不动杆菌的ZEN毒素降解酶及其编码基因与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102618517 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618517 A *CN102618517A* (21)申请号 201210089260.1 (22)申请日 2012.03.29 C12N 9/18(2006.01) C12N 15/55(2006.01) A23L 1/015(2006.01) A23K 1/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381 号 (72)发明人 唐语谦 吴晖 余元善 肖性龙 肖俊梅 陈艺 (74)专利代理机构 。

2、广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 (54) 发明名称 不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶及其编码基因与 应用 (57) 摘要 本发明公开了不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶及 其编码基因与应用。不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.6 所示。不动杆菌的 ZEN毒素降解酶的编码基因的序列如SEQ ID NO.5 所示。本发明的不动杆菌 ZEN 毒素降解酶对真菌 毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解能力， 可在 12h 内将 90以上的 ZEN 降解成低雌激素活性产物， 不生成玉米赤霉烯酮、 玉米赤霉醇等高雌激素活 性类似物， 具有真正的脱毒效果。本发明确定。

3、了 Acinetobacter sp.SM04 的玉米赤霉烯酮毒素降 解酶编码序列， 即 Prx 基因， 为将来研究酶的活性 位点和通过定点突变改变 Prx 酶活奠定了基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶， 其特征在于 ： 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.6 所示。 2. 权利要求 1 所述的不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶的编码基因， 其特征在于 ： 其。

4、序列如 SEQ ID NO.5 所示。 3. 权利要求 1 所述的不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102618517 A 2 1/8 页 3 不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及不动杆菌 Acinetobacter sp.SM04 的玉米赤 霉烯酮毒素降解酶及其编码基因与应用。 背景技术 0002 玉米赤霉烯酮 (zearalenone， ZEA， ZEN) 是一种具有二羟基苯甲酸内酯结构的雌 激素类真菌毒素， 由玉米赤霉菌、 禾谷镰刀菌、 三线镰刀菌等菌产生， 主要污染小。

5、麦、 大麦、 燕麦、 玉米等农作物。全世界每年约有 25的农作物被霉菌毒素污染， 我国食品和饲料工 业平均每年因霉变所致损失总产量 10以上。从全国仓库和饲料厂中抽样检测， 发现玉米 等农作物和饲料中 ZEN 的检出率高达 100， 检出浓度超标严重。ZEN 会引起种猪或家禽早 熟， 生殖周期紊乱， 给种猪等养殖业带来巨大的损失。而且， 人摄入被 ZEN 污染的农、 畜产品 可引发多种中毒症、 中枢神经受损， 甚至死亡。因此， 防止农作物和饲料的霉变与霉变后脱 毒处理是食品储藏和食品加工过程中不可或缺的环节。 0003 目前对于霉变的处理， 国内没有理想的脱毒剂。粮食厂、 饲料厂等每年至少需购。

6、 买 2 亿元进口霉菌吸附类解毒剂， 但这类解毒剂并不能真正将毒素降解成无毒物， 而且 ZEN 残留时间长、 难处理， 已引起国内外科研工作者的极大关注。FAO 和世界卫生组织已将解决 ZEN 问题作为全世界的当务之急， 各国对粮食中 ZEN 含量有严格限量标准， 因此， 研究具有 自主知识产权、 经济有效、 不破坏农作物和饲料原有营养成分的 ZEN 脱毒技术具有重要深 远的意义， 符合国民经济和社会发展的趋势。 0004 生物降解是利用自然界存在的微生物分解物质， 对环境不会造成负面影响。目 前 报 道 的 具 有 ZEN 降 解 能 力 的 菌 株， 包 括 有 Fusarium oxys。

7、porum， Agrobactgerium tumefaciens， Clonostachys sp.， Gliocladium roseun， Eubacterium BBSH 797， Trichosporon mycotoxinivorans 等， 人们从中发现了各种对 ZEN 有降解能力的酶。因 ZEN 是二羟基苯甲酸内酯， 人们筛选到一些内酯水解酶， 认为内酯键的打开可将 ZEN 的球形结 构打开变成直链形结构， 使之不能与雌激素受体结合， 从而消除其高雌激素症。 0005 例如 Michihiko 等用外消旋的泛酰内酯作底物从农杆菌中筛选到新的内酯水解 酶 Agrobacteriu。

