一种定点修饰N末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂及其制备方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310047046.4	申请日：	2013.02.06
公开号：	CN103087182A	公开日：	2013.05.08
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/61申请日:20130206\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/61; C07K1/107	主分类号：	C07K14/61
申请人：	中国科学院过程工程研究所
发明人：	胡涛; 吴玲; 苏志国; 马光辉
地址：	100190 北京市海淀区中关村北二条1号
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内容摘要

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种定点修饰N-末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂（GHA），以及其制备方法。所述方法包括以下：（1）以分子量为20kDa和40kDa的PEG醛分别定点修饰GHA的N末端；（2）用凝胶过滤色谱分离纯化上述两种PEG修饰产物；（3）两种PEG修饰产物的药效动力学的初步评价。其中，分子量为20kDa的PEG醛为优化的PEG，修饰产物具有较高的药效。

权利要求书

权利要求书一种定点修饰N‑末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂（GHA），其特征在于PEG化生长激素拮抗剂是由PEG共价修饰到生长激素拮抗剂的N‑末端。
根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其特征在于每个生长激素拮抗剂分子仅结合1个PEG分子。
根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其中PEG是单甲氧基聚乙二醇（mPEG），包括单甲氧基聚乙二醇醛、单甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基碳酸酯，其分子量在5kDa~40kDa之间。
根据权利要求3所述的PEG化生长激素拮抗剂，所述mPEG分子量是20kDa，所述的mPEG是单甲氧基聚乙二醇醛，结构为mPEG‑R‑CHO，其中R是碳数为1‑10的烷基。
根据权利要求4所述的PEG化生长激素拮抗剂，所述单甲氧基聚乙二醇醛是单甲氧基聚乙二醇丙醛。
根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其特征在于PEG与生长激素拮抗剂发生修饰反应的摩尔比为1‑20。
根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其特征在于PEG与生长激素拮抗剂发生修饰反应的摩尔比为4‑8。
权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂的制备方法，其特征在于PEG与生长激素拮抗剂发生修饰反应的反应时间为6‑48小时，反应温度在4‑37°C，反应pH为4.0‑7.0，缓冲体系为20mM的磷酸缓冲液，用氰基硼氢化钠（NaCNBH3）作为还原剂。
根据权利要求8所述的PEG化生长激素拮抗剂的制备方法，其分离纯化条件为使用凝胶过滤色谱，其中优选Superdex200凝胶过滤柱。
根据权利要求8所述的PEG化生长激素拮抗剂的制备方法，其特征在于发生修饰反应时NaCNBH3与生长激素拮抗剂的摩尔比为10‑200，优选的摩尔比在80‑160之间。

