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1、(10)申请公布号 CN 103087170 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103087170 A *CN103087170A* (21)申请号 201310004974.2 (22)申请日 2013.01.07 C07K 14/435(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/70(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 孙黎 邱礽 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 。
2、公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称 一种巨噬细胞移动抑制因子及其制备和应用 (57) 摘要 本发明涉及分子生物学领域， 具体的说是一 种巨噬细胞移动抑制因子 MIF 及其制备和应用。 巨噬细胞移动抑制因子为序列表 SEQ ID No.1 中 的氨基酸序列所示。制备方法 ： 以美国红鱼 cDNA 为模板， 用引物F1和R1进行PCR扩增， PCR产物连 接表达载体后得质粒 pMIF1， 将其转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过亲和层析纯化获得重组巨噬细胞 移动抑制因子 MIF。本发明的巨噬细胞移动抑制 因子能够显著抑制细菌感染鱼类。 (51)Int.Cl. 权利要求书。
3、 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103087170 A CN 103087170 A *CN103087170A* 1/1 页 2 1.一种巨噬细胞移动抑制因子 （MIF） ， 其特征在于 ： 巨噬细胞移动抑制因子MIF为序列 表 SEQ ID No.1 中的氨基酸序列所示。 2. 一种权利要求 1 所述的巨噬细胞移动抑制因子 （MIF） 的制备方法， 其特征在于 ： 1） 质粒 pMIF 的构建 ： 以美国红鱼 cDNA 为模板， 用。
4、引物 F1 和 R1 进行 PCR 扩增， PCR 产物纯化后与 SwaI 酶切 的质粒pET259用T4DNA连接酶连接， 连接液转化入大肠杆菌， 筛选转化子提取质粒， 即为质 粒 pMIF ； 所述 F1 为 5 -GATATCATGCCGATGTTTGTGGTG-3 ， R1 为 5 -GATATCGCCAAAGGTAGTGTTGTT CC-3 ； 2） 将上述所得质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过亲和层析纯化获得序列表 SEQ ID No.1 所示的巨噬细胞移动抑制因子 MIF。 3. 一种权利要求 1 所述的巨噬细胞移动抑制因子 MIF 的应用， 其特征在于 ： 所述巨噬 。
5、细胞移动抑制因子 MIF 用于制备抗细菌药物或抗细菌抑制剂。 权 利 要 求 书 CN 103087170 A 2 1/3 页 3 一种巨噬细胞移动抑制因子及其制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学领域， 具体的说是一种巨噬细胞移动抑制因子 MIF 及其制 备和应用。 背景技术 0002 巨噬细胞移动抑制因子 （Macrophage migration inhibitory factor） 是一个约 12.5kDa的蛋白， 主要由激活的淋巴细胞、 单核细胞、 巨噬细胞等分泌。 巨噬细胞移动抑制因 子具有多种功能， 包括抑制巨噬细胞定向迁移、 调控糖皮质激素 （glucocorti。
6、coid） 介导的 免疫抑制效应等， 但其主要功能是参与炎症反应。 在哺乳动物中， 巨噬细胞移动抑制因子储 存于细胞质中， 在外源刺激时 （例如病原侵染） ， 细胞质中的巨噬细胞移动抑制因子迅速释 放质胞外。释放的巨噬细胞移动抑制因子作为细胞因子而调控急性和慢性炎症反应， 从而 影响机体的免疫应答。 因此， 巨噬细胞移动抑制因子在机体抗细菌、 病毒感染反应过程中起 重要作用。 发明内容 0003 本发明目的在于提供一种巨噬细胞移动抑制因子 MIF 及其应用。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0005 一种巨噬细胞移动抑制因子 （MIF） ， 巨噬细胞移动抑制因子 MIF。
