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1、(10)申请公布号 CN 103276107 A (43)申请公布日 2013.09.04 CN 103276107 A *CN103276107A* (21)申请号 201310174312.X (22)申请日 2013.05.13 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院病原生物学研究所 地址 100176 北京市朝阳区北京经济技术开 发区荣京东街 6 号 申请人 郭军华 (72)发明人 彭俊平 郭军华 金奇 (74)专利代理机构 北京华科联合专利事务所 11130 代理人 王为 (54。
2、) 发明名称 一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法 (57) 摘要 本发明提供一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤 病毒的方法， 该方法以排除 PCR 扩增产物污染为 前提、 以多重 PCR 质谱联用为平台的高灵敏度 检测和 / 或鉴定人多瘤病毒的方法， 本发明检测 的 12 种人类多瘤病毒包括 ： BKPyV、 JCPyV、 KIPyV、 WUPyV、 MCPyV、 HPyV6、 HPyV7、 TSPyV、 HPyV9、 MWPyV、 STLPyV 和 HPyV12， 检测部位为病毒基因组中编码 病毒衣壳蛋白的晚期编码区 VP1。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 。
3、1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103276107 A CN 103276107 A *CN103276107A* 1/1 页 2 1. 一种可同时检测多种人多瘤病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包含 SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.39 的多核苷酸。 2. 根据权利要求 1 的试剂盒， 其中所述人多瘤病毒包括 ： BK polyomavirus(BKPyV),、 JC polyomavirus(JCPyV)、 KI polyomavirus(KIPyV)、 WU polyo。
4、mavirus(WUPyV)、 Merkel cell polyomavirus(MCPyV)、Human polyomavirus6(HPyV6)、 Human polyomavirus7(HPyV7)、trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus(TSPyV)、 Human polyomavirus9(HPyV9)、 MW polyomavirus(MWPyV)/Human polyomavirus10(HPyV10)/MX polyomavirus (MXPyV)、 STL polyomavirus(STLPyV) 和 Human p。
5、olyomavirus12(HPyV12)。 3. 根据权利要求 1 的试剂盒， 其中， SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24 为 12 种人多瘤病毒的 正向和反向引物序列 ； SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.38为碱基延伸探针序列 ； SEQ ID NO.25和 SEQ ID NO.26 为质控引物序列 ； SEQ ID NO.39 为探针序列。 4.权利要求1的试剂盒的使用方法， 其特征在于， 每种病毒采用针对VP1基因区序列探 针检测， 所述方法包括以下步骤 : (1) 用一对 PCR 引物， 在引物的 5 端带有 ACGTTGGATG 碱基的任意组合的标签序列。
6、， 使 总长度达到 30 个碱基以上， 以区别于探针 ； 在扩增区域中的保守序列区设计一条单碱基延 伸探针， 探针的长度为 14-28 个碱基， 在探针的 3 末端， 允许延伸一个经设计确定的碱基， 作为该病毒特异性序列标记， 单碱基延伸后总长度不超过 29 个碱基 ； （2） 第一次 PCR 扩增反应， 将 dUTP/dATP/dGTP/dCTP 混合物、 UNG 酶、 Tag 酶和多重 PCR 引物一同加入 PCR 反应体系中， 先进行 dUTP 的消化， 降解 PCR 扩增产物， 然后灭活 UNG 酶， 随后作 45 个循环 PCR 扩增， 获得待测样本中靶序列扩增产物 ； （3） 用虾。
7、碱性磷酸酶处理， 使第一轮反应中剩余 dNTP 脱磷酸失活 ； （4） 第二次单碱基延伸扩增， 将 ddNTPs 或类似核酸末端终止剂加入反应体系中， 使之 在单碱基延伸探针的 3 端， 延伸一个序列特异性单核苷酸， 作分子量标记， 扩增 200 个循 环， 每个探针的延伸产物之间分子量相差至少 20Da ； （5） 采用阳离子交换树脂吸附盐离子， 纯化延伸反应产物 ； （6） 纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测， 根据分子量标记确定待测人多瘤病毒 的类型。 权 利 要 求 书 CN 103276107 A 2 1/8 页 3 一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法 技术领域 0001 本发。
8、明涉及一种病原微生物的检测方法， 特别涉及一种高灵敏度检测和鉴定人多 瘤病毒的方法。 背景技术 0002 多瘤病毒是双链 DