抗东方马脑炎病毒E2蛋白的单克隆抗体（EEEV5E4）及其识别的B细胞表位多肽和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103421746 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421746 A *CN103421746A* (21)申请号 201310298414.2 (22)申请日 2013.07.16 CGMCC NO.7008 2012.12.11 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/10(2006.01) C07K 7/08(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 39/42(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01。

2、) C12R 1/91(2006.01)(71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端 街 427 号 (72)发明人 吴东来 徐青元 刘霓红 杨涛 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 (54) 发明名称 抗东方马脑炎病毒 E2 蛋白的单克隆抗体 （EEEV-5E4） 及其识别的 B 细胞表位多肽和应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 抗 东 方 马 脑 炎 病 毒 （Eastern equine encephalitis virus,EEEV） E2 蛋白的单克隆抗体 （EE。

3、EV-5E4）及其识别的 B 细胞表位多肽和应用。本发明还公开了一株能够 稳定分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 命名为 EEEV-5E4， 其微生物保藏号是 ： CGMCC No.7008， 由 该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能够与EEEV E2 蛋白发生特异性反应， 而与相应阴性对照不发 生反应。本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体 所识别的 EEEV E2 蛋白特异性 B 细胞表位多肽可 用于制备鉴别诊断 EEEV/VEEV 与其它甲病毒的试 剂， 为建立 EEEV/VEEV 与甲病毒属其它病毒的血 清学鉴别诊断方法以及进一步研究甲病毒属相关 病毒的预防与治疗措施奠定了基础。 (83)生物。

4、保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103421746 A CN 103421746 A *CN103421746A* 1/1 页 2 1. 一株分泌抗东方马脑炎病毒 （Eastern equine encephalitis virus,EEEV） E2 蛋白 单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 命名为 EEEV-5E4， 其微生物保藏号为 ： CGMCC No.7008。 2. 由权利要求 1 所述的杂。

5、交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。 3. 东方马脑炎病毒 E2 蛋白的线性 B 细胞表位多肽， 其特征为 ： 所述多肽的氨基酸序列 如 SEQ ID NO.1 所示， 所述表位多肽由权利要求 2 所述的单克隆抗体所识别。 4. 权利要求 1 所述的杂交瘤细胞株在制备诊断东方马脑炎病毒或委内瑞拉马脑炎病 毒感染的试剂中的应用。 5. 权利要求 1 所述的杂交瘤细胞株在制备预防或治疗东方马脑炎病毒或委内瑞拉马 脑炎病毒感染的药物中的应用。 6. 权利要求 2 所述的单克隆抗体在制备诊断东方马脑炎病毒或委内瑞拉马脑炎病毒 感染的试剂中的应用。 7. 权利要求 2 所述的单克隆抗体在制备预防或治疗东方马脑炎。

6、病毒或委内瑞拉马脑 炎病毒感染的药物中的应用。 8.权利要求3所述线性B细胞表位多肽在制备诊断东方马脑炎病毒或委内瑞拉马脑炎 病毒感染的试剂中的应用。 9.权利要求3所述线性B细胞表位多肽在制备预防或治疗东方马脑炎病毒或委内瑞拉 马脑炎病毒感染的试剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103421746 A 2 1/8 页 3 抗东方马脑炎病毒 E2 蛋白的单克隆抗体 （EEEV-5E4） 及其 识别的 B 细胞表位多肽和应用 技术领域 0001 本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体， 尤其涉及一株分泌抗东方 马脑炎病毒 E2 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体 ；。

7、 本发明还涉及 一个 B 细胞表位， 尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的东方马脑炎病毒或委内瑞拉马脑炎 病毒 E2 蛋白 B 细胞表位多肽 ； 本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、 单克隆抗体以及 B 细胞表 位多肽在制备诊断、 预防或治疗东方马脑炎病毒或委内瑞拉马脑炎病毒感染的相关试剂与 药物中的应用， 属于马脑炎的防治领域。 背景技术 0002 东方马脑炎 （Eastern equine encephalitis,EEE） 是由东方马脑炎病毒 （Eastern equine encephalitis Virus,EEEV） 引起的一种典型的人兽共患病毒性疾病。该病以发 病急、 传染性强、 致死率高。

