产生抗人D二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201310444744.8

申请日:

2013.09.26

公开号:

CN103468644A

公开日:

2013.12.25

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/20申请日:20130926|||公开

IPC分类号:

C12N5/20; C07K16/18; G01N33/68; C12R1/91(2006.01)N

主分类号:

C12N5/20

申请人:

重庆探生科技有限公司

发明人:

赵忠颢; 王晓东; 李金芳

地址:

400039 重庆市九龙坡区科城路71号留学生创业园D栋3号楼7楼

优先权:

专利代理机构:

重庆志合专利事务所 50210

代理人:

胡荣珲

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内容摘要

本发明涉及抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用。本发明用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术经多次细胞融合,利用ELISA法克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠腹水法生产单克隆抗体。并利用已制备的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,以D-二聚体作为检测抗原,进行抗体配对试验,获得能检测天然D-二聚体的抗体配对并以此建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。杂交瘤细胞株分泌相应的单克隆抗体,能进行配对和检测天然血清,初步建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。

权利要求书

权利要求书
1.  一种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其保藏号为CCTCC NO:C2013138。

2.  一种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其保藏号为CCTCC NO:C2013139。

3.  一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。

4.  一种权利要求2所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。

5.  一种用于检测人D-二聚体的试剂盒,其包含权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体。

6.  一种权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株的制备方法,其特征在于,包含步骤:
1)用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠;
2)通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合,利用间接ELISA法进行正向和负向筛选,克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

7.  根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤1)包含:将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化,乳化完成后,对8周龄的Balb/c小鼠进行基础免疫。

8.  根据权利要求7所述的方法,其特征在于,2周后,追加免疫一次。

9.  根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤2)包含:将脾细胞与骨髓瘤细胞混合,以聚乙二醇为融合剂,形成融合细胞,将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中,并置CO2中在37℃培养;用间接ELISA法进行筛选,筛选时,先用纤维蛋白原及其降解产物包被,进行负向筛选,去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞;然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选,对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化,并置于CO2中于37℃培养,直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。

10.  权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测人D-二聚体的制剂中的应用。

说明书

说明书产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域,尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人D-二聚体的单克隆抗体。
背景技术
D-二聚体(D-dimer)是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后,再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物。具体而言,血浆中纤维蛋白原在凝血酶(thrombin)、Factor XIIIa(转谷酰胺酶)和钙离子的作用下,去掉血纤肽A、B,暴露出新的结合位点,自发聚集形成非共价结合的纤维蛋白束;纤维蛋白束再在Factor XIIIa的作用下,形成γ-γ的异肽键,将聚合形式以共价键的方式稳定下来,称为交联纤维蛋白,即血栓的基本骨架;交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下,降解为不同大小的交联纤维蛋白降解产物,其最小结构(DD/E,也有文献认为是DD)因为含有两个由异肽键共价交联的D片段而称为D-二聚体。
近年来,D-二聚体作为体内交联纤维蛋白水解的标志性产物,其临床诊断价值已得到普遍认同。它以其高度的敏感性和阴性预示能力,在深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)的排除、弥散性血管内凝血(DIC)的诊断及溶栓治疗效果监测等方面具有很好的临床应用价值。
目前实验室中检测D-二聚体都是基于免疫学的方法,包括免疫层析(胶体金)方法、双向测流免疫测定法、化学发光酶联免疫法和免疫比浊测定法(包括免疫散射比浊法和免疫投射比浊法,每一种又有乳胶凝集增强和普通的两种类型)。所有这些方法都需要高质量的D-二聚体特异性抗体,上述部分方法只用一种抗体即可工作,部分方法需要两种抗体进行配对后才能实现测定。目前D-二聚体检测所用抗体全部来自于国外,国内尚未见到相关抗体报道和销售,客观上影响了国内公司在D-二聚体检测试剂上的研发,在一定程度上导致了目前国内D-二聚体检测试剂市场基本上被欧美公司全部占据的局面。
发明内容
本发明根据临床病人在凝血-纤维蛋白溶解过程中血液成分的相关变化,以纯化的天然D-二聚体为免疫原,通过改良的杂交瘤技术,获得杂交瘤细胞株,分泌D-二聚体特异性单克隆抗体。这两株单克隆抗体能够配对用于D-二聚体的免疫检测。该抗体对将有助于D-二聚体免疫检测试剂的研发。
