内、 皮下、 腹膜内、 吸入、 口服、 肺 内和肌内。药物进入循环的速率已被证明是分子量或分子大小的函数。包含本发明化合物 的脂质体或其它药物载体的应用可以潜在地使该药物定位于例如某些组织类型， 如网状内 皮系统 (RES) 的组织中。能够促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞表面结合的脂质体制 剂也是有用的。
     药学可接受制剂是指可以使本发明核酸分子有效地分布在最适合于期望活性 的身体位置中的组合物或制剂。适合于与本发明核酸分子一起调配的药剂的非限制性 实例包括 ： PEG 结合的核酸、 磷脂结合的核酸、 含有亲脂部分的核酸、 硫代磷酸酯、 P- 糖 蛋白抑制剂 ( 如 Pluronic P85)， 其可以增强药物进入各种组织如 CNS(Jolliet-Riant and Tillement， 1999， Fundam.Clin.Pharmacol.， 13， 16-26) ； 生物可降解聚合物如在 植 入 后 缓 释 递 送 的 聚 (DL- 丙 交 酯 - 共 - 乙 交 酯 ) 微 球 (Emerich， DF 等 人， 1999， Cell Transplant， 8， 47-58， Alkermes， Inc.Cambridge， Mass.) ； 以及负载纳米颗粒， 如由聚氰基 丙烯酸丁酯制成的那些， 其可以递送药物穿过血脑屏障并可以改变神经元摄取机制 (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 23， 941-949， 1999)。 包 括 核 酸 分 子 CNS 递 送 在内的递送策略的其它非限制性实例， 包括以下文献中描述的材料 ： Boado 等人， 1998， J.Pharm.Sci.， 87， 1308-1315 ； Tyler 等人， 1999， FEBS Lett.， 421， 280-284 ； Pardridge 等 人， 1995， PNAS USA.， 92， 5592-5596 ； Boado， 1995， Adv.Drug Delivery Rev.， 15， 73-107 ； Aldrian-Herrada 等人， 1998， Nucleic Acids Res.， 26， 4910-4916 ； 和 Tyler 等人， 1999， PNAS USA.， 96， 7053-7058。所有这些文献都通过引用完整地合并在此。
     本发明的特征还在于使用这样的组合物， 其包含含有聚乙二醇脂质的表面修饰的 脂质体 (PEG- 修饰的， 或长循环脂质体或隐形脂质体 (stealth liposomes))。本发明核酸 分子也可以包含具有各种分子量的共价连接的 PEG 分子。这些制剂提供了增大药物在靶组织中的积累的方法。这类药物载体可以对抗单核吞噬细胞系统 (MPS 或 RES) 的调理和清除 作用， 从而使血液循环时间较长， 并增强组织暴露于被包封药物的能力 (Lasic 等人， Chem. Rev.1995， 95， 2601-2627 ； Ishiwata 等人， Chem.Pharm.Bull.1995， 43， 1005-1011)。长循环 脂质体基于它们避免积累在代谢侵袭性 MPS 组织如肝脏和脾中的能力， 也可以在相比阳离 子脂质体较大的程度上保护药物不受核酸酶降解。所有这些文献都通过引用合并在此。
     本发明化合物、 核酸分子、 多肽和抗体 ( 也称作 “活性化合物” )， 及其衍生物、 片 段、 类似物和同源物也可以掺入在适合于给予的药物组合物中。此种组合物典型地包含 核酸分子、 蛋白质， 或抗体和药学可接受载体。如本文使用的， “药学可接受载体” 旨在包 括与药物给予相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗真菌药剂、 等渗和吸收 延缓药剂等。合适的载体描述在本领域标准参考手册 “雷明顿药物科学” (Remington′ s Pharmaceutical Sciences) 最新版中， 其通过引用合并在此。此种载体或稀释剂的优选实 例包括， 但不局限于， 水、 盐水、 林格氏溶液、 葡萄糖溶液， 和 5％人血清白蛋白。也可以使用 脂质体和非水媒剂如不挥发油。 此种介质和媒介物在药学活性物质中的应用是本领域是熟 知的。考虑了任何常规介质或试剂在该组合物中的应用， 除了与该活性化合物不相容的那 些。补充的 (supplementary) 活性化合物也可以掺入到该组合物中。
     本发明也包括制备用于储存或给予的组合物， 其在药学可接受载体或稀释剂中 包含药物有效量的期望化合物。对于治疗使用可接受的载体或稀释剂是药学领域熟知 的， 例如描述在 “雷 明 顿 药 物 科 学” (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences)， Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985) 中， 该文献通过引用合并在此。例如， 可以提供 防腐剂、 稳定剂、 染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、 山梨酸和对羟基苯甲酸酯。另外， 可以 使用抗氧化剂和悬浮剂。
     此种化合物的毒性和治疗功效可以通过例如确定 LD50( 致使 50％群体死亡的量 ) 和 ED50( 对 50％群体治疗有效的量 ) 的细胞培养物或实验动物标准药学程序确定。 毒性和 治疗效果之间的剂量比是治疗指数 (therapeutic index)， 它可以表示成比值 LD50/ED50。 优选表现出较大治疗指数的化合物。虽然可以使用表现出有毒副作用的化合物， 但应当注 意， 要设计使此种化合物靶向受感染组织部位的递送系统以便将对未感染细胞的潜在损害 减到最小， 从而减少副作用。从细胞培养物分析和动物研究获得的数据可以用于调配人用 剂量的范围。此种化合物的剂量优选在毒性很小或无毒性的循环浓度范围内， 包括 ED50。 该剂量在这个范围内随所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。 对于本发明方法中使用 的任何化合物， 治疗有效剂初始可以由细胞培养物分析估计。可以在动物模型中调配剂量 从而获得包括 IC50( 即， 实现症状半数抑制的测试化合物浓度 ) 的循环血浆浓度范围， 如在 细胞培养物中测定的。此种信息可以用于更准确地确定对人有用的剂量。血浆中的水平可 以通过例如高效液相色谱测量。
     该制剂可以以包含常规无毒的药学可接受载体、 佐剂和媒剂的单位剂量制剂 ( 形 式 )， 通过口服、 局部、 肠道外、 吸入或喷雾或直肠给予。如本文使用的术语肠道外包括， 经 皮、 皮下、 血管内 ( 例如， 静脉内 )、 肌内， 或鞘内注射或输注技术等。另外， 提供了包含本发 明核酸分子和药学可接受载体的药物制剂。 本发明一种或多种核酸分子可以与一种或多种 无毒的药学可接受载体和 / 或稀释剂和 / 或佐剂结合， 期望时， 与其它活性成分结合。本发 明药物组合物可以为适合于口服使用的形式， 例如， 片剂、 含片 (troche)、 锭剂、 水性或油性悬液、 可分散粉末或颗粒、 乳液、 硬胶囊或软胶囊， 或糖浆或酏剂。