8、著称， 被美国 CDC 列为 B 类传染病 ； 我国卫生部制订的 人间传 染的病原微生物名录 将 EEEV 列为第一类病原微生物。由于 EEEV 具有制备生物战剂与生 物恐怖主义武器的潜在可能性， 受到国际社会的高度重视。EEEV 属于披膜病毒科甲病毒 属虫媒病毒 A 组， 是 EEEV 抗原群的唯一病毒， 代表株为 Ten Broeck 株， 与西方马脑炎病毒 （Western equine encephalitis Virus,WEEV） 、 委内瑞拉马脑炎病毒 （Venezuelan equine encephalitis Virus,VEEV） 同属于新大陆病毒。根据血凝抑制活性的差异。

9、， 可将 EEEV 分为 两个抗原变异型， 北美型 （North America,NA） 与南美型 （South America,SA） 。对 EEEV 基 因与抗原的研究表明 NA 高度保守， 只包含一个亚型 （Lineage 型） ， 所有的北美及加勒比 地区的病毒分离株均属于 NA 并且能够在人和马上引起严重的疾病， 人类感染的死亡率达 30-80%， 马感染的死亡率达90-95% ； 而SA包含3个主要亚型 （Lineage型-型） ， 包括中 南美洲的病毒分离株， 各亚型病毒通常只造成马的致死性感染， 人类通常为隐形感染。 EEEV 首次于1933年在美国东部新泽西州和弗吉尼亚州马 。

10、场的感染马脑中分离获得的。 1947年 EEEV爆发于美国路易斯安那州与德克萨斯州， 造成14344例马脑炎的病例， 其中11722匹马 死亡。1938 年首次确定人类感染 EEEV 病例并确定其呈地方性流行， 有 30 例感染的儿童出 现致死性脑炎。本病主要流行于美洲， 如美国东部 （东北部） 及南部的几个洲， 加拿大东部、 墨西哥、 巴拿马、 哥伦比亚、 多米尼亚、 圭亚那、 巴西、 阿根廷和古巴等， 除此之外在菲律宾、 波兰、 俄罗斯等国也有 EEE 的病例报道。我国于 1991 年首次在新疆采集的一组全沟硬蜱中 分离到 1 株 EEEV， 2001 年分离获得 WEEV， 至今尚未分离。

11、到 VEEV。在 2003 年福建省的临床 病例中发现有 EEEV 的感染者， 虽然至今并未出现流行， 但是东南沿海每年夏季都有大量病 因不明的 “病毒性脑炎” ， 临床分析表明多数病例是由多种病毒感染的多症侯群综合征并且 患者预后较差。再者我国对 EEEV 的研究起步较晚且尚无有效的疫苗与药物用于 EEE 的防 治， 所以我国急需加强对该病的研究， 以做好相应的技术储备。 0003 EEEV 基因组为不分节段的单股正链 RNA， 全长约为 11.7kb， 编码 5 种结构蛋白， 其 中 E2 蛋白是主要的免疫原性蛋白之一， 含有 420 个氨基酸。其氨基端 2/3 的氨基酸在甲病 说 明 书。

12、 CN 103421746 A 3 2/8 页 4 毒属中最为易变， 其羧基端360-379位与405-416位为两段不带电荷的氨基酸区， 前者高度 多变， 20 个氨基酸中仅有 4 个保守氨基酸， 后者同源性很高， 11 个氨基酸中有 9 个为保守氨 基酸， 这两段序列均为跨膜区且可以作为转录终止的信号序列。在氨基酸 380-404 位有两 个疏水区， 能将 E2 蛋白固定在脂质包膜中并在甲病毒的组装过程中与核衣壳蛋白相互作 用。 这两个疏水区之间的区域相对亲水， 位于病毒包膜蛋白靠近胞质的一侧， 含有甲病毒属 共有的 5 个连续氨基酸 （393半胱氨酸 - 异亮氨酸 - 苏氨酸 - 脯氨酸。

13、 - 酪氨酸 397） ， 在甲病毒 组装过程中与病毒的核衣壳蛋白相互作用。此外， EEEV 的 E2 蛋白含有两个潜在的糖基化 位点， 302 天冬酰胺 - 脯氨酸 - 苏氨酸 305 与 315 天冬酰胺 - 苯丙氨酸 - 苏氨酸 318。同时 E2 蛋白与病毒的受体结合、 病毒的吸附与侵入以及病毒的组装相关， 并且含有多个与病毒的 中和活性、 血凝抑制活性以及抗感染活性相关的抗原表位。 对于同属的VEEV， 使用单克隆抗 体进行治疗， 可对不同血清群的 VEEV 产生广泛的保护力， 并且保护力可达 75% 以上。所以 可以通过制备 EEEV E2 蛋白特异性的单克隆抗体并鉴定 E2 蛋白。

