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1、(10)申请公布号 CN 103421788 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421788 A *CN103421788A* (21)申请号 201310151410.1 (22)申请日 2013.04.27 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 熊立仲 方玉洁 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 张红兵 (54) 发明名称 水稻逆境应答型启动子 OsSN1P 。
2、的分离和利 用 (57) 摘要 本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉 及一种水稻逆境应答型启动子 OsSN1P 的分离和 利用。 通过分离、 克隆和功能验证得到一种对多种 非生物逆境如干旱、 高盐、 高温、 ABA 等应答的启 动子， 其核苷酸序列如SEQ ID NO ： 1所示。 该启动 子能够提高抗逆相关基因在非生物逆境环境中的 特异表达， 可应用于遗传改良水稻耐受非生物逆 境的能力。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 序列表 2 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书12页 序列表2页 附图6页 。
3、(10)申请公布号 CN 103421788 A CN 103421788 A *CN103421788A* 1/1 页 2 1.一种分离的水稻逆境应答型启动子OsSN1P， 其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO ： 1所 示。 2. 权利要求 1 所述的启动子在提高水稻抗逆相关基因在非生物逆境环境中特异表达 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103421788 A 2 1/12 页 3 水稻逆境应答型启动子 OsSN1P 的分离和利用 技术领域 0001 本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及分离、 克隆和通过功能验证得到一 种对多种非生物逆境 ( 干旱、 高盐、 高温、 ABA 等。
4、 ) 应答的启动子能够提高抗逆相关基因在 非生物逆境环境中特异表达， 应用于遗传改良水稻耐受非生物逆境的能力。本发明采用 PCR 扩增及融合 GUS 报告基因遗传转化的方法， 克隆得到控制水稻非生物逆境应答启动子 SN1P， 通过Real-time PCR， 转基因植株GUS染色观察及GUS酶活测定， 证明该启动子受非生 物逆境 ( 干旱、 高温、 氧化胁迫 ) 诱导， 可应用于水稻的遗传改良。 背景技术 0002 在自然或农业生产条件下， 植物的生长发育过程会受到各种环境因素的影响。干 旱、 高盐、 极端温度等诸多非生物逆境胁迫条件常常会敏使植物受到伤害甚至死亡。 对农业 生产来说， 这些不。
5、良环境是影响作物产量和品质的最直接、 最重要的因素， 因此成为了制约 许多地区农业发展的瓶颈。随着现代分子生物学技术的不断发展， 研究抗逆相关基因的功 能和调控机制， 并利用这些基因培育出具有优良抗逆性的作物品种， 已成为农业科学技术 研究的重要目标之一。 0003 由于植物在其生长过程中不可随意移动， 因此在长期的进化和自然选择中渐渐 形成了一套抵御不良环境的自我保护机制。植物感受外界逆境信号后通过信号转导过程 调节细胞内抗逆相关蛋白的表达， 进而调整自身的代谢、 生理状态或形态来适应不利环 境， 维持基本的生存活动。植物感应到逆境胁迫后经过一系列的信号传导和转录调控， 启 动下游大量与胁迫。
6、应答相关基因的表达， 产生如 LEA 类蛋白、 渗调蛋白、 抗冻蛋白、 通道蛋 白等一些使细胞免受胁迫伤害的物质， 进而使植物增强对胁迫的耐受能力 (Valliyodan B， Nguyen H T.Understanding regulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants.Curr Opin Plant Biol， 2006， 9 ： 189-195)。 近 年 来， 通过转基因手段改良植物抗逆性近年来正逐步得到可行性论证和普遍接受。已经有许 多研究证实， 在植物中超量表达逆境应答相关基。