说明书

说明书一种定点修饰N‑末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种定点修饰N‑末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂，以及其制备方法。
背景技术
生长激素的主要作用在于促进生长，涉及调节身体的生长，以及调节蛋白质、碳水化合物和脂类的代谢。生长激素的代谢作用由胰岛素样生长因子‑I（IGF‑I）介导。垂体生长激素腺瘤是常见的垂体肿瘤之一，由于生长激素（GH）过度分泌、IGF‑I浓度增高，导致巨人症和肢端肥大症，其病亡率可高达20%‑30%。目前的治疗方法主要是减少或抑制生长激素的分泌，以降低生长激素的水平，防止生长激素的过度分泌，但是治疗效果不佳。
生长激素拮抗剂（GHA）可通过阻止生长激素与其受体（GHR）的结合，阻止后续的信号转导，降低血浆IGF‑I的水平，从而达到治疗的目的。GHA是通过置换人生长激素（hGH）的8个氨基酸残基，并用基因工程的方法表达出来的一种蛋白质。这8个氨基酸残基在人生长激素第1结合位点内，对生长激素与GHR的结合功能特别重要。其中，第18位天冬氨酸取代组氨酸（H18D）、第21位天冬酰胺取代组氨酸（H21N）、第167位天冬酰胺取代精氨酸（R167N）、第168位丙氨酸取代赖氨酸（K168A）、第171位丝氨酸取代天冬氨酸（D171S）、第172位精氨酸取代赖氨酸（K172R）、第174位丝氨酸取代谷氨酸（E174S）和第179位苏氨酸取代异亮氨酸（I179T）。通过氨基酸的置换，使第1结合位点与GHR的亲和力大为增加。
此外，B2036是一种人生长激素的9个氨基酸残基被置换的蛋白质。除了置换上述8个氨基酸残基以外，还有第1结合位点的第120位甘氨酸取代赖氨酸（G120K）。然而，B2036分子与GHR二聚体的亲和力却与人生长激素相当。这是由于尽管B2036的第1结合位点与GHR的亲和力有所增加，但第2结合位点几乎失去了与GHR的结合能力，从而能够抑制生长激素的生物学功能。由于B2036在体内的血浆半衰期短，仅为15‑20分钟，所以不能持续阻断生长激素的功能。在临床使用时需要加大给药量和给药次数，并带来一定的毒副作用，增加了病人的痛苦与经济负担。
聚乙二醇（PEG）修饰被认为是一种能有效克服蛋白质药物血浆半衰期短的方法之一。这是因为PEG自身有着巨大的优势，它是一种线性的、在溶液中可自由卷曲且不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，已被美国FDA批准用于人体。目前已有多种PEG修饰的蛋白质药物被美国FDA批准上市，如PEG修饰的干扰素α2a（Pegasys,Roche公司）等。使用PEG共价修饰蛋白质，可以延长蛋白质的体内循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性，增加蛋白质的溶解性以及改变蛋白质在人体内的生物学分布。PEG修饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰（包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰以及巯基修饰等。其中，定点修饰主要包括N‑末端修饰和半胱氨酸残基修饰。N‑末端修饰是通过PEG醛与一定量的还原剂如氰基硼氢化钠（NaCNBH3）在偏酸的环境下进行的还原烷基化反应。
Kopchick等（Endocr.Rev.2002,23:623‑646）将B2036分子共价修饰上4~6个分子量为5kDa的PEG分子，得到的生长激素类似物称为PEG‑B2036，即培维索孟（Pegvisomant）。由于Pegvisomant第168位和172位都不是赖氨酸残基，所以PEG化对Pegvisomant的第1结合位点的影响小于PEG‑hGH（G120K）。而Pegvisomant第120位为赖氨酸残基，可被PEG化，进一步降低了它与第2结合位点的亲和力。Pegvisomant于2003年获得美国FDA的批准上市，用于治疗垂体生长激素腺瘤引起的肢端肥大症，商品名索马沃（Somavert）。目前，欧洲也已将其用于肢端肥大症的临床治疗。但是，由于Pegvisomant是在B2036分子上接上4~6个分子量为5kDa的PEG分子。这种修饰产物不均一，修饰位点随机性强，每种成分无法定量、也无法进行分离，使得批次间的重复性较差，不同批次间的产物生物活性或有差别，不利于产品的质量控制和临床应用。Ross等（J.Clin.Endocrinol.Metab.2001,86:1716‑1723）的研究也表明Pegvisomant与GHR二聚体的亲和力要低于人生长激素。Pegvisomant与GHR二聚体的亲和力为PEG‑hGH（G120K）的6.6倍，但只有人生长激素的1/40。因此，Pegvisomant的浓度要远高于人生长激素才能达到拮抗的目的。这可能是因为在B2036分子的8个赖氨酸残基及N‑末端残基上修饰4~6个5kDa的PEG分子后，降低了Pegvisomant第1结合位点与GHR的亲和力。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种PEG修饰GHA的方法。分别采用分子量为20kDa和40kDa的PEG醛定点修饰GHA的N‑末端的α‑氨基，制备分子量均一的定点修饰N‑末端的PEG化GHA，即每个GHA分子的N‑末端结合1个PEG分子。最终修饰产物成分单一，易于分离纯化，产物收率高，预期能减少GHA生物活性的损失。
本发明的另一个目的还在于解决PEG修饰后GHA的半衰期增加而其药效降低的问题。通过比较分子量为20kDa和40kDa的PEG修饰产物对血浆IGF‑1的抑制作用，探讨不同链长PEG对GHA生物活性的影响，寻找PEG修饰GHA的药代动力学与药效动力学间的平衡点。在实施方案中发现，20kDa的PEG修饰产物（M‑P20K‑GHA）表现出较高的药效，而40kDa的PEG修饰产物（M‑P40K‑GHA）的药效几乎消失。因此，20kDa的PEG醛为优选的PEG用于修饰GHA。
本发明制备N‑末端PEG单修饰的生长激素拮抗剂的方法，包括以下步骤：
（1）确定M‑P20K‑GHA的制备条件：将GHA置换到50mM NaAc‑HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（0.1mM），按GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3的不同摩尔比例，于4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）检测PEG修饰产物，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。
（2）修饰产物M‑P20K‑GHA的纯化及鉴定：根据步骤1所述，选择GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比1:8:80用于制备M‑P20K‑GHA。以Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。收集修饰产物的洗脱峰，浓缩后用SDS‑PAGE和凝胶过滤色谱对修饰产物进行鉴定。
（3）确定M‑P40K‑GHA的制备条件：将GHA置换到50mM NaAc‑HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（0.1mM），按GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3的不同摩尔比例，于4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）检测PEG修饰产物，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。
（4）修饰产物M‑P40K‑GHA的纯化及鉴定：根据步骤3所述，选择GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比1:4:80用于制备M‑P40K‑GHA。以Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。收集产物的洗脱峰，浓缩后用SDS‑PAGE和凝胶过滤色谱进行产物鉴定。
（5）M‑P20K‑GHA和M‑P40K‑GHA的修饰位点鉴定：将GHA、M‑P20K‑GHA及M‑P40K‑GHA置换到含2.0M脲的NH4HCO3（0.05M，pH8.3）溶液中，将蛋白浓度调整为1.0mg/mL。将胰蛋白酶和蛋白以质量比为1:100的比例，于37℃下孵育10小时，酶解产物使用反相HPLC柱（Proteonavi，0.46cm×25cm）进行酶切片段的分离和鉴定。
（6）M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA的药效动力学：选取250~300克雄性SD大鼠20只，随机分为4组。其中，第1组为对照组，皮下注射0.15M的NaCl（500μl）；第2‑4组分别为GHA、M‑P20K‑GHA及M‑P40K‑GHA组。注射剂量为2mg GHA/kg SD大鼠，共注射500μl。经皮下注射后，于第1、4、24、48、72、96、120和144小时进行眼眶采血，离心收集血浆。用ELISA试剂盒测定血浆中IGF‑I的含量。
与传统的GHA修饰策略相比，本发明的优势在于提供了一种将不同分子量的PEG醛修饰在GHA的N‑末端的方法，从而得到均一且定点的PEG单修饰产物，使GHA的活性中心不被PEG修饰，减少GHA生物活性的损失。以M‑P20K‑GHA及M‑P40K‑GHA为例，通过比较不同分子量的PEG醛单修饰产物，考察其对血浆IGF‑I的抑制作用，探讨不同链长PEG对GHA生物活性的影响，确定修饰GHA的最佳PEG链长。
附图说明
图1分子量为20kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm），洗脱液流速为0.5ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。样品为不同反应比例下制备的PEG修饰产物。
图2分子量为40kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm），洗脱液流速为0.5ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。样品为不同反应比例下制备的PEG修饰产物。