14、的 B 细胞表位以建立 EEEV 的快速准确的鉴别诊断方法并进一步研究预防与治疗措施。 发明内容 0004 本发明目的之一是提供一株分泌抗东方马脑炎病毒 E2 蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株 ； 0005 本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体， 该单克隆 抗体可与 EEEV/VEEV E2 蛋白发生特异性反应 ； 0006 本发明目的之三是鉴定 EEEV E2 蛋白特异性的 B 细胞表位多肽。 0007 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的 ： 0008 本发明利用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达纯化的重组 EEEV E2 蛋白作为免 疫原免疫 BALB。

15、/c 小鼠， 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 进行融合， 以原核表达纯化的 重组 E2 蛋白 （原核表达载体为 pET-30a） 作为包被抗原建立间接 ELISA 方法筛选杂交瘤细 胞， 最终获得一株能够稳定分泌抗EEEV E2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 其微生物保 藏号是 ： CGMCC No.7008 ； 命名为 EEEV-5E4， 分类命名为 ： 分泌抗 EEEV-5E4 单克隆抗体的杂 交瘤细胞株 ； 保藏时间为 2012 年 12 月 11 日 ； 保藏单位是 ： 中国普通微生物菌种保藏管理 中心 ； 保藏地址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院中科院微生物研究所。 。

16、0009 本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体， 命名为 EEEV-5E4， IFA 检测结果表明该杂交瘤细胞与重组 EEEV/VEEV E2 蛋白发生特异性反应， 而 与相应阴性对照不发生反应。 0010 本发明利用肽扫描技术对 EEEV-5E4 所识别的 EEEV E2 蛋白的 B 细胞表位进 行了鉴定， 结果为 ： EEEV-5E 所特异性识别的 EEEV E2 蛋白的 B 细胞表位多肽的氨基酸 为 241PRGEGDTFKGKLHVPF256（SEQ ID NO.1 所示） 。同时， 序列比对特异性鉴定结果显示 241PRGEGDTFKGKLHVPF256 为 EEE。

17、V/VEEV 型特异性表位。 0011 综上所述， 本发明制备并鉴定出了一种特异性针对EEEV E2蛋白的单克隆抗体， 本 发明的单克隆抗体以及单克隆抗体所识别的针对EEEV/VEEV特异性的B细胞表位多肽可用 于制备 EEEV/VEEV 与其它甲病毒鉴别或诊断的试剂以及预防或治疗 EEEV/VEEV 的相关药 物， 为建立 EEEV/VEEV 与其它甲病毒属病毒的鉴别诊断方法以及进一步研究 EEEV/VEEV 的 说 明 书 CN 103421746 A 4 3/8 页 5 防治措施奠定了基础。 附图说明 0012 图 1 为原核表达及纯化的重组 EEEV E2 蛋白的 SDS-PAGE 与。

18、 Western Blot （WB） 鉴定 ； 0013 1 ： EEEV E2 蛋白诱导前 ； 2 ： EEEV E2 蛋白诱导后 ； 3 ： 空载体 pET-30a 表达蛋白 ； 4 ： 纯化后的 EEEV E2 蛋白 （SDS-PAGE） ； 5 ： 未纯化的 EEEV E2 蛋白 （WB） ； 6 ： 纯化的 EEEV E2 蛋 白 （WB） ； M ： 标准蛋白 Marker ； 0014 图 2 为真核表达及纯化的重组 EEEV E2 蛋白的 SDS-PAGE 与 Western blot 鉴定 ； 0015 1 ： 重组杆状病毒感染 Sf9 细胞的裂解产物 ； 2 ： 重组杆状病。