本发明提供的两株产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,本发明将其命名分别为1C6(细胞保藏号CCTCC NO:C2013138),培养物名称:杂交瘤细胞株1-C6(IgG1)和1D10(细胞保藏号CCTCC NO:C2013139),培养物名称:杂交瘤细胞株1-D10(IgG2b)。保藏单位为中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection,简称CCTCC),地址:中国武汉武汉大学,保藏日为2013年9月5日。
杂交瘤细胞株1C6和1D10均由纯化的D-二聚体免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。
本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1C6所产生的单克隆抗体。
本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1D10所产生的单克隆抗体。
本发明还提供一种用于检测D-二聚体的试剂盒,其包含杂交瘤细胞株1C6和/或1D10所产生的单克隆抗体。
本发明还提供上述的杂交瘤细胞株的制备方法,其主要包含步骤:
1)用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠;
2)通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合,利用间接ELISA法进行正向和负向筛选,克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
具体地,步骤1)包含:将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化,乳化完成后,对8周龄的Balb/c小鼠进行基础免疫。2周后,追加免疫一次。
具体地,步骤2)包含:将脾细胞与骨髓瘤细胞混合,以聚乙二醇为融合剂,形成融合细胞,将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中,并置CO2中在37℃培养;用间接ELISA法进行筛选,筛选时,先用纤维蛋白原及其降解产物包被,进行负向筛选,去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞;然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选,对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化,并置于CO2中于37℃培养,直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。
上述的单克隆抗体可用于制备检测人D-二聚体的制剂。
本发明利用已制备的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,以D-二聚体作为检测抗原,进行抗体配对试验,经过优化ELISA反应条件,获得能检测天然D-二聚体的抗体配对并以此成功建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
本发明通过杂交瘤技术,制备了抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10,分泌相应的单克隆抗体,能进行配对和检测天然血清,初步建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合附图,作详细说明如下。
附图说明
图1表示单克隆抗体1C6的ELISA鉴定,其中上行为包被D-二聚体抗原,中行为包被D-单体,下行为包被纤维蛋白原及其降解产物;每一行中左边第1孔为阴性对照,第2到12孔为抗体倍比稀释,从1:1000、1:2000、…….到1:106。
图2 表示单克隆抗体1D10的ELISA鉴定,其中上行为包被D-二聚体抗原,中行为包被D-单体,下行为包被纤维蛋白原及其降解产物;每一行中左边第1孔为阴性对照,第2到12孔为抗体倍比稀释,从1:1000、1:2000、…….到1:106。 
图3 表示单克隆抗体1C6的免疫印迹鉴定,其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹,右侧为变性电泳后的免疫印迹;每图中,DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原,DD-C为国内公司的D-二聚体抗原,第三和第四条分别为D片段(D fragment)和E片段(E fragment)。
图4 表示单克隆抗体1D10的免疫印迹鉴定,其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹,右侧为变性电泳后的免疫印迹;每图中,DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原,DD-C为国内公司的D-二聚体抗原,第三和第四条分别为D片段(D fragment)和E片段(E fragment)。
图5 表示HRP标记抗体的效价检测结果。其中上行为单克隆抗体1C6,下行为单克隆抗体1D10;包被抗原为D-二聚体,孔1、2和3是阴性对照,孔4为标记抗体1:1000稀释,孔5为1:2000,孔6为1:4000,……,孔12为1:256000。
图6 表示D-二聚体ELISA检测体系的分析特异性鉴定,分别测定D-二聚体和各种相关抗原,横坐标为抗原浓度,单位为单位为μg/ml;纵坐标为450nm处吸光度。
图7 表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线,横坐标为D-二聚体的浓度,单位为μg/ml;纵坐标为450nm处吸光度。
图8表示 D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果比较,横坐标为本发明中涉及方法的检测结果,纵坐标为Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果,单位均为ng/mL。
具体实施方式
本发明以纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术经多次细胞融合,利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水经HiTrap IgG Purification HP亲和层析柱纯化,所得的单克隆抗体进行效价测定,亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌D-二聚体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10,ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。
本发明建立了D-二聚体的ELISA检测体系:应用抗D-二聚体抗体1C6为捕获抗体,抗D-二聚体抗体1D10为检测抗体,建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法,能够准确检测血清中的天然D-二聚体,并以此成功建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
材料和来源
实验动物:Balb/C小鼠购自第三军医大学实验动物中心(中国重庆)。
细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
D-二聚体等抗原购自Abcam公司,HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。
纯化柱和填料购自美国GE公司。
其余试剂均为国产分析纯试剂。
 