7、因能够在一定程度上提高植物的抗逆性 (Hu 等 .Overexpressing aNAM， ATAF， and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103 ： 12987-12992 ； Hou 等 .A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regLates cell viability and stress tole。
8、rance.Proc Natl Acad Sci， 2009， 106(15) ： 6410-6415)。 但是报道中的这些超量表达通常用的都是组成型启动子， 尽管 组成型启动子超量表达效应高， 但是通常会伴随着不可避免的负面效应， 如对植物产生毒 害或负担或者使转基因植株致死等 (Puranik 等， NAC proteins ： regulation and role in stress tolerance.Trends Plant Sci， 2012， 17(6) ： 369-381)。尽管已经有文献报道从植 物中分离出受逆境应答的启动子 (Kasuga 等， Acombination 。
9、of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol， 2004， 45 ： 说 明 书 CN 103421788 A 3 2/12 页 4 346-350 ； Xiao 等， Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance unde。
10、r the field conditions.Theor Appl Genet， 2007， 115(1) ： 35-46)， 但是将逆境诱导型启动子应用于重要粮食作物水稻抗逆品种培育的成功例子还非常少。 NAC(NAM， ATAF， and CUC) 转录因子是植物特有的一类转录因子， 迄今为止已发现该家族 在水稻中有 151 个成员 (Nuruzzaman 等， Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice.Gene， 2010， 465 ： 30-44)， 许多研究报道 NAC 转录因子在植物的 生长发育和。
11、逆境应答中过程中发挥着至关重要的作用。我们的研究表明 NAC 家族中有相 当一部分成员受到非生物逆境胁迫诱导表达 (Fang 等， Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice.Mol Genet Genomics， 2008， 280(6) ： 547-563)。 0004 水稻(Oryza sativa)作为一种重要的粮食作物， 其抗逆改良一直是人们努力的目 标。在。
12、自然气候条件日益恶劣的今天， 培育抗逆水稻新品种的意义和紧迫性显而易见。本 发明涉及的 SN1 基因是水稻 NAC 家族成员之一， 通过实时荧光定量 PCR 技术验证了 SN1 基 因的启动子受多种非生物逆境诱导表达， 通过启动子活性定量分析表明， SN1 基因启动子驱 动下的 GUS 报告基因在干旱、 高温和氧化胁迫条件下表达显著上升， 该启动子可用于抗逆 性相关基因在水稻等作物中的诱导表达， 从而有效地提高植株抗非生物逆境的性能， 对于 培育抗逆作物新品种将具有重要意义。 发明内容 0005 本发明的目的涉及一个水稻 NAC 家族基因 SN1 的启动子在水稻抗逆改良中的应 用。SN1 基因。
13、是一个编码 NAC 蛋白的基因。该基因对包括干旱， 高温， 低温， 氧化胁迫， 伤害 在内的多种非生物逆境胁迫均有应答。本发明分离和应用一种 SN1 基因的启动子片段， 该 片段赋予下游目的基因在干旱、 高温及 MV 模拟的氧化胁迫条件下表达量显著上升的能力。 其中， 所述的 SN1P 启动子核苷酸序列长度为 2233bp， 其核苷酸序列如序列表 SEQ NO ： 1 所 示。 0006 本发明通过以下技术方案实施 ： 0007 首先是分离对逆境应答表达的候选基因的启动子。 所选择的候选基因是水稻内源 基因， 属于 NAC 转录因子家族， 命名为 SN1(TIGR ID 为 LOC_OsO1g。