19、毒感染 Sf9 细胞的 裂解产物上清 ； 3 ： 重组杆状病毒感染 Sf9 细胞的裂解产物沉淀 ； 4 ： 纯化的 EEEV-E2 蛋白 （SDS-PAGE） ； 5 ： 纯化的 EEEV-E2 蛋白 （WB） ； 6 ： 野生型杆状病毒感染的 Sf9 昆虫细胞 ； M ： 标 准蛋白 Marker ； 0016 图 3 为应用 IFA 检测单克隆抗体 EEEV-5E4 与重组杆状病毒感染的 Sf9 昆虫细胞 和野生型杆状病毒感染的 Sf9 昆虫细胞的反应性结果 ； 0017 1-3 ： EEEV-5E4、 鼠的阳性血清、 阴性血清与重组杆状病毒感染的 Sf9 昆虫细胞的 反应 ； 4-6 ：。

20、 EEEV-5E4、 鼠的阳性血清、 阴性血清与野生型杆状病毒感染的 Sf9 昆虫细胞的反 应 ； 0018 图 4 为原核表达的 42 条 16 氨基酸短肽 SDS-PAGE 分析 ； 0019 M ： 蛋白质分子量标准 ； V ： 空载体 pMALTM-c2X 表达的蛋白 ； 1-42 ： 表达的 42 条短肽 pE2-1 pE2-42 ； 0020 图 5 为原核表达的 16 肽与 EEEV-5E4 反应性的 Western blot 鉴定 ； 0021 M ： 标准蛋白 Marker ； 1 ： EEEV-5E4 与真核表达的重组 E2 蛋白的反应 ； 2 ： EEEV-5E4 与 p。

21、E2-25 的反应 ； 0022 图 6 为单克隆抗体 EEEV-5E4 对应 B 细胞表位的特异性分析。 具体实施方式 0023 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0024 主要实验材料和来源 0025 1. 蛋白、 细胞、 毒种 0026 原核表达并纯化的 EEEV E2 蛋白、 真核表达并纯化的 EEEV E2 蛋白， SP2。

22、/0 细胞、 Sf9细胞， 携带EEEV E2基因的重组杆状病毒BACV-E2以及E2蛋白截短表达的42条短肽均 由本实验室保存。 0027 2. 主要试剂和药品 0028 胎牛血清 （FBS） 、 DMEM 干粉和 L- 谷氨酰胺购自 GIBCOL 公司 ； 弗氏佐剂、 50%PEG、 50HAT、 50HT 和 8- 氮鸟嘌呤 （8-AG）和异硫氰酸荧光素 （FITC）标记山羊抗小鼠 IgG 说 明 书 CN 103421746 A 5 4/8 页 6 均购自 Sigma 公司 ； 辣根过氧化物酶 （HRP） 标记的山羊抗小鼠 IgG 为金桥生物技术有限 公司进口分装产品 ； SBA Cl。

23、onotypingTM System/HRP 抗体亚类鉴定试剂盒购于 Southern Biotechnology 公司 ； pMALTM Protein Fusion and Purification System 融合蛋白表达与 纯化试剂盒购自 New ENGLAND Biolabs（NEB） 公司 ； Premix Ex Taq HS、 T4DNA 连接酶、 DNA Marker、 限制性内切酶 BamH 、 Hind 、 EcoR 和 Sal 购置于 TaKaRa 公司 ； 抗 6His 标 签的单克隆抗体购自 Roche 公司 ； Ni2+NTA 树脂购自 Novagen 公司。 0。

24、029 3. 实验动物 0030 6 周龄 BALB/c 小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。 0031 实施例 1EEEV-E2 蛋白的原核与真核表达及纯化 0032 1. 引物设计 0033 原核表达载体采用 pET-30a， 根据已知的 EEEV 北美变异株 E2 基因序列 （GenBank 登录号 ： X63135.1） 设计 PCR 扩增引物 ： 0034 pE-E2-25F ： 0035 5 -CTggatccGATTTGGACACTCATTTCACCCAGT-3 （BamH ） ； 0036 pE-E2-1260-1241R ： 0037 5 -GCCaagct。

25、tTTATGCCCTCGTCGGCTTAATGC-3 （Hind ） 。 0038 真核表达采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统， 按照上述序列分别设计两对PCR扩 增引物 ： 0039 pF-E2-25F ： 0040 5-CTggatccGGATTTGGACACTCATTTCACCCAGT-3（BamH ） ； 0041 pF-E2-1260-1241R ： 0042 5-GCCaagcttTTATGCCCTCGTCGGCTTAATGC-3（Hind ） 。 0043 2.EEEV E2 蛋白的原核表达载体构建及 E2 蛋白的原核表达与纯化 0044 首先 PCR 扩增 EEEV E2。