7、 为序列表 SEQ ID No.1 中的氨基酸序列所示。 0006 巨噬细胞移动抑制因子 （MIF） 的制备方法 ： 0007 1） 质粒 pMIF 的构建 ： 0008 以美国红鱼 cDNA 为模板， 用引物 F1 和 R1 进行 PCR 扩增， PCR 产物纯化后与 SwaI 酶切的质粒pET259用T4DNA连接酶连接， 连接液转化入大肠杆菌， 筛选转化子提取质粒， 即 为质粒 pMIF ； 0009 所述 F1 为 5 -GATATCATGCCGATGTTTGTGGTG-3 ， R1 为 5 -GATATCGCCAAAGGTAGTGT TGTTCC-3 ； 0010 2） 将上述所得质。
8、粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过亲和层析纯化获得序列表 SEQ ID No.1 所示的巨噬细胞移动抑制因子 MI F。 0011 巨噬细胞移动抑制因子 MIF 的应用 ： 所述巨噬细胞移动抑制因子 MIF 用于制备抗 细菌药物或抗细菌抑制剂。 0012 本发明具有如下优点 ： 本发明的巨噬细胞移动抑制因子能够显著抑制细菌侵染。 附图说明 0013 图 1 为本发明实施例提供的经纯化的蛋白电泳检测图。 具体实施方式 说 明 书 CN 103087170 A 3 2/3 页 4 0014 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述， 而 非以任何形式对本发明进行限。
9、制。 0015 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法 ： 0016 1. 质粒提取、 DNA(PCR) 产物纯化、 DNA 片段从凝胶中回收皆使用 “天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司” 的相应试剂盒。 0017 2. 大 肠 杆 菌 用 Hanahan 方 法 （Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001） 。 0018 3. 所有限制性内切酶和连接酶皆购自于 “纽英伦生物技术有限公司” ， 北京。 0019 实施例。
10、 1 0020 本发明的巨噬细胞移动抑制因子 MIF 为序列表 SEQ ID No.1 中的氨基酸序列。 0021 序列表 SEQ ID No.1 为 ： 0022 MPMFVVNTNVAKCDVPAGLLSEATEELAKAMGKPAQYIAVHINPDQMMMFGGKGDPCALCSLHSIGKIS GAHNKQYSKLPCGLLNKHLGISADRIYINFVDMDAANVAWNNTTFG 0023 （a） 序列特征 ： 0024 长度 ： 115 0025 类型 ： 氨基酸序列 0026 链型 ： 单链 0027 拓扑结构 ： 线性 0028 （b） 分子类型 ： 蛋白质 0029 （。
11、c） 假设 ： 否 0030 （d） 反义 ： 否 0031 （e） 最初来源 ： 美国红鱼 0032 结构特点 ： 该蛋白预期含有一个互变异构酶 （tautomerase）结构域 （氨基酸 10-56） 。 0033 实施例 2 0034 重组 MIF 的制备 ： 0035 1） 质粒 pMIF 的构建 ： 0036 以美国红鱼 cDNA 为模板， 用引物 F1 和 R1 进行 PCR 扩增。PCR 条件为 ： 94 60s 预变性模板 DNA, 然后 94 40s,57 60s,72 60s,5 个循环后改为 94 40s,62 60s,72 60s,30 个循环后再在 72延伸反应 7-。
12、10min。PCR 产物用天根 DNA 产物纯化 试剂盒纯化。将载体 pET259（pET259 构建过程参见 Zheng,W.J.,Hu,Y.H.,Sun,L.,2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus). Fish.Shellfish.Immunol.28,829-836） 用SwaI酶切后回收5.4kb片段， 将其与上述纯化的 PCR 片段用 T4DNA 连接酶于室温连接 2-4 小时， 连接液转化入大肠杆菌 DH5， 在含卡那霉 素 （30ug/ml） 的 LB 固。