14、09550)。该基因在水稻品 种 “中花 11” 的苗期干旱、 高温、 高盐胁迫和 ABA 处理下均受到诱导上升表达 ( 如图 2)。所 分离的该基因的启动子来源于水稻品种 “日本晴” ， 命名为 SN1P。SN1P 启动子是具有如图 1 中碱基第 1-2233 所示的序列 ； 在该序列的第 52-56、 1894-1898 碱基位点含有与逆境相关 的ABA应答元件ABRELATERD1(Simpson等， Two different novelcis-acting elements of erd1， a clpA homologous Arabidopsis gene function in。
15、 induction by dehydration stress and dark-induced senescence.Plant J， 2003， 33 ： 259-270 ； Nakashima 等， Transcriptional regulation of ABI3-and ABA-responsive genes including RD29B and RD29A in seeds， germinating embryos， and seedlings of Arabidopsis.Plant Mol Biol， 2006， 60 ： 51-68) ； 在 317-334、 222。
16、8-2233 碱基位点含有逆境相关的厌氧应答 元件 ANAERO2CONSENSUS(Mohanty 等， Detection and preliminary analysis of motifs in promoters of anaerobically induced genes of different plant species.Ann 说 明 书 CN 103421788 A 4 3/12 页 5 Bot， 2005， 96 ： 669-681) ； 在 953-957、 1408-1412 碱基位点含有逆境相关的高温应答元 件 CCAATBOX1(Rieping M， Schoff。
17、l F， Synergistic effect of upstream sequences， CCAAT box elements， and HSE sequences for enhanced expression of chimaeric heat shock genes in transgenic tobacco.Mol Gen Genet， 1992， 231 ： 226-232 ； Haralampidis 等， Combinatorial interaction of cis elements specifies the expression of the Arabidopsis 。
18、AtHsp90-1gene.Plant Physiol， 2002， 129 ： 1138-1149 ； Wenkel 等， CONSTANS and the CCAAT Box Binding Complex Share a Functionally Important Domain and Interact to Regulate Flowering of Arabidopsis.Plant Cell， 2006， 18 ： 2971-2984) ； 在 1217-1222 碱基位点含有逆境相关的低温应答元件 LTRE1HVBLT49(Dunn 等， Identification of p。
19、romoter elements in a low-temperature-responsive gene(blt4.9)from barley(Hordeum vulgare L.).Plant Mol Biol， 1998， 38 ： 551-564)。 0008 本发明所提供的启动子 SN1P 区域含有多个与逆境相关的顺式作用元件 ( 如图 1 所示 )， 能特异性地对高温、 低温、 氧胁迫等逆境和 ABA 起应答反应。申请人利用 SN1P 启动 子构建的 GUS 表达载体 ( 如图 5 所示 ) 转化水稻受体品种 “中花 11 号” ， 可以在转基因材料 受到逆境胁迫时诱导报告基因 G。