8、m tumefaciens AKU316， 能高效、 特异地水解泛酰内酯和镰刀菌属的内 酯 (Michihiko K， JunichiN， et al.Purification and characterization of a novel lactono hydrolase from agrobacterium tumefaciens.Biosci.Biotechnol.Biochem.， 2000， 64(6) ： 1255-1262.)。 0006 Jan 等从 Gliocladium roseum 中发现针对 ZEN 的特异性内酯酶 zes2， 该酶可除 去碳酸基， 催化 ZEA 水解。

9、成无毒物 (Jan U， Petr K.Role of zearalenone lactonasein protection of gliocladium roseum from fungitoxic effects of the mycotoxin zearalenone.Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73(2) ： 637-642.)。 0007 Naoko 等克隆了 ZEN 内酯水解酶 zhd101， 并在大肠杆菌成功表达 (Naoko T A， Shuichi O， Takehiko S， et al.Metabolism 。

10、of zearalenone by genetically modified 说 明 书 CN 102618517 A 3 2/8 页 4 organisms expressing the detoxification gene from clonostachys rosea.Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70(6) ： 3239-3249.)。 0008 但酯键的水解并不能完全降解 ZEN， 该反应仍然可逆。Jnos 从根霉属菌和毛霉 菌等丝状真菌中鉴定了与 ZEN 降解有关的酶和基因， 并转入其它微生物用于饲料的脱毒 (Jnos。

11、Varga， ZsanettPteri， KatalinTbori， et al.Degradation of ochratoxin A and other mycotoxins by Rhizopusisolates.Food Microbiology， 2005， 99(3) ： 321-328.)。 0009 以上 ZEN 降解酶作用速率较低， 功能不强。而且， 对已发现微生物代谢物进行分析 后， 发现大部分菌都是将 ZEN 转化成 或 型的 ZEN 或玉米赤霉烯醇， 这些产物的雌激素 毒性与 ZEN 相似或更甚， 这种降解不能称为真正的脱毒。因此， 发掘可以高效、 安全降解玉 米赤霉烯。

12、酮的功能菌株具有重要意义。 0010 上述文献报道为不动杆菌 ZEN 降解酶基因克隆的引物设计及基因测序的同源性 比较提供了依据， 但不动杆菌 ZEN 降解酶基因序列至今未见报道和申请专利。 0011 中国专利申请 201210016172.9 要求保护一株不动杆菌菌株 Acinetobacter sp.SM04 及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用， 该菌对真菌毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解 能力， 可在 12h 内将 90以上的 ZEN 降解成低雌激素活性产物， 不生成玉米赤霉烯酮、 玉米 赤霉醇等高雌激素活性类似物， 具有真正的脱毒效果。 发明内容 0012 为了克服现有技术的缺点与不足， 本发。

13、明的首要目的在于提供不动杆菌的 ZEN 毒 素降解酶。 0013 本发明的另一目的在于提供上述不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶的编码基因。 0014 本发明的再一目的在于提供上述不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶的应用。 0015 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0016 不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.6 所示。 0017 不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶的编码基因， 其序列如 SEQ ID NO.5 所示。 0018 本发明通过培养不动杆菌 Acinetobacter sp.SM04， 从其培养上清液中分离、 纯化 得到 ZEN 降解酶， 经过 SDS-。

14、PAGE 和 MALDI-TOF-TOF/MS 分析和鉴定得到该 ZEN 降解酶的两 段特异性氨基酸序列。 0019 基 于 MALDI-TOF-TOF/MS 酶 蛋 白 分 析 鉴 定 的 蛋 白 序 列，设 计 引 物 扩 增 Acinetobacter sp.SM04ZEN降解酶基因的部分序列， 采用High-efficiency Tail-PCR技术 多次扩增、 拼接后， 得到该酶的全基因核苷酸序列和氨基酸序列， 并对该基因进行表达和蛋 白功能的验证。 0020 实验结果表明 ： 本发明的不动杆菌的 ZEN 毒素降解酶能将 ZEN 降解为低雌激素代 谢产物 ； 本发明不动杆菌的 ZEN。