实施例1  抗D-二聚体单克隆抗体的制备
1. D-二聚体单克隆抗体的制备
将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化,抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后,以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100 μg/ml)。2周后,将D-二聚体与等量的弗氏不完全佐剂乳化,以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100 μg/ml);2周后,再采用同样方式追加免疫一次,7天后处死小鼠取出小鼠脾脏,将脾细胞进行细胞融合。
融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8:1混合,以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中,并置于6% CO2中在37℃培养。用间接ELISA法进行筛选。筛选时,先用纤维蛋白原及其降解产物包被,进行负向筛选,去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞;然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选,对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化,并置于6% CO2中于37℃培养,直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止,即可进行单克隆抗体的扩大培养。
采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的Balb/c小鼠,于腹腔内注入液态石蜡0.5 mL,1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀,并将细胞数调至4×105 个/mL,每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。
2. D-二聚体单克隆抗体的纯化
收集腹水后对其进行纯化,具体方案为:配置抗体纯化所需buffer:Binding Buffer (A液)20 mmol/L磷酸钠,0.8 mol/L (NH4)2SO4,pH 7.5;Elution Buffer (B液):20 mmol/L 磷酸钠,pH 7.5;Regeneration Buffer(C液):20 mmol/L磷酸钠,pH 7.5,并按体积比30 %加入异丙醇;在单抗腹水中加入硫酸铵,使其终溶度与A液中硫酸铵的溶度一致,0.45 μm滤膜过滤等待上样;选用HiTrap IgG Purification HP柱接入AKTA prime蛋白纯化仪,A、B液和C液对柱子进行充分洗涤;用A液进行充分平衡后,将准备的样品从A管上样,上样后用A液平衡柱子,去除杂蛋白,再用B液洗脱纯化柱,收集洗脱峰;调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0,将抗体分装冷冻于-20℃保存;用Regeneration Buffer使填料进行再生,然后用Binding Buffer进行平衡即可。
3. ELISA鉴定抗D-二聚体单克隆抗体
将纯化的D-二聚体抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml,ELISA条板每孔加入100μl,4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原,洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000......,按100μl/孔加入对应条孔中,另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h,洗板,加入二抗,1:3000 HRP标记山羊抗小鼠IgG,按100μl/孔加入对应条孔中,37℃孵育40min。弃液,洗板,拍干,加入底物液100μl/孔,避光显色10min,加入终止液50μl/孔。在450nm 处测定吸光度值。结果如图 1和图2所示,单克隆抗体1C6对D-二聚体效价达到1:50万,对D-单体的效价为1:8000,对纤维蛋白原及其降解产物的效价为0;单克隆抗体1D10对D-二聚体效价为1:100万,对D-单体效价为0,对纤维蛋白原及其降解产物的效价为0。
4. 抗D-二聚体单克隆抗体的免疫印迹鉴定
1)将Marker 3 μl、D-二聚体抗原20 μl、相关对照抗原20 μl行SDS-PAGE。
2)电泳结束后,取下凝胶,置于转印缓冲液中平衡10 min。
3)将0.22 μm PVDF膜先用无水甲醇处理20 s,再用ddH2O洗涤5 min。然后再浸入Transfer Buffer超过5 min。同时将滤纸浸入Transfer Buffer中。
4)转膜:从下至上依次排列:滤纸—PVDF膜—胶—滤纸,排出气泡,放入转膜仪,18 V恒压电转移1.5 h。
5)转膜完成后,在膜上可见清晰蛋白marker,ddH2O清洗两遍,TBST洗5 min。将转移膜置于封闭液中,室温封闭2 h。
6)弃去封闭液,用1×TBST漂洗膜3次,每次15 min。
7)加入以1:1000稀释的纯化抗体,4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次,每次15 min。
8)加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体,37℃孵育3 h。
9)1×TBST洗涤3次,每次15 min。
10)用化学发光显色,显影定影后,观察分析结果并摄像。在D-二聚体对应分子量处处均可见抗D-二聚体单克隆抗体结合清晰条带。结果如图3和图4所示。在7%非变性条件下,单克隆抗体1C6和1D10均能识别并结合两种不同来源的D-二聚体,不识别D-片段和E-片段,在7%变性条件下,两种单克隆抗体均不识别和结合这四种形式的抗原。。
实施例2  双抗体夹心ELISA法检测D-二聚体
1. HRP标记抗体
本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与抗体蛋白的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,具体步骤如下:
1)HRP酶的准备:称取10 mg HRP酶,加2 mL纯水配置为5 mg/ml的HRP液体,按照每mg HRP酶加入34 μL计算,加340 μL NaIO4,4℃避光放置,1 h后,按照每mg HRP酶加入250 μL的量加入乙二醇250 μL,避光放置4℃,30 min后转入透析袋中,用1 mM醋酸缓冲液(pH 4.0~4.4)透析过夜,期间至少换液2次,均要求避光。
2)抗体的准备:0.01 M的PBS缓冲液进行4℃透析过夜,并测定蛋白浓度。
3)标记:抗体与HRP酶按1:1(质量比)混合,加入1 mol/L Na2CO3缓冲液(1:80),调解反应的pH为9.5,25℃反应2~3 h。
4)终止:新鲜配制0.1 mol/L NaH4B(4 mg/mL),按照每mg HRP酶加入47 μL。4℃放置2 h后,转入透析袋。用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0~7.2)透析过夜,期间至少换液两次,避光。
5)HRP标记抗体的效价检测:将纯化的D-二聚体抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml,ELISA条板每孔加入100μl,4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原,洗板,加入350μl/孔的1%BSA进行封闭,37℃,2h。洗板后将HRP标记好的待鉴定单克隆抗体作1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000......,按100μl/孔加入对应条孔中,另作空白及阴性对照孔。37℃孵育40min,弃液,洗板,拍干,加入底物液100μl/孔,避光显色10min,加入终止液50μl/孔。在450nm 处测定吸光度值。结果如图5所示,结果显示,1-C6和1-D10酶标抗体的效价均>1:256000,满足应用要求。
6)分装保存:标记好的抗体用棕色EP管分装,并测定抗体效价。-20℃避光保存。
2. 抗体配对及临床样本的检测
1)标本收集:
从第三军医大学第一附属医院收集临床血浆标本,取回过程中用冰袋储存,以保持标本新鲜,离心取上清加防腐剂后做好标记分装于1.5 ml Ep管中,-80℃保存,并将病人基本信息录入电脑,做好编号。
2)标本检测:
选取单克隆抗体1C6作为捕获抗体,酶标单克隆抗体1D10作为检测抗体,D-二聚体校准品为测定对象,检测方法如下:a. 包被酶标板:用包被液将抗体稀释为5 μg/ml,每孔加100 μl, 4℃包被过夜。b. 将包被过夜的酶标板洗3遍,甩干。c. 封闭:每孔加封闭液350 μl,37℃孵育1 h,洗涤3遍,甩干。d. 用抗体稀释液将D-二聚体校准品从50 μg /ml开始倍比稀释,每孔加100 μl,第一孔为空白对照,做标准曲线。检测临床标本时,每孔加标本100 μl,37℃孵育1 h。e. 洗板3遍,甩干。f. 将相对应的酶标二抗以1:5000稀释,每孔加入100 μl,37℃孵育30 min。g. 洗板5遍,甩干。h. 每孔加入100 μl底物显色液,室温避光显色5 min。i. 每孔加入50 μl终止液,450nm处读取吸光度值,同时制作标准曲线,根据标准曲线确定临床样本中D-二聚体的含量。
具体请参照图6、图7和图8。图6显示基于单克隆抗体1C6和1D10建立的ELISA体系结果表明,新建的ELISA仅对D-二聚体反应,而对纤维蛋白原、FgDP-X和FgDP-Y没有反应,提示该检测体系具有良好的特异性。图7 表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线,横坐标为D-二聚体的浓度,单位为μg/ml;纵坐标为450nm处吸光度。提示该检测体系在0-2μg/ml范围内线性良好。图8表示 D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果比较,横坐标为本发明中涉及方法的检测结果,纵坐标为Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果,单位均为ng/mL。提示该检测体系与公认方法检测结果相关良好,具有很好的检测准确度。
同时请参照表1,其中对D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Simens公司的D-dimer Plus试剂测定结果进行了比较,结果表明,对于阴性标本,二者之间的符合率为97%,对于阳性标本,二者之间的符合率为84%,总体符合率为91%。
表1 新建ELISA 体系与公认试剂检测结果比较
 阴性结果阳性结果合计Siemens D-Dimer PLUS1401122521C6/1D1013694230符合率(%)978491
虽然本发明已以较佳实施例披露如上,然其并非用以限定本发明,任何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作些许的更动与改进,因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

