《一种亚砜生物碱类化合物及其制备方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种亚砜生物碱类化合物及其制备方法与应用.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103145740 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145740 A *CN103145740A* (21)申请号 201310064261.5 (22)申请日 2013.02.28 C07D 519/00(2006.01) A61K 31/439(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (。
2、71)申请人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市高新园区凌工路 2 号 (72)发明人 赵心清 矫文策 白凤武 (74)专利代理机构 大连星海专利事务所 21208 代理人 花向阳 (54) 发明名称 一种亚砜生物碱类化合物及其制备方法与应 用 (57) 摘要 一种亚砜生物碱类化合物及其制备与应用， 属于微生物技术领域。这种亚砜生物碱类化合 物是将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤液 体培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 48-72h， 以 10% 接种量接种到发酵培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 432-456h， 发酵液经分离纯化法 得到。该。
3、化合物对多种细菌尤其是金黄色葡萄 球菌具有显著的抑制作用， 同时对人乳腺癌细胞 MCF-7， 人肝癌细胞 SMMC-7721， 人急性骨髓性白 血病细胞U937以及小细胞肺癌细胞NCI-H1688具 有一定的抗肿瘤活性， 具有较好的抗癌新药及抗 菌新药开发前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103145740 A CN 103145740 A *CN103145740A* 1/1 页 2 1. 一种亚砜生物碱类化合物， 其特征。
4、是 ： 所述化合物的分子结构式 I 为 ： 在 I 式中 ： R1为 2. 根据权利要求 1 所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法， 其特征是 ： 将海洋链霉菌 接种到胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 48-72h， 以 10% 接种量 接种到发酵培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 432-456h， 发酵液经分离纯化法得到亚砜 生物碱类化合物。 3. 根据权利要求 2 所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法， 其特征是 ： 所述分离纯化 法如下 ： 将 6 升发酵液 6000 r/min 离心 10 min， 得到发酵液上清液与菌丝体 ； 。
5、上清液以 1:2 的比例与乙酸乙酯混合， 反复萃取三次， 并使用旋转蒸发仪蒸干， 得到的上清液乙酸乙 酯提取物 ； 菌丝体使用等体积比甲醇 / 丙酮破壁浸提 12h 后， 6000 r/min 离心 10 min 后取 上清液， 得到甲醇 / 丙酮菌丝体提取物， 使用旋转蒸发仪除去甲醇 / 丙酮， 并用乙酸乙酯萃 取， 得到菌丝体乙酸乙酯提取物， 将上清液与菌丝体的乙酸乙酯提取物合并后得到发酵液 粗提物 ； 将发酵液粗提物过硅胶柱， 干法上柱， 以乙酸乙酯 - 二氯甲烷和甲醇 - 乙酸乙酯进 行梯度洗脱， 在洗脱前首先用二氯甲烷平衡， 然后按照如下洗脱梯度， 用 100 毫升的不同梯 度洗脱液。
6、进行洗脱， 洗脱梯度分别为纯二氯甲烷， 二氯甲烷 ： 乙酸乙酯 =2:1、 二氯甲烷 ： 乙 酸乙酯 =1:1、 二氯甲烷 ： 乙酸乙酯 =1:2， 纯乙酸乙酯， 乙酸乙酯 ： 甲醇 =2:1、 乙酸乙酯 ： 甲醇 =1:1、 乙酸乙酯 ： 甲醇 =1:2， 纯甲醇， 以上洗脱梯度均为体积比 ； 得到 9 个组分， 以金黄色葡 萄球菌为指示菌进行活性检测， 结果显示组分5具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性 ； 以C18反 相柱对组分5进行分离， 分别用浓度为30%、 60%、 80%和100%的甲醇进行洗脱， 结果显示80% 的甲醇洗脱液具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性 ； 对该组分进行高效液相色谱检测。
