一种磷酸果糖激酶及其编码基因的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102965354 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102965354 A *CN102965354A* (21)申请号 201210545736.8 (22)申请日 2012.12.14 C12N 9/12(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 中国热带农业科学院橡胶研究所 地址 571737 海南省海口市儋州市宝岛新村 。

2、(72)发明人 龙翔宇 戚继艳 唐朝荣 何斌 梁启福 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 王慧凤 (54) 发明名称 一种磷酸果糖激酶及其编码基因的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种磷酸果糖激酶及其编码基 因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之 一的蛋白质 ： 1）序列表中的 SEQ ID .1 的氨 基酸残基序列 ； 2） 将序列表中的 SEQ ID .1 氨 基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和 / 或缺失和 / 或添加且具有磷酸果糖激酶的由 SEQ ID ： 1 衍生的蛋白质。该蛋白经转基因实 验表明， 该基因具有磷酸果糖激酶。

3、功能， 该基因的 cDNA转入磷酸果糖激酶缺陷株RL257后获得的转 基因菌株可以在以甘露醇为唯一碳源的 M63 基本 培养基上正常生长。经基因表达实验表明， 该蛋 白， 可提高其对逆境的抗性， 从而提高产量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 7 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种蛋白质， 是如下 1) 或 2) 所示的蛋白质 ： 1） 由序列表中的 SEQ ID .1 的氨基酸残基序列组成的蛋白质 ； 2） 将序列表中的 。

4、SEQ ID .1 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有磷酸果糖激酶功能的由 SEQ ID ： 1 衍生的蛋白质。 2. 根据权利要求 1 所述的蛋白质， 其特征在于 ： 所述蛋白质为具有磷酸果糖激酶功能 的蛋白质。 3. 权利要求 1 或 2 所述的蛋白的编码基因。 4. 根据权利要求 3 所述的编码基因， 其特征在于 ： 所述编码基因的 cDNA 核苷酸序列如 下 1)、 2） 、 3） 或 4） 所示 ： 1） 序列表中 SEQ ID ： 2 的核苷酸序列 ； 2） 序列表中 SEQ ID ： 2 自 5末端第 5-1417 位核苷酸所示的核苷酸。

5、序列 ； 3） 在严格条件下可与 1） 或 2） 所述的 DNA 序列杂交的核苷酸序列 ； 4） 与序列表中 SEQ ID ： 2 的核苷酸序列具有 90以上的同源性的且编码蛋白具有 磷酸果糖激酶功能的核苷酸序列。 5. 根据权利要求 3 所述的编码基因， 其特征在于 ： 所述编码基因的基因组基因的核苷 酸序列如下 1)、 2） 、 或 3） 所示 ： 1） 序列表中 SEQ ID ： 3 的核苷酸序列 ； 2） 在严格条件下可与 1） 所述的 DNA 序列杂交的核苷酸序列 ； 4） 与序列表中 SEQ ID ： 3 的核苷酸序列具有 90以上的同源性的且编码蛋白具有 磷酸果糖激酶功能的核苷酸。

6、序列。 6. 含有权利要求 3 或 4 或 5 所述的编码基因的重组表达载体、 转基因细胞系或转基因 重组菌。 7. 权利要求 1 所述的蛋白及其编码基因在培育能以甘露醇为唯一碳源培养的转基因 菌株中的应用。 8. 权利要求 1 所述的蛋白及其编码基因在制备磷酸果糖激酶中的应用。 9. 权利要求 1 所述的蛋白及其编码基因在培育抗逆性提高的转基因橡胶树中的应用。 10. 权利要求 1 所述的蛋白及其编码基因在胶乳产量提高的转基因橡胶树中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102965354 A 2 1/7 页 3 一种磷酸果糖激酶及其编码基因的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种橡胶树磷酸。