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1、(10)申请公布号 CN 103468644 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103468644 A *CN103468644A* (21)申请号 201310444744.8 (22)申请日 2013.09.26 CCTCC NO:C2013138 2013.09.05 CCTCC NO:C2013139 2013.09.05 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/18(2006.01) G01N 33/68(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 重庆探生科技有限公司 地址 400039 重庆市九龙坡区科城路 71 号 留。

2、学生创业园 D 栋 3 号楼 7 楼 (72)发明人 赵忠颢 王晓东 李金芳 (74)专利代理机构 重庆志合专利事务所 50210 代理人 胡荣珲 (54) 发明名称 产生抗人 D- 二聚体的单克隆抗体的杂交瘤 细胞株及制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及抗人 D- 二聚体的单克隆抗体的 杂交瘤细胞株及制备方法和应用。本发明用纯化 的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠, 通 过杂交瘤技术经多次细胞融合, 利用 ELISA 法克 隆化筛选出能稳定分泌抗 D- 二聚体单克隆抗体 的杂交瘤细胞株。小鼠腹水法生产单克隆抗体。 并利用已制备的抗 D- 二聚体单克隆抗体作为捕 获抗体和检测。

3、抗体, 以 D- 二聚体作为检测抗原, 进行抗体配对试验, 获得能检测天然 D- 二聚体的 抗体配对并以此建立了检测 D- 二聚体的双抗体 夹心 ELISA 方法。杂交瘤细胞株分泌相应的单克 隆抗体, 能进行配对和检测天然血清, 初步建立了 检测 D- 二聚体的双抗体夹心 ELISA 方法。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103468644 A CN 103468644 A *CN103468644A* 1。

4、/1 页 2 1. 一种产生抗人 D- 二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 其保藏号为 CCTCC NO : C2013138。 2. 一种产生抗人 D- 二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 其保藏号为 CCTCC NO : C2013139。 3. 一种权利要求 1 所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。 4. 一种权利要求 2 所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。 5.一种用于检测人D-二聚体的试剂盒, 其包含权利要求3和/或权利要求4所述的单 克隆抗体。 6. 一种权利要求 1 或 2 所述的杂交瘤细胞株的制备方法, 其特征在于, 包含步骤 : 1) 用纯化的 D- 二聚体作为免疫原免。

5、疫动物 Balb/c 小鼠 ; 2) 通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合, 利用间接 ELISA 法 进行正向和负向筛选, 克隆化筛选出能稳定分泌抗 D- 二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 7. 根据权利要求 6 所述的方法, 其特征在于, 步骤 1) 包含 : 将纯化的 D- 二聚体与等量 的弗氏完全佐剂乳化, 乳化完成后, 对 8 周龄的 Balb/c 小鼠进行基础免疫。 8. 根据权利要求 7 所述的方法, 其特征在于, 2 周后, 追加免疫一次。 9. 根据权利要求 6 所述的方法, 其特征在于, 步骤 2) 包含 : 将脾细胞与骨髓瘤细胞混 合, 以聚乙二醇为融合。

6、剂, 形成融合细胞, 将融合细胞悬于含小牛血清的 HAT 培养液中, 并 置 CO2中在 37培养 ; 用间接 ELISA 法进行筛选, 筛选时, 先用纤维蛋白原及其降解产物包 被, 进行负向筛选, 去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞 ; 然后用 D- 二 聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选, 对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行 细胞克隆化, 并置于 CO2中于 37培养, 直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。 10.权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测人D-二聚体的制剂中 的应用。 权 利 要 求 书 CN 103468644 A 2 1/6 页 3。

7、 产生抗人 D- 二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备 方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药工程技术领域, 尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人 D- 二聚体的单克隆抗体。 背景技术 0002 D- 二聚体 (D-dimer) 是纤维蛋白单体经活化因子 XIII 交联后, 再经纤溶酶水解所 产生的一种特异性降解产物。具体而言, 血浆中纤维蛋白原在凝血酶 (thrombin)、 Factor XIIIa(转谷酰胺酶) 和钙离子的作用下, 去掉血纤肽 A、 B, 暴露出新的结合位点, 自发聚集 形成非共价结合的纤维蛋白束 ; 纤维蛋白束再在 Factor XIIIa 的作用下, 形。