     口服用组合物可以根据本领域中已知用于制造药物组合物的任何方法制备， 此种 组合物可以包含一种或多种这样的增甜剂、 调味剂、 着色剂或防腐剂， 以便提供药学上精美 的可口制剂。 对于口服给予， 该药物组合物可以采用例如， 与药学可接受赋形剂一起通过常 规方式制成的片剂或胶囊形式， 该药学可接受赋形剂为， 例如， 粘合剂 ( 例如， 预糊化玉米 淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素 )， 填料 ( 例如， 乳糖、 微晶纤维素或磷酸氢钙 )， 润滑剂 ( 例如， 硬脂酸镁、 滑石粉或二氧化硅 )， 崩解剂 ( 例如， 马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉 钠 )， 或润湿剂 ( 例如， 十二烷基硫酸钠 )。该片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。 用于口服给予的液体制剂可以采用， 例如， 溶液、 糖浆或悬液形式， 或者它们可以以适合于 在使用前用水或其它适合的媒剂配制 (constitution) 的干制品形式存在。此种液体制剂 可以利用药学可接受的添加剂通过常规方式制备， 该药学可接受的添加剂为， 例如， 悬浮剂 ( 例如， 山梨醇糖浆、 纤维素衍生物或氢化食用脂肪 )， 乳化剂 ( 例如， 卵磷脂或阿拉伯胶 )， 非水性媒剂 ( 例如， 杏仁油、 油性酯、 乙醇或分馏的植物油 )， 和防腐剂 ( 例如， 对羟基苯甲酸 甲酯或丙酯或山梨酸 )。 适当时， 该制剂也可以包含缓冲盐、 调味剂、 着色剂和增甜剂。 用于 口服给予的制剂可以适当地调配成可控制释放活性化合物。对于颊部给予， 该组合物可以 采用以常规方式调配成的片剂或锭剂形式。
     赋形剂可以为， 例如， 惰性稀释剂， 例如碳酸钙、 碳酸钠、 乳糖、 磷酸钙或磷酸钠 ； 造粒剂和崩解剂， 例如， 玉米淀粉或海藻酸 ； 粘合剂， 例如淀粉、 明胶或阿拉伯胶 ； 以及润滑 剂， 例如硬脂酸镁、 硬脂酸或滑石粉。该片剂可以是不包衣的， 或可以通过已知技术进行包 衣。在一些情况下， 此种包衣可以通过已知技术制备从而延缓在胃肠道中的崩解和吸收， 从而提供较长时间的持续作用。例如， 可以采用时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂 酸甘油酯。口服用制剂也可以制备成硬明胶胶囊形式， 其中活性成分与惰性固体稀释剂例 如碳酸钙、 磷酸钙或高岭土混合， 或者制备成软明胶胶囊形式， 其中活性成分与水或油性介 质， 例如花生油、 液体石蜡或橄榄油混合。
     水性悬液包含与适合于制造水性悬液的赋形剂混合的活性材料。 此种赋形剂是悬 浮剂， 例如， 羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 海藻酸钠、 聚乙烯吡咯烷酮、 黄蓍树胶和阿拉伯树胶 ； 分散或润湿剂可以是天然存在的磷脂， 例如卵磷脂， 或者环氧烷与 脂肪酸的缩合产物， 例如硬脂酸聚氧乙烯酯， 或者环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物， 例如 十六醇聚氧乙烯十七烷醚 (heptadecaethyleneoxycetanol)， 或者环氧乙烷与衍生自脂肪 酸和己糖醇的偏酯的缩合产物， 例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯， 或者环氧乙烷与衍生自脂 肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物， 例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性悬液也可以 包含一种或多种防腐剂， 例如， 对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯， 一种或多种着色剂， 一种或多 种调味剂， 以及一种或多种增甜剂， 如蔗糖或糖精。
     油性悬液可以通过将活性成分悬浮在植物油， 例如花生油、 橄榄油、 芝麻油或椰子 油中， 或者悬浮在矿物油如液体石蜡中调配而成。 该油性悬液可以包含增稠剂， 例如， 蜂蜡、 硬石蜡或十六醇。可以添加增甜剂和调味剂从而提供可口的口服制剂。这些组合物可以通 过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存 ( 防腐 )。
     适合于添加水制备水性悬液的可分散粉末和颗粒提供了与分散或润湿剂、 悬浮剂 和一种或多种防腐剂混合的活性成分。 上面所述的那些已列举了合适的分散或润湿剂或悬浮剂实例。也可以存在另外的赋形剂， 例如增甜剂、 调味剂和着色剂。本发明药物组合物也 可以为水包油乳液形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以 是天然存在的树胶， 例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶， 天然存在的磷脂， 例如大豆、 卵磷脂， 和衍 生自脂肪酸和己糖醇， 酐的酯或偏酯， 例如， 脱水山梨醇单油酸酯， 以及所述偏酯与环氧乙 烷的缩合产物， 例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。该乳液也可以包含增甜剂和调味剂。
     糖浆和酏剂可以与增甜剂， 例如， 甘油、 丙二醇、 山梨醇、 葡萄糖或蔗糖一起调配。 此种制剂也可以包含缓和剂、 防腐剂和调味剂以及着色剂。该药物组合物可以为无菌可注 射水性或油性悬液形式。 这种悬液可以根据已知技术利用前面已提及的那些适合的分散或 润湿剂和悬浮剂调配。 该无菌可注射制剂也可以是在无毒性肠道外可接受稀释剂或溶剂中 的无菌可注射溶液或悬液， 例如 1， 3- 丁二醇中的溶液。在可接受媒剂和溶剂当中， 可以采 用水、 林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外， 无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。对于 这个目的， 可以采用任何温和的不挥发油， 包括合成的单或双甘油酯。另外， 脂肪酸如油酸 可应用于可注射制剂中。
     对于吸入给予， 根据本发明使用的化合物方便地以气溶胶喷雾形式， 由利用合适 的推进剂例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷、 二氧化碳或其它合适的气体加压 的袋子或雾化器递送。在加压气溶胶的情况下， 剂量单位可以通过提供用于递送计量的量 的阀门确定。可以将， 例如用于吸入器或吹药器 (insufflator) 中的明胶的胶囊和药筒调 配成， 包含该化合物与合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。可以将该化合物调配 用于肠道外注射给予， 例如推注或连续输注。
     也可以将该化合物调配成， 例如含有传统栓剂基质如可可油或其它甘油酯的直肠 组合物， 如栓剂或保留灌肠剂 (retention enemas)。除了前述制剂之外， 还可以将该化合 物调配成积存制剂 (depot preparation)。此种长效制剂可以通过 ( 例如皮下或肌内 ) 植 入给予或通过肌内注射给予。 因而， 例如， 可以将该化合物与合适的聚合材料或疏水材料一 起调配 ( 例如在可接受的油中调配成乳液 )， 或与离子交换树脂一起调配， 或调配成难溶性 (sparingly soluble) 衍生物， 例如难溶性盐。