7、果糖激酶及其编码基因与应用。 背景技术 0002 糖酵解途径， 又称 EMP 途径或者己糖二磷酸途径， 是绝大多数生物所共有的葡萄 糖分解生产能量的基本代谢途径， 其代谢中间体也是氨基酸， 脂质等细胞成分合成所需的 前体。因此， 糖酵解途径同时也参与了生物与非生物胁迫， 如抗病、 抗旱、 抗寒、 氮及氧胁迫 等。糖酵解途径有 3 种关键酶， 分别为磷酸果糖激酶 （PFK） 、 丙酮酸激酶、 己糖激酶。PFK 以 ATP 作为磷酸基团的供体， 催化 6- 磷酸果糖 （F-6-P）的 1 位磷酸化， 生成 1,6 磷酸果 糖 （F-1,6-BP） ； PFK 拥有四聚体结构， 由于糖酵解发生于胞浆。

8、中， 必然受到多种变构效应剂 的影响。目前普遍认为调节酵解途径最重要的是 PFK。由于 PFK 稳定性较差且酶活相对 较低， 早些年对其酶活及分子特性研究相对较少， 主要集中在动物及微生物中。目前在植 物中也有报道， 研究人员发现低温可以诱导马铃薯中的磷酸果糖激酶活性下降， 磷酸己糖 急剧增加提高其抗旱能力 （Hammond JBW,Burrell MM,Kruger NJ.1990.Effects of low temperature on the activity ofphosphofuctokinase from potato tubers.Planta 180,613-616.） 。2。

9、007 年， 在拟南芥中分离得到 11 个磷酸果糖激酶基因， 并对其进行了活 性及组织特性分析 （Mustroph A,Sonnewald U,Biemelt S.2007.Characterisation of the ATP-dependentphosphofuctokinase gene family from Arabidopsis thaliana. FEBS LETT581(13):2401-10.） 。糖酵解途径也被认为是立枯丝核菌侵染水稻后的一个 重要代谢变化过程 （纹枯病） ， 关键酶磷酸果糖激酶在此过程中诱导上调表达 （Mutuku JM,NoseA.2012.Highac。

10、tivities and mRNAexpression ofpyrophosphate-fuctose-6-phos phate-phosphotransferase and 6-phosphofuctokinase areinduced as a response to Rhizoctonia solani infection in rice leaf sheaths.Physiological andMolecular Plant Pathology 77(1):41-51.） 。 0003 橡胶树又名巴西橡胶树、 三叶橡胶树， 原产于南美洲亚马逊河流域， 属于大戟 科三叶橡胶树属。在 2。

11、000 多种产胶植物中， 橡胶树所分泌的胶乳特性最好， 已成为重 要的工业原料及战略物资， 其胶乳产量占世界天然橡胶产量的 90% 以上 （Priyadarshan PM,Goncalves PdeS.2003.Hevea gene pool for breeding.Genetic Resources and CropEvolution 50:101-114） 。 目前天然橡胶的生物合成途径已大致了解， 橡胶树主要以蔗 糖为原料， 经过糖酵解， 三羧酸循环生成乙酰辅酶 A， 同时产生大量的 ATP， 然后以乙酰辅酶 A为原料， 通过一系列的酶促反应合成橡胶 （邹智,杨礼富,王真辉,袁坤.20。

12、09.橡胶树中 橡胶的生物合成与调控 . 植物生理学通讯 45(12):1231-1238） 。糖酵解将为胶乳再生提供 大量能量及物质基础， 因此橡胶的生物合成与橡胶树胶乳糖酵解途径密切相关。研究橡胶 树糖酵解途径， 有助于进一步了解橡胶树蔗糖利用及胶乳再生机制， PFK 为糖酵解中最为重 要的限速酶， 其基因及酶活特性在橡胶树研究中未见报道。 说 明 书 CN 102965354 A 3 2/7 页 4 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种磷酸果糖激酶及其编码基因与应用。 0005 本发明所提供的磷酸果糖激酶， 来源于大戟科橡胶树属的巴西橡胶树 （Heveabrasiliensis） 。