15、 毒素降解酶的编码基因其重组表达产物亦能有效降解 ZEN。 0021 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 0022 1、 本发明的不动杆菌 ZEN 毒素降解酶对真菌毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解能 力， 可在 12h 内将 90以上的 ZEN 降解成低雌激素活性产物， 不生成玉米赤霉烯酮、 玉米赤 霉醇等高雌激素活性类似物， 具有真正的脱毒效果。 0023 2、 本发明确定了 Acinetobacter sp.SM04 的玉米赤霉烯酮毒素降解酶编码序列， 说 明 书 CN 102618517 A 4 3/8 页 5 即 Prx 基因， 为将来研究酶的活性位点和通过定点突变改变 Prx 。

16、酶活奠定了基础。 附图说明 0024 图 1 是 Acinetobacter sp.SM04 的 M1 培养物上清液的 Sephadex G-50 柱洗脱液 各组分的蛋白质吸收峰图谱 ； 组分 17 为 ZEN 降解酶峰。 0025 图 2 是处理液中 ZEN 的含量变化图。 0026 图 3 是 Prx 基因在 E.coli 中诱导表达的实验结果图 ； 泳道 M ： 蛋白标准分子量 marker(14.4kDa 98kDa) ； 泳道 A ： 未诱导的 BL21(DE3)+Prx 菌体粗酶蛋白 ； 泳道 B ： IPTG 诱导的 BL21(DE3)+Prx 菌体粗酶蛋白 ； 泳道 C ： 纯。

17、化后的重组 Prx。 0027 图 4 是重组 E.coli 表达的 Prx 在不同 H2O2浓度下降解 ZEN 的效率。 0028 图 5 是重组质粒 pY-Prx 的双酶切检测电泳图 ； 泳道 M ： DNA 标准分子量 marker(100bp 1500bp) ； 泳道 1 ： 重组质粒 pY ； 泳道 2 ： 重组质粒 pY-Prx。 0029 图 6 是 Prx 基因在 S.cerevisiae 中诱导表达的实验结果图 ； 泳道 M ： 蛋白标准 分子量 marker(14.4 98kDa) ； 泳道 1 ： INVSc1 菌株诱导表达上清液 ； 泳道 2 ： 重组菌株 INVSc1。

18、-Prx， 诱导 24h， 上清 ； 泳道 3 ： 重组菌株 INVSc1-Prx， 诱导 48h， 上清 ； 泳道 4 ： 重组菌 株 INVSc1-Prx， 诱导 72h， 上清。 0030 图7是重组酿酒酵母表达的Prx酶蛋白降解ZEN的色谱图 ； A ： ZEN标准品 ； B ： 重组 Prx 酶蛋白 +ZEN， 反应时间 0h ； C ： 重组 Prx 酶蛋白 +ZEN， 反应时间 12h。 具体实施方式 0031 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0032 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如分子克隆 ： 。

19、实 验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按 照制造商所建议的条件。 0033 实施例 1 0034 不动杆菌 ZEN 降解酶的制备， 包括以下步骤 ： 0035 (1) 从不动杆菌 Acinetobacter sp.SM04 培养上清液中纯化 ZEN 降解酶 0036 1、 将接种有 1 (v/v)Acinetobacter sp.SM04 菌悬液 (OD600 0.8) 的培养物 (M1 培养基 ) 在 30的气浴摇床中培养 (200r/min)36h 至对数生长末期， 将液体培养物离 心 。

20、5min(12000g， 4 )， 离心后的上清液用 0.22m 滤膜过滤， 滤过液在 50使用真空旋 转蒸发仪浓缩 5 倍 ； 0037 所用培养基的配方如下 ： 0038 基本无机盐培养基 ： 3g NH4NO3、 1.5g K2HPO43H2O、 1g KCl、 0.5gMgSO47H2O、 0.1g CaCl2和 10mL 微量元素储备液混合后， 加去离子水定容到 1000mL， pH7.3。 0039 微量元素储备液 ： 2g/L FeSO47H2O， 0.4g/L MnSO44H2O， 0.4g/LCuSO45H2O， 0.4g/L CoCl66H2O 和 0.5g/L ZnCl2。

21、。 0040 M1 培养基 ： 15g 乙酸钠和 1000mL 基本无机盐培养基混合， 调节 pH 为 7.3。 0041 2、 将浓缩液加入 Sephadex G-50 柱 (2.0cm25cm) 中， 用去离子水洗脱 ( 流速为 说 明 书 CN 102618517 A 5 4/8 页 6 0.5mL/min)， 分段收集， 测定各管组分的 A260nm 值和 ZEN 降解酶活力。合并 ZEN 降解酶活 力高的各管。 0042 3、 用 DEAE Sephadex A-50 柱 (2.0cm20cm) 进一步纯化步骤 (1)-2 获得的 ZEN 降解酶组分， 用磷酸钠盐缓冲液进行pH梯度洗。