图3凝胶过滤柱分离纯化PEG修饰产物。使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm），洗脱液流速为1.0ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。收集箭头所示的洗脱峰，即对应于纯化的M‑P20K‑GHA和M‑P40K‑GHA。
图4PEG修饰产物的纯度鉴定。凝胶过滤色谱图使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm），洗脱液流速为0.5ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。插图是SDS‑PAGE分析结果。第1泳道是标准蛋白，第2泳道是GHA，第3泳道是M‑P20K‑GHA，第4泳道是M‑P40K‑GHA。
图5PEG修饰位点的鉴定图谱。使用反相HPLC柱（Proteonavi，0.46cm×25cm）进行酶切肽段分离。
图6SD大鼠血浆中IGF‑I的浓度变化曲线。SD大鼠经皮下注射PEG修饰产物，血浆中IGF‑I的含量由IGF‑I ELISA定量试剂盒测定。
具体实施方式
实施例1M‑P20K‑GHA制备条件的确定
将GHA置换到50mM NaAc‑HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（即0.1mM），按GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比为1:4:40、1:4:80、1:6:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40、1:8:80以及1:8:160，4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）对修饰产物进行检测，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。20kDa PEG醛修饰GHA的结果如图1所示，以M‑P20K‑GHA的峰面积与总的峰面积比值大小来衡量产率。随着20kDa PEG醛和NaCNBH3反应比例的提高，M‑P20K‑GHA的产率也随之提高。但是，随着反应比例的增加，出现了多修饰的GHA，即D‑P20K‑GHA，并随着反应比例的增加而增加。此外，随着反应比例的增加，GHA的残留量显著下降；当GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，GHA基本反应完全。虽然GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，能够得到较多的GHA修饰产物，但是由于D‑P20K‑GHA的产率较多，因而GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，M‑P20K‑GHA的产率要低于摩尔比为1:8:80(~75%)。因此，选择GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比1:8:80用于制备M‑P20K‑GHA。
实施例2M‑P40K‑GHA制备条件的确定
将GHA置换到50mM NaAc‑HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（即0.1mM），按GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比为1:4:40、1:4:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40以及1:8:80，4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）对得到的结合产物进行检测，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。如图2所示，与20kDa的PEG醛修饰GHA的情况基本相同，采用40kDa的PEG醛修饰GHA，随着GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比例的增加，M‑P40K‑GHA的产率增加，GHA残量逐渐减少。虽然GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3的摩尔比为1:8:80时，能够得到较多的GHA修饰产物，但是由于D‑P40K‑GHA的产率较多，因而GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:80时，M‑P40K‑GHA的产率要低于摩尔比为1:4:80(~71%)。因此，选择GHA：PEG醛：NaCNBH3摩尔比1:4:80用于制备M‑P40K‑GHA。
实施例3M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA的分离纯化及鉴定
根据实施例1所述，选择GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比1:8:80用于制备M‑P20K‑GHA。根据实施例2所述，选择GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比1:4:80用于制备M‑P40K‑GHA。以Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）。如图3所示，经洗脱后出现了三个洗脱峰，分别对应于PEG的二修饰产物（每个GHA结合2个PEG）、PEG的单修饰产物（每个GHA结合1个PEG）和未修饰的GHA。分别收集两种PEG修饰的单修饰产物，浓缩后用SDS‑PAGE和凝胶过滤色谱鉴定。收集修饰产物的洗脱液，浓缩后用于后续的产品鉴定。
实施例4M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA的鉴定
用SDS‑PAGE和凝胶过滤色谱鉴定M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA。如图4插图所示，M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA在SDS‑PAGE电泳图上均表现出一条带，这表明这两种PEG修饰产物具有较高的纯度。M‑P40K‑GHA电泳带的迁移速率要慢于M‑P20K‑GHA，而M‑P20K‑GHA要慢于GHA。这表明PEG修饰能增加GHA的分子量，且M‑P40K‑GHA的分子量要高于M‑P20K‑GHA。如图4所示，经缓冲液洗脱后，M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA分别在Superdex200凝胶过滤柱（1.0cm×30cm）出现1个单一的洗脱峰。其中，M‑P20K‑GHA的出峰时间要快于M‑P40K‑GHA，而要慢于GHA。这表明M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA具有较高的纯度，且分子量要大于GHA。
实施例5PEG修饰位点的鉴定
将GHA、M‑P20K‑GHA与M‑P40K‑GHA经含2.0M脲的NH4HCO3（0.05M，pH8.3）的缓冲液中充分透析，而后调节浓度至1.0mg/mL。取胰蛋白酶，用超纯水配置浓度为1.0mg/mL的储液。按照胰蛋白酶和蛋白的质量比为1:100的比例，分别加入胰蛋白酶储液，于37℃孵育10小时。使用反相HPLC柱（Proteonavi，0.46cm×25cm）进行酶切肽段分离。反相HPLC柱使用95%的溶液A（含0.1%三氟乙酸的超纯水）和5%的溶液B（含0.1%三氟乙酸的乙腈）充分平衡，流速为0.5mL/min。采用线性洗脱方式于100min从5%溶液B升至50%溶液B，检测流出液在214nm的吸收值。
结果如图5所示，胰蛋白酶可以将GHA及其PEG修饰产物切成不同的肽段。其中以T2肽段作为对照，M‑P20K‑GHA和M‑P40K‑GHA与未修饰的GHA相比，由8个氨基酸残基组成且N‑末端所在的T1肽段（FPTIPLSR）消失，这是因为T1段经PEG修饰后，出峰位置发生改变，这说明了M‑P20K‑GHA和M‑P40K‑GHA的修饰位点均在N‑末端的α‑氨基。除此之外，其它酶切片段与GHA相比无显著变化。这表明PEG能特异性地修饰GHA的N末端。
实施例6M‑P20K‑GHA和M‑P40K‑GHA的药效动力学评价
选取250~300克雄性SD大鼠20只，随机分为4组。其中，第1组为对照组，皮下注射0.15mol/L的NaCl（500μl）；第2‑4组分别为GHA、M‑P20K‑GHA及M‑P40K‑GHA组。注射剂量为2mg GHA/kg SD大鼠，注射500μl，经皮下注射后，于1、4、24、48、72、96、120和144小时进行眼眶采血，离心收集血浆。
以IGF‑1浓度高低作为评价GHA药效的指标。血浆中IGF‑I的含量由IGF‑I ELISA定量试剂盒（R&D Systems,Inc.,USA）测定。如图6所示，对照组、GHA组和M‑P40K‑GHA组的IGF‑I水平相差不大，而M‑P20K‑GHA的IGF‑I水平比对照组约低30~43%。这说明M‑P20K‑GHA抑制了IGF‑1的水平，即M‑P20K‑GHA的药效要显著优于M‑P40K‑GHA。GHA组的IGF‑I的水平与对照组差异不大，这是由于GHA在体内被快速消除，体内的循环半衰期为15~20分钟，未能有效降低IGF‑1水平。对于M‑P20K‑GHA而言，PEG的链长较短，会部分屏蔽GHA分子上与GHR的结合位点，降低GHA的活性。然而M‑P20K‑GHA的半衰期延长能够抵消GHA生物活性的降低，从而能够显著降低IGF‑I水平。对于M‑P40K‑GHA而言，由于将40kDa的PEG修饰在GHA的N‑末端，高分子量的PEG能完全屏蔽GHA与GHR的结合位点，使GHA的活性几乎完全丧失。尽管M‑P40K‑GHA的半衰期显著延长，却无法弥补GHA的生物活性丧失。因此，M‑P20K‑GHA在延长GHA的半衰期的同时，能最大程度地保留GHA的生物活性。分子量为20kDa的PEG醛可作为优化的PEG用于修饰GHA。