     适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液 ( 对于水可溶的情况 ) 或分散液和用 于临时配制无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。注射用制剂可以单位剂量形式呈现， 例 如， 在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。 该组合物可以采用这样的形式， 如在油性或水 性媒剂中的悬液、 溶液， 或乳液， 并可以包含配制剂 (formulatory agents) 如悬浮剂、 稳定 剂， 和 / 或分散剂。替换地， 该活性成分可以是粉末形式， 在使用前用合适的媒剂如无菌的 无热源水进行配制。对于静脉给予， 合适的载体包括生理盐水、 抑菌水、 CremophorTM(BASF， Parsippany， N.J.) 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在所有情况下， 该组合物必须是无菌的， 并且 应当被液化到具有方便注射性的程度。该组合物在制造和储存条件下必须稳定， 必须能够 防止微生物如细菌和真菌的污染作用。该载体可以是溶剂或悬浮介质， 包含例如水、 乙醇、 多元醇 (polyol， 多羟基化合物 )( 例如， 甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇等 )， 及其合适的混合 物。合适的流动性， 例如， 可以通过使用包衣材料例如卵磷脂、 在悬液的情况下通过维持所 需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂维持。 通过使用各种抗细菌和抗真菌剂， 例如， 对羟基 苯甲酸酯 (parabens)、 氯丁醇、 苯酚、 抗坏血酸、 硫柳汞 (thimerosa) 等， 可以实现预防微生 物的目的。在许多情况下， 优选在组合物中包括等渗剂， 例如， 糖、 多元醇如甘露醇、 山梨糖醇、 氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的药剂， 例如单硬脂酸铝和明胶， 可以延缓可注 射组合物的吸收。
     在一个实施方式中， 该活性化合物可以与能够防止该化合物从身体内快速排出的 载体一起制备， 例如， 控制释放制剂， 包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用生物可 降解的、 生物相容的聚合物， 如乙烯醋酸乙烯酯 (ethylene vinyl acetate)、 聚酐、 聚乙醇 酸、 胶原、 聚原酸酯和聚乳酸。 对于本领域技术人员而言， 制备此种制剂的方法是明显的。 该 材料也可以从 Alza 公司和诺华医药有限公司 (Nova Pharmaceuticals， Inc.) 购得。脂质 体悬液 ( 包括靶向于带有病毒抗原单克隆抗体的感染细胞的脂质体 ) 可以用作药学可接受 载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备， 例如美国 No.4,522,811 描述的。
     为了便于给予和 ( 保障 ) 剂量一致性， 调配剂量单位形式的口服或肠道外组合物 是特别有利的。 如本文使用的剂量单位形式是指适于作为单一剂量供被治疗主体用的物理 离散单元 ( 单位， unit) ； 每个单元均包含根据产生期望治疗效果计算出的预定量的活性化 合物， 其与所需药物载体结合。本发明剂量单位形式的规格 (specification) 由该活性化 合物的独特性质、 需要达到的特定治疗效果， 和混合 (compound) 此种活性化合物用于治疗 个体的领域固有的局限性决定， 且直接取决于这些因素。
     可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括含有该抗体的固体疏水性聚合 物的半透性基质， 该基质为成形物品形式， 例如， 膜或微胶囊。缓释基质的实例包括， 聚酯、 水凝胶 ( 例如， 聚 (2- 羟乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯基醇 ))、 聚交酯 ( 美国专利 No.3,773,919)、 L- 谷氨酸与 γ- 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物、 不可降解的乙烯 - 醋酸乙烯 TM 酯、 可降解的乳酸 - 乙醇酸共聚物如 LUPRON DEPOT ( 由乳酸 - 乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林组成的可注射微球 ) 和聚 -D-(-)-3- 羟基丁酸。虽然诸如乙烯 - 醋酸乙烯酯和乳酸 - 乙 醇酸的聚合物能够在超过 100 天的时间内释放分子， 但是某些水凝胶在较短的时间内释放 蛋白质。
     对于向非人动物给予， 本发明治疗组合物也可以添加到动物饲料或饮用水中。可 以方便地调配该动物饲料和饮用水组合物， 以便动物连同其食物一起摄入治疗上适当的量 的组合物。也可以方便地使该组合物以用于添加到饲料或饮用水中的预混合料 ( 形式 ) 存 在。该组合物也可以结合其它治疗化合物给予主体从而增强总体治疗效果。用于治疗适应 症的多种化合物的使用可以增强有益效果， 同时降低副作用的存在。
     实施例 ( 参考附图 )
     Mitsugumin 29(MG29) ： 分离出与肌肉特异性突触素有关的蛋白质。 骨骼肌三联体 是由陷入细胞质中的质膜的单个凹陷部分 ( 横管或 T 管 ) 组成， 该单个凹陷部分与肌质网 (SR) 终池的两个部分并置。鉴于三联体在诱导肌肉收缩中的重要性， 通过免疫染色筛查定 位于三联体中的新蛋白质的抗体文库， 鉴定调节兴奋 - 收缩 (E-C) 偶联和骨骼肌中 Ca2+ 调 控其它方面的其它蛋白质， 不足为奇。在筛查这个文库期间鉴定的最重要的蛋白质之一是 跨膜蛋白突触素家族的新成员， mitsugumin 29(MG29)。
     MG29 几乎仅表达于小鼠和人的骨骼肌纤维上， 但在肾脏上观察到少许表达 ( 参见 图 1、 图 2 和参考文献 8)， 并包含使该蛋白质定位于三联体横 (T-) 管膜和 SR 膜中的四个跨 膜结构域。这种亚细胞分布提示 MG29 可以介导 T- 管膜和连接 SR 膜之间的通讯。MG29 蛋 白质结构与神经递质释放所必需的跨膜家族， 突触素家族成员在氨基酸序列上是同源的，并与该突触素家族成员具有共同的典型结构特征。
     突触素 ： 突触形成、 释放和生物发生。 突触素起初被鉴定为小突触囊泡中丰富的高 度免疫原性膜蛋白， 也在致密核心的嗜铬和神经分泌颗粒中发现。突触素及其同源物突触 孔蛋白 ( 或突触素 II) 和泛有小泡蛋白 (pantophysin) 与四个跨膜区具有共同的跨膜组织 机构 (transmembrane organization)， 并具有共同的胞质氨基和羧基末端。
     突触素的独特特征在于它具有低聚结构， 导致突触素可能是在神经递质释放期间 形成的融合孔成分的观念的形成。而且， 已证明与突触素 mRNA 互补的反义寡核苷酸可以降 低通过注射全脑 mRNA 诱导的爪蟾卵母细胞的 Ca2+- 依赖性谷氨酸盐分泌。显微注射到运动 神经元中的突触素抗体阻断了神经肌肉传导。 这些数据与突触素是神经递质分泌所必需的 ( 这一事实 ) 一致。然而， 鉴定突触素功能的遗传途径尚未成功， 缺少突触素的突变小鼠表 现出正常的表型。 这可以反映出突触孔蛋白或其它突触素家族成员的代偿作用。 事实上， 突 触素和突触孔蛋白二者都有缺陷的小鼠的突触可塑性 (synaptic plasticity) 存在缺陷。
     已提出突触素在囊泡形成中起结构作用。由于突触素具有强的结合胆固醇的能 力， 因而它与突触囊泡生物发生期间形成膜曲率有关。还已知突触素可以与突触囊泡膜的 其它蛋白质， 即， 小突触囊泡蛋白 (synaptobrevin) 和液泡膜 H+-ATPase 紧密相互作用。据 认为， 这些相互作用可以在 SNARE 复合物或融合孔形成的水平上调节胞吐膜融合。酵母液 泡融合的研究支持后者的观点， 该研究暗示液泡 ATPase(ATP 酶 ) 直接参与膜融合。
     骨骼肌在性质上是最具可塑性的组织之一， 正常肌肉生理需要形成和维持复合物 膜结构。 在整个发育过程中， 老化和包括疲劳在内的其它过程需要不断地改变骨骼肌系统， 因而与骨骼肌膜结构可塑性相关的基因和蛋白质的鉴定和表征， 是理解肌肉生理所必需 的。因而， 在结构上， MG29 可以视为骨骼肌生物发生中的突触素对应物。
     MG29 在肌肉疲劳中的作用的发现。 鉴于 mg29(-/-) 动物中三联体膜超微结构的破 坏程度， 非应激动物中没有可鉴定的功能表型令人惊讶。 因而我们推测， 因为生理反应在应 激条件下会发生改变， 所以我们需要探究 mg29(-/-) 动物及其肌肉在此种条件下的反应。 最初， 我们测试了整个动物对跑台训练运动诱导的应激的体内反应。 我们发现， 基因敲除动 物无法维持较长时间的体力活动， 且跑动速度显著低于野生型同窝对照。这些研究给了我 们初步的线索 ： MG29 是生理相关性分子， 对肌肉性能具有直接的作用， 特别是在体力活动 增加期间。 因为缺乏体力活动可能会导致许多慢性退行性疾病、 肌肉功能降低和肌肉萎缩， 所以我们接着探究了 MG29 在肌肉疲劳中的作用。
