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1、(10)申请公布号 CN 102397273 A (43)申请公布日 2012.04.04 CN 102397273 A *CN102397273A* (21)申请号 201110402728.3 (22)申请日 2011.12.07 A61K 31/365(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 沈阳药科大学 地址 110036 辽宁省沈阳市沈北新区道义大 街 168 号 (72)发明人 马恩龙 肖伟 李艳春 邱峰 张鹏飞 杨星刚 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 李宇彤 (54) 发明名称 穿心莲内酯的医药新用途 (。
2、57) 摘要 本发明属于医药技术领域， 涉及穿心莲内酯 的医药新用途， 具体涉及穿心莲内酯在制备用于 治疗恶性胶质瘤药物中的新用途。穿心莲内酯体 内及体外可抑制人恶性胶质瘤细胞的生长， 其机 制涉及下调 PI3K/Akt 信号活性， 进而诱导人恶性 胶质瘤细胞周期阻滞于G2/M期。 穿心莲内酯可制 备肠道及非肠道给药剂型， 用于人恶性胶质瘤的 的治疗。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 CN 102397273 A1/1 页 2 1. 穿心莲内酯在制备治疗人恶性胶质瘤药物中的应用。 2. 根据权。
3、利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 穿心莲内酯作为 PI3K/Akt 信号抑制剂而 使细胞周期阻滞于 G2/M 期。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于， 穿心莲内酯与临床上接受的赋形剂 混合制成肠道或非肠道给药制剂。 权 利 要 求 书 CN 102397273 A1/4 页 3 穿心莲内酯的医药新用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及穿心莲内酯的医药新用途， 具体涉及其在制备 治疗胶质瘤药物中的新用途。 背景技术 0002 恶性胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤， 手术治疗以及放射治疗效果都不理 想。目前化学治疗是临床治疗恶性胶质瘤的主要手段。恶性胶。
4、质瘤发病涉及多种原癌基 因和抑癌基因结构与功能的异常 , 本质上是一种多基因异常性疾病。表现为正常生长调控 异常 , 出现无限增殖和凋亡抑制 , 从而导致细胞异常蓄积 , 乃至肿瘤形成， 有文献表明， PI3K/Akt 信号通路在恶性胶质瘤细胞中过度激活。 0003 PI3K/Akt 信号通路一直以来被广泛关注， 目前我国 PI3K/Akt 信号活性抑制 剂专利有14项。 PI3K/Akt信号可以调节细胞的许多生理功能 ： 细胞周期、 细胞迁移和侵袭、 细胞生存， 据报道 70% 的胶质瘤中存在 PI3K/Akt 信号的超常激活， 因此 PI3K/Akt 信号抑制 剂可以成为治疗胶质瘤的一个突。
5、破口。2006 年礼来公司的 Enzastaurin 获准在欧美等地 作为治疗胶质瘤的孤儿药开展三期临床试验。这种名为 “Enzastaurin” 的新药是一种口服 PI3K/Akt 信号抑制剂， 它通过降低细胞增殖能力、 加速肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤诱发的 血管生成等多种机制抑制肿瘤生长。 0004 穿心莲是爵床科植物的地上部分， 它是一种常用中药， 味苦性寒， 归心肺大肠膀胱 经。 泉州本草 记载其能 “清热解毒、 消炎退肿、 治咽喉炎症、 痢疾、 高热” ， 属清热解毒药。 穿心莲内酯是穿心莲的主要成分之一， 它分子量是350.44， 呈方菱形或片状结晶。 穿心莲内 酯有广泛的药理作用，。
6、 它不仅具有解热抗炎、 抗病毒和调节免疫的作用， 而且具有抗肿瘤作 用， 在体内、 体外均有抑制多种肿瘤增殖和诱导分化的作用。 作用机理涉及诱导肿瘤细胞 凋亡 ； 阻滞细胞周期于G0/G1期 ； 抑制肿瘤血管生成等。 然而目前对于穿心莲内酯在恶 性胶质瘤治疗中的应用及作用机制均未见报道。 发明内容 0005 本发明首次发现穿心莲内酯可通过全新的机制产生抗恶性胶质瘤作用， 从而可制 备用于治疗人恶性胶质瘤的药物。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ： 穿心莲内酯可诱导恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞周期阻滞于 G2/M 期从而抑制细胞生长 ； 能够在体外对恶性胶质瘤 U251、。