26、 基因进行胶回收， 回收获得的 E2 基因与原核表达载体 pET-30a 分别进行双酶切。将已酶切的 E2 基因和原核表达载体 pET-30a 进行连接， 在 DNA 连接仪中 16连接 4h。将上述连接产物转化 E.coli DH5， 37恒温倒置过夜培养。随机 挑取单个菌落， 分别接种到 5mL LB 液体培养基 （Kan+100g/mL） 中， 37过夜培养。提取重 组质粒进行初步筛选， 空载体 pET-30a 作为阴性对照。对疑似重组质粒分别进行双酶切鉴 定与 PCR 鉴定。将上述鉴定全部正确的含有阳性重组质粒的菌液进行测序， 测序正确的重 组质粒命名为 pET-E2。 0045 将重。

27、组质粒 pET-E2 转化 E.coli BL21， 37过夜培养后， 随机挑取单个菌落， 接种 于 5mL LB 液体培养基 （100g/mL Kan+） 中 37过夜培养， 然后进行重组 E2 蛋白的诱导表 达。首先取 1mL 过夜培养的重组菌菌液加入到 100mL（100g/mL Kan+） LB 培养基中 37 培养至 OD600nm约为 0.5， 加入终浓度为 1.0mmol/L 的 IPTG， 37诱导 4-5h。超声裂解菌体， 分别收集上清和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳， 结果原核表达蛋白出现在沉淀中， 以包涵体形式 存在， 由于原核表达蛋白携带 6His 标签， 使用 Ni。

28、2+NTA 树脂对其进行变性纯化， 结果只 有一条特异性的条带出现在 55Ku 左右 （图 1） ， 与 E2 蛋白的分子质量相符， 蛋白浓度可达 1.51mg/mL。利用 HRP 标记的抗 6His 标签单克隆抗体进行 Western blot 鉴定， 表明 E2 蛋白表达纯化成功。 说 明 书 CN 103421746 A 6 5/8 页 7 0046 3.EEEV E2 蛋白的真核核表达载体构建及 E2 蛋白的真核表达与纯化 0047 首先扩增 EEEV-E2 基因， 进行胶回收， 回收获得的 E2 基因与杆状病毒的穿梭载体 pFastBacTMHT A 分别进行双酶切。将已酶切的 E2。

29、 基因和 pFastBacTMHT A 进行连接， 在 DNA 连接仪中 16连接 4h。将上述连接产物转化 E.coli DH5， 37恒温倒置过夜培养。随机 挑取单个菌落， 分别接种到 5mL LB 液体培养基 （Amp+100g/mL） 中， 37过夜培养。提取重 组质粒进行初步筛选， 空载体 pFastBacTMHT A 作为阴性对照。对疑似重组质粒分别进行双 酶切鉴定与 PCR 鉴定。将上述鉴定全部正确的含有阳性重组质粒的菌液进行测序， 测序正 确的重组质粒命名为 pFast-E2。 0048 将重组质粒 pFast-E2 转化感受态细胞 E.coli DH10BacTM， 首先将 。

30、-80保存的感 受态细胞 DH10BacTM（100L） 置于冰上融化 ； 将重组质粒 pFast-E21L 加入 到融化的 DH10BacTM中混匀， 冰浴 30min 后迅速 42热激 60s， 再冰浴 5min。在超净台内向混合物中 加入室温的无抗生素的 SOC 液体培养基 900L， 37震荡培养 4h。将上述菌液分别做 10 倍、 100 倍稀释， 将原倍、 10 倍以及 100 倍稀释的菌液各 100L 分别涂板 （LA-Bac 平板即含 Kan+50g/mL、 庆大霉素 7g/mL、 四环素 10g/mL、 X-gal100g/mL 和 IPTG40g/mL 的 LB 固体培养基。