     肌肉疲劳在广义上定义为肌肉产生力量的能力下降， 由于反复或连续活动引起。 疲劳是所有动物都会经历的现象， 被认为是限制长期肌肉收缩从而将劳倦过度引起的损伤 减到最小的生物控制过程的一部分。肌肉疲劳的潜在细胞机制的一些当前理论包括 ： a) 2+ T- 管和 SR 的 Ca 释放之间的有效通讯遭到破坏， b) 肌细胞中钠或其它离子浓度发生变化， 导致动作电位传播失败， c) 活性氧物质 (reactive oxygen species， ROS)/ 代谢物理论认 为， 肌肉活动增加导致可以直接改变蛋白质功能的过氧化物、 过氧化氢和游离基净增多。 这 个理论有时扩展至更广泛的概念中， 它假定诸如 ROS、 无机磷酸盐、 ADP、 AMP 等代谢物的总 2+ 积累量在疲劳期间增大， 并导致 SR 中的 Ca 释放量减少， 肌球蛋白 - 肌动蛋白相互作用的 2+ 功能受到抑制。d) 疲劳刺激导致细胞内 Ca 增多， 诱导 Ca2+ 激活的蛋白酶的产生， 随后导 致必需 E-C 偶联相关蛋白被清除。虽然在工作机制上没有明确地定义， 但肌肉生理研究一致认为最佳肌肉性能在细 胞内 Ca 稳态得以维持时出现， 因为 SR 中的 Ca2+ 释放不足会导致力量输出减小。在疲劳期 间， 这种缺陷的 Ca2+ 释放过程可能是由 T- 管和 SR 膜上鱼尼丁受体 (ryanodine receptor， RyR) 之间不适当的偶联、 SR Ca2+ 含量降低， RyR 功能直接变化以及钙池调控钙离子进入 (SOCE) 受损引起的。
     我们利用离体肌肉收缩分析探究了 mg29(-/-) 小鼠骨骼肌的易疲劳性， 我们发现 它们疲劳的程度较大， 疲劳后恢复的程度较小， 即使在咖啡因的存在下产生的力量也比野 生型对照小鼠产生的少。 这些研究结果明确地揭示， mg29(-/-) 骨骼肌中的 E-C 偶联遭到破 2+ 坏。当从细胞外介质中除去 Ca 时和 / 或当在药理学上阻断细胞外 Ca2+ 进入时， mg29(-/-) 2+ 和野生型小鼠肌肉之间的疲劳特性的这种差异减小， 表明细胞外 Ca 进入是 mg29(-/-) 肌 肉抗疲劳性降低的主要因素。
     MG29 是 与 老 化 相 关 的 骨 骼 肌 Ca 稳 态 功 能 异 常 的 前 哨 (sentinel)。 老 化 对 肌肉功能的影响与肌纤维去神经、 运动单元缺失， 和运动单元重塑关联。因为在显著 的 肌 肉 萎 缩 变 得 明 显 之 前 功 能 发 生 改 变， 所 以 E-C 偶 联 机 构 (machinery) 和 细 胞 内 Ca 稳态的变化充当肌肉老化的病因因素或对肌肉老化的适应性反应。已证明， 包括 DHPR 在 内 的 数 个 三 联 体 蛋 白 的 功 能 改 变 (Delbono， O.， O ′ Rourke， K.S.&Ettinger， W.H.Excitation-calcium release uncoupling in aged single human skeletal muscle fibers.J Membr Biol148 ， 211-22(1995) ； Renganathan ， M. ， Messi ， M.L.&Delbono ， O.Dihydropyridine receptor-ryanodine receptor uncoupling in aged skeletal muscle.J Membr Biol 157， 247-53(1997))， calsequestrin(Margreth， A.， Damiani， E.&Bortoloso， E.Sarcoplasmic reticulum in aged skeletal muscle.Acta Physiol Scand 167， 331-8(1999) ； Narayanan， N.， Jones， D.L.， Xu， A.&Yu， J.C.Effects of aging on sarcoplasmic reticulum function and contraction duration in skeletal muscles of the rat.Am J Physiol 271， C1032-40(1996))， and SERCA(Chen， B.， Jones， T.E.&Bigelow， D.J.The nucleotide-binding site of the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase is conformationally altered in aged skeletal muscle.Biochemistry 38 ， 14887-96(1999) ； Schoneich ，C. ，Viner ，R.I. ，Ferrington ，D.A.&Bigelow ， D.J.Age-related chemical modification of the skeletal muscle sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase of the rat.Mech Ageing Dev 107， 221-31(1999))， 导 致 老 化的骨骼肌中 Ca 稳态遭到破坏。已提出电压诱导的钙释放 (VICR) 过程的累积解偶 联 (uncoupling) 可 能 是 肌 肉 老 化 过 程 中 的 病 因 和 / 或 适 应 性 变 化 的 一 部 分 (Payne， A.M.&Delbono， O.Neurogenesis of excitation-contraction uncoupling in aging skeletal muscle.Exerc Sport Sci Rev 32， 36-40(2004))。肌肉老化的分子标记以及它 们对老化相关性肌肉功能障碍的贡献的鉴定最近已成为 E-C 偶联研究和一般老年病医疗 研究的主要焦点。
     我们将最初的 Ca 火花发现延伸到健康年轻肌肉中， 鉴定出老化骨骼肌中的 Ca 火 花信号的表型变化 (Weisleder， N. 等人， Muscle aging is associated with compromised Ca2+spark signaling and segregated intracellular Ca2+release.J Cell Biol 174， 639-45(2006) ； Melzer， W.When sparks get old.J Cell Biol 174， 613-4(2006))。 似2+乎年轻肌肉中 Ca 火花的可塑性在老化骨骼肌中受损， 其中 Ca 火花反应的持续时间减少 并且无法通过添加几轮渗透应力来再刺激。人们可以想到， 老化肌肉中 Ca 火花信号的 受损可能与 T- 管 /SR 膜结构的变化和 / 或 SR Ca 释放机构的改变有联系， 可能是由蛋 白表达中老化相关性变化引起的。利用生物化学分析， 我们发现 MG29 的表达在老化骨 骼肌中显著降低。MG29 是维持膜结构和骨骼肌中的 Ca 信号所必需的 (Takeshima， H. 等 人， Mitsugumin29， a novel Synaptophysin family member from the triad junction in skeletal muscle.Biochem J 331(Pt 1)， 317-22(1998) ； Brandt， N.R.&Caswell， A.H.Localization of mitsugumin 29to transverse tubules in rabbit skeletal muscle.Arch Biochem Biophys 371， 348-50(1999) ； Komazaki， S.