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1、(10)申请公布号 CN 103087182 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103087182 A *CN103087182A* (21)申请号 201310047046.4 (22)申请日 2013.02.06 C07K 14/61(2006.01) C07K 1/107(2006.01) (71)申请人中国科学院过程工程研究所地址 100190 北京市海淀区中关村北二条 1 号 (72)发明人胡涛吴玲苏志国马光辉 (54) 发明名称一种定点修饰 N- 末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂及其制备方法 (57) 摘要本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明。

2、涉及一种定点修饰 N- 末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂（GHA），以及其制备方法。所述方法包括以下：（1）以分子量为 20kDa 和 40kDa 的 PEG 醛分别定点修饰 GHA 的 N 末端；（2）用凝胶过滤色谱分离纯化上述两种 PEG 修饰产物；（3）两种 PEG 修饰产物的药效动力学的初步评价。其中，分子量为 20kDa 的 PEG 醛为优化的 PEG，修饰产物具有较高的药效。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5。

3、页附图3页 (10)申请公布号 CN 103087182 A CN 103087182 A *CN103087182A* 1/1 页 2 1. 一种定点修饰 N- 末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂（GHA），其特征在于 PEG 化生长激素拮抗剂是由 PEG 共价修饰到生长激素拮抗剂的 N- 末端。 2. 根据权利要求 1 所述的 PEG 化生长激素拮抗剂，其特征在于每个生长激素拮抗剂分子仅结合 1 个 PEG 分子。 3. 根据权利要求 1 所述的 PEG 化生长激素拮抗剂，其中 PEG 是单甲氧基聚乙二醇（mPEG），包括单甲氧基聚乙二醇醛、单甲氧基聚乙二醇。

4、醛琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基碳酸酯，其分子量在 5kDa40kDa 之间。 4. 根据权利要求 3 所述的 PEG 化生长激素拮抗剂，所述 mPEG 分子量是 20kDa，所述的 mPEG 是单甲氧基聚乙二醇醛，结构为 mPEG-R-CHO，其中 R 是碳数为 1-10 的烷基。 5. 根据权利要求 4 所述的 PEG 化生长激素拮抗剂，所述单甲氧基聚乙二醇醛是单甲氧基聚乙二醇丙醛。 6. 根据权利要求 1 所述的 PEG 化生长激素拮抗剂，其特征在于 PEG 与生长激素拮抗剂发生修饰反应的摩尔比为 1-20。 7. 根据权利要求 1 所述的 PEG 化。

5、生长激素拮抗剂，其特征在于 PEG 与生长激素拮抗剂发生修饰反应的摩尔比为 4-8。 8. 权利要求 1 所述的 PEG 化生长激素拮抗剂的制备方法，其特征在于 PEG 与生长激素拮抗剂发生修饰反应的反应时间为6-48小时，反应温度在4-37C，反应pH为4.0-7.0，缓冲体系为 20mM 的磷酸缓冲液，用氰基硼氢化钠（NaCNBH3）作为还原剂。 9. 根据权利要求 8 所述的 PEG 化生长激素拮抗剂的制备方法，其分离纯化条件为使用凝胶过滤色谱，其中优选 Superdex200 凝胶过滤柱。 10.根据权利要求8所述的PEG化生长激素拮抗剂的制备方法，其特征。