13、， 名称为 HbPFK1， 是如下 1） 或 2） 的蛋白质 ： 0006 1） 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0007 2） 将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和 / 或添加且与序列 1 所示蛋白具有相同活性的由 1） 衍生的蛋白质。 0008 序列表中的序列 1 由 470 个氨基酸残基组成。 0009 为了便于序列 1 编码的 HbPFK1 纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0010 表 1 标签的序列 0011 标签残基序列 Poly-Arg5-。

14、6（通常为 5 个）RRRRR Poly-His2-10( 通常为 6 个）HHHHHH FLAG8DYKDDDDK Strep-tag II8WSHPQFEK c-myc10EQKLISEEDL 0012 上述 HbPFK1 可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。上述 HbPFK1 的编码基因可通过将序列表中序列 2 自 5末端第 5-1417 位碱基所示的 DNA 序列 中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或 在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0013 所述磷酸果糖激酶 （HbPFK1） 的编。

15、码基因也属于本发明的保护范围。 0014 所述磷酸果糖激酶 （HbPFK1） 的 cDNA 为如下 1） 或 2） 或 3） 或 4） 的 DNA 分子 ： 0015 1） 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ； 0016 2） 序列表中序列 2 自 5末端第 5-1417 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0017 3） 在严格条件下与 1） 或 2） 限定的 DNA 序列杂交且编码所述磷酸果糖激酶的 DNA 分子 ； 0018 4） 与序列表中序列 2 的核苷酸序列具有 90以上的同源性的且编码蛋白具有磷 酸果糖激酶功能的核苷酸序列。 0019 序列表中序列 2 全长为 1741 个核。

16、苷酸， 包含一个长度为 1413 个核苷酸的开放阅 读框 （ORF， 自序列 2 的 5 端第 5-1417 位核苷酸序列） 、 4 个核苷酸的 5 -UTR（自序列 2 的 5 端第 1-4 位核苷酸序列） 和 324 个核苷酸的 3 -UTR（自序列 2 的 5 端第 1417-1741 位 核苷酸序列） ， 编码一个长度为 470 个氨基酸 （序列表中序列 1） 、 分子量约为 52KDa 的蛋白， 即为磷酸果糖激酶。 说 明 书 CN 102965354 A 4 3/7 页 5 0020 所述磷酸果糖激酶 （HbPFK1） 的基因组基因为如下 1） 或 2） 或 3） 的 DNA 分子。

17、 ： 0021 1） 序列表中序列 3 所示的 DNA 分子 ； 0022 2） 在严格条件下与 1） 限定的 DNA 序列杂交且编码所述磷酸果糖激酶的 DNA 分子 ； 0023 3） 与序列表中序列 2 的核苷酸序列具有 90以上的同源性的且编码蛋白具有磷 酸果糖激酶功能的核苷酸序列。 0024 上述严格条件可为在0.1SSPE(或0.1SSC)， 0.1%SDS的溶液中， 在65C下杂 交并洗膜。 0025 该序列具有序列表中序列 3 的核苷酸序列， 共 2265 个核苷酸， 包含了一个长度为 524 个核苷酸的内含子 （自序列 3 的 5 端第 592-1116 位核苷酸序列） ， 编。

18、码序列表序列 1 所 示的蛋白质。 0026 含有所述磷酸果糖激酶的编码基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重 组菌均属于本发明的保护范围。 0027 上述磷酸果糖激酶及其编码基因在培育能以甘露醇为唯一碳源培养的转基因菌 株中的应用也属于本发明的保护范围。 0028 上述磷酸果糖激酶及其编码基因在制备磷酸果糖激酶中的应用也属于本发明的 保护范围。 0029 本发明的橡胶树磷酸果糖激酶 HbPFK1 基因， 经转基因实验表明， 该基因具有磷酸 果糖激酶功能， 该基因的cDNA转入磷酸果糖激酶缺陷株RL257后获得的转基因菌株可以在 以甘露醇为唯一碳源的 M63 基本培养基上正常生长。 。