31、） 上， 37恒温倒置培养 48h， 然后进行蓝白斑筛选。随机挑选单个白色菌落 划线培养接种到新的LA-Bac平板上做进一步的培养鉴定， 挑取白色菌落分别接种至5mL含 50g/mL Kan+、 7g/mL 庆大霉素、 10g/mL 四环素的 LB 液体培养基中， 同时挑取蓝色菌 落作为阴性对照， 37过夜培养后分别提取重组杆粒与空杆粒。PCR 鉴定正确的重组杆粒， 命名为 BAC-E2， 用于转染获得重组杆状病毒。 0049 利用杆状病毒转染试剂Cellfectin Reagent， 将重组杆粒BAC-E2转染Sf9昆虫细 胞， 获得带有 E2 基因的重组杆状病毒 BACV-E2， 分别设立。

32、野生型杆粒转染与单独的转染试 剂作为阴性对照。具体操作如下 ： 0050 （1） 使用 Sf9 细胞铺板。六孔细胞培养板中每孔 Sf9 细胞 （细胞活力在 97% 以上） 4.5105个 /mL， 于 27恒温培养箱中至少培养 1h， 使细胞完全贴壁。 0051 （2） 转染准备 （每孔用量） ： 0052 a ： A 液 0053 使用 Sf9 基础培养液 （Grace 粉 （11L） 1 瓶、 酵母提取物 3.3g、 水解乳蛋白 3.3g、 碳酸氢钠 （NaHCO3） 0.35g） 将 1g 重组杆粒 BAC-E2 稀释至 100L 中 ； 0054 b ： B 液 0055 使用 Sf9。

33、 基础培养液将 6L Cellfectin Reagent 转染试剂稀释至 100L 中 ； 0056 c ： A 液与 B 液混匀后， 室温孵育 15-45min。 0057 对照组 1 ： 将 1g 野生型杆粒加入到 100L Sf9 基础培养液中与 B 液混合 ； 0058 对照组 2 ： 只加入 B 液。 0059 （3） 转染时， 先弃掉细胞培养板中的原来的 Sf9 完全培养液， 再用 Grace 基础培养 液清洗细胞， 2mL/ 次， 共清洗 2 次。 0060 （4） 将 800L Grace 基础培养液加入到已孵育好的 A 液和 B 液的混合物中然后混 匀并将混合好的约 1mL。

34、 的脂类 -DNA 复合物加入到 Sf9 昆虫细胞培养板中。 0061 （5） 27恒温孵育 5h， 弃掉转染液， 加入新的 Sf9 完全培养液 （0.1%1000 双抗， 10% 胎牛血清 （FBS） ， 89%Sf9 昆虫细胞基础培养液） ， 3.0mL/ 孔， 27 下孵育 72h 或至病变 说 明 书 CN 103421746 A 7 6/8 页 8 出现。 0062 待上述 Sf9 细胞发生明显病变 （75的细胞病变） 后， 收集细胞培养液， 离心所得 上清即为重组杆状病毒母液， 命名为 BACV-E2/P1， 4避光保存， 同时取一定量的 BACV-E2/ P1 继续感染 Sf9 。

35、昆虫细胞， 并不断摸索能够获得较高滴度的重组杆状病毒的感染条件 （最 适病毒接种量、 用于病毒接种的最适 Sf9 昆虫细胞生长密度、 最适的病毒感染时间以及最 适的病毒收获时间等） ， 从而确定重组杆状病毒 BACV-E2 滴度最高与重组 E2 蛋白表达量最 大时的病毒代次。BACV-W 定义为空杆粒转染 Sf9 昆虫细胞获得的野生型杆状病毒。 0063 收集感染重组杆状病毒BACV-E2/P1-P4各代次的Sf9细胞， 离心后超声裂解细胞， 分离上清和沉淀， 进行 SDS-PAGE 电泳分析。结果确定蛋白表达量最大的重组杆状病毒的感 染代次为 BACV-E2/P3， 大量接种 BACV-E2。

36、/P2， 以获得足够的重组 E2 蛋白用于纯化。重组蛋 白以包涵体形式存在， 在 55Ku 左右出现 1 条明显的条带， 与 E2 蛋白的分子质量大小相符 （图 2） 。野生型杆状病毒 BACV-W 表达蛋白按上述方法处理后作为阴性对照。由于真核表达 蛋白携带6His标签， 使用Ni2+NTA树脂进行变性纯化， 蛋白浓度可达1.36mg/mL。 利用HRP 标记的抗 6His 标签单克隆抗体进行 Western blot 鉴定， 表明 E2 蛋白表达纯化成功。 0064 实施例 2 单克隆抗体的制备 0065 1. 小鼠免疫 0066 以 Bac-to-Bac 真核表达系统表达纯化的重组 E2。