20、US 的表达 ( 如图 7 和图 8 所示 )。本发明的效果详见具体 实施方式。 0009 详细的技术方案如下所述 ： 0010 一种分离出的水稻DNA分子， 其核苷酸序列如图1和序列表SEQ ID NO ： 1所示， 其 中启动子 SN1P 包含如图 1 和序列表 SEQ ID NO ： 1 所示的序列中的第 1-2233 位碱基所示的 核酸序列。 0011 上述分离的 DNA 分子， 其区域内除基本启动子元件外 ( 如 TATA-box)， 还包含多个 逆境应答顺式作用元件(如ABRELATERD1、 ANAERO2CONSENSUS、 CCAATBOX1和LTRE1HVBLT49) 的组。
21、合。 0012 所述的 SN1P 启动子全部或部分序列可以用于构建的水稻表达载体。 0013 所述的 SN1P 启动子全部或部分序列可应用于构建水稻表达载体， 通过遗传转化 的方法培育改良植物， 优选的植物是水稻。 0014 利用上述的 SN1P 启动子全部或部分序列构建水稻表达载体， 通过遗传转化的方 法可以用于培育的抗逆植物材料， 所述的抗逆植物的是指植株、 种子或细胞无性系。 0015 按照以上的技术方案， 申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所提供的 SN1P启动子构建抗逆相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗逆性。 受体植物可以是 包括水稻、 小麦、 玉米等在内的禾谷类作物， 。
22、当然也可以是包括其他一些重要的经济作物， 例如玉米、 棉花、 油菜或番茄等。 0016 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。 附图说明 0017 序列表SEQ ID NO ： 1是本发明克隆的水稻启动子SN1P的核苷酸序列， 序列长度为 2233bp。 0018 图 1 ： SN1P 启动子序列 ( 基本启动子元件结构 )。基本启动子元件序列用阴影部 分显示， 逆境应答 ABRELATERD1、 ANAERO2CONSENSUS、 CCAATBOX1、 LTRE1HVBLT49 元件核心序 说 明 书 CN 103421788 A 5 4/12 页 6 列用斜体并加下划线表示。 0019。
23、 图 2 ： SN1 基因在多种逆境下的表达情况。各处理样品为 ： 干旱 (drought) 处理 0h， 3h， 6h， 12h ； 高盐 (salt) 处理 0h， 3h， 6h， 12h ； 高温 (heat) 处理 0min， 1h， 3h， 6h ； 低温 (cold)处理0h， 1h， 6h， 24h ； 水涝胁迫(flood)处理0h， 6h， 12h， 24h ； 伤害(wound)处理0h， 1h， 6h， 12h ； 氧化胁迫 (H2O2) 处理 0h， 1h， 3h， 12h ； ABA(100M) 处理 0h， 0.5h， 3h， 6h。 0020 图 3 ： SN1P。
24、 启动子的组织器官表达模式 ( 图中组织器官从左至右依次为 ： 愈伤， 根， 茎尖， 叶， 叶鞘， 1cm 穗， 5cm 穗， 10cm 穗， 雌蕊， 雄蕊和胚 )。 0021 图 4 ： DX2181G 载体的质粒图谱。 0022 图 5 ： 本发明构建的表达载体 DX2181G-SN1P 的图谱。该载体含有潮霉素抗性筛选 基因 (hygromycin)， 启动子 SN1P 被融合到 GUS 基因 5 端非翻译区。 0023 图6 ： SN1P是本发明的SN1P启动子在该启动子转基因水稻正常生长条件下驱动下 游GUS报告基因的表达(图中染色组织器官名称从左至右从上至下依次为 ： 分化初期愈伤。
25、， 分化幼苗， 叶尖， 叶片， 叶枕、 叶耳和叶舌， 叶鞘， 叶鞘纵切面， 根， 颖壳， 幼胚， 种子 )。 0024 图 7 ： 抗性愈伤中 SN1P 启动子控制下的 GUS 基因在干旱、 高温、 水涝和甲基紫精 (MV) 模拟的氧化胁迫处理下的表达活性， 图中显示 GUS 染色结果。 0025 图 8 ： 抗性愈伤中 SN1P 启动子驱动 GUS 报告基因在干旱、 高温、 水涝和甲基紫精 (MV) 模拟的氧化胁迫处理下的 GUS 酶活定量分析结果。 0026 图 9 ： 是本发明的中间质粒 pEGEM-T Vectorde 图谱。 0027 图 10 ： 是在中间质粒 pEGEM-T Ve。