， Nishi， M.， Takeshima， H.&Nakamura， H.Abnormal formation of sarcoplasmic reticulum networks and triads during early development of skeletal muscle cells in mitsugumin29-deficient mice.Dev Growth Differ43 ， 717-23(2001) ； Komazaki ，S. ，Nishi ，M. ，Kangawa ， K.&Takeshima， H.Immunolocalization of mitsugumin29in developing skeletal muscle and effects of the protein expressed in amphibian embryonic cells.Dev Dyn 215， 87-95(1999) ； Nishi， M.et al.Abnormal features in skeletal muscle from mice lacking mitsugumin29.J Cell Biol 147， 1473-80(1999))。 在 年 轻 mg29(-/-) 和 老 化 wt 小鼠骨骼肌中都检测到三联体周围的膜超微结构异常 ： T 管肿胀， 有时从 A-I 接合处消 失， 并且由有液泡且片段化的结构形成 SR 网络不佳， 导致三联体不重合 (misalignment， 未对准 )(Nishi， M. 等人， Abnormal features in skeletal muscle from mice lacking mitsugumin29.J Cell Biol 147， 1473-80(1999))。
     除了年轻 mg29(-/-) 和老化 wt 肌肉中膜结构的变化类似之外， 数个另外的研 究也提出 MG29 可以用作肌肉老化的分子标记。首先， mg29(-/-) 小鼠在 6 个月或更年 轻时表现出肌无力， 这类似于老化 wt 小鼠的萎缩表型 (Nagaraj， R.Y. 等人， Increased susceptibility to fatigue of slow-and fast-twitch muscles from mice lacking the MG29gene.Physiol Genomics 4， 43-9(2000))。其次， 老化肌肉中的钙池调控钙离子 进入 (SOCE) 显著下调 (Brotto， M.， Weisleder， N.&Ma， J.J.Store-Operated Ca2+Entry in Muscle Physiology.Curr Chem Biol 1(2007))， 这类似于在 mg29(-/-) 新生儿 (Pan， Z. 等人， Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.Nat Cell Biol 4， 379-83(2002)) 和 成 年 (Brotto， M.A. 等 人， Functional but reduced store-operated Ca entry in adult mg29(-/-)skeletal muscles.Biophs J 88， 633A(2005)) 肌肉中鉴定出的 SOCE 功能失调性。第三， 在 mg29(-/-) 和老化肌肉中 似乎都出现了对 EC- 偶联表现出微分灵敏度 ( 差异灵敏度 ) 的隔离的钙释放池的常见现 象。我们的研究说明， 年轻 mg29(-/-) 和老化 wt 肌纤维中都存在生理 VICR 机制无法动员 ( 调动， mobilize) 的隔离钙池 (Weisleder， N. 等人， Muscle aging is associated with compromised Ca2+spark signaling and segregated intracellular Ca2+release.J Cell Biol 174， 639-45(2006))。第四， 我们鉴定出年轻 mg29(-/-) 肌肉中的可塑性 Ca 火花信号 缺失， 缺失方式非常类似于在老化骨骼肌中看到的。 受损的 Ca 火花信号和隔离的细胞内 Ca 释放的鉴定可以为对抗老化对肌肉功能的影响的未来治疗干预提供独特的靶。
     mg29-/- 小鼠由于肌肉葡萄糖摄取的改变而血糖水平升高。糖尿病的主要标志是受感染患者血液中葡萄糖水平升高。这个状态可能是由于胰岛素分泌减少引起的， 如I型 青少年糖尿病情况， 或者是由于身体对胰岛素的反应受损引起的， 如 II 型胰岛素抗性糖尿 病情况。 骨骼肌是胰岛素的主要靶， 因为肌肉负责身体中大部分的葡萄糖消耗， 因而可以在 胰岛素的存在下吸收大量葡萄糖。为了使此能发生， 含有葡萄糖转运体 4 型 (Glut4) 的囊 泡必须移位到质膜中。因为 MG29 对骨骼肌中的膜融合起着重要作用， 所以有可能 MG29 也 促进对胰岛素作出反应而控制质膜上 Glut4 增大的机制。
     为了测试这种假设， 我们首先检查了人糖尿病患者肌肉中的 MG29 水平是怎样变 化的。如果 MG29 是骨骼肌中 Glut4 机构的重要组分， 那么可以预测糖尿病人患者骨骼肌中 MG29 的表达和 / 或 MG29 蛋白的亚细胞定位将会改变。证明情况确实是这样的。我们发现 MG29 蛋白的表达在糖尿病患者骨骼肌活组织检查中显著增大 ( 图 3)。这可能是这些糖尿 病肌肉中的代偿反应， 试图增大葡萄糖摄取。然而， 我们在糖尿病肌肉中检查 MG29 定位的 结果揭示， 这种另外的 MG29 表达无法提高葡萄糖摄取， 因为糖尿病肌肉中的 MG29 蛋白定位 发生改变 ( 图 4)。在糖尿病肌肉中， MG29 在细胞内间隙中较为常见， 而在正常肌肉中， 大部 分 MG29 发现于肌纤维膜中。这种定位错误可能会促使糖尿病病状的进展。
     为了直接测试 MG29 在糖尿病中的作用， 我们对年轻 mg29-/- 小鼠进行了葡萄糖负 荷实验。我们发现在腹膜内 (IP) 推注葡萄糖之后， 雄性和雌性 mg29-/- 动物都无法有效 地清除它们血流中的葡萄糖 ( 图 5)。注意到， 其余的葡萄糖水平保持不变， 表明缺少 MG29 不影响肝脏在葡萄糖代谢中的作用。因为 mg29-/- 葡萄糖水平保持长时间较高， 所以似乎 mg29-/- 肌肉摄取葡萄糖的能力存在缺陷， 而不是胰岛素分泌存在缺陷。 这在对 mg29-/- 和 对照动物执行的胰岛素负荷的进一步实验中得到证实。当 IP 注射胰岛素可以诱导野生型 对照动物血糖显著降低时， 相同的胰岛素注射对 mg29-/- 小鼠血糖水平的影响小得多 ( 图 6)。这些研究结果表明， 导致 mg29-/- 小鼠血糖升高的潜在缺陷是动物清除葡萄糖 ( 的能 力 )， 而不是胰岛素生产受损， 与在 II 型糖尿病患者中观察到的情况类似。因而， 骨骼肌中 缺少 MG29 可以使动物容易患糖尿病症状。
     我 们 通 过 用 高 脂 食 物 饲 喂 mg29-/- 动 物 和 年 龄 匹 配 的 野 生 型 对 照 小 鼠， 测 试 mg29-/- 动物是否更易于罹患糖尿病。已知这种途径可以诱导小鼠患糖尿病。虽然 mg29-/- 和对照小鼠体重增加的速率相似 ( 图 7a)， 但是 mg29-/- 小鼠在比对照小鼠小得多 的年龄表现出对糖尿病负荷实验有易感性 ( 图 7b)。这是骨骼肌从血流中吸收葡萄糖从而 维持肌肉中的能量供应和降低血糖水平从而阻止糖尿病需要 MG29 的另外证明。如果缺少 MG29 可以诱导糖尿病， 那么控制 MG29 表达可以提供治疗 I 型和 II 型糖尿病的有效方法。