6、在于发生修饰反应时 NaCNBH3与生长激素拮抗剂的摩尔比为 10-200，优选的摩尔比在 80-160 之间。权利要求书 CN 103087182 A 2 1/5 页 3 一种定点修饰 N- 末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂及其制备方法技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种定点修饰 N- 末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂，以及其制备方法。背景技术 0002 生长激素的主要作用在于促进生长，涉及调节身体的生长，以及调节蛋白质、碳水化合物和脂类的代谢。生长激素的代谢作用由胰岛素样生长因子 -I（IGF-I）介导。垂体生长。

7、激素腺瘤是常见的垂体肿瘤之一，由于生长激素（GH）过度分泌、 IGF-I 浓度增高，导致巨人症和肢端肥大症，其病亡率可高达20%-30%。目前的治疗方法主要是减少或抑制生长激素的分泌，以降低生长激素的水平，防止生长激素的过度分泌，但是治疗效果不佳。 0003 生长激素拮抗剂（GHA）可通过阻止生长激素与其受体（GHR）的结合，阻止后续的信号转导，降低血浆IGF-I的水平，从而达到治疗的目的。 GHA是通过置换人生长激素（hGH）的 8 个氨基酸残基，并用基因工程的方法表达出来的一种蛋白质。这 8 个氨基酸残基在人生长激素第 1 结合位点内，对生长。

8、激素与 GHR 的结合功能特别重要。其中，第 18 位天冬氨酸取代组氨酸（H18D）、第 21 位天冬酰胺取代组氨酸（H21N）、第 167 位天冬酰胺取代精氨酸（R167N）、第 168 位丙氨酸取代赖氨酸（K168A）、第 171 位丝氨酸取代天冬氨酸（D171S）、第 172 位精氨酸取代赖氨酸（K172R）、第 174 位丝氨酸取代谷氨酸（E174S）和第 179 位苏氨酸取代异亮氨酸（I179T）。通过氨基酸的置换，使第 1 结合位点与 GHR 的亲和力大为增加。 0004 此外， B2036 是一种人生长激素的 9 个氨基酸残基被。

9、置换的蛋白质。除了置换上述 8 个氨基酸残基以外，还有第 1 结合位点的第 120 位甘氨酸取代赖氨酸（G120K）。然而， B2036 分子与 GHR 二聚体的亲和力却与人生长激素相当。这是由于尽管 B2036 的第 1 结合位点与 GHR 的亲和力有所增加，但第 2 结合位点几乎失去了与 GHR 的结合能力，从而能够抑制生长激素的生物学功能。由于 B2036 在体内的血浆半衰期短，仅为 15-20 分钟，所以不能持续阻断生长激素的功能。在临床使用时需要加大给药量和给药次数，并带来一定的毒副作用，增加了病人的痛苦与经济负担。 0005 聚乙二醇（PEG）修饰被。

10、认为是一种能有效克服蛋白质药物血浆半衰期短的方法之一。这是因为 PEG 自身有着巨大的优势，它是一种线性的、在溶液中可自由卷曲且不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，已被美国 FDA 批准用于人体。目前已有多种 PEG 修饰的蛋白质药物被美国 FDA 批准上市，如 PEG 修饰的干扰素 2a （Pegasys,Roche 公司）等。使用 PEG 共价修饰蛋白质，可以延长蛋白质的体内循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性，增加蛋白质的溶解性以及改变蛋白质在人体内的生物学分布。 PEG 修饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰（包括 N 端氨基的酰化修饰、赖氨酸。

11、侧链氨基的酰化修饰、 N 端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰以及巯基修饰等。其中，定点修饰主要包括 N- 末端修饰和半胱氨酸残基修饰。N- 末端修饰是通过 PEG 醛与一定量的还原剂如氰基硼氢化钠（NaCNBH3）在偏酸的环境下进行的还原烷基化反应。说明书 CN 103087182 A 3 2/5 页 4 0006 Kopchick 等（Endocr.Rev.2002,23:623-646）将 B2036 分子共价修饰上 46 个分子量为 5kDa 的 PEG 分子，得到的生长激素类似物称为 PEG-B2036，即培维索孟（Pegvisomant）。由于。

12、Pegvisomant 第 168 位和 172 位都不是赖氨酸残基，所以 PEG 化对 Pegvisomant 的第 1 结合位点的影响小于 PEG-hGH （G120K）。而 Pegvisomant 第 120 位为赖氨酸残基，可被 PEG 化，进一步降低了它与第 2 结合位点的亲和力。Pegvisomant 于 2003 年获得美国 FDA 的批准上市，用于治疗垂体生长激素腺瘤引起的肢端肥大症，商品名索马沃（Somavert）。目前，欧洲也已将其用于肢端肥大症的临床治疗。但是，由于 Pegvisomant 是在 B2036 分子上接上 46 个分子量为 5kDa。

13、的 PEG 分子。这种修饰产物不均一，修饰位点随机性强，每种成分无法定量、也无法进行分离，使得批次间的重复性较差，不同批次间的产物生物活性或有差别，不利于产品的质量控制和临床应用。Ross 等（J.Clin.Endocrinol. Metab.2001,86:1716-1723）的研究也表明Pegvisomant与GHR二聚体的亲和力要低于人生长激素。Pegvisomant 与 GHR 二聚体的亲和力为 PEG-hGH（G120K）的 6.6 倍，但只有人生长激素的 1/40。因此， Pegvisomant 的浓度要远高于人生长激素才能达到拮抗的目的。这可能是因。