26、ctorde 中插入了 SN1P 基因片段 ( 见图 10 的右 侧 ) 的质粒图谱。 具体实施方式 0028 以下实施方式定义了本发明， 并描述了本发明在分离 SN1P 启动子， 克隆包含有 SN1P 启动子的 DNA 片段， 以及验证 SN1P 启动子功能的方法。根据以下的描述和这些实施 例， 本领域技术人员可以确定本发明的基本特征， 并且在不偏离本发明精神和范围的情况 下， 可以对本发明做出各种改变和修改， 以使其适用不同的用途和条件。 0029 1、 SN1P 启动子的分离和鉴定 0030 通过水稻品种 “中花 11 号” ( 来源于中国农业科学院作物科学研究所， 公开推广的 水稻品种。
27、 ) 的逆境表达谱分析， 发现了一个对多种逆境条件应答的基因， 其 TIGR(http:/ rice.plantbiology.msu.edu/)ID 为 LOC_Os01g09550， 被命名为 SN1， 对应的 PAC 克隆号为 P0710E05。 0031 下一步就是分离该基因的启动子。具体步骤如下 ： 在 NCBI(http:/www. ncbi.nlm.nih.gov/) 找到该基因对应的粳稻 “日本晴”的基因组序列 (P0710E05) 并 选取该基因的转录起始位点上游 2.5kb 的范围作为候选启动子区域进行 PCR 扩增。设 计引物 SN1P-F(5 -AACTGGAAACCG。
28、TGAGAC-3 ) 和 SN1P-R(5 -AA GCTGCTTTCACAAGTTTA-3 )， 并在引物 5 端分别添加限制性酶切位点 SalT( 用斜体加下划 线表示， 酶切位点前的两个碱基为保护碱基 )。首先利用引物 SN1P-F 和 SN1P-R 以 “日本 晴” 基因组 DNA(CTAB 法抽提水稻基因组 DNA 文献见 ： Zhang 等， genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis.Theor 说 明 书 CN 103421788 A 6 5。
29、/12 页 7 Appl Genet， 1992， 83 ： 495-499)为模板进行扩增， 反应体系为20LLAbufferII体系(购自 TaKaRa公司)， 反应条件是 ： 94预变性4min ； 94 30sec， 55 30sec， 72 2min 30sec， 32 个循环 ； 72延伸 7min。将扩增获得的 PCR 产物连入 pGEM-T( 购自普洛麦格 ( 北京 ) 生物技术有限公司， 即美国 Promega 公司代理商 ) 载体上， 通过酶切筛选阳性克隆并测序 (ABI3730 测序仪， Applied Biosystem， 测序在国家植物基因中心 武汉 完成 )， 结果。
30、证 实 ： 所扩增序列为预期的 SN1P 启动子序列， 其包含多个高温、 低温、 厌氧、 ABA 逆境应答顺式 作用元件 ( 如图 1)， 将获得的重组质粒载体被命名为 pGEM-SN1P。 0032 2、 检测水稻内源 SN1 基因的表达水平 0033 申请人选用粳稻品种 “中花 11 号” 作为表达谱分析的材料。选择正常生长至 4 叶 期幼苗进行各种逆境和脱落酸 (ABA) 处理。干旱处理是使其自然干燥， 0h， 3h， 6h， 12h 后取 样 ； 高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在 200mM NaCl 的溶液， 0h， 3h， 6h， 12h 后取样 ； 高温胁迫是 将幼苗放入 42人工气候。
31、室， 0h， 1h， 3h， 6h 后取样 ； 低温胁迫是将幼苗放入 4人工气候 室， 0h， 1h， 6h， 24h 后取样 ； 水涝胁迫是将幼苗置于装满水的四面透光容器内， 0h， 6h， 12h， 24h 后取样 ； 伤害处理是用镊子对幼苗进行机械损伤， 0h， 1h， 6h， 12h 后取样 ； 氧化胁迫是将 幼苗根部浸泡在 1 H2O2溶液中， 0h， 1h， 3h， 12h 后取样 ； 脱落酸 (ABA) 处理是用 100M 的 脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后并加施到幼苗根部， 0h， 0.5h， 3h， 6h后取样。 组织 表达谱分析仍以粳稻品种 “中花 11” 为材料。
32、， 取各个发育时期的组织样品 ( 愈伤， 根， 茎尖， 叶， 叶鞘， 1cm 穗， 5cm 穗， 10cm 穗， 雌蕊， 雄蕊， 胚 )。总 RNA 的提取采用 TRIZOL 试剂 ( 购自 Invitrogen 公司 ) 提取， 提取方法按照上述 TRIZOL 试剂说明书 )， 利用反转录酶 SSIII( 购 自 Invitrogen 公司 ) 将其反转录合成 cDNA( 方法根据 Invitrogen 公司反转录酶试剂说明 书 )， 反应条件为 ： 65 5min， 50 120min， 70 10min。以上述反转录合成的 cDNA 为模 板， 用引物 (SN1F ： 5 -GCACGT。