     在另一系列实验中， 我们直接测试了这些假设， 即， MG29 表达的丧失将会阻止肌肉 中胰岛素诱导的葡萄糖摄取， 以及另外 MG29 的表达将会增大骨骼肌摄取葡萄糖的能力。这 里我们使用 2- 脱氧葡萄糖摄取分析来测量不同小鼠肌肉在静息状态和在暴露于胰岛素的 情况下吸收葡萄糖的能力 ( 图 8)。从野生型或 MG29 基因敲除 (mg29-/-) 小鼠中切出比目 鱼肌或趾长伸肌 (EDL)， 并测试它们的葡萄糖摄取。在这个分析中， 我们看到， mg29-/- 小鼠 相比 wt 小鼠表现出显著降低的 2-DG 摄取能力， 证实了我们早期的研究结果， 即， 这些小鼠 的葡萄糖摄取受损。在另一组实验中， 我们测量了由于用仅在骨骼肌中产生增大的 MG29 表 达 ( 参见图 15) 的重组 AAV 处理而过表达 MG29 的野生型小鼠的葡萄糖摄取。当测试这些 MG29 过表达肌肉的摄取能力时， 它们表现出增大的葡萄糖摄取能力。 这些研究表明 MG29 是胰岛素刺激的葡萄糖摄取所必需的， 在肌细胞内提供另外的 MG29 可以增大葡萄糖摄取。因 而， 增大 MG29 表达是降低血糖水平来治疗糖尿病的可行途径。
     骨骼肌的 Ca 火花反应在 mg29-/- 和糖尿病肌肉中受损。我们前面的工作已经证 明， mg29-/- 骨骼肌在渗透应力 8 之后表现出受损的 Ca 火花反应。考虑到在 mg29-/- 动物 和糖尿病患者之间看到有关葡萄糖操控的相似的功能表型， 我们测试了是否也可以在 Ca 信号中看到相似的缺陷。在 13 ～ 16 周龄的对照野生型、 I 型糖尿病小鼠 (akita) 或 II 型 糖尿病小鼠 (db/db) 中执行 Ca 火花测量。记录紧接在处死小鼠之前从其尾部静脉中取出 的血液样品的非禁食血清葡萄糖水平。按照我们实验室中确定的方案， 我们测量了从趾短 屈肌 (FDB) 分离的肌纤维中的 Ca 火花。我们观察到， db/db 肌纤维中自发性静息 Ca 火花 的频率未增大 ( 数据未给出 )。 我们实验室前面的研究表明， 在年轻和健康 WT 肌肉纤维中， 通过短暂地施加低渗 Tyrode 溶液而短暂地暴露于渗透应力中可以使肌纤维膜肿胀， 用等 渗 Tyrode 立即清洗可以使膜体积恢复， 接着产生外周强有力的 Ca 火花活性。利用这种途 径， 我们发现 db/db 肌纤维与 WT 肌纤维相比表现出数目大大减少的 Ca 火花事件 ( 图 9a)。 火花频率降低的程度可能与动物的血糖水平直接关联， 其中更严重的糖尿病动物与血糖水 平较低的这些动物相比表现出更少的火花 ( 图 9b)。当基于非禁食血糖水平对 db/db 小鼠 进行分类时， 我们发现存在这样的阈值， 即， 当血糖小于 260mg/dL( 较低的血糖 ) 时， 尽管 2+ 在这些小鼠中观察到明显的肥胖， 但 Ca 火花频率没有受损 (145±22 事件 /min) 的阈值。 此外， 我们发现 I 型糖尿病的 akita 模型中 Ca 火花减少。这些结果表明， Ca 火花减少是糖 尿病肌肉的共同特征， 而且这种表型可能归因于 MG29 表达或功能的变化， 因为它们非常像 mg29-/- 骨骼肌的已知表型。
     与提高葡萄糖水平关联的处理修复糖尿病的 Ca 火花反应。糖尿病治疗的最新 发现已集中于靶向肠促胰岛素 (incretins)， 膳食摄入之后活化的胃肠激素的活性， 其为 II 型糖尿病的治疗途径。胰高血糖素原 (pro-glucagon) 起源的胰高血糖素样肽 1(GLP1) 是一类肠促胰岛素激素。GLP1 的生理功能包括刺激胰腺 β 细胞释放胰岛素， 抑制胰高 血 糖 素 活 性， 从 而 使 它 成 为 治 疗 DM 的 治 疗 靶 (Gutniak， M.， Orskov， C.， Holst， J.J.， Ahren， B.&Efendic， S.Antidiabetogenic effect of glucagon-like peptide-1(7-36) amide in normal subjects and patients with diabetes mellitus.N Engl J Med326， 1316-22(1992))。Merck 发现的 Sitagliptin(Januvia) 的目标是抑制切割 GLP1 的二肽 基肽酶 4(DPP-4)， 从而延长人体中的 GLP1 的寿命。虽然用 Januvia 治疗的患者表现出血 糖正常化， 但此时还没有完全检查 Januvia 在骨骼肌中的生理影响。有趣地， 将 GLP1 与大 鼠比目鱼肌一起温育的离体研究发现， PKB 和糖原合成酶活性增大， 表明代谢和功能得到 改善 (Acitores， A.， Gonzalez， N.， Sancho， V.， Valverde， I.&Villanueva-Penacarrillo， M.L.Cell signalling of glucagon-like peptide-1action in rat skeletal muscle.J Endocrinol 180， 389-98(2004))。
     这里我们测试了是否 GLP1 处理不仅可以降低血糖水平， 而且还可以增大在糖尿 病骨骼肌中观察到的 Ca 火花数目。我们发现持续 1 小时的 GLP1 处理 (10nM) 显著增多了 db/db 肌纤维中的 Ca2+ 火花事件， 从而将 Ca2+ 火花频率恢复到类似于未经处理的 WT 中的水 平 (Fig.10a， b)。这暗示着， GLP1 处理可以激活信号级联， 该信号级联导致 RyR 开放概率 (Po) 增大， 而不是每根纤维中的 RyR 数目增多， 因为用 GLP1 处理 WT 肌肉导致 Ca2+ 火花频率仅微量增加。如 Ca2+ 火花定位的图表所示， 在 db/db 或 WT 纤维中 GLP1 处理都没有改变 2+ 外周肌膜下 Ca 火花分布 ( 图 1oc)， 暗示虽然糖尿病纤维中的 Ca2+ 信号级联发生改变， 但 2+ 负责维持该膜附近 Ca 火花定位的因素仍然是完整的。
     给予 GLP1 可以改善糖尿病小鼠骨骼肌的收缩性。我们的关于糖尿病骨骼肌 Ca 调控特性的数据揭示， 糖尿病动物中 Ca 火花反应受损可以通过施用 GLP1 逆转。这激起 我们测试增大的 Ca 火花活性是否可以转化为 (translated as) 增大的肌肉力量， 如通过 离体收缩性分析所测量的。将非禁食 db/db 小鼠的趾长伸肌 (EDL) 安装在测力器 (force transducer) 上， 并按照图 11 所示的方案进行电刺激。 在收缩性研究中给予 10 倍于 Ca2+ 火 花实验所用剂量的 GLP1(100nM) 从而将解剖肌肉相比分离的肌纤维增大的质量考虑进去。 测试了该肌肉在各种频率下产生的最大力量 (Tmax)， 然后利用电场的快速脉冲使该肌肉疲 劳， 然后再测量 Tmax。GLP1 施用 1 小时后， 对该肌肉重复执行这种刺激方案 ( 图 11a)。计 算在 GLP1 施用前后 Tmax 的比率， 将可以说明施用 GLP1 可以如何影响疲劳后肌肉功能的恢 复。
     在利用 db/db 肌肉进行的系列收缩性实验中， 我们发现 GLP1 处理可以增大 db/db 小鼠的 Tmax 恢复率。未经处理的 db/db 肌肉的恢复率 (0.6) 相比未经处理的 WT(1.1) 降 低。GLP1 暴露可以使 db/db 肌肉的恢复率重回到在 WT 肌肉中看到的水平 ( 图 11b， c)。这 个数据表明， GLP1 处理可以使肌肉从剧烈刺激引起的疲劳中更好地恢复。
     肌肉收缩方面的进一步检查表明， GLP1 处理没有显著改变 db/db 肌纤维的力量频 率关系 ( 图 11d)。另外， GLP1 处理后颤搐率没有显著变化。这揭示， GLP1 处理没有改变肌 肉收缩仪器对 Ca 的灵敏度。因而， 该肌肉制品是通过上游信号通路的作用而不是收缩蛋白 的变化的作用而对 GLP1 暴露作出反应的。
     糖尿病肌肉中 MG29 表达的变化和自噬标记。组织对疾病的病理生理学反应经常 包括特定基因的表达变化。因为我们已将 MG29 的缺乏与糖尿病表型如高血糖水平和 Ca 调 控缺陷的形成联系在一起， 所以我们测试了糖尿病肌肉中 MG29 表达将如何变化。在图 12 中， 我们发现糖尿病肌肉中 MG29 蛋白水平的增大与血液中葡萄糖的浓度直接关联。这可以 构成由对糖尿病小鼠血糖水平增大的反应而产生的糖尿病肌肉代偿反应， 试图增大骨骼肌 摄取葡萄糖的能力。