14、为在 B2036 分子的 8 个赖氨酸残基及 N- 末端残基上修饰 46 个 5kDa 的 PEG 分子后，降低了 Pegvisomant 第 1 结合位点与 GHR 的亲和力。发明内容 0007 针对上述问题，本发明提出了一种PEG修饰GHA的方法。分别采用分子量为20kDa 和 40kDa 的 PEG 醛定点修饰 GHA 的 N- 末端的 - 氨基，制备分子量均一的定点修饰 N- 末端的 PEG 化 GHA，即每个 GHA 分子的 N- 末端结合 1 个 PEG 分子。最终修饰产物成分单一，易于分离纯化，产物收率高，预期能减少 GHA 生物活性的损失。 0008 本。

15、发明的另一个目的还在于解决PEG修饰后GHA的半衰期增加而其药效降低的问题。通过比较分子量为20kDa和40kDa的PEG修饰产物对血浆IGF-1的抑制作用，探讨不同链长 PEG 对 GHA 生物活性的影响，寻找 PEG 修饰 GHA 的药代动力学与药效动力学间的平衡点。在实施方案中发现， 20kDa 的 PEG 修饰产物（M-P20K-GHA）表现出较高的药效，而 40kDa 的 PEG 修饰产物（M-P40K-GHA）的药效几乎消失。因此， 20kDa 的 PEG 醛为优选的 PEG 用于修饰 GHA。 0009 本发明制备 N- 末端 PEG 单修饰的生长激素拮抗。

16、剂的方法，包括以下步骤： 0010 （1）确定 M-P20K-GHA 的制备条件：将 GHA 置换到 50mM NaAc-HAc 缓冲液（pH5.5）中。调整 GHA 浓度为 2.2mg/mL（0.1mM），按 GHA ： PEG 醛（20kDa）： NaCNBH3的不同摩尔比例，于 4分别反应过夜（16 小时）。以 Superdex200 凝胶过滤柱（1cm30cm）检测 PEG 修饰产物，洗脱液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。 0011 （2）修饰产物 M-P20K-GHA 的纯化及鉴定：根据步骤 1 所述，选择 GHA ： PEG 醛。

17、（20kDa）： NaCNBH3摩尔比 1:8:80 用于制备 M-P20K-GHA。以 Superdex200 凝胶过滤柱（1.6cm60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。收集修饰产物的洗脱峰，浓缩后用 SDS-PAGE 和凝胶过滤色谱对修饰产物进行鉴定。 0012 （3）确定 M-P40K-GHA 的制备条件：将 GHA 置换到 50mM NaAc-HAc 缓冲液（pH5.5）中。调整 GHA 浓度为 2.2mg/mL（0.1mM），按 GHA ： PEG 醛（40kDa）： NaCNBH3的。

18、不同摩尔比例，于 4分别反应过夜（16 小时）。以 Superdex200 凝胶过滤柱（1cm30cm）检测 PEG 修饰说明书 CN 103087182 A 4 3/5 页 5 产物，洗脱液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。 0013 （4）修饰产物 M-P40K-GHA 的纯化及鉴定：根据步骤 3 所述，选择 GHA ： PEG 醛（40kDa）： NaCNBH3摩尔比 1:4:80 用于制备 M-P40K-GHA。以 Superdex200 凝胶过滤柱（1.6cm60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为 20mM 磷酸缓冲。

19、液（pH7.2）。收集产物的洗脱峰，浓缩后用 SDS-PAGE 和凝胶过滤色谱进行产物鉴定。 0014 （5） M-P20K-GHA 和 M-P40K-GHA 的修饰位点鉴定：将 GHA、 M-P20K-GHA 及 M-P40K-GHA 置换到含 2.0M 脲的 NH4HCO3（0.05M， pH8.3）溶液中，将蛋白浓度调整为 1.0mg/ mL。将胰蛋白酶和蛋白以质量比为 1:100 的比例，于 37下孵育 10 小时，酶解产物使用反相 HPLC 柱（Proteonavi， 0.46cm25cm）进行酶切片段的分离和鉴定。 0015 （6） M-P20K。

20、-GHA与M-P40K-GHA的药效动力学：选取250300克雄性SD大鼠20只，随机分为 4 组。其中，第 1 组为对照组，皮下注射 0.15M 的 NaCl（500l）；第 2-4 组分别为 GHA、 M-P20K-GHA 及 M-P40K-GHA 组。注射剂量为 2mg GHA/kg SD 大鼠，共注射 500l。经皮下注射后，于第 1、 4、 24、 48、 72、 96、 120 和 144 小时进行眼眶采血，离心收集血浆。用 ELISA 试剂盒测定血浆中 IGF-I 的含量。 0016 与传统的 GHA 修饰策略相比，本发明的优势在于提供了一种将不同分子量。

21、的 PEG 醛修饰在GHA的N-末端的方法，从而得到均一且定点的PEG单修饰产物，使GHA的活性中心不被 PEG 修饰，减少 GHA 生物活性的损失。以 M-P20K-GHA 及 M-P40K-GHA 为例，通过比较不同分子量的 PEG 醛单修饰产物，考察其对血浆 IGF-I 的抑制作用，探讨不同链长 PEG 对 GHA 生物活性的影响，确定修饰 GHA 的最佳 PEG 链长。附图说明 0017 图1分子量为20kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200 凝胶过滤柱（1cm30cm），洗脱液流速为 0.5ml/min，洗脱缓冲液为。