13、体培养基上培养 18-24 小时 , 筛选转化子提取质粒， 即为质粒 pMIF。 0037 所述LB固体培养基组成成分按重量百分比计 ： 1.0蛋白胨,0.5酵母粉,1.0 氯化钠 ,1.2琼脂， 96.3蒸馏水。所述 F1 为 5 -GATATCATGCCGATGTTTGTGGTG-3 ； R1 为 5 -GATATCGCCAAAGGTAGTGTTGTTCC-3 。 0038 2） 重组 MIF 的表达纯化 说 明 书 CN 103087170 A 4 3/3 页 5 0039 将上述的质粒 pMIF 用常规方法转化大肠杆菌 BL21(DE3)（购自于 “天根生化科技 有限公司” ， 北京）。
14、 ， 在含有卡那霉素 （30ug/ml） 的 LB 固体培养基上培养 18-24 小时 , 挑取一 个转化子， 将其命名为 BL21/pMIF。将 BL21/pMIF 于含有卡那霉素 （30ug/ml） 的 LB 液体培 养基中过夜培养 ； 取 1ml 过夜后的培养液 , 加入 100ml 新鲜的含有卡那霉素 （30ug/ml） 的 LB 液体培养基中， 于 37下转速 200rpm 摇动培养至 OD600为 0.6, 加入终浓度为 0.3mM 的 IPTG， 30继续以转速160rpm摇动培养5-6h， 而后以5000g， 4离心10min， 收集菌液， 加入 5ml裂解液， 在室温于摇床上。
15、缓慢摇动1-2小时， 直至菌悬液变澄清为止。 将菌液以10000g， 4离心 30min， 回收上清液。将上清液采用蛋白亲和层析柱 His Trap HP Columns（购于 美国 GE Healthcare 公司） 回收纯化， 纯化的蛋白经 SDS-PAGE 电泳检测 （8v/cm 电压下电泳 25-30min， 随后 15v/cm 电压下电泳 2-2.5h） ， 发现其分子量与 MIF 相同， 即为重组 MIF（参 见图 1） 。 0040 所述裂解液为终浓度的 10mM NaH2PO4、 10mM Tris 和 8M 尿素 ,pH 8.0。所述 LB 液 体培养基组成成分按重量百分比计。
16、 ： 1.0蛋白胨 ,0.5酵母粉 ,1.0氯化钠 ,97.5蒸 馏水。 0041 实施例 3 0042 重组 MIF 的应用 0043 步骤 1） 蛋白注射 0044 将上述实施例 2 步骤 2） 的重组 MIF 在 PBS 中稀释至 0.8mg/ml， 即为 MIF 稀释液。 将 10 条美国红鱼 （重约 560g） 随机分为 2 组， 每组 5 条。将这 2 组分别命名为 A 和 B。将 A 组的每条鱼腹腔注射 100ul MIF 稀释液， 将 B 组 ( 对照组 ) 的每条鱼腹腔注射 100ul PBS。 0045 所 述 PBS 组 成 成 分 按 重 量 百 分 比 计 ： 0.8。
17、 NaCl,0.02 KCl,0.358 Na2HPO4.12H2O,0.024 NaH2PO4， 余量为水。 0046 步骤 2） 细菌悬液制备 0047 在 LB 培养基中培养迟缓爱德华氏菌 TX1 至 OD600为 0.8, 然后离心 （5000g， 4， 10min） ， 收集菌体， 将其悬浮于 PBS 中至终浓度为 5x107cfu/ml， 即为迟缓爱德华氏菌悬液。 0048 所述菌株 TX1 保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC， 保 藏编号为 ： CGMCC No.2330， 分类命名为迟缓爱德华氏菌 （Edwardsiella tarda） 。 0049。
18、 步骤 3） 攻毒感染 0050 在上述步骤 1） 注射后 5h， 将 A 和 B 组鱼腹腔注射 100ul 上述步骤 2） 的细菌悬液。 在注射后 4h， 取鱼肾脏和脾脏组织， 分别在 2ml PBS 中匀浆， 将 100ul 匀浆液涂布于 LB 平 板。将平板置于 30培养 48h， 计算出现的菌落数。结果表明 A 组鱼肾脏和脾脏的细菌数 （分别为 1x104和 7x103） 显著 （P0.01） 低于 B 组鱼肾脏和脾脏的细菌数 （分别为 4.6x105和 2x105） 。 0051 这些结果表明， 巨噬细胞移动抑制因子 MIF 能够显著抑制细菌侵染。 说 明 书 CN 103087170 A 5 1/1 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 103087170 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103087170 A 7 。