     有趣地， 我们也观察到糖尿病动物的自噬作用增强， 它也依赖于血液中的葡萄糖 浓度。自噬是在细胞的营养物除去后被诱导的细胞状态。在这些状态下， 细胞将消耗多种 细胞器， 试图产生另外的能量以便让细胞存活。这个过程对于细胞重塑以及在产生新细胞 时某些细胞器的再循环也很重要。 自噬已与包括肿瘤形成和糖尿病在内的数种致病状态有 关。如从图 12 中可以看出， 在糖尿病小鼠骨骼肌中微管相关蛋白轻链 3(LC3) 转换率增大， 这是自噬作用增强的标志。Akita 和 db/db 小鼠都表现出增大的 LC3 转换率， 该转换率与 血糖水平的升高直接关联。这些研究结果类似于在各种糖尿病模型中的胰腺 β 细胞中看 到的那些， 其中增强的自噬作用被认为可以促使糖尿病病状的进展。 因而， 这些研究结果表 明， 增强的自噬作用可能通过也影响骨骼肌功能而促使糖尿病的进展。如果骨骼肌中的自 噬反应可以通过操控 MG29 通路或通过其它方式调节， 那么这可以为糖尿病提供治疗途径。
     MG29 可以促进肌细胞中的 Glut4 活性。 考虑到在 mg29-/- 小鼠中观察到的糖尿病 易感性表型， 有必要确定是否 MG29 可以对与血液葡萄糖摄取有关的骨骼肌机构有直接影响。我们第一系列实验确定了， MG29 和 Glut4 可以在细胞中形成物理相互作用复合物。我 们发现， MG29 的荧光融合蛋白和同一细胞中表达的 Glut4 将共同定位于囊泡样结构中 ( 图 13a)。这为两种蛋白质之间存在物理相互作用提供了证据。
     我们继续研究从而确定在肌细胞中这种物理相互作用是否具有功能影响。C2C12 肌源性细胞系没有表达 MG29， 并在先前已被证明对胰岛素刺激不敏感。当荧光标记的 Glut4 表达在 C2C12 细胞中时， 我们发现改变的 Glut4 定位可以促进 C2C12 细胞对胰岛素 的不敏感性。Glut4 主要远离质膜定位， 在此处它将不能摄取葡萄糖 ( 图 14a)。为了确定 MG29 表达的缺少是否会促使 C2C12 细胞中的 Glut4 定位异常， 我们制取可以在肌细胞中特 异性表达 MG29 的腺相关病毒 (AAV)(AAV-fgMG29)( 图 15a)。当 C2C12 细胞受到这种病毒 感染时， 它们可以表达丰富的 MG29( 图 15b)， 而非肌肉 HEK293 细胞在受感染时不能表达 MG29， 证实病毒诱导的表达具有肌肉特异性。我们发现， 我们也可以利用这种病毒， 通过将 其注射到活小鼠肌肉中来增大天然骨骼肌中的基因表达 ( 图 15c)， 这可以被证明为增大肌 肉中 MG29 表达量的有效治疗途径。在 C2C12 细胞中， MG29 表达使得 Glut4 出现在质膜上的 频率似乎大得多 ( 图 14b)。我们发现， 这是剂量依赖性反应， 其中 MG29 水平的增大将直接 导致出现在质膜上的 Glut4 增多 ( 图 14c)。这些研究结果表明， MG29 表达是适当的 Glut4 功能所必需的， MG29 表达的增大可以增多定位于质膜上的 Glut4。如果 MG29 表达水平可以 增大， 可能通过施用 AAV-fgMG29 或其它药物或分子方式增大， 那么增强 Glut4 运输到质膜 ( 的能力 ) 可以增强肌细胞摄取葡萄糖 ( 的能力 )。
     MG29 表达随着运动增大。运动可以诱导肌肉摄取葡萄糖， 经常用作改变生活方式 辅助治疗 II 型糖尿病患者的方式。先前也已证明长期运动训练可以调节骨骼肌中许多基 因的表达， 特别是与生理性肥大期间收缩仪器的装配相关的那些。 然而， 在运动之后蛋白质 表达水平就立即显著增大的基因实例很少， 已知这种情况发生在 Glut4 移位到质膜上时。 在我们检查 MG29 在肌肉疲劳和肌肉减少症中的作用时， 我们对运动后小鼠骨骼肌中 MG29 表达是否改变进行测试。我们发现在一轮跑台运动之后 MG29 表达水平立即增大 ( 图 16)。 在跑台运动 24 小时后， 这种表达的增大达到峰值。 考虑 mg29-/- 小鼠或老化骨骼肌中 MG29 水平的降低与肌肉性能衰减和疲劳感增大相关， 这种 MG29 表达的短暂增大可能是骨骼肌 对急性运动的适应性反应。增大的 MG29 可以增强肌肉性能并将这些状况下的疲劳减到最 低。如果 MG29 上调是此种反应的一部分， 那么诱导 MG29 表达的进一步增大可能足以另外 地改进骨骼肌性能和增大肌肉摄取葡萄糖摄取。
     MG29 表达经受转录后调节。考虑到在短暂的一轮跑台运动之后 MG29 表达显著上 调， 我们试图更好地理解控制 MG29 表达的细胞机制。 在这个过程中， 我们观察到 C2C12 肌源 性细胞在成肌细胞阶段或分化的肌管阶段都不能不表达 MG29 蛋白 ( 图 17a)。当 C2C12 成 肌细胞分化成肌管并在不同时间点进行收获时， 通过 Western 印迹没有检测到蛋白表达， 然而通过实时 PCR 可以检测到丰富的 MG29mRNA 表达。这些研究结果高度揭示， 在 mRNA 水 平上发生了一定水平的 MG29 翻译控制。如果可以解析这种调节的分子机制， 那么可以提供 操控 MG29 表达的方法， 作为对抗糖尿病的治疗途径。
     为了理解控制 MG29 转录后调节的分子机制， 我们检查了 MG29mRNA 的结构。我们 发现小鼠和人 mg29mRNA 中的 3’ UTR 大大长于这些物种中的 mRNA 的平均 3’ UTR， 并且生物 信息学建模发现主要二级结构存在于 MG29 的 3’ UTR 区 ( 数据未给出 )。3’ UTR 的缺失分析确定了负责转录后调节的特异性区域 ( 图 17b)。这个区域含有增强或阻遏 mRNA 翻译的 补助因素 ( 辅助因子， accessory factors) 的数个结合位点。发现的三类特别有趣的序列 是 HuR、 ARE 和 15-LOX-DICE 位点。HuR 位点反应于应激如氧化应激而调节 mRNA 的稳定性 和翻译。ARE(AU 富含元件 ) 与 mRNA 失稳有关。15-LOX-DICE(15- 脂氧化酶分化控制元件 ) 与 hnRNP E1 和 K 结合从而抑制翻译开始。ARE(AU 富含元件 ) 与 mRNA 失稳有关。
     明显地， MG29 表达的转录后水平以依赖于天然 MG29mRNA 的 UTR 的存在的方式被 调节。调制这种调节通路可以增大骨骼肌中 MG29 的表达。这增大了 MG29 蛋白的表达， 因 而具有作为糖尿病治疗途径的潜在性。另一种潜在途径可以是增大细胞中 MG29 的功能， 而 不需增大 MG29 的表达。
     实验材料和方法
     细胞转染。C2C12 鼠类成肌细胞系购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)( 马纳萨斯 (Manassas)， VA)。使细胞在补充有 10％胎牛血清、 100 单 位 /ml 青霉素和 100ug/ml 链霉素的 C2C12 或 HEK293 细胞 DMEM 培养基中在 37℃和 5％ CO2 下的加湿环境中生长。为了诱导肌管分化， 使 C2C12 成肌细胞生长至汇合， 并将培养基更换 成含有 2％马血清、 青霉素 (100U/ml)、 链霉素 (100μg/ml) 的 DMEM。 对于短暂转染， 将 70％ 汇合的 C2C12 成肌细胞或 HEK293 细胞接种在玻璃底器皿中或塑料多孔组织培养皿中。24 小时之后， 按照制造商的指导， 使用 GeneJammer 试剂 (Stratagene) 用质粒转染细胞。在转 染后的 24 ～ 48 小时或独立实验指示的时间， 通过活细胞共焦成像使细胞可视化。其它细 胞用于分离 mRNA 或蛋白质从而执行 Western 印迹和其它生物化学实验。在一些实验中， 在 观察前使 C2C12 成肌细胞分化成肌管， 持续指示的时间。