8、成 - 的异 肽键, 将聚合形式以共价键的方式稳定下来, 称为交联纤维蛋白, 即血栓的基本骨架 ; 交联 纤维蛋白在纤溶酶的作用下, 降解为不同大小的交联纤维蛋白降解产物, 其最小结构 (DD/ E, 也有文献认为是 DD) 因为含有两个由异肽键共价交联的 D 片段而称为 D- 二聚体。 0003 近年来, D- 二聚体作为体内交联纤维蛋白水解的标志性产物, 其临床诊断价值已 得到普遍认同。它以其高度的敏感性和阴性预示能力, 在深静脉血栓 (DVT) 和肺栓塞 (PE) 的排除、 弥散性血管内凝血 (DIC) 的诊断及溶栓治疗效果监测等方面具有很好的临床应用 价值。 0004 目前实验室中检测。

9、 D- 二聚体都是基于免疫学的方法, 包括免疫层析 (胶体金) 方 法、 双向测流免疫测定法、 化学发光酶联免疫法和免疫比浊测定法 (包括免疫散射比浊法和 免疫投射比浊法, 每一种又有乳胶凝集增强和普通的两种类型) 。所有这些方法都需要高质 量的 D- 二聚体特异性抗体, 上述部分方法只用一种抗体即可工作, 部分方法需要两种抗体 进行配对后才能实现测定。目前 D- 二聚体检测所用抗体全部来自于国外, 国内尚未见到相 关抗体报道和销售, 客观上影响了国内公司在 D- 二聚体检测试剂上的研发, 在一定程度上 导致了目前国内 D- 二聚体检测试剂市场基本上被欧美公司全部占据的局面。 发明内容 000。

10、5 本发明根据临床病人在凝血 - 纤维蛋白溶解过程中血液成分的相关变化, 以纯化 的天然 D- 二聚体为免疫原, 通过改良的杂交瘤技术, 获得杂交瘤细胞株, 分泌 D- 二聚体特 异性单克隆抗体。这两株单克隆抗体能够配对用于 D- 二聚体的免疫检测。该抗体对将有 助于 D- 二聚体免疫检测试剂的研发。 0006 本发明提供的两株产生抗人 D- 二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 本发 明将其命名分别为 1C6(细胞保藏号 CCTCC NO : C2013138) , 培养物名称 : 杂交瘤细胞 株 1-C6(IgG1)和 1D10(细胞保藏号 CCTCC NO : C2013139) , 培养。

11、物名称 : 杂交瘤细 胞株 1-D10(IgG2b)。保藏单位为中国典型培养物保藏中心 (China Center for Type CultureCollection, 简称 CCTCC) , 地址 : 中国武汉武汉大学, 保藏日为 2013 年 9 月 5 日。 0007 杂交瘤细胞株 1C6 和 1D10 均由纯化的 D- 二聚体免疫 Balb/c 小鼠后小鼠脾脏 B 说 明 书 CN 103468644 A 3 2/6 页 4 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。 0008 本发明还提供一种由杂交瘤细胞株 1C6 所产生的单克隆抗体。 0009 本发明还提供一种由杂交瘤细胞株 1D10。

12、 所产生的单克隆抗体。 0010 本发明还提供一种用于检测 D- 二聚体的试剂盒, 其包含杂交瘤细胞株 1C6 和 / 或 1D10 所产生的单克隆抗体。 0011 本发明还提供上述的杂交瘤细胞株的制备方法, 其主要包含步骤 : 1) 用纯化的 D- 二聚体作为免疫原免疫动物 Balb/c 小鼠 ; 2) 通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合, 利用间接 ELISA 法 进行正向和负向筛选, 克隆化筛选出能稳定分泌抗 D- 二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 0012 具体地, 步骤 1) 包含 : 将纯化的 D- 二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化, 乳化完成 后, 对 8 周龄。

13、的 Balb/c 小鼠进行基础免疫。2 周后, 追加免疫一次。 0013 具体地, 步骤 2) 包含 : 将脾细胞与骨髓瘤细胞混合, 以聚乙二醇为融合剂, 形成融 合细胞, 将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中, 并置CO2中在37培养 ; 用间接ELISA 法进行筛选, 筛选时, 先用纤维蛋白原及其降解产物包被, 进行负向筛选, 去掉能够与纤维 蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞 ; 然后用 D- 二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进 行正向筛选, 对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化, 并置于CO2中于37培 养, 直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。 0014 上述的单克隆。

14、抗体可用于制备检测人 D- 二聚体的制剂。 0015 本发明利用已制备的抗 D- 二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体, 以 D- 二 聚体作为检测抗原, 进行抗体配对试验, 经过优化ELISA反应条件, 获得能检测天然D-二聚 体的抗体配对并以此成功建立了检测 D- 二聚体的双抗体夹心 ELISA 方法。 0016 本发明通过杂交瘤技术, 制备了抗 D- 二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1C6 和 1D10, 分泌相应的单克隆抗体, 能进行配对和检测天然血清, 初步建立了检测 D- 二聚体的 双抗体夹心 ELISA 方法。 0017 为让本发明的上述和其它目的、 特征和优点能更明显易懂, 。

15、下文特举较佳实施例, 并配合附图, 作详细说明如下。 附图说明 0018 图 1 表示单克隆抗体 1C6 的 ELISA 鉴定, 其中上行为包被 D- 二聚体抗原, 中行为 包被 D- 单体, 下行为包被纤维蛋白原及其降解产物 ; 每一行中左边第 1 孔为阴性对照, 第 2 到 12 孔为抗体倍比稀释, 从 1:1000、 1:2000、. 到 1:106。 0019 图2 表示单克隆抗体1D10的ELISA鉴定, 其中上行为包被D-二聚体抗原, 中行为 包被 D- 单体, 下行为包被纤维蛋白原及其降解产物 ; 每一行中左边第 1 孔为阴性对照, 第 2 到 12 孔为抗体倍比稀释, 从 1:。