22、脱， 分段收集， 分别测定各管组分的ZEN降解 酶活力。合并 ZEN 降解酶活力高的管。 0043 各管组分的 ZEN 降解酶活力测定方法如下 ： 0044 将 0.40mL 各管收集液、 0.10mL 0.25mol/L 的 Tris-HCl(pH8.5) 缓冲液和 20L 0.5mol/L H2O2溶液混合均匀， 添加 10L ZEN 甲醇储备液 (ZEN 浓度为 1mg/mL)， 置于 40 恒温水浴温育 12h， 添加 0.5mL 甲醇中止反应， 在 12000g 下离心 5min， 取 30L 上清液用 HPLC 检测其 ZEN 残量。以去离子水作为空白对照。结果以相对降解活力表示，。

23、 相对降解活 力 ( ) (ZEN 的添加量 - 处理后 ZEN 的残留量 )/ZEN 的添加量 100。 0045 高效液相色谱 (HPLC) 检测 ZEN 的条件 ： 色谱柱采用 Waters XTerraR MS C18 柱 (4.6150mm， 5m)。流动相为乙腈水甲醇 46 46 8。柱温 30， 流量为 1ml/ min。 结果采用荧光检测器， 激发波长274nm， 发射波长450nm。 采用外标法定量ZEN的浓度， 计算各组分的降解效率。 0046 4、 将步骤 (1)-3 获得的 ZEA 降解酶组分再次用 Sephadex G-50 柱纯化， 纯化条件 与步骤 (1)-2 相。

24、同。测定各管组分的 A260nm 值， 其吸收峰见图 1。然后收集各吸收峰测定 其 ZEN 降解活力确定 ZEN 降解酶组分。 0047 (2)ZEN 降解酶的分析及鉴定 0048 1、 步骤(1)最终得到的ZEN降解酶组分用12.5SDS-PAGE凝胶电泳分析， 考马斯 亮蓝染色后， 取出凝胶中蛋白条带进行酶解 (50乙腈， 25mmol/LNH4HCO3， 0.02g/L 胰 蛋白酶， 25mmol/L NH4HCO3， 10乙腈的水溶液， 37， 16h)， 将酶解上清液萃取冻干。 0049 2、 完全冻干的样品重新用 0.1三氟乙酸水溶液溶解， 然后使用 MALDI-TOF-TOF 质。

25、谱仪进行分析， 结果见表 1。 0050 表 1 Acinetobacter sp.SM04 中 ZEN 降解酶的鉴定结果 0051 0052 实施例 2 0053 ZEN 降解酶降解 ZEN 的效率检测 0054 以实施例 1 步骤 (1) 中的 ZEN 降解酶活力测定方法为基础， 取实施例 1 步骤 (1) 最后得到的 ZEN 降解酶， 测定在不同处理时间下处理液中 ZEN 的含量变化， 结果见图 2。 0055 从图 2 可以看出， 纯化的 ZEN 降解酶利用 H2O2氧化降解 ZEN 的降解速率相对 较慢， 可在 12h 内降解 90以上的 ZEN， 根据斜率推算出其氧化降解 ZEN 。

26、的速率约为 1.6gmL-1h-1。 0056 实施例 3 说 明 书 CN 102618517 A 6 5/8 页 7 0057 ZEN 被 ZEN 降解酶降解后产物的雌激素活性检测 0058 将 0.40mL 实 施 例 1 步 骤 (1) 最 后 得 到 的 ZEN 降 解 酶、 0.10mL0.25mol/L 的 Tris-HCl(pH8.5) 缓冲液和 20L 0.5mol/L H2O2溶液混合均匀， 添加 10L ZEN 甲醇储备 液 (1mg/mL)， 置于 40恒温水浴温育 12h， 添加 0.5mL 甲醇中止反应。 0059 上述的反应产物(即实验组)用来进行MCF-7细胞增。