19、0030 另外， 本发明的基因表达分析显示 HbPFK1 基因在胶乳中高表达， 同时受乙烯利及 割胶伤害诱导下调表达， 且与橡胶树胶乳产量呈正相关， 因此该基因可能与橡胶树胶乳再 生密切相关， 可作为橡胶树转基因育种的重要靶基因， 有望通过调控该基因的表达来合理 调节乳管的糖酵解， 进而促进橡胶树胶乳再生， 从而最大潜力的挖掘橡胶树生产潜力。此 外， 该基因可作为重要的基因资源， 还可能在橡胶树以外的其他植物或微生物的高产或抗 逆基因工程中得到应用。 附图说明 0031 图 1 为 HbPFK1 基因在树叶、 树皮及胶乳中的表达分析 （三种不同组织转录组数据 结果） 0032 图2为HbPFK。

20、1基因的组织特异性表达分析 （叶芽、 老皮、 雄蕊、 叶片、 雌蕊、 嫩皮、 种 子及胶乳） 0033 图 3 为割胶对 HbPFK1 基因表达的影响 0034 图 4 为伤害处理对 HbPFK1 基因表达的影响 0035 图 5 为 HbPFK1 基因在不同品系中的表达分析 0036 图 6 为乙烯利处理对 HbPFK1 基因表达的影响 0037 图 7 为 HbPFK1 的原核表达分析 （黑框内所示条带为受 IPTG 诱导后所产生的特异 表达的目标蛋白） 0038 图 8 为大肠杆菌 pfk 缺陷株在甘露醇培养基上生长情况 （A ： 不含质粒的 pfk 缺陷 株 （缺陷型， RL257） 。

21、， 不生长 ； B ： 含有未连接 HbPFK1 基因质粒的 pfk 缺陷株 （转 pEASY-E1 菌 说 明 书 CN 102965354 A 5 4/7 页 6 株） ， 不生长 ； C ： 含有连接HbPFK1基因质粒的pfk缺陷株 （转pEASY-HbPFK1菌株） ， 恢复生长） 具体实施方式 0039 我们首次克隆了橡胶树磷酸果糖激酶基因的全长 cDNA， 并进行了基因表达分析和 功能研究， 将该基因命名为 HbPFK1。下述实施例中所述的方法， 如无特别说明， 均为常规方 法。 0040 实施例 1. 磷酸果糖激酶及其编码基因的获得 0041 分析已在 NCBI 登陆的拟南芥、。

22、 杨树和蓖麻的磷酸果糖激酶的核苷酸序列， 通过搜 索我们建立的橡胶树胶乳EST序列数据库， 确定一条1300bp左右的橡胶树磷酸果糖激酶基 因EST组装后序列 （contig） ， 设计一对特异性引物扩增得到该cDNA片段， 并利用cDNA末端 的快速扩增技术 （RACE） ， 最终获得包含完整读码框的 cDNA 全长序列。 0042 具体方法如下 ： 0043 cDNA 片段克隆 0044 特异性引物设计如下 ： 0045 F（5 端） ： 5 -AAAAAC CTT CCC ACT TAA CAG ACT-3 ； 0046 R（3 端） ： 5 -TTA GTG ACG GAT CTC A。

23、CC CAT-3 。 0047 以巴西橡胶树热研 7-33-97 （中国热带农业科学院橡胶研究所培育， 中国热带农业 科学院橡胶研究所长期有种苗出售） 叶片 cDNA 为模板 （以随机引物反转录获得） ， F 和 R 为 引物， 其终浓度为 0.4mol/L， 在 20l 反应体系中进行 PCR 扩增。扩增程序为 ： 94预变 性3min ； 94变性30s， 62退火30s， 72延伸90s， 30次循环 ； 72延伸10min。 获得一段 1300bp 左右的核苷酸片段， 为磷酸果糖激酶基因 cDNA 片段。 0048 5 及 3 端 RACE 0049 按照 SMARTTM cDNA L。