16、1000、 1:2000、. 到 1:106。 0020 图 3 表示单克隆抗体 1C6 的免疫印迹鉴定, 其中左侧为非变性电泳后的免疫印 迹, 右侧为变性电泳后的免疫印迹 ; 每图中, DD-A 的抗原为购自 Abcam 公司的 D- 二聚体抗 原, DD-C 为国内公司的 D- 二聚体抗原, 第三和第四条分别为 D 片段 (D fragment) 和 E 片段 (E fragment) 。 0021 图 4 表示单克隆抗体 1D10 的免疫印迹鉴定, 其中左侧为非变性电泳后的免疫印 说 明 书 CN 103468644 A 4 3/6 页 5 迹, 右侧为变性电泳后的免疫印迹 ; 每图中,。

17、 DD-A 的抗原为购自 Abcam 公司的 D- 二聚体抗 原, DD-C 为国内公司的 D- 二聚体抗原, 第三和第四条分别为 D 片段 (D fragment) 和 E 片段 (E fragment) 。 0022 图 5 表示 HRP 标记抗体的效价检测结果。其中上行为单克隆抗体 1C6, 下行为单 克隆抗体 1D10 ; 包被抗原为 D- 二聚体, 孔 1、 2 和 3 是阴性对照, 孔 4 为标记抗体 1:1000 稀 释, 孔 5 为 1:2000, 孔 6 为 1:4000, 孔 12 为 1:256000。 0023 图 6 表示 D- 二聚体 ELISA 检测体系的分析特异。

18、性鉴定, 分别测定 D- 二聚体和各 种相关抗原, 横坐标为抗原浓度, 单位为单位为 g/ml ; 纵坐标为 450nm 处吸光度。 0024 图7 表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线, 横坐标为D-二聚 体的浓度, 单位为 g/ml ; 纵坐标为 450nm 处吸光度。 0025 图 8 表示 D- 二聚体 ELISA 检测体系测定 D- 二聚体与 Siemens 公司的 D-dimer Plus 试剂测定结果比较, 横坐标为本发明中涉及方法的检测结果, 纵坐标为 Siemens 公司 的 D-dimer Plus 试剂测定结果, 单位均为 ng/mL。 具体实施方式 。

19、0026 本发明以纯化的 D- 二聚体作为免疫原免疫动物 Balb/c 小鼠, 通过杂交瘤技术经 多次细胞融合, 利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂 交瘤细胞株, 腹水经 HiTrap IgG Purification HP 亲和层析柱纯化, 所得的单克隆抗体进 行效价测定, 亲和力测定。经筛选得到 2 株稳定分泌 D- 二聚体特异性单克隆抗体的杂交瘤 细胞株 1C6 和 1D10, ELISA 和免疫印迹鉴定结果表明 2 株单克隆抗体均具有较高的特异性。 0027 本发明建立了 D- 二聚体的 ELISA 检测体系 : 应用抗 D- 二聚体抗体 1C6 为。

20、捕获抗 体, 抗 D- 二聚体抗体 1D10 为检测抗体, 建立标准的双抗体夹心 ELISA 检测方法, 能够准确 检测血清中的天然 D- 二聚体, 并以此成功建立了检测 D- 二聚体的双抗体夹心 ELISA 方法。 0028 材料和来源 实验动物 : Balb/C 小鼠购自第三军医大学实验动物中心 (中国重庆) 。 0029 细胞培养基和胎牛血清购自 Gibco 公司。 0030 D- 二聚体等抗原购自 Abcam 公司, HRP- 山羊抗小鼠 IgG 购自中山公司。 0031 纯化柱和填料购自美国 GE 公司。 0032 其余试剂均为国产分析纯试剂。 0033 实施例 1 抗 D- 二聚体。

21、单克隆抗体的制备 1. D- 二聚体单克隆抗体的制备 将纯化的 D- 二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化, 抗原乳化采用双注射器互推法。乳化 完成后, 以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对 5 只 8 周龄左右的 Balb/c 小鼠进行基础免 疫 (100 g/ml) 。2 周后, 将 D- 二聚体与等量的弗氏不完全佐剂乳化, 以四肢皮下多点注 射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫 (100 g/ml) ; 2 周后, 再采用同样方式追加免疫一 次, 7 天后处死小鼠取出小鼠脾脏, 将脾细胞进行细胞融合。 0034 融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞 (Sp2/0) 以8:1混合, 以聚乙二醇为融合剂。 。

22、融 合细胞悬于含小牛血清的 HAT 培养液中, 并置于 6% CO2中在 37培养。用间接 ELISA 法进 说 明 书 CN 103468644 A 5 4/6 页 6 行筛选。筛选时, 先用纤维蛋白原及其降解产物包被, 进行负向筛选, 去掉能够与纤维蛋白 原及其降解产物结合的杂交瘤细胞 ; 然后用 D- 二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正 向筛选, 对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化, 并置于 6% CO2中于 37培 养, 直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止, 即可进行单克隆抗体的扩大培养。 0035 采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的 Balb。