33、CTTCGAGCACAAAA-3 和 SN1R ： 5 -TGGCTGGTAAGGCCATTCTG-3 ) 对 SN1 基因进行特异的 PCR 扩增。同时用引物 UF(5 -AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3 ) 和 UR(5 -ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3 )对水稻Ubiquitin基因进行特异性扩增， 以作为内对照进 行定量分析。反应条件为 ： 95 5min ； 95 10sec， 60 5sec， 72 34sec， 45 个循环。反 应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明， SN1 启动子 ( 其序列如 SEQ NO ： 1 所示 ) 在干旱、 高。
34、盐、 高温、 氧化胁迫和 ABA 处理下诱导 SN1 基因上升表达 ( 图 2)。组织表达谱分 析检测发现 SN1 在各个组织器官中均有表达， 在根、 叶和雄蕊中表达量较高 ( 图 3)。 0034 3、 SN1P 启动子驱动 GUS 报告基因载体的构建和遗传转化 0035 为了能更好的分析 SN1P 启动子的功能， 申请人构建了 SN1P 驱动 GUS 报告基因的 表达载体并转化到粳稻品种中花11号中， 从转基因材料的GUS活性研究该基因启动子的功 能。 0036 SN1P 驱动 GUS 报告基因的表达载体构建方法如下 ： 首先对实施例 1 中得到的 pGEM-SN1P 质粒进行 SalI 。
35、单酶切， 回收外源片段。同时， 用同样的方法酶切 GUS 表达载 体 DX2181G(DX2181G 载体质粒图谱见图 4， DX2181G 是在国际上常用的植物遗传转化载体 pCAMBIA1301基础上改建的， 含有GUS报告基因的农杆菌介导的遗传转化载体)， 酶切完毕， 用氯仿异戊醇 ( 体积比 24 1) 抽提， 纯化酶切产物。用包含 SN1P 启动子的酶切片段和 酶切的 DX2181G 载体做连接反应， 其后转化大肠杆菌 Top10( 该大肠杆菌 Top10 菌株购自 Invitrogen 公司 )。通过酶切筛选阳性克隆并验证外源片段插入方向， 将获得的重组质粒 说 明 书 CN 10。
36、3421788 A 7 6/12 页 8 载体被命名为 SN1P-DX2181G( 载体上的 SN1P 启动子序列就是 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸 序列， 序列长度为 2233bp， 本发明构建的重组质粒载体 SN1P-DX2181G 载体图谱见图 5)。 0037 通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法 ( 其具体转化步骤如下所述 ) 将重组质粒 载体 SN1P-DX2181G 转入到水稻品种 “中花 11” 中， 经过预培养、 侵染、 共培养、 筛选具有潮 霉索抗性的愈伤、 分化、 生根、 练苗、 移栽， 得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻 ( 中花 11) 遗传转化方法 ( 体。
37、系 ) 在 Hiei 等人报道的方法 (Hiei 等， Efficient transformation of rice， Oryza sativa L.， mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J， 1994， 6 ： 271-282) 基础上改良进行。 0038 本实施例的具体遗传转化步骤如下 ： 0039 (1) 电转化 ： 将最终启动子驱动 GUS 报告基因的目标载体 SN1P-DX2181G( 质粒图 谱见图 5)， 用 1800v 电压， 电转化入农杆。