7、 U87 细胞生长具有抑制作用 ； 穿心莲内酯体内对荷胶质瘤 动物模型肿瘤生长具有抑制作用 ； 穿心莲内酯诱导 G2/M 周期阻滞与下调 Cdk1 和 Cdc25C 蛋 白表达有关 ； 还可以作为 PI3K/Akt 信号抑制剂通过抑制 PI3K/Akt 信号产生周期阻滞及增 殖抑制作用。 0007 穿心莲内酯可与临床上接受的赋形剂混合制成组合物， 用于制备治疗恶性肿瘤的 说 明 书 CN 102397273 A2/4 页 4 药物。 附图说明 0008 图 1 为穿心莲内酯体外对恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞生长的抑制作用 ； 图 2 为穿心莲内酯对荷胶质瘤动物模型肿瘤生长的抑制作用 ；。
8、 图 3 为穿心莲内酯可诱导恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞周期阻滞于 G2/M 期 ； 图 4 为穿心莲内酯对恶性胶质瘤细胞 G2/M 周期调控蛋白表达的影响 ； 图 5 为穿心莲内酯可抑制恶性胶质瘤细胞 PI3K/Akt 信号活性 ； 图 6 为 PI3K/Akt 信号抑制剂 LY294002 可增强穿心莲内酯诱导的增殖抑制、 G2/M 周期 阻滞以及 Cdk1 和 Cdc25C 蛋白下调作用。 具体实施方式 0009 实施例 1、 穿心莲内酯体外对恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞生长的抑制作用 1 实验方法 U251、 U87 细胞贴壁生长于含 10胎牛血清、 100U/ml 青。
9、霉素、 100g/ml 链霉素、 0.2%NaHCO3 的 RPMI-1640 培养液中， 置于含 5 CO2、 饱和湿度、 37培养箱里培养， 隔天换 培养液传代培养。 0010 取对数生长期的贴壁肿瘤细胞配制成 6104个 /mL 浓度， 每孔 100l 接种于 96 孔板中培养过夜， 待细胞充分贴壁后， 除去原有的培养液， 加入不同浓度穿心莲内酯 （沈阳 药科大学天然药物研究室提供） 、 PI3K/Akt 信号特异抑制剂 LY294002（5M、 10M、 20M， 阳 性对照） 或 DMSO（终浓度 0.1%， 阴性对照） ， 每孔 100l。37 分别培养 48 小时、 72 小时，。
10、 培养结束后每孔加入 5mg/ml MTT 15l 继续 37培养 4 小时后小心弃去上清液， 加 DMSO 150l /well， 振荡 10 分钟以充分溶解结晶物。在酶标仪下测定 OD 值， 按公式计算药物对 肿瘤细胞体外增殖的抑制率 （Inhibition Rate， IR） 。 0011 2 实验结果 由图 1 可见， 穿心莲内酯 （Andro） 在 10-100M 浓度范围内作用 48 或 72 小时对体外培 养的人恶性胶质瘤细胞 U251、 U87 的增殖有抑制作用， 且其增殖抑制作用呈时间及浓度依 赖性。作用 72h 的 IC50 为 45M。阳性对照药 LY294002 对人恶。
11、性胶质瘤细胞 U251 也呈现 剂量依赖性的增殖抑制作用。 0012 实施例 2、 穿心莲内酯体内对荷胶质瘤动物模型肿瘤生长的抑制作用 1 实验方法 六周龄雌性裸鼠 15 只， 购于中国军事医学科学院， 恒温恒湿饲养于无菌系统。分 为三组， 空白对照组， DMSO 组和穿心莲内酯 （Andro） 给药组， 每组 8 只。取 U251 细胞， 调至 细胞浓度为 3107/ml， 细胞活力用台盼蓝检测， 细胞存活率 90%， 用注射器吸取上述悬液， 右后肢外侧皮下注射 100 l 单细胞悬液。三组裸鼠接种后 5 日后， 用游标卡尺测量肿瘤 长径和短径， 然后每日分别灌胃给药相应剂量药物， 空白对照。
12、组裸鼠不予处理， DMSO 组裸鼠 每日灌胃含 0.2% DMSO 的羧甲基纤维素钠溶液， 穿心莲内酯 （Andro） 给药组裸鼠每日灌胃 说 明 书 CN 102397273 A3/4 页 5 50mg/kg 穿心莲内酯 （溶于含 0.2% DMSO 的羧甲基纤维素钠溶液） 。给药后每 5 日游标卡尺 测量肿瘤长径和短径， 按 “肿瘤大小 = 肿瘤长径 短径 20.5” 计算瘤体积。取每组的平 均值， 绘制药物对肿瘤生长的抑制曲线。 2 实验结果 由图 2 可见， 与 DMSO、 空白对照组相比， 50mg/kg 穿心莲内酯灌胃给药可显著抑制人恶 性胶质瘤模型肿瘤的生长。 0013 实施例 。
13、3、 穿心莲内酯可诱导恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞周期阻滞于 G2/M 期从而 抑制细胞生长 ； 1 实验方法 为了确认穿心莲内酯抑制人恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞增殖作用的机制， 采用流式细 胞术考察了不同浓度穿心莲内酯作用后细胞周期分布的变化。U251、 U87 细胞以 1106个 /ml 的密度种在培养瓶中， 加入不同浓度穿心莲内酯后 72 小时收集细胞， 1000 rpm/ 分离 心 5 分钟， 小心弃尽上清， 分别加入 500 lPBS， 混悬细胞， 逐滴加入 10 ml 70% 的冰冷乙 醇， -20固定过夜。检测前样品 1000 rpm/ 分离心 5 分钟， 小心。