23、/c 小鼠, 于腹腔内注入液态石蜡 0.5 mL, 1 周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤 细胞悬浮混匀, 并将细胞数调至 4105 个 /mL, 每只 Balb/c 小鼠腹腔注射 0.5 mL 杂交瘤 细胞。10-14 天后收集腹水。 0036 2. D- 二聚体单克隆抗体的纯化 收集腹水后对其进行纯化, 具体方案为 : 配置抗体纯化所需 buffer : Binding Buffer (A 液) 20 mmol/L 磷酸钠, 0.8 mol/L (NH4)2SO4, pH 7.5 ; Elution Buffer (B 液) : 20 mmol/ L 磷酸钠, pH 7.5 。

24、; Regeneration Buffer(C 液) : 20 mmol/L 磷酸钠, pH 7.5, 并按体积比 30 % 加入异丙醇 ; 在单抗腹水中加入硫酸铵, 使其终溶度与 A 液中硫酸铵的溶度一致, 0.45 m 滤膜过滤等待上样 ; 选用 HiTrap IgG Purification HP 柱接入 AKTA prime 蛋白纯化 仪, A、 B 液和 C 液对柱子进行充分洗涤 ; 用 A 液进行充分平衡后, 将准备的样品从 A 管上样, 上样后用 A 液平衡柱子, 去除杂蛋白, 再用 B 液洗脱纯化柱, 收集洗脱峰 ; 调节洗脱蛋白的 pH 至 7.0-8.0, 将抗体分装冷冻于。

25、 -20保存 ; 用 Regeneration Buffer 使填料进行再生, 然后用 Binding Buffer 进行平衡即可。 0037 3. ELISA 鉴定抗 D- 二聚体单克隆抗体 将纯化的 D- 二聚体抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至 5g/ml, ELISA 条板每 孔加入100l, 4包被过夜。 次日取出板子弃抗原, 洗板。 将待鉴定单克隆抗体作1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000, 按 100l/ 孔加入对应条孔中, 另作空白及阴阳 对照孔。 37孵育1h, 洗板, 加入二抗, 1:3000 HRP标记山羊抗小鼠IgG, 按10。

26、0l/孔加入 对应条孔中, 37孵育 40min。弃液, 洗板, 拍干, 加入底物液 100l/ 孔, 避光显色 10min, 加入终止液 50l/ 孔。在 450nm 处测定吸光度值。结果如图 1 和图 2 所示, 单克隆抗体 1C6 对 D- 二聚体效价达到 1:50 万, 对 D- 单体的效价为 1:8000, 对纤维蛋白原及其降解产 物的效价为 0 ; 单克隆抗体 1D10 对 D- 二聚体效价为 1:100 万, 对 D- 单体效价为 0, 对纤维 蛋白原及其降解产物的效价为 0。 0038 4. 抗 D- 二聚体单克隆抗体的免疫印迹鉴定 1) 将 Marker 3 l、 D- 二聚。

27、体抗原 20 l、 相关对照抗原 20 l 行 SDS-PAGE。 0039 2) 电泳结束后, 取下凝胶, 置于转印缓冲液中平衡 10 min。 0040 3) 将 0.22 m PVDF 膜先用无水甲醇处理 20 s, 再用 ddH2O 洗涤 5 min。然后再 浸入 Transfer Buffer 超过 5 min。同时将滤纸浸入 Transfer Buffer 中。 0041 4) 转膜 : 从下至上依次排列 : 滤纸PVDF 膜胶滤纸, 排出气泡, 放入转膜仪, 18 V 恒压电转移 1.5 h。 0042 5) 转膜完成后, 在膜上可见清晰蛋白 marker, ddH2O 清洗两遍。

28、, TBST 洗 5 min。将 转移膜置于封闭液中, 室温封闭 2 h。 0043 6) 弃去封闭液, 用 1TBST 漂洗膜 3 次, 每次 15 min。 0044 7) 加入以 1:1000 稀释的纯化抗体, 4孵育过夜。1TBST 漂洗膜 3 次, 每次 15 说 明 书 CN 103468644 A 6 5/6 页 7 min。 0045 8) 加入已稀释到 1:10000 的 HRP- 羊抗小鼠 IgG 抗体, 37孵育 3 h。 0046 9) 1TBST 洗涤 3 次, 每次 15 min。 0047 10) 用化学发光显色, 显影定影后, 观察分析结果并摄像。在 D- 二聚。

29、体对应分子量 处处均可见抗 D- 二聚体单克隆抗体结合清晰条带。结果如图 3 和图 4 所示。在 7% 非变性 条件下, 单克隆抗体 1C6 和 1D10 均能识别并结合两种不同来源的 D- 二聚体, 不识别 D- 片 段和 E- 片段, 在 7% 变性条件下, 两种单克隆抗体均不识别和结合这四种形式的抗原。 。 0048 实施例 2 双抗体夹心 ELISA 法检测 D- 二聚体 1. HRP 标记抗体 本法是以NaIO先将HRP表面的糖分子氧化成醛基, 然后再与抗体蛋白的氨基相结合, 所获酶标记抗体的产率高, 具体步骤如下 : 1) HRP 酶的准备 : 称取 10 mg HRP 酶, 加 。

30、2 mL 纯水配置为 5 mg/ml 的 HRP 液体, 按照 每 mg HRP 酶加入 34 L 计算, 加 340 L NaIO4, 4避光放置, 1 h 后, 按照每 mg HRP 酶加 入 250 L 的量加入乙二醇 250 L, 避光放置 4, 30 min 后转入透析袋中, 用 1 mM 醋酸缓 冲液 (pH 4.0 4.4) 透析过夜, 期间至少换液 2 次, 均要求避光。 0049 2) 抗体的准备 : 0.01 M 的 PBS 缓冲液进行 4透析过夜, 并测定蛋白浓度。 0050 3) 标记 : 抗体与 HRP 酶按 1:1(质量比) 混合, 加入 1 mol/L Na2CO。