24、ibrary Construction Kit 说明书进行构建 RACE cDNA 文库 ( 试剂盒购自 Clontech 公司 )， 根据磷酸果糖激酶的 cDNA 序列设计 2 条基因特异性引物 （P1 ： 5 -CTT GGA TCAAAG AAG ATT TGC TGG CGT-3 ； P2 ： 5 -GTAATG GACCAT AAA TGG GCA TGG-3） 。其中 P1 与试剂盒提供的接头引物 5 PCR Primer（5 -AGC AGT GGTATC AAC GCA GAG T-3 ) 用于 5 RACE ； P2 与试剂盒提供的另一个接头引物 3 PCR Primer（5。

25、 -TTC TAG AGG CCG AGG CGG CC-3 ） 用于 3 RACE。扩增程序为 ： 94预变性 3min ； 94变性 30s， 68 退火 2min， 30 次循环 ； 72延伸 10min。5 及 3 端 RACE 产物分别为 300bp、 400bp， 产物经 切胶纯化后， 克隆测序。 0050 HbPFK1 基因全长的克隆 0051 根据所得到的磷酸果糖激酶基因的 cDNA 片段， 以及 5 端和 3 端扩增序列， 利用 DNAMAN 软件进行序列拼接， 得到该基因全长 cDNA 的拼接序列。根据拼接序列， 分别在 5 末 端和 3 末端各设计一条引物 （F:5 -A。

26、GA CAT GGC GGT TTC TTT GCCCGAATC-3 ， R:5 -TGC CTG TTC TTG GTG ATA CGT ACG TAT GAT G-3 ） 。以巴西橡胶树热研 7-33-97 叶片 cDNA 为 模板， 进行 PCR 扩增， 引物终浓度均为 0.4mol/L， 扩增程序为 ： 94预变性 4min ； 94变 性45S， 68退火3min， 共30次循环 ； 72延伸10min。 将该PCR获得的片段连接到pMD18-T 载体 （TaKaRa） 进行测序， 测序表明上述获得的片段即为本发明的磷酸果糖激酶基因， 该片 段具有序列表中序列 2 的核苷酸序列， 序。

27、列表中序列 2 全长为 1741 个核苷酸， 包含一个长 说 明 书 CN 102965354 A 6 5/7 页 7 度为 1413 个核苷酸的开放阅读框 （ORF， 自序列 2 的 5 端第 5-1417 位核苷酸序列） 、 4 个核 苷酸的 5 -UTR（自序列 2 的 5 端第 1-4 位核苷酸序列） 和 324 个核苷酸的 3 -UTR（自序 列2的5 端第1417-1741位核苷酸序列） ， 编码一个长度为470个氨基酸 （序列表中序列1） 、 分子量约为52KDa的蛋白， 即为磷酸果糖激酶， 将该磷酸果糖激酶基因命名为HbPFK1。 将上 述含有序列2的核苷酸的pMD18-T重组。

28、载体命名为pMD18-HbPFK1。 同时以巴西橡胶树热研 7-33-97 叶片基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增 （程序同上所述） ， 测序结果表明获得磷酸果 糖激酶的基因组序列， 该序列具有序列表中序列3的核苷酸序列， 共2265个核苷酸， 包含了 一个长度为 524 个核苷酸的内含子 （自序列 3 的 5 端第 592-1116 位核苷酸序列） 。 0052 实施例 2. 橡胶树 HbPFK1 基因表达模式分析 0053 橡胶树 HbPFK1 基因组织特异性表达 0054 在实验室已有的转录组数据库中 （橡胶树 7-33-97 叶片、 树皮及胶乳） 分析橡胶树 HbPFK1 基。