14、弃尽上清， 每份样品中加入 10 l 的 RNAase(200 g/ml） ， 混匀， 37作用 30 分钟后， 加入 50 l 的 PI (1 mg/ml） ， 4避光作用 30 分钟， 流式细胞仪检测。 0014 实验结果 结果表明， 穿心莲内酯作用72小时， 可呈剂量依赖性的诱导人恶性胶质瘤U251、 U87细 胞周期阻滞于 G2/M 期。说明穿心莲内酯对恶性胶质瘤细胞的增殖抑制作用与诱导细胞周 期阻滞于 G2/M 期相关。 0015 实施例 4、 穿心莲内酯诱导恶性胶质瘤细胞发生 G2/M 周期阻滞与下调 Cdk1 和 Cdc25C 蛋白表达有关 ； 1 实验方法 为考察穿心莲内酯诱导。
15、恶性胶质瘤细胞 G2/M 周期阻滞作用的机制， 采用 Western blotting 方法检测穿心莲内酯对 G2/M 周期调控蛋白表达的影响。收集经穿心莲内酯处理 60 小时细胞 1106个， 蛋白裂解液冰浴裂解 30 分钟后， 收集样品， 上样前用 Bradford 法测 定样品蛋白浓度。按 10 g/ 孔上样， 70V 电泳后将蛋白转移至 PVDF 膜。一抗杂交后的膜 在 TBST 溶液中漂洗 3 次， 每次室温轻摇 10 分钟。加入二抗， 室温轻摇孵育 1 小时后 ECL 发 光底物显色， 暗室中放入医用 X 射线胶片曝光。 0016 实验结果 如图 4 所示， 50 M、 70 M 。
16、的穿心莲内酯作用 60 h 可下调恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞 Cdk1 和 Cdc25C 蛋白的表达， 而对 Cyclin A、 Cyclin B1 的表达没有影响。表明穿心莲内酯 诱导的 G2/M 阻滞与下调 Cdk1 和 Cdc25C 蛋白有关。 0017 实施例 5、 穿心莲内酯可抑制恶性胶质瘤细胞 PI3K/Akt 信号活性 1. 实验方法 Western blotting 法 （同实施例 4 方法） 2. 实验结果 由图 5 可见， 30、 50、 70 M 的穿心莲内酯作用 60 h， 可剂量依赖性的下调 U251、 U87 细 胞PI3K/Akt信号中磷酸化Akt、 磷。
17、酸化mTOR及磷酸化p70s6k蛋白的表达， 磷酸化Akt、 磷酸 说 明 书 CN 102397273 A4/4 页 6 化mTOR及磷酸化p70s6k蛋白水平的下降表明应用穿心莲内酯后， 恶性胶质瘤细胞中PI3K/ Akt 信号的活性被抑制。 0018 实施例 6、 PI3K/Akt 信号抑制剂 LY294002 可增强穿心莲内酯诱导的增殖抑制、 G2/M 周期阻滞以及 Cdk1 和 Cdc25C 蛋白下调作用 1. 实验方法 恶性胶质瘤 U251、 U87 细胞预先用 LY294002 处置 30 分钟， 再用不同浓度穿心莲内 酯处置， 分别考察 PI3K/Akt 信号抑制剂 LY294。
18、002 对穿心莲内酯诱导的增殖抑制、 G2/M 周 期阻滞以及 Cyclin A、 Cyclin B1 蛋白下调作用的影响。增殖抑制采用 MTT 法 （同实施例 1 方法） ， G2/M 周期阻滞采用流式细胞术 （同实施例 2 方法， 蛋白表达采用 Western blotting 法 （同实施例 4 方法） 。 0019 实验结果 如图 6 所示， 单独使用 LY294002（5 M） 能够抑制恶性胶质瘤 U251 细胞中 Akt 的活 化 （图 6G） ， 但不能产生明显细胞增殖抑制和 G2/M 周期阻滞作用 （图 6A-F） 。当 LY294002 （5 M） 与穿心莲内酯 （30 M）。
19、 合用后， 可见 PI3K/Akt 信号抑制作用明显增强。同时， 与各 自单独应用比较， 二者合用后对恶性胶质瘤细胞的增殖抑制和 G2/M 周期阻滞作用明显增 强 （P0.01） （图 6A-F） ， 说明进一步抑制 PI3K/Akt 信号可增强穿心莲内酯诱导的增殖抑制 和 G2/M 周期阻滞作用， 也表明抑制 PI3K/Akt 信号确实参与了穿心莲内酯诱导的增殖抑制 和 G2/M 周期阻滞作用。LY294002（5 M） 也可增强穿心莲内酯 （30 M） 诱导的 Cdk1 和 Cdc25C 蛋白下调作用 （图 6G） ， 说明穿心莲内酯抑制 PI3K/Akt 信号可直接也可间接通过下 调 Cdk1 和 Cdc25C 蛋白而诱导 G2/M 周期阻滞作用。 说 明 书 CN 102397273 A1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102397273 A2/4 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102397273 A3/4 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 102397273 A4/4 页 10 图 6 说 明 书 附 图 。