31、3缓冲液 (1:80) , 调解反应的 pH 为 9.5, 25反应 2 3 h。 0051 4) 终止 : 新鲜配制 0.1 mol/L NaH4B(4 mg/mL) , 按照每 mg HRP 酶加入 47 L。 4放置 2 h 后, 转入透析袋。用 0.01 mol/L PBS 缓冲液 (pH7.0 7.2) 透析过夜, 期间至 少换液两次, 避光。 0052 5) HRP 标记抗体的效价检测 : 将纯化的 D- 二聚体抗原用包被稀释液稀释至 5g/ ml, ELISA条板每孔加入100l, 4包被过夜。 次日取出酶标板弃抗原, 洗板, 加入350l/ 孔的 1%BSA 进行封闭, 37,。

32、 2h。洗板后将 HRP 标记好的待鉴定单克隆抗体作 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000, 按 100l/ 孔加入对应条孔中, 另作空白及阴性 对照孔。37孵育 40min, 弃液, 洗板, 拍干, 加入底物液 100l/ 孔, 避光显色 10min, 加入 终止液 50l/ 孔。在 450nm 处测定吸光度值。结果如图 5 所示, 结果显示, 1-C6 和 1-D10 酶标抗体的效价均 1:256000, 满足应用要求。 0053 6) 分装保存 : 标记好的抗体用棕色 EP 管分装, 并测定抗体效价。-20避光保存。 0054 2. 抗体配对及临。

33、床样本的检测 1) 标本收集 : 从第三军医大学第一附属医院收集临床血浆标本, 取回过程中用冰袋储存, 以保持标 本新鲜, 离心取上清加防腐剂后做好标记分装于1.5 ml Ep管中, -80保存, 并将病人基本 信息录入电脑, 做好编号。 0055 2) 标本检测 : 选取单克隆抗体 1C6 作为捕获抗体, 酶标单克隆抗体 1D10 作为检测抗体, D- 二聚体校 准品为测定对象, 检测方法如下 : a. 包被酶标板 : 用包被液将抗体稀释为 5 g/ml, 每孔 加 100 l, 4包被过夜。b. 将包被过夜的酶标板洗 3 遍, 甩干。c. 封闭 : 每孔加封闭 液 350 l, 37孵育 。

34、1 h, 洗涤 3 遍, 甩干。d. 用抗体稀释液将 D- 二聚体校准品从 50 g 说 明 书 CN 103468644 A 7 6/6 页 8 /ml 开始倍比稀释, 每孔加 100 l, 第一孔为空白对照, 做标准曲线。检测临床标本时, 每 孔加标本 100 l, 37孵育 1 h。e. 洗板 3 遍, 甩干。f. 将相对应的酶标二抗以 1 : 5000 稀释, 每孔加入 100 l, 37孵育 30 min。g. 洗板 5 遍, 甩干。h. 每孔加入 100 l 底 物显色液, 室温避光显色 5 min。i. 每孔加入 50 l 终止液, 450nm 处读取吸光度值, 同时 制作标准曲。

35、线, 根据标准曲线确定临床样本中 D- 二聚体的含量。 0056 具体请参照图 6、 图 7 和图 8。图 6 显示基于单克隆抗体 1C6 和 1D10 建立的 ELISA 体系结果表明, 新建的 ELISA 仅对 D- 二聚体反应, 而对纤维蛋白原、 FgDP-X 和 FgDP-Y 没有 反应, 提示该检测体系具有良好的特异性。图 7 表示 D- 二聚体 ELISA 检测体系测定 D- 二 聚体的标准曲线, 横坐标为 D- 二聚体的浓度, 单位为 g/ml ; 纵坐标为 450nm 处吸光度。 提示该检测体系在 0-2g/ml 范围内线性良好。图 8 表示 D- 二聚体 ELISA 检测体系。

36、测定 D-二聚体与Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果比较, 横坐标为本发明中涉及方法 的检测结果, 纵坐标为Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果, 单位均为ng/mL。 提示 该检测体系与公认方法检测结果相关良好, 具有很好的检测准确度。 0057 同时请参照表 1, 其中对 D- 二聚体 ELISA 检测体系测定 D- 二聚体与 Simens 公司 的D-dimer Plus试剂测定结果进行了比较, 结果表明, 对于阴性标本, 二者之间的符合率为 97%, 对于阳性标本, 二者之间的符合率为 84%, 总体符合率为 91%。 0058 表 1 新建 。

37、ELISA 体系与公认试剂检测结果比较 阴性结果 阳性结果 合计 SiemensD-DimerPLUS140112252 1C6/1D1013694230 符合率 (%)978491 虽然本发明已以较佳实施例披露如上, 然其并非用以限定本发明, 任何所属技术领域 的技术人员, 在不脱离本发明的精神和范围内, 当可作些许的更动与改进, 因此本发明的保 护范围当视权利要求所界定者为准。 说 明 书 CN 103468644 A 8 1/5 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103468644 A 9 2/5 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103468644 A 10 3/5 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103468644 A 11 4/5 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103468644 A 12 5/5 页 13 图 8 说 明 书 附 图 CN 103468644 A 13 。

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