27、殖率测试。 用不添加ZEN的处 理组和 ZEN 溶液 (10L 1mg/mL 的 ZEN 甲醇储备液与 0.14mL 0.25mol/LTris-HCl(pH8.5) 缓冲液和 20L 0.5mol/L H2O2溶液混合均匀 ) 作对照组。 0060 MCF-7 人乳腺癌细胞购买自中国科学院细胞库。MCF-7 人乳腺癌细胞增殖实 验 方 法 见 文 献 Cetin Y.， Bullerman L.B.Cytotoxicity of Fusariummycotoxins to mammalian cell cultures as determined by the MTT bioassayJ.F。

28、ood and Chemical Toxicology， 2005， 43 ： 755-764。 0061 实验结果 ： 12h 后， 实验组 MCF-7 细胞的增殖百分比为 3.21.4， 处理组 MCF-7 细胞的增殖百分比为1.20.7， 均未表现出对MCF-7细胞有增殖作用， 而对照组MCF-7细 胞的增殖百分比高达 860.8。 0062 上述结果证明 ： Acinetobacter sp.SM04 的 ZEN 降解酶可将 ZEN 降解为低雌激素 代谢产物。 0063 实施例 4 0064 ZEN 降解酶基因的克隆 0065 (1) 提取不动杆菌 Acinetobacter sp.S。

29、M04 的 DNA 0066 取培养至对数期的不动杆菌 Acinetobacter sp.SM04 细胞， 先加入 567L 的 TE 缓冲液， 再加入 30L 10 SDS 和 15L 的蛋白酶 K， 混匀， 于 37温育 1h。加入 100L 5mol/L NaCl， 充分混匀， 再加入 80L CTAB/NaCl 溶液， 混匀后再 65温育 10min。 0067 加入等体积的酚 / 氯仿 / 异戊醇混匀， 离心 4-5min， 将上清转入一只新管中， 加入 0.6-0.8 倍体积的异丙醇， 轻轻混合沉淀 DNA。用 1mL 的 70乙醇洗涤后， 离心， 弃乙醇， 风 干。将 DNA 悬。

30、于无菌水或 50L TE 缓冲液中溶解， -20保存备用。 0068 (2)ZEN 降解酶编码基因的获得 0069 1. 引物设计 0070 基于 MALDI-TOF-TOF/MS 酶蛋白分析鉴定的蛋白序列， 利用 PrimerPremier5.0 引 物设计软件设计了以下简并引物来扩增Acinetobacter sp.SM04 ZEN降解酶基因的部分序 列， 引物交由上海生工生物工程公司合成。 0071 简并引物 1 ： 5 -GTWGCTTCGCCTTCTTTCCATTT-3 0072 简并引物 2 ： 5 -AATCCAAATCGTWGARHTNAAYGC-3 0073 2、 酶基因的获。

31、得 0074 (1)PCR 参数设置 ： 以 Acinetobacter sp.SM04 的 DNA 为反应模板， 98预变性 1min， 94 30s， 52 30s， 72 1.0min， 保持 30 个循环， 72保温 10min。 0075 (2) 将 PCR 扩增到的产物用 T4连接酶连接到 pMDTM18-T 载体上并测序， 测序结果 用 NCBI BLAST search program 分析。分析结果表明， PCR 获得的 400bp 的核苷酸序列与 Acinetobacter属的Peroxiredoxin有很高的同源性， 因此可以确定本发明的ZEN降解酶为 过氧化物酶。 说 。

32、明 书 CN 102618517 A 7 6/8 页 8 0076 (3) 采用 Lie et al. 的 High-efficiency Tail-PCR 技术扩增上述目标核酸序 列的两端侧翼序列， 获得的侧翼序列经测序和拼接后， 使用 NCBI BLAST Search 和 Expasy Search 程序来分析核酸序列和理论氨基酸序列。Acinetobacter sp.SM04 过氧化物酶基因 Prx 的序列见 SEQ ID NO.5， Acinetobacter sp.SM04 过氧化物酶的氨基酸序列见 SEQ ID NO.6。 0077 实施例 5 0078 ZEN 毒素降解酶 Pr。

33、x 基因在大肠杆菌中的表达和鉴定 0079 (1) 构建表达载体 0080 根据实施例 4 得到的 ZEN 降解酶编码基因设计引物， 引物包含酶切位点 (NdeI、 XhoI)， 引物如下 ： 0081 引物 1 ： 5-CTGTATACATATGAGCTTGATTAATACTGAAGT-3 -NdeI 0082 引物 2 ： 5-TAGGCTGCTCGAGTTAGATTTTACCAACTAAGTCG-3 -XhoI 0083 PCR 模板和条件同实施例 4 ； 0084 得到扩增产物后， 用 NdeI 和 XhoI 分别双酶切 PCR 产物和 pET-31b(+) 载体， 将酶 切后的 PC。