7、， 并在半 制备型 HPLC 进行制备， 得到所述亚砜生物碱类化合物。 4. 根据权利要求 2 所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法， 其特征是 ： 所述胰蛋白胨 大豆肉汤液体培养基的组分如下 ： 酪蛋白胨 17 g、 大豆蛋白胨 3 g、 葡萄糖 2.5 g、 NaCl 5 g、 K2HPO4 2.5g， 蒸馏水定容至 1000 ml， pH 7.00.2 ； 发酵培养基组成如下 ： 可溶性淀粉 20.0 g、 大豆粉 25 g、 葡萄糖 10 g、 酵母粉 4 g、 牛肉膏 1 g、 蛋白胨 2 g、 NaCl 2 g、 K2HPO4 0.5 g、 CaCO3 5 g， 蒸馏水定容至 100。
8、0 ml， pH 7.2。 5. 根据权利要求 1 所述的亚砜生物碱类化合物的应用， 其特征是 ： 用于制备抑制金黄 色葡萄球菌的抗菌制剂， 或用于制备治疗肺癌、 肝癌、 白血病的抗肿瘤药物。 权 利 要 求 书 CN 103145740 A 2 1/4 页 3 一种亚砜生物碱类化合物及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种亚砜生物碱类化合物及其制备与应用， 属于微生物技术领域。 背景技术 0002 随着抗生素在临床上的普遍应用 , 临床上耐药性病原菌不断出现以及近年来出 现的 SARS、 禽流感和超级细菌” ， 迫切需要开发新的抗生素类药物。放线菌生产的活性物质 很多具有医药和。
9、植物保护方面的用途 , 已广泛用作抗细菌、 抗真菌和抗肿瘤药物。现在已 发现的数万种微生物来源的生物活性物质中,约有70%是由放线菌所合成的。 然而， 随着陆 地放线菌的过度开发， 发现新颖生物活性化合物的几率逐年降低。 海洋微生物生活在高压、 高盐、 寡营养等特殊环境中 , 形成了独特的生长和代谢方式 , 与陆地微生物相比更有可 能产生结构新颖、 功能独特的次级代谢物 , 具有巨大的开发潜力。 0003 海洋链霉菌 （Streptomyces xinghaiensis NRRL B24674T） 是本实验室于 2006 年 分离自大连星海湾水下 20 米海泥样品中， 经过 16S rRNA，。
10、 形态和生理生化实验确定为一株 新的海洋链霉菌。前期研究表明， 海洋链霉菌发酵液粗提物对大肠杆菌， 金黄色葡萄球菌， 枯草芽孢杆菌， 铜绿假单胞菌具有不同程度的抑制作用。 0004 亚砜类化合物由于具有广谱的生物活性， 如杀虫活性、 抗菌活性、 抗肿瘤活性、 除草剂活性等， 受到国内外学者的普遍关注， 但天然亚砜类化合物报道很少， 已有的报道 常常来自于陆地植物中， 如分离自牙甘蓝 （Brussels sprouts） 中的 S-methyl-cysteine sulfoxid 和西西里蜜蒜 （Allium siculums）中的 S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxid。
11、e, S-n-butyl-cysteine sulfoxide。 在 海 洋 无 脊 椎 动 物 中， 如 海 绵 (Pseudoceratina purpurea) 和海鞘 (Polycitor sp.) 中也分离得到少量的亚砜类化合物， 如 psammaplin N, eudistomin K, lehualides J, varacins B 和 varacins D, eudistomidin E 和 aplisulfamines 等。到目前为止， 还没有亚砜类化合物从海洋微生物中发现得到。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种具有药用价值的新化合物及其制备方法和该化合物 在抗。
12、菌及抗肿瘤治疗中的应用。 0006 本发明采用的技术方案是 ： 一种亚砜生物碱类化合物的分子结构式 I 为 ： 说 明 书 CN 103145740 A 3 2/4 页 4 0007 在 I 式中 ： R1为 0008 所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法 ： 将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉 汤液体培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 48-72h， 以 10% 接种量接种到发酵培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 432-456h， 发酵液经分离纯化法得到亚砜生物碱类化合物。 0009 所述分离纯化法如下 ： 将 6 升发酵液 6000 r/min 离心 10。