22、20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。样品为不同反应比例下制备的 PEG 修饰产物。 0018 图2分子量为40kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200 凝胶过滤柱（1cm30cm），洗脱液流速为 0.5ml/min，洗脱缓冲液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。样品为不同反应比例下制备的 PEG 修饰产物。 0019 图 3 凝胶过滤柱分离纯化 PEG 修饰产物。使用的是 Superdex200 凝胶过滤柱（1.6cm60cm），洗脱液流速为 1.0ml/min，洗脱缓冲液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。收集箭头所示。

23、的洗脱峰，即对应于纯化的 M-P20K-GHA 和 M-P40K-GHA。 0020 图 4PEG 修饰产物的纯度鉴定。凝胶过滤色谱图使用的是 Superdex200 凝胶过滤柱（1cm30cm），洗脱液流速为 0.5ml/min，洗脱缓冲液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。插图是 SDS-PAGE 分析结果。第 1 泳道是标准蛋白，第 2 泳道是 GHA，第 3 泳道是 M-P20K-GHA，第 4 泳道是 M-P40K-GHA。 0021 图 5PEG 修饰位点的鉴定图谱。使用反相 HPLC 柱（Proteonavi， 0.46cm25cm）进行酶切肽段。

24、分离。 0022 图 6SD 大鼠血浆中 IGF-I 的浓度变化曲线。SD 大鼠经皮下注射 PEG 修饰产物，血浆中 IGF-I 的含量由 IGF-I ELISA 定量试剂盒测定。说明书 CN 103087182 A 5 4/5 页 6 具体实施方式 0023 实施例 1M-P20K-GHA 制备条件的确定 0024 将 GHA 置换到 50mM NaAc-HAc 缓冲液（pH5.5）中。调整 GHA 浓度为 2.2mg/mL （即 0.1mM），按 GHA ： PEG 醛（20kDa）： NaCNBH3 摩尔比为 1:4:40、 1:4:80、 1:6:80、 1:。

25、6:60、 1:6:120、 1:8:40、 1:8:80 以及 1:8:160， 4分别反应过夜（16 小时）。以 Superdex200 凝胶过滤柱（1cm30cm）对修饰产物进行检测，洗脱液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。20kDa PEG 醛修饰 GHA 的结果如图 1 所示，以 M-P20K-GHA 的峰面积与总的峰面积比值大小来衡量产率。随着 20kDa PEG 醛和 NaCNBH3反应比例的提高， M-P20K-GHA 的产率也随之提高。但是，随着反应比例的增加，出现了多修饰的 GHA，即 D-P20K-GHA，并随着反应比例的增加而增加。。

26、此外，随着反应比例的增加， GHA的残留量显著下降；当GHA ： PEG醛： NaCNBH3的摩尔比为 1:8:160 时， GHA 基本反应完全。虽然 GHA ： PEG 醛： NaCNBH3的摩尔比为 1:8:160 时，能够得到较多的 GHA 修饰产物，但是由于 D-P20K-GHA 的产率较多，因而 GHA ： PEG 醛： NaCNBH3的摩尔比为 1:8:160 时， M-P20K-GHA 的产率要低于摩尔比为 1:8:80(75%)。因此，选择 GHA ： PEG 醛（20kDa）： NaCNBH3摩尔比 1:8:80 用于制备 M-P20K-GH。

27、A。 0025 实施例 2M-P40K-GHA 制备条件的确定 0026 将 GHA 置换到 50mM NaAc-HAc 缓冲液（pH5.5）中。调整 GHA 浓度为 2.2mg/mL（即 0.1mM），按 GHA ： PEG 醛（40kDa）： NaCNBH3摩尔比为 1:4:40、 1:4:80、 1:6:60、 1:6:120、 1:8:40 以及1:8:80， 4分别反应过夜（16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm30cm）对得到的结合产物进行检测，洗脱液为 20mM 磷酸缓冲液（pH7.2）。如图 2 所示，与 20kDa 的 PEG 。

28、醛修饰 GHA 的情况基本相同，采用 40kDa 的 PEG 醛修饰 GHA，随着 GHA ： PEG 醛（40kDa）： NaCNBH3 摩尔比例的增加， M-P40K-GHA 的产率增加， GHA 残量逐渐减少。虽然 GHA ： PEG 醛（40kDa）： NaCNBH3 的摩尔比为 1:8:80 时，能够得到较多的 GHA 修饰产物，但是由于 D-P40K-GHA 的产率较多，因而GHA ： PEG醛： NaCNBH3的摩尔比为1:8:80时， M-P40K-GHA的产率要低于摩尔比为 1:4:80(71%)。因此，选择 GHA ： PEG 醛： NaCNB。

29、H3摩尔比 1:4:80 用于制备 M-P40K-GHA。 0027 实施例 3M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA 的分离纯化及鉴定 0028 根据实施例 1 所述，选择 GHA ： PEG 醛（20kDa）： NaCNBH3摩尔比 1:8:80 用于制备 M-P20K-GHA。根据实施例 2 所述，选择 GHA ： PEG 醛（40kDa）： NaCNBH3摩尔比 1:4:80 用于制备 M-P40K-GHA。以 Superdex200 凝胶过滤柱（1.6cm60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为 20mM 磷酸盐缓冲液（pH7.2）。如图 3 所示。