37、 蛋白作为免疫原腹腔免疫 6 周龄 雌性 BALB/c 小鼠 3 只， 100g/ 只， 共免疫 3 次。一免将弗氏完全佐剂与纯化的重组 E2 蛋 白混合 ； 二免和三免均将弗氏不完全佐与纯化的 E2 蛋白混合， E2 蛋白与佐剂均等体积混 合 ； 分别在二免与三免一周后尾静脉采血， 间接 ELISA 检测血清抗体效价。在融合前 3 天， 对抗体水平较高的 BALB/c 小鼠加强免疫， 每只小鼠直接腹腔注射 100g 纯化的 E2 蛋白。 0067 2. 细胞融合 0068 融合前 1 天准备饲养细胞， 按照常规方法取 BALB/c 小鼠腹腔巨噬细胞铺于 96 孔 细胞培养板中待用。 摘除眼球。

38、采血后脱颈致死待取脾的小鼠， 无菌取脾并分离脾细胞， 按脾 细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞 4 1 的比例用 PEG 进行细胞融合， 融合后的细胞铺于准备好的 饲养细胞之上。 0069 3. 阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆 0070 利用纯化后的原核表达EEEV E2蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细 胞株， 对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养， 同时用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行 3 次 克隆纯化， 将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得 1 株稳定分泌抗 EEEV E2 蛋白 单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 其微生物保藏号是 ： CGMCC No.7008， 命名为EEEV-5E4。

39、， 同时也 将其分泌的单克隆抗体分别命名为 EEEV-5E4。 0071 4. 单克隆抗体的大量制备 0072 在注射杂交瘤细胞前一周， 先取雌性 BALB/c 小鼠 （8-12 周龄）腹腔注射石蜡 油 500L/ 只， 一周后腹腔注射 DMEM 基础培养液稀释的阳性杂交瘤细胞 （细胞密度为 1-2106个 /mL） ， 500L/ 只。此后观察小鼠状态， 小鼠腹部逐渐变大， 待其行动不便时收 集腹水。收集的腹水离心分装后 -20保存。 0073 实施例 3 单克隆抗体的鉴定 0074 1. 单克隆抗体的亚类鉴定 说 明 书 CN 103421746 A 8 7/8 页 9 0075 按照 S。

40、BA ClonotypingTM System/HRP 抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例 1 所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。 0076 结果显示本发明单克隆抗体 EEEV-5E4 的重链为 IgG1， 轻链为 链。 0077 2.IFA 试验 （重组杆状病毒感染 Sf9 细胞的 IFA 鉴定） 0078 （1） 使用 Sf9 昆虫细胞铺板 （96 细胞培养板） ， 细胞生长至板底面积的 80-90% 时， 接种第二代重组杆状病毒 BACV-E2/P2 ； 同时以相同条件下接种野生型杆状病毒 （BACV-W） 的 Sf9 昆虫细胞作为阴性对照。 0079 （2） 48h 后细胞产生明显病变。

41、， 弃去培养液， 加入 75% 的冰乙醇， 100L/ 孔， 4固 定 30min。 0080 （3） 弃去上述固定液， PBST清洗3次， 5min/次。 细胞培养板可以-20冻存备用。 0081 （4） 将所筛选出的阳性杂交瘤细胞培养液上清加入上述细胞培养孔中， 100L/ 孔。 同时以200稀释的小鼠阴性血清作为阴性对照， 200稀释的小鼠阳性血清作为阳性 对照。 0082 （5） 37孵育 1h 后， 弃去一抗， 用 PBST 清洗 3 次， 5min/ 次。 0083 （6） 将 FITC 标记山羊抗小鼠的二抗 100 稀释， 100L/ 孔， 加入到上述细胞培养 孔中。 0084 。