13、 min， 得到发酵液上清液 与菌丝体 ； 上清液以 1:2 的比例与乙酸乙酯混合， 反复萃取三次， 并使用旋转蒸发仪蒸干， 得到的上清液乙酸乙酯提取物 ； 菌丝体使用等体积比甲醇 / 丙酮破壁浸提 12h 后， 6000 r/ min 离心 10 min 后取上清液， 得到甲醇 / 丙酮菌丝体提取物， 使用旋转蒸发仪除去甲醇 / 丙酮， 并用乙酸乙酯萃取， 得到菌丝体乙酸乙酯提取物， 将上清液与菌丝体的乙酸乙酯提取 物合并后得到发酵液粗提物 ； 将发酵液粗提物过硅胶柱， 干法上柱， 以乙酸乙酯 - 二氯甲烷 和甲醇 - 乙酸乙酯进行梯度洗脱， 在洗脱前首先用二氯甲烷平衡， 然后按照如下洗脱梯。
14、度， 用 100 毫升的不同梯度洗脱液进行洗脱， 洗脱梯度分别为纯二氯甲烷， 二氯甲烷 ： 乙酸乙 酯 =2:1、 二氯甲烷 ： 乙酸乙酯 =1:1、 二氯甲烷 ： 乙酸乙酯 =1:2， 纯乙酸乙酯， 乙酸乙酯 ： 甲醇 =2:1、 乙酸乙酯 ： 甲醇 =1:1、 乙酸乙酯 ： 甲醇 =1:2， 纯甲醇， 以上洗脱梯度均为体积比 ； 得到 9 个组分， 以金黄色葡萄球菌为指示菌进行活性检测， 结果显示组分 5 具有拮抗金黄色葡萄 球菌的活性 ； 以 C18 反相柱对组分 5 进行分离， 分别用浓度为 30%、 60%、 80% 和 100% 的甲醇 进行洗脱， 结果显示 80% 的甲醇洗脱液具。
15、有拮抗金黄色葡萄球菌的活性 ； 对该组分进行高 效液相色谱检测， 并在半制备型 HPLC 进行制备， 得到所述亚砜生物碱类化合物。 0010 所述胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基的组分如下 ： 酪蛋白胨 17 g、 大豆蛋白胨 3 g、 葡萄糖 2.5 g、 NaCl 5 g、 K2HPO4 2.5g， 蒸馏水定容至 1000 ml， pH 7.00.2 ； 发酵培养基 组成如下 ： 可溶性淀粉 20.0 g、 大豆粉 25 g、 葡萄糖 10 g、 酵母粉 4 g、 牛肉膏 1 g、 蛋白 胨 2 g、 NaCl 2 g、 K2HPO4 0.5 g、 CaCO3 5 g， 蒸馏水定容至 1000 。
16、ml， pH 7.2。 0011 用于制备抑制金黄色葡萄球菌的抗菌制剂， 或用于制备治疗肺癌、 肝癌、 白血病的 抗肿瘤药物。 0012 本发明的有益效果主要体现在 ： 这种亚砜生物碱类化合物是将海洋链霉菌接种到 胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 48-72h， 以 10% 接种量接种到 发酵培养基中， 28-30， 180-200rpm 培养 432-456h， 发酵液经分离纯化法得到。该化合物 对多种细菌尤其是金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用， 同时对人乳腺癌细胞 MCF-7， 人肝 癌细胞 SMMC-7721， 人急性骨髓性白血病细胞 U937 以。
17、及小细胞肺癌细胞 NCI-H1688 具有一 定的抗肿瘤活性， 具有较好的抗癌新药及抗菌新药开发前景。 说 明 书 CN 103145740 A 4 3/4 页 5 附图说明 0013 图 1 为星海新碱在甲醇溶液中的紫外吸收谱图 ； 0014 图 2 为星海新碱的红外光谱谱图 ； 0015 图 3 为星海新碱的 ESI-MS 质谱谱图 ； 0016 图 4 为星海新碱核磁氢谱 1H-NMR 谱图 ； 0017 图 5 为星海新碱核磁碳谱 13C-NMR 谱图。 具体实施方式 0018 以下结合附图和实施例进一步说明本发明。 0019 实施例 1 0020 将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤液。
18、体培养基中， 28， 200rpm 培养 48h， 得 到海洋链霉菌种子培养液 ； 种子液以 10% 接种量接种到装有 150ml 发酵培养基的 500ml 三 角瓶中， 共 50 瓶， 28， 200rpm 培养 432h， 得到 7L 海洋链霉菌发酵液。将发酵液 6000 r/ min 离心 10 min， 得到发酵液上清液与菌丝体。上清液以 1:2 的比例与乙酸乙酯混合， 反 复萃取三次， 并使用旋转蒸发仪蒸干， 得到的上清液乙酸乙酯提取物 ； 菌丝体使用甲醇 / 丙 酮 （1:1， v:v） 破壁浸提 12h 后， 6000 r/min 离心 10 min 后取上清液， 得到甲醇 / 。