34、R 产物 ( 包含 Prx 的开放阅读框 ) 纯化， 并用 T4DNA 连接酶连接到 pET-31b(+) 载 体中， 转入感受态 E.coLi DH5。挑取单菌落， 接种于 LB 液体培养基 ( 含 50g/mL 氨苄青 霉素 ) 中， 使用菌落 PCR 和测序的方法来检测转化结果。成功转入 pET-31b(+) 的细胞即为 E.coLi BL21(DE3)+Prx 转化子。 0085 (2) 诱导表达 0086 将E.coLi BL21(DE3)+Prx转化子培养于LB氨苄抗性培养基中(37， 250r/min)， OD600值达到 0.5 后， 添加 0.5mmol/L IPTG， 继续。

35、培养 4h。将培养液纯化 ( 纯化步骤同实施 例 1 步骤 (1) 后得到 ZEN 毒素降解酶。 0087 (3) 表达产物 SDS-PAGE 分析 0088 取步骤 (2) 得到的 ZEN 毒素降解酶 1mL， SDS-PAGE 电泳 (2SDS 上样缓冲液， 100， 5min， 12000r/min)。电泳结束后， 采用考马斯亮蓝法对凝胶进行染色， 脱色分析。 0089 SDS-PAGE 蛋白电泳液 ： 10 (W/V)SDS 溶液 ； 1 TEMED(V/V) 四甲基乙二胺 ； 10 AP(W/V) ； 0090 样 品 溶 解 液 ： 2 SDS， 5 巯 基 乙 醇， 10 甘 油。

36、， 0.02 溴 酚 蓝， 0.01mol/ LpH8.0Tris-HCl 缓冲液 ； 0091 凝胶贮液 ： 30分离胶贮液， 10浓缩胶贮液 ； 0092 凝胶缓冲液 ： 分离胶缓冲液 (3.0mol/L pH8.9Tris-HCI 缓冲液 )， 浓缩胶缓冲液 (0.5mol/L pH6.7Tris-HCI 缓冲液 ) ； 0093 电极缓冲液 ： 0.1 SDS， 0.05mol/L Tris-HCl 0094 染色液 ： 考马斯亮蓝 R2500.125g， 加入 50mL 甲醇， 10mL 冰乙酸， 定容至 100mL。 0095 脱色液 ： 冰乙酸 75mL， 甲醇 50mL， 加入。

37、蒸馏水定容至 1000mL.。 0096 电泳结果如图 3 所示， ZEN 降解酶能在 E.coli BL21(DE3)+Prx 菌株中大量的诱导 表达 ( 泳道 B 和 C) ； 与未诱导的对照组 ( 泳道 A) 相比， 诱导组中出现一个明显的蛋白条带 (41kDa 位置 )。从 SDS-PAGE 电泳染色图片的条带的浓度上可以推算， 重组表达蛋白站细胞 总蛋白的 50左右。 说 明 书 CN 102618517 A 8 7/8 页 9 0097 (4) 表达产物降解 ZEN 的测试 0098 用步骤 (2) 得到的 ZEN 毒素降解酶做降解 ZEN 的测试。 0099 以实施例 1 步骤 。

38、(1) 中的 ZEN 降解酶活力测定方法为基础， 检测不同 H2O2浓度下 重组大肠杆菌表达的 Prx 酶蛋白降解 ZEN 的效率 ( )， 以 H2O2(40mmol/L) 作对照组 ()。 0100 结果见图4， 随着H2O2浓度的增加， 重组Prx酶氧化降解ZEN的速率明显提高， 经过 30处理 12h 后， ZEN 降解率高达 95以上。说明重组 Prx 酶具有较强的 ZEN 降解能力。 0101 实施例 6 0102 ZEN 毒素降解酶 Prx 基因在酵母菌中的表达鉴定 0103 (1) 构建表达载体 0104 根据酵母表达载体 pPIC9K 上信号肽基因 序列 (SEQ ID NO。