42、（7） 37孵育1h后， 弃二抗， PBST清洗3次， 5min/次 ； 然后荧光显微镜拍照记录。 0085 IFA结果显示该单克隆抗体培养上清与感染BACV-E2的Sf9昆虫细胞呈阳性反应， 而与感染 BACV-W 的 Sf9 昆虫细胞呈阴性反应 （图 3） 。 0086 实施例 4B 细胞表位的鉴定 0087 1.E2 蛋白 42 条短肽的截短表达 0088 （1） 分别将 42 对互补的寡核苷酸链 54退火 30min， 形成带有粘性末端的双链 DNA ； 0089 （2） 使用限制性内切酶 EcoR 和 Sal 对原核表达载体 pMALTM-c2X 进行双酶切 ； 0090 （3） 将。

43、双酶切胶回收之后的 pMALTM-c2X 与退火后形成的双链 DNA 连接， 16作用 4h ； 0091 （4） 将连接产物转化E.coli DH5。 双酶切及PCR鉴定正确后进行测序， 将测序正 确的42个重组质粒分别命名为pE2-1pE2-42。 此后， 将构建的重组质粒pE2-1pE2-42 转化E.coli TB1。 在过夜培养的平板上随机挑取单个菌落， 分别接种到5mL LB液体培养基 （Amp+100g/mL） 中， 37过夜培养。 0092 （5） 取菌液以 1:100 接种于 LB 液体培养基 （Amp+100g/mL） 中， 37培养至菌液 OD600nm约为 0.5， 加。

44、入诱导剂 IPTG 至终浓度为 1mmol/L， 16诱导表达 10h， 离心收集菌体。 沉淀采用 Column Buffer 重悬， 超声裂解， 分离上清和沉淀， 进行 SDS-PAGE 电泳分析， 上清 中在 49Ku 左右出现 1 条明显的条带， 与融合蛋白分子质量大小相符 （图 4） 。 0093 2.B 细胞表位多肽的初步鉴定 0094 将上述确定成功表达的 42 条短肽， 分别以浓度 100ng/ 孔包被 ELISA 反应板， 以该 单克隆抗体培养上清作为一抗利用间接 ELISA 进行筛选确定此单克隆抗体所对应的抗原 表位。 0095 利用 Western Blot 进行进一步确定。

45、， 将鉴定反应的短肽、 空载体 pMALTM-c2X 表达 说 明 书 CN 103421746 A 9 8/8 页 10 蛋白以及真核表达重组 E2 蛋白进行 SDS-PAGE 电泳后， 转印至 NC 膜上， 用上述已鉴定表位 的杂交瘤细胞培养上清作为一抗， 山羊抗小鼠 HRP-IgG 作为二抗， DAB 显色。 0096 间接ELISA与Western Blot结果均证实单克隆抗体EEEV-5E4与pE2-25反应， 对 应 E2 蛋白短肽的氨基酸 241PRGEGDTFKGKLHVPF256（SEQ ID NO.1 所示） 。 0097 3.B 细胞表位多肽的特异性鉴定 0098 对上述。

46、鉴定出的 B 细胞表位利用 NCBI（National Center for Biotechnology Information） Blastp 进行同源性比较， 选择甲病毒属各病毒的代表株系 （EEEV NA 型 ： X63135 与 U01556 ； EEEV SA 型 ： AF159559 ； EEEV SA 型 ： GU001934 ； EEEV SA 型 ： AF159561 ； VEEV ： ACV42439 ； WEEV ： ACN87270 ； Ross River virus ： AEC49788 ； Sindbis virus ： AAC83379） 结合生物信息软件 Me。

47、gAlign 依次对各个表位的进行序列比对。根据序 列比对结果合成E2蛋白的相应短肽， 利用间接ELISA进一步确定已鉴定的线性表位在甲病 毒属新大陆病毒中的保守性， 以合成的 V5 标签 （GKPIPNPLLGLDST） 作为合成肽的阴性对照， 以抗IFN-的单克隆抗体作为单克隆抗体对照。 结果显示， 本发明的单克隆抗体EEEV-5E4 能够与病毒株 EEEV NA 型、 EEEV SA 型、 EEEV SA 型、 EEEV SA 型以及 VEEV 发生特 异性反应， 而与病毒株 WEEV 则没有交叉反应， 因此， 说明与 EEEV-5E4 对应的是 EEEV/VEEV 抗原群的特异性表位， 序列比对以及间接 ELISA 的鉴定结果见图 6。 说 明 书 CN 103421746 A 10 1/1 页 11 0001 序 列 表 CN 103421746 A 11 1/2 页 12 图 1图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103421746 A 12 2/2 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103421746 A 13 。