38、菌 EHA105 菌株， 涂到带有对应抗性选择的常用的 LA 培养基上， 筛选出阳性克隆， 用于下述转化愈伤。 0040 (2) 愈伤组织诱导 ： 将成熟的水稻种子 “中花 11” 去壳， 然后依次用 70的乙醇溶 液处理1分钟， 0.15氯化汞(HgCl2)溶液种子表面消毒15分钟 ； 再用灭菌水清洗种子4-5 次， 将消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)培养获得愈伤组织， 将所得愈伤组织转 移至诱导培养基 ( 成分见后 ) 置于黑暗处培养 4 周， 培养温度 251。 0041 (3) 愈伤继代 ： 挑选亮黄色、 紧实且相对干燥的胚性愈伤， 放于愈伤继代培养基 ( 成分见后 ) 上黑暗。
39、下培养 2 周， 培养温度 251。 0042 (4) 预培养 ： 挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤， 放于预培养基 ( 成分见后 ) 上黑暗 下培养 2 周， 培养温度 251。 0043 (5) 农杆菌培养 ： 在带有对应抗性选择的 LA 培养基上 ( 成分见后 ) 预培养农 杆菌 EHA105( 来源于澳大利亚 CAMBIA 实验室商用菌株， 携带有本发明的启动子载体 SN1P-DX2181G， 载体图谱见图 5) 两天， 培养温度 28 ； 将所述的农杆菌转移至悬浮培养基 ( 成分见后 ) 里， 28摇床上培养 2-3 小时。 0044 (6) 农杆菌侵染 ： 将预培养的愈伤转移至灭菌好的。
40、瓶子内 ； 调节农杆菌的悬浮液 至 OD6000.8-1.0 ； 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡 30 分钟 ； 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干 ； 然后放置在共培养基 ( 成分见后 ) 上培养 3 天， 培养温度 19-20。 0045 (7) 愈伤洗涤和选择培养 ： 灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌 ； 浸泡在含 400ppm 羧 苄青霉素 (CN) 的灭菌水中 30 分钟 ； 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干 ； 再转移愈伤至选择 培养基 ( 成分见后 ) 上选择 2-3 次， 每次 2 周 ( 第一次筛选用的羧苄青霉素浓度为 400ppm， 第二次及以后羧苄青霉素浓度为 250ppm， 潮霉素浓度为。
41、 250ppm)。 0046 (8) 分化 ： 将抗性愈伤转移至预分化培养基 ( 成分见后 ) 上黑暗处培养 5-7 周 ； 转 移预分化培养的愈伤至分化培养基上 ( 成分见后 )， 光照 (4000lx) 下培养， 培养温度 26。 0047 (9) 生根 ： 剪掉分化时产生的根 ； 然后将其转移至生根培养基中于光照 (4000lx) 下培养 2-3 周， 培养温度 26。 0048 (10) 移栽 ： 洗掉根上的残留培养基， 将具有良好根系的幼苗转入温室， 同时在最 初的几天保持水分湿润。 0049 培养基组分及其配方 ： (1) 试剂和溶液缩写 ： 本发明中培养基所用到的植物激 素的缩写。
42、表示如下 ： 6-BA(6-BenzylaminoPurine， 6- 苄基腺嘌呤 ) ； CN(Carbenicillin， 说 明 书 CN 103421788 A 8 7/12 页 9 羧 苄 青 霉 素 ) ； KT(Kinetin，激 动 素 ) ； NAA(Napthalene acetic acid，萘 乙 酸 ) ； IAA(Indole-3-acetic acid，吲 哚 乙 酸 ) ； 2， 4-D(2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid， 2， 4- 二 氯 苯 氧 乙 酸 ) ； AS(Acetosringone，乙 酰 丁 香 酮 ) ； CH。
43、(Casein Enzymatic Hydrolysate， 水解酪蛋白 ) ； HN(Hygromycin B， 潮霉素 ) ； DMSO(Dimethyl Sulfoxide， 二甲 基亚砜) ； N6max(N6大量成分溶液) ； N6mix(N6微量成分溶液) ； MSmax(MS大量成分溶液) ； MSmix(MS 微量成分溶液 )。(2) 主要溶液配方 ： 0050 1)N6 培养基大量元素母液 10 倍浓缩液 (10X) 的配制 ： 0051 0052 0053 逐一溶解， 然后室温下定容至 1000ml。 0054 2)N6 培养基微量元素母液 100 倍浓缩液 (100X) 。