19、丙酮菌丝 体提取物， 使用旋转蒸发仪除去甲醇 / 丙酮， 并用乙酸乙酯萃取， 得到菌丝体乙酸乙酯提取 物， 将上清液与菌丝体的乙酸乙酯提取物合并后得到发酵液粗提物。将发酵液粗提物过硅 胶柱， 干法上柱， 以乙酸乙酯 - 二氯甲烷 (0100%) 和 甲醇 - 乙酸乙酯 (0100%) 进行 梯度洗脱， 得到 9 个组分。以金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） 为指示菌进行活 性检测， 结果显示组分 5 具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性。以 C18 反相柱对组分 5 进行分 离， 分别用 30%, 60%, 80% 和 100% 的甲醇进行洗脱， 结果显示 80% 的甲醇洗。
20、脱液具有拮抗 金黄色葡萄球菌的活性。对该组分进行高效液相色谱进行检测， 并在半制备型高效液相色 谱进行制备， 得到所述的亚砜生物碱类化合物 6 毫克。 0021 该化合物相关参数如下 : 0022 外观 ： 褐色粘性油状物 ； 0023 比旋光度 ： 10.8（1mg/ml， 甲醇溶液） ； 0024 分子量 ： 724.35 ； 0025 分子式 ： C50H48N2OS ； 0026 紫外最大吸收波长 ： 232.5nm（甲醇溶液， 见图 1） ； 0027 IR 图谱 ： 见图 2 ； 0028 MS 图谱 ： 见图 3 ； 0029 NMR 图谱 ： 1H-NMR 见图 4， 13C-。
21、NMR 见图 5。 0030 根据上述特征， 可断定该化合物为一种新的亚砜生物碱类化合物， 将它命名为星 海新碱， 该化合物系首次从海洋微生物中发现的新型含亚砜基团的生物碱类活性物质。 0031 实施例 2 0032 用接种环挑取平板中金黄色葡萄球菌单菌落， 接种于 4ml 的 LB 培养基中， 37， 200rpm 培养 4-6 小时， 使其终浓度为约含 12108CFU/ml ； 取无菌试管 13 支， 排成一排， 除 第 1 管加入 1.6ml LB 培养基外， 其余每管加入 LB 培养基 1ml， 在第 1 管加入星海新碱 1280 说 明 书 CN 103145740 A 5 4/4。
22、 页 6 g/ml 0.4ml 混匀， 然后吸取 1ml 至第 2 管， 混匀后再吸取 1ml 至第 3 管， 如此连续倍比稀 释至第 11 管， 并从第 11 管中吸取 1ml 弃去， 第 12 管为不含药物的生长对照。此时各管药 物浓度依次为 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25g/ml。然后在每管内加入上述制备 好的接种物各 1ml， 使每管最终菌液浓度约为 5105CFU/ml。第 1 管至第 11 管药物浓度分 别为 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 05、 0.25、 0.125g/ml。将接种好的稀释管塞好。
23、塞子， 置 37 培养箱中培养 1620 小时。观察不长金黄色葡萄球菌 （试管内澄清） 的试管浓度即为星海新 碱的最小抑菌浓度， 实际检测得知星海新碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为 0.5g/ ml。 0033 上述的星海新碱可用于制备抑制金黄色葡萄球菌， 大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌， 铜绿 假单胞菌的抗菌制剂， 对金黄色葡萄球菌， 包括临床上分离得到的耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌 （MRSA） 的生长具有抑制作用， 同时对大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌也有 一定的抑制作用， 但是对白色念珠菌的抑制作用较差。本发明提供的亚砜生物碱化合物对 测试菌的抑制作用见表 1。 0034 表 1 。
24、星海新碱最小抑菌浓度 0035 0036 “” ： 未测试。 0037 上述的星海新碱可用于制备抗肿瘤药物， 用于治疗肺癌、 或肝癌、 或白血病的抗肿 瘤药物。对人乳腺癌细胞 MCF-7， 人肝癌细胞 SMMC-7721， 人急性骨髓性白血病细胞 U937 以 及小细胞肺癌细胞 NCI-H1688 具有一定的生长抑制作用。星海新碱对人肿瘤细胞的生长抑 制作用见表 2。 0038 表 2 ： 亚砜生物碱化合物的体外抗肿瘤活性 0039 说 明 书 CN 103145740 A 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103145740 A 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103145740 A 8 3/3 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 103145740 A 9 。