     FDB 骨骼肌纤维分离。通过颈脱位法处死小鼠， 并手术除去后肢， 放入测得渗透 压为 290mOsm 的等渗 Tyrode 中。切出趾短屈肌 (FDB)， 并转移到补充有 0.2％ I 型胶原酶 (Sigma C-0310) 的 Tyrode 中， 在 37℃下放置 90 分钟。通过小直径移液器轻轻地将肌纤维 分成数代。将分离的 FDB 肌纤维涂布 ( 接种， plate) 在 ΔTC 玻璃底器皿 (Bioptech 有限 公司 ) 中的 1ml Tyrode 缓冲液中。
     共焦 Ca2+ 成像和火花分析。在单独的肌纤维分离后， 将该纤维涂布在含有等渗 tyrode 溶液 (290mOsm) 的器皿中。将 10μM Fluo4-AM， 膜渗透性细胞溶质 Ca2+ 指示剂染料 装到该器皿中， 放置在室温下温育 60 分钟， 同时进行不同的药物处理。用等渗 tyrode 替换 该器皿容积的 50％三次， 洗涤该器皿中多余的染料。 使用亮视野共焦显微术， 通过光学显微 术筛查完整肌纤维膜和规则条纹式的纤维。将符合这些标准的肌纤维浸浴在等渗溶液， 生 理静息条件下。在装配有氩激光器 (479nm)、 氦 - 氖激光器 (632nm) 和 40X， 1.3NA 油浸物镜 2+ 的 BioRad Radiance-2100 共焦显微镜上测量 SR Ca 的释放。以 2ms/ 线的采集速度进行 线扫描成像， 以 3.08s/ 帧 (512x512 像素 ) 采集系列 x-y 图像。 施加渗透性冲击来扰乱膜偶 联的并置 (juxtaposition)， 从而分析 Bin1 的敲低是否会改变 Ca2+ 火花活性。 首先， 用等渗 溶液灌注纤维 30 秒， 然后施加诱导膜肿胀 ( 膨胀， swell) 的低渗 Tyrode 溶液 (170mOsm)1 分钟。然后迅速地将溶液切换回等渗溶液 (290mOsm) 从而观察膜变形后的 Ca2+ 火花活性。 在这个记录过程中， 观察到 Ca2+ 火花的可逆性 / 可塑性， 不论它们的活性是否是短暂的以及 是否回到基线。对于每个动物， 通过渗透性冲击处理 3 ～ 4 根纤维， 并为每根纤维记录 2 个 图像 ( 由每 2ms 扫描 30000 线的 512 像素 (300002ms linescans of512pixels) 组成 )。使用为 IDL 软件定制的程序执行图像分析， 线性扫描强度针对所计算的静息荧光 (F0) 的标准 化， 和确定单个事件的幅度和持续时间。使用 OriginPro 6.0 软件进行统计学数据分析， 并 使用 ANOVA 完成不同处理组之间的比较。
     完整 EDL 和比目鱼肌分离。从小鼠切出完整 EDL 和比目鱼肌， 将其保存在补充有 12mM 葡萄糖， 不断地用 100％ O2 鼓泡的等渗 Tyrode 溶液中。EDL 肌肉平均长度为 12mm， 平 均质量为 80mg， 而比目鱼肌的平均长度为 10mm， 平均质量为 10mg。将肌肉垂直地安装在玻 璃刺激仪器 (Radnoti) 上， 该玻璃刺激仪器带有铂电极， 附接在可移动等长力测力器 ( 等长 测力器， isometric force transducer) 和固定锚定器上， 可以拉伸肌肉， 直至获得给定频 率和产生 Tmax 的频率下的最大力。
     疲劳期间的力量测量。PowerLab 计算机接口程序 (ADInstruments) 用于控制电 刺激方案， 记录、 数字化和储存力量输出数据。 用在完整肌肉两侧运行的铂电极完成场刺激 ( 方波电流持续 500ms， 300mA 使用频率 )。安装后， 将 EDL 肌肉平行安装， 并调节它们的静 息长度以便产生最大等长力 (Tmax)。然后使该肌肉经受力与频率关系 (1 ～ 120Hz)， 利用 产生 50％ Tmax 的频率进行疲劳刺激。在 50％ Tmax 频率 (1min 间隔， 0.83％频宽比 ( 占空 因数， duty cycle)) 下恢复 20min 之后， 将最终浓度为 100nM 的 GLP1 加入到处理室中， 并 温育 1 小时。然后执行另一组力量与频率、 疲劳和恢复。将 GLP1 处理之后的 Tmax 和颤搐 力值除以处理前的值， 从而计算对照组和 GLP1 处理组的力量下降百分比。对力量与频率关 系进行作图。校准后将力量标准化为克， 并通过 Origin 软件 (OriginLab) 分析所有数据。 在室温 (23±2℃ ) 下进行实验， 并使用学生 t 试验完成组之间的比较。
     溶 液。 该 等 渗 平 衡 盐 溶 液 由 ( 以 mM 计 )5.5 葡 萄 糖、 140NaCl、 5KCl、 2.5CaCl2、 2MgCl2 和 10HEPES(ph7.2) 组成， 测得的渗透压为 290mOsm。在该低渗溶液中， 将 NaCl 调节 到 70mM 从而将渗透压降低到 170mOsm。将 GLP17-36 酰胺溶解在水中从而获得 10nM 的最终 浓度用于火花测量， 和 100nM 的最终浓度用于收缩性实验。将渥曼青霉素 (wortmannin) 溶 解在 0.1％ DMSO 中， 得到 1uM 的最终浓度。所有化合物都从 Sigma 获得。
     Western 印迹。利用标准程序进行免疫印迹。简言之， 收获 C2C12 或 HEK293 细胞， 并在蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (cocktail)(Sigma) 的存在下用冰冷的改良 RIPA 缓冲液 (150mM NaCl， 5mM EDTA， 1％ NP40， 20mM Tris-HCl， pH7.5) 使其裂解。在 4-12％ SDS- 聚丙烯酰胺 凝胶上对 20μg 总蛋白进行分离。
     跑台运动 (treadmill running)。将组中的 6 只小鼠放在后面配备有电网的水平 Exer-6M 啮齿动物跑台 (Columbus Instruments) 上， 连续驯化它们四天。 在第 1 天， 使它们 以 38m/min 运动 5 分钟 ； 第二天以 48m/min 运动 5 分钟 ； 第 3 天以 58m/min 运动 5 分钟 ； 第 4 天以 68m/min 运动 5 分钟。在第 5 天， 使对照和实验小鼠同时以 88m/min 运动直至力竭， 如跌倒在电网上两次所指示的， 记录力竭之前的运动时间。对三个对照和实验小鼠各在每 个实验条件下进行三次试验。
     血糖测量。将雄性和雌性小鼠禁食过夜 (16 小时 )， 称重， 按照 2g/kg 体重给 小鼠腹腔内 (IP) 推注 20 ％ D- 葡萄糖溶液。在注射前， 和注射后的各个时间点 (15、 30、 45、 90、 120 分钟 ) 采集尾部静脉血 ( 约 10μL) 用于通过商业葡萄糖监测器 (OneTouch Ultramini(LifeScan， Johnson&Johnson)) 测量葡萄糖含量。
     2- 脱氧葡萄糖摄取 (2-DG) 分析。 小心地在肌腱处切出肌肉 ( 比目鱼肌和 EDL)， 然后立即将其转移到含有缺少葡萄糖的 2.0ml Kreb’ s 溶液， 和含有 2mM 丙酮酸盐 ( 酯 ) 的小 瓶中， 在振动的水浴 ( 每分钟振荡 60 次， 29℃， 在小瓶空气相中连续通气 95％ O2/5％ CO2) 中 温育 60min。平衡 35 分钟之后， 加入放射性标记的 2-DG(1mM) 和胰岛素 (200nM)， 将其温育 另外 25 分钟， 然后将该样品冻结在液氮中。为了分析 2-DG 摄取， 将肌肉加入到含有 0.5ml 1N NaOH 的 Eppendorf 管中， 在 55℃下加热 60min。 将该管子离心， 将上清液的等分试样加入 到闪烁鸡尾酒 (scintillation cocktail) 中， 并如别处描述的 (Shashkin P 等人， (1995). 14 3 J Biol Chem 270， 25613-25618.) 对 C 和 H 进行计数。葡萄糖摄取率以 umol/25min/ml 细胞内水的方式给出。 对全部肌肉的所有实验都是以成对方式进行的， 即， 一块肌肉没有胰 岛素， 对侧肌肉有胰岛素。
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