44、的配制 0055 0056 室温下溶解并定容至 1000ml。 0057 3) 铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) 的配制 0058 准备 800ml 双蒸水并加热至 70， 加入乙二铵四乙酸二钠 (Na2EDTA2H2O)3.73 克， 充分溶解后在 70水浴中保持 2 小时， 定容至 1000ml， 4保存备用。 0059 4) 维生素贮存液 (100X) 配制 0060 0061 加水定容至 1000ml， 4保存备用。 0062 5)MS 培养基大量元素母液 (10X) 的配制 0063 说 明 书 CN 103421788 A 9 8/12 页 10 0064 室温下溶解。
45、并定容至 1000ml。 0065 6)MS 培养基微量元素母液 (100X) 的配制 0066 0067 室温下溶解并定容至 1000ml。 0068 7)2， 4-D 贮存液， 6-BA 贮存液， 萘乙酸 (NAA) 贮存液， 吲哚乙酸 (IAA) 贮存液 ： 1 均 为 mg/ml。 0069 8) 葡萄糖贮存液 ： 0.5g/ml。 0070 9)AS 贮存液的配制 ： 秤取 AS0.392g， DMSO10ml。 0071 (3) 用于水稻遗传转化的培养基配方 0072 1) 愈伤组织诱导培养基 0073 0074 加蒸馏水至 900ml， 1N 氢氧化钾调节 pH 值到 5.9， 。
46、煮沸并定容至 1000ml， 分装到 50ml 三角瓶 (25ml/ 瓶 )， 封口灭菌。 0075 2) 继代培养基 0076 说 明 书 CN 103421788 A 10 9/12 页 11 0077 加蒸馏水至 900ml， 1N 氢氧化钾调节 pH 值到 5.9， 煮沸并定容至 1000ml， 分装到 50ml 三角瓶 (25ml/ 瓶 )， 封口灭菌。 0078 3) 预培养基 0079 0080 0081 加蒸馏水至250ml， 1N氢氧化钾调节pH值到5.6， 封口灭菌。 使用前加热溶解培养 基并加入 5ml 葡萄糖贮存液和 250l AS 贮存液， 分装倒入培养皿中 (25m。
47、l/ 皿 )。 0082 4) 共培养基 0083 0084 加蒸馏水至250ml， 1N氢氧化钾调节pH值到5.6， 封口灭菌。 使用前加热溶解培养 基并加入 5ml 葡萄糖贮存液和 250l AS 贮存液， 分装倒入培养皿中 (25ml/ 每皿 )。 0085 5) 悬浮培养基 说 明 书 CN 103421788 A 11 10/12 页 12 0086 0087 加蒸馏水至100ml， 调节pH值到5.4， 分装到两个100ml的三角瓶中， 封口灭菌。 使 用前加入 1ml 葡萄糖贮存液和 100l AS 贮存液。 0088 6) 选择培养基 0089 0090 0091 加蒸馏水至 。
48、250ml， 调节 pH 值到 6.0， 封口灭菌。使用前溶解培养基， 加入 250l HN 和 400ppmCN， 分装倒入培养皿中 (25ml/ 皿 )。 0092 7) 预分化培养基 0093 0094 加蒸馏水至 250ml， 1N 氢氧化钾调节 pH 值到 5.9， 封口灭菌。使用前溶解培养基， 说 明 书 CN 103421788 A 12 11/12 页 13 加入 250lHN 和 200ppm CN， 分装倒入培养皿中 (25ml/ 皿 )。 0095 8) 分化培养基 0096 0097 加蒸馏水至 900ml， 1N 氢氧化钾调节 pH 值到 6.0。煮沸并定容至 100。
49、0ml， 分装到 50ml 三角瓶 (50ml/ 瓶 )， 封口灭菌。 0098 9) 生根培养基 0099 0100 加蒸馏水至 900ml， 1N 氢氧化钾调节 pH 值到 5.8。煮沸并定容至 1000ml， 分装到 生根管中 (25ml/ 管 )， 封口灭菌。 0101 4、 SN1P 启动子表达模式鉴定 0102 将 SN1P 启 动 子 ( 见 SEQ ID NO ： 1) 控 制 GUS 报 告 基 因 构 建 出 的 转 化 载 体 SN1P-DX2181G 转化 “中花 11” ， 对转基因植株在不同发育阶段组织部位进行了 GUS 染色 (100ml GUS 染 色 液 配 方 ： 0.1M Na2HPO4pH7.040ml。