29、因的组织表达特异性， 结果显示该基因在胶乳中高表达， 树皮中次之， 叶片中表达 量最低 （图 1， 相对表达量以树叶的表达量为对照） 。同时， 又以橡胶树 7-33-97 叶片、 叶芽、 雌蕊、 雄蕊、 胶乳、 嫩皮、 老皮及种子 RNA 随机反转录的 cDNA 为模板， 用 HbPFK1 基因特异引 物 （F:5-CTG GTG TGG TTT GTT GAA TGA G-3 ； R:5-CCT GTT CTT GGT GAT ACG TAC G-3） 进行实时荧光定量 PCR， 结果同样显示该基因在胶乳中高表达， 种子中次之， 在其他组织中 表达相对较低 （图 2， 相对表达量以叶芽的表达。

30、量为对照） 。 0055 割胶对 HbPFK1 基因的表达影响 0056 以未开割巴西橡胶树热研 7-33-97 不同刀次的胶乳 RNA 随机反转录的 cDNA 为模 板 （三天一刀， 连续采样五刀） ， 用 HbPFK1 基因特异引物 （同上） 进行实时荧光定量 PCR， 结果 表明割胶影响 HbPFK1 基因的表达， 前三刀中 HbPFK1 基因明显下调表达， 而在第四、 五刀中 略有回升 （图 3， 相对表达量以第三刀胶乳的表达量为对照） 。 0057 伤害处理对 HbPFK1 基因的表达影响 0058 沿橡胶树 （未开割树） 割线下 3-4mm 处每隔 4cm 按一图钉， 图钉留于橡胶。

31、树割线下 原处。 处理时间为0h， 2h， 12h， 24h， 开割后直接收集胶乳并提取其RNA， 逆转录成cDNA， 进行 HbPFK1 基因表达分析， 结果显示 HbPFK1 基因受伤害明显下调表达， 24h 时该基因表达量最 低 （图 4， 相对表达量以伤害诱导 24h 的表达量为对照） 。 0059 不同品系中 HbPFK1 基因的表达模式 0060 热研 8-79、 热研 7-33-97 和 PR107（中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗 出售） 具有不同胶乳再生能力及胶乳产量 ： 热研 8-79 胶乳再生能力最强， 胶乳产量最高 ； 热 研 7-33-97 胶乳再生能力居中， 。

32、胶乳产量居中 ； PR107 胶乳再生能力最低， 胶乳产量最低 （黄 德宝 , 秦云霞 , 唐朝荣 .2010. 橡胶树三个品系热研 8-79、 热研 7-33-97 和 PR107 胶乳生理 参数的比较研究 . 热带亚热带植物学报 ,18(2):170-175） 。分别提取橡胶树不同品系热研 8-79、 热研7-33-97和PR107的胶乳RNA， 逆转录成cDNA， 进行HbPFK1基因的表达模式分析， 该基因在三个品系胶乳中的表达差异在2倍以上， 热研8-79中表达量最高， 在热研7-33-97 中次之， 在 PR107 中表达量最低 （图 5, 相对表达量以 PR107 胶乳的表达量为。

33、对照） ， HbPFK1 基因表达与胶乳产量呈正相关。 0061 激素对 HbPFK1 基因的表达影响 0062 选取6种植物激素 （乙烯利ET、 茉莉酸JA、 脱落酸ABA、 细胞分裂素CTK、 赤霉素GA、 说 明 书 CN 102965354 A 7 6/7 页 8 水杨酸 SA） ， 分别涂于橡胶树割线以及割线上方 1cm 割面处刺激橡胶树 （0h、 3h、 12h、 24h） 。 实时荧光定量结果显示 ： 在所测的六种植物激素中， HbPFK1 基因的表达受乙烯利 ET 诱导， 在 3h、 12h 下调表达， 24h 略有上升趋势 （图 6， 相对表达量以乙烯利诱导 12h 的表达量。