39、.9) 设计引物， 引物 包含酶切位点 (KpnI 和 BamHI)， 引物对如下 ： 0105 信号肽基因 引物 1 ： 5-AGAGGTACCATGAGATTTCCTTCAATTTTT-3 -KpnI 0106 信号肽基因 引物 2 ： 5-ATATGGATCCATTCGCGGCCGCCCTAGG-3 -BamHI 0107 以质粒 pPIC9K 为模板扩增信号肽基因 。用 KpnI 和 BamHI 双酶切信号肽基因 的 PCR 产物和载体 pYES2， 并用 T4DNA 连接酶将双酶切产物连接过夜， 连接产物转入感受 态 E.coli DH5。转化子质粒 pY 用 PCR 和测序的方法检。

40、测结果。筛选成功转入信号肽 基因 的转化子进入下一步操作。 0108 根据实施例 4 得到的 ZEN 降解酶编码基因设计引物， 引物包含酶切位点 (XhoI 和 BamHI)， 引物对如下 ： 0109 ZEN 降解酶基因引物 1 ： 0110 5-AATAGGATCCATGAGCTTGATTAATACTGA-3 -BamHI 0111 ZEN 降解酶基因引物 2 ： 0112 5-ATTCTCGAGTTAGATTTTACCAACTAAGTC-3 -XhoI 0113 以Acinetobacter sp.SM04的DNA为模板， PCR扩增ZEN降解酶编码基因。 用BamHI 和 XhoI 双。

41、酶切 ZEN 毒素降解酶基因的 PCR 产物和 pY。连接和转化方法与信号肽基因方 法一致。 0114 转化子质粒 pY-Prx 用双酶切检测， 结果如图 5。从图 5 可以看出， 重组质粒 pY-Prx 已成功转化入 Prx 基因和信号肽基因 。 0115 (2)ZEN 毒素降解酶在酿酒酵母中表达及酶活性的测定 0116 1、 感受态细胞的制备 0117 于 YPD 培养基中培养 S.cerevisiae INVSc1 细胞 (30， 200r/min， 24h) ； 收获 细胞 (1500g， 10min) ； 重悬细胞 (1mL 100mmol/L LiAc， 12,000g， 15s)。

42、 ； 再次重悬细胞 (400ul 100mmol/L LiAc) ； 按 50uL 每管分装。 0118 2、 酵母转化 0119 对于每一个转化， 按以下顺序加入 ： 50 PEG3350240uL ； 1mol/L LiAc36uL ； 单链 Salmon sperm( 鲑鱼精 )DNA 2mg/mL 25uL ； 质粒 pY-Prx DNA5 10ug。转化条件如下 ： 30， 30min ； 42， 20min ； 6000r/min ； 取 100ul 菌液铺 SC-U 培养基平板， 30培养 2 3 天。转化子以菌落 PCR 方法进行鉴定。 0120 3、 诱导表达及 SDS-PA。

43、GE 分析 说 明 书 CN 102618517 A 9 8/8 页 10 0121 培养经鉴定的酵母转化子至 OD600 3， 取 6.67mL 培养物去上清， 并将细胞转移至 50mL 以半乳糖为碳源的 SC-U 诱导培养基中诱导表达。 0122 取24h、 48h和72h上清液各1mL， 经处理后(处理方法同实施例5步骤(3)一致)， 进行SDS-PAGE电泳。 电泳结束， 用考马斯亮蓝对凝胶进行染色， 脱色分析， 电泳结果见图6。 0123 由图 6 可见， 诱导 72h 重组蛋白的表达量最大。 0124 (3) 表达产物降解 ZEN 的测试方法 0125 以实施例 1 步骤 (1) 。

44、中的 ZEN 降解酶活力测定方法为基础， 测定不同处理时间下 重组酿酒酵母表达的 Prx 酶蛋白降解 ZEN 的效率， 结果见图 7。 0126 结果表明， 重组酿酒酵母表达的 Prx 酶具有明显的 ZEN 降解能力。 0127 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102618517 A 10 1/4 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102618517 A 11 2/4 页 12 0003 序 列 表 CN 102618517 A 12 3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 102618517 A 13 4/4 页 14 序 列 表 CN 102618517 A 14 1/4 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618517 A 15 2/4 页 16 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618517 A 16 3/4 页 17 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102618517 A 17 4/4 页 18 图 7 说 明 书 附 图 CN 102618517 A 18 。