30、，经洗脱后出现了三个洗脱峰，分别对应于 PEG 的二修饰产物（每个 GHA 结合 2 个 PEG）、 PEG 的单修饰产物（每个 GHA 结合 1 个 PEG）和未修饰的 GHA。分别收集两种 PEG 修饰的单修饰产物，浓缩后用 SDS-PAGE 和凝胶过滤色谱鉴定。收集修饰产物的洗脱液，浓缩后用于后续的产品鉴定。 0029 实施例 4M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA 的鉴定 0030 用 SDS-PAGE 和凝胶过滤色谱鉴定 M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA。如图 4 插图所示， M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA 在 SDS-PA。

31、GE 电泳图上均表现出一条带，这表明这两种 PEG 修饰产物具有较高的纯度。M-P40K-GHA 电泳带的迁移速率要慢于 M-P20K-GHA，而 M-P20K-GHA 要慢于 GHA。这表明 PEG 修饰能增加 GHA 的分子量，且 M-P40K-GHA 的分子量要高于 M-P20K-GHA。如图4所示，经缓冲液洗脱后， M-P20K-GHA与M-P40K-GHA分别在Superdex200 凝胶过滤柱（1.0cm30cm）出现 1 个单一的洗脱峰。其中， M-P20K-GHA 的出峰时间要快于说明书 CN 103087182 A 6 5/5 页 7 M-P40K-GH。

32、A，而要慢于 GHA。这表明 M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA 具有较高的纯度，且分子量要大于 GHA。 0031 实施例 5PEG 修饰位点的鉴定 0032 将 GHA、 M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA 经含 2.0M 脲的 NH4HCO3（0.05M， pH8.3）的缓冲液中充分透析，而后调节浓度至 1.0mg/mL。取胰蛋白酶，用超纯水配置浓度为 1.0mg/mL 的储液。按照胰蛋白酶和蛋白的质量比为1:100的比例，分别加入胰蛋白酶储液，于37孵育 10 小时。使用反相 HPLC 柱（Proteonavi， 0.46cm25cm）。

33、进行酶切肽段分离。反相 HPLC 柱使用 95% 的溶液 A（含 0.1% 三氟乙酸的超纯水）和 5% 的溶液 B（含 0.1% 三氟乙酸的乙腈）充分平衡，流速为 0.5mL/min。采用线性洗脱方式于 100min 从 5% 溶液 B 升至 50% 溶液 B，检测流出液在 214nm 的吸收值。 0033 结果如图 5 所示，胰蛋白酶可以将 GHA 及其 PEG 修饰产物切成不同的肽段。其中以 T2 肽段作为对照， M-P20K-GHA 和 M-P40K-GHA 与未修饰的 GHA 相比，由 8 个氨基酸残基组成且 N- 末端所在的 T1 肽段（FPTIPLSR）消失，。

34、这是因为 T1 段经 PEG 修饰后，出峰位置发生改变，这说明了 M-P20K-GHA 和 M-P40K-GHA 的修饰位点均在 N- 末端的 - 氨基。除此之外，其它酶切片段与 GHA 相比无显著变化。这表明 PEG 能特异性地修饰 GHA 的 N 末端。 0034 实施例 6M-P20K-GHA 和 M-P40K-GHA 的药效动力学评价 0035 选取 250300 克雄性 SD 大鼠 20 只，随机分为 4 组。其中，第 1 组为对照组，皮下注射 0.15mol/L 的 NaCl（500l）；第 2-4 组分别为 GHA、 M-P20K-GHA 及 M-P40K。

35、-GHA 组。注射剂量为 2mg GHA/kg SD 大鼠，注射 500l，经皮下注射后，于 1、 4、 24、 48、 72、 96、 120 和 144 小时进行眼眶采血，离心收集血浆。 0036 以IGF-1浓度高低作为评价GHA药效的指标。血浆中IGF-I的含量由IGF-I ELISA 定量试剂盒（R&D Systems,Inc.,USA）测定。如图 6 所示，对照组、 GHA 组和 M-P40K-GHA 组的 IGF-I 水平相差不大，而 M-P20K-GHA 的 IGF-I 水平比对照组约低 3043%。这说明 M-P20K-GHA 抑制了 IGF-1 的水平，。

36、即 M-P20K-GHA 的药效要显著优于 M-P40K-GHA。GHA 组的 IGF-I 的水平与对照组差异不大，这是由于 GHA 在体内被快速消除，体内的循环半衰期为 1520 分钟，未能有效降低 IGF-1 水平。对于 M-P20K-GHA 而言， PEG 的链长较短，会部分屏蔽 GHA 分子上与 GHR 的结合位点，降低 GHA 的活性。然而 M-P20K-GHA 的半衰期延长能够抵消 GHA 生物活性的降低，从而能够显著降低 IGF-I 水平。对于 M-P40K-GHA 而言，由于将 40kDa 的 PEG 修饰在 GHA 的 N- 末端，高分子量的 PEG 。

37、能完全屏蔽 GHA 与 GHR 的结合位点，使 GHA 的活性几乎完全丧失。尽管 M-P40K-GHA 的半衰期显著延长，却无法弥补 GHA 的生物活性丧失。因此， M-P20K-GHA 在延长 GHA 的半衰期的同时，能最大程度地保留 GHA 的生物活性。分子量为 20kDa 的 PEG 醛可作为优化的 PEG 用于修饰 GHA。说明书 CN 103087182 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说明书附图 CN 103087182 A 8 2/3 页 9 图 4 图 5 说明书附图 CN 103087182 A 9 3/3 页 10 图 6 说明书附图 CN 103087182 A 10 。

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