34、为对 照） ； 而在其他几种激素对 HbPFK1 基因无明显影响。 0063 实施例 3. 原核表达与 HbPFK1 基因的功能验证 0064 利用 pEASY-E1 表达载体 （pEASY-E1 表达载体购自 TransGen Biotech 公司） 构建 了 HbPFK1 基因的原核表达载体， 同时采用大肠杆菌磷酸果糖激酶缺陷株 RL257（菌株购自 美国耶鲁大学） 对该基因进行功能验证， 具体方法如下 ： 0065 含 HbPFK1 基因编码区重组载体的获得 0066 设计 HbPFK1 基因编码区引物 （F:5-ATG GCG GTT TCT TTG CCC GAA TC-3， R:5。

35、-TCA TTT CCT AAC AAA ATC AGG CTG ATT AGT GAC-3） ， 以 pMD18-HbPFK1 为模版， 进 行 PCR 扩增， 扩增程序为 ： 95预变性 4min ； 94变性 45s， 68退火 2min， 共 30 次循环 ； 72延伸 5min。将扩增产物与 pEASY-E1 表达载体进行连接， 得到重组载体， 利用载体引物 （T7） 及基因特异引物 （HbPFK1 基因编码区引物） 进行 PCR 鉴定， 确保磷酸果糖激酶编码片段 正向克隆到表达载体。重组载体进行测序鉴定， 将鉴定表明正确的含有序列表中序列 2 的 第 5-1417 位核苷酸序列、 。

36、读框准确的重组表达载体命名为 pEASY-HbPFK1。 0067 HbPFK1 基因的原核表达 0068 将获得的重组载体 pEASY-HbPFK1 导入 E.coli BL21(DE3) 中 （感受态购自天根生 化科技有限公司） ， 得到重组表达菌， 将鉴定正确的重组菌在含 50g/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中培养至 OD600=0.40.6， 添加 IPTG（异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷） 至终浓度 为 1mM， 30下诱导培养 4h， 以未加 IPTG 的培养基培养的同样重组菌为对照， 离心收集菌 体， 菌体蛋白进行 12%SDS-PAGE 电泳检测。结果表明， 在 IPTG。

37、 诱导下 HbPFK1 这个基因实现 了高效异源表达， 并且表达蛋白的表观分子量与理论分子量相近， 大约 55kDa（图 7） 。 0069 HbPFK1 基因的功能验证 0070 大肠杆菌磷酸果糖激酶缺陷株 RL257（RL257 菌株购自美国耶鲁大学） 在以甘露醇 为唯一碳源的基本培养基上不能生长， 但可利用甘油获得碳源而生长。取 RL257 单菌落同 时点种含 0.5%（质量百分含量） 维生素 B1 和 0.4% 甘油 （体积百分含量） （或甘露醇 （质量百 分含量） ） 的M63基本培养基 （M63基本培养基为每升含1.98g （NH4） 2SO4,13.6g KH2PO4,0.05g。

38、 FeSO47H2O,0.25g MgSO47H2O,PH7.0 的培养基） ， 能够在甘油培养基 （上述含 0.5%（质量 百分含量） 维生素 B1 和 0.4%（体积百分含量） 甘油的 M63 基本培养基） 上生长的而在甘露 醇培养基 （上述含 0.5%（质量百分含量） 维生素 B1 和 0.4%（质量百分含量） 甘露醇的 M63 基本培养基） 上不能生长的为磷酸果糖激酶基因缺陷株 RL257。 0071 将获得的重组载体 pEASY-HbPFK1 导入缺陷株 RL257， 并以不含 HbPFK1 基因的载 体 pEASY-E1 菌株为对照。转化方法采用常规的化学法 CaCl2转化法 （分。

39、子克隆实验指南 （第 3 版） ） ， 同时利用载体引物 （T7） 及基因特异引物 （HbPFK1 基因编码区引物） 进行 PCR 鉴 定。将经鉴定后的阳性转 pEASY-HbPFK1 菌株、 转 pEASY-E1 菌株及 RL257 分别接在含有 1mM IPTG（异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷） ， 0.5%（质量百分含量） 维生素 B1 和 0.4%（体积 百分含量） 甘露醇的 M63 基本培养基 （即 0.4% 甘露醇为唯一碳源的 M63 基本培养基） ， 37 过夜培养， 结果发现转pEASY-HbPFK1菌株在以甘露醇为唯一碳源的M63基本培养基上正常 说 明 书 CN 1029。

40、65354 A 8 7/7 页 9 生长， 而 RL257 和转 pEASY-E1 菌株均不能在甘露醇为唯一碳源的 M63 基本培养基上正常培 养。将阳性转 pEASY-HbPFK1 菌株、 转 pEASY-E 1 菌株及 RL257 分别接在含 1mM IPTG （异丙 基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷） ， 0.5%（质量百分含量） 维生素 B1 和 0.4%（体积百分含量） 甘 油的 M63 基本培养基上， 均可以正常生长 （这段我觉得可以不写吧， 或者可以写在甘露醇培 养基之前， 作为阳性对照） 。说明所构建的重组载体 pEASY-HbPFK1 能够表达出具有活性的 磷酸果糖激酶， 使 p。

41、fk 基因缺陷的宿主菌能够利用甘露醇做为碳源而生长 （图 8） ， 说明本发 明 HbPFK1 为磷酸果糖激酶编码基因。图 8 中， A ： 不含质粒的 pfk 缺陷株 （缺陷型， RL257） ， 不生长 ； B ： 含有未连接 HbPFK1 基因质粒的 pfk 缺陷株 （转 pEASY-E1 菌株） ， 不生长 ； C ： 含有 连接 HbPFK1 基因质粒的 pfk 缺陷株 （转 pEASY-HbPFK1 菌株） ， 恢复生长。 0072 4. 结论 0073 我们首次克隆了橡胶树磷酸果糖激酶 HbPFK1 基因的全长 cDNA， 经转基因实验表 明， 该基因具有磷酸果糖激酶功能， 该基。

42、因的 cDNA 转入磷酸果糖激酶缺陷株 RL257 后获得 的转基因菌株可以在以甘露醇为唯一碳源的 M63 基本培养基上正常生长。基因表达分析显 示 HbPFK1 基因在胶乳中高表达， 同时受乙烯利及割胶伤害诱导下调表达， 且与橡胶树胶乳 产量呈正相关， 因此该基因可能与橡胶树胶乳再生密切相关， 可作为橡胶树转基因育种的 重要靶基因， 有望通过调控该基因的表达来合理调节乳管的糖酵解， 进而促进橡胶树胶乳 再生， 从而最大潜力的挖掘橡胶树生产潜力。此外， 该基因可作为重要的基因资源， 还可能 在橡胶树以外的其他植物或微生物的高产或抗逆基因工程中得到应用。 说 明 书 CN 102965354 A。

43、 9 1/7 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102965354 A 10 2/7 页 11 0003 序 列 表 CN 102965354 A 11 3/7 页 12 0004 序 列 表 CN 102965354 A 12 4/7 页 13 0005 序 列 表 CN 102965354 A 13 5/7 页 14 0006 序 列 表 CN 102965354 A 14 6/7 页 15 0007 序 列 表 CN 102965354 A 15 7/7 页 16 序 列 表 CN 102965354 A 16 1/5 页 17 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102965354 A 17 2/5 页 18 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102965354 A 18 3/5 页 19 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102965354 A 19 4/5 页 20 图 7 说 明 书 附 图 CN 102965354 A 20 5/5 页 21 图 8 说 明 书 附 图 CN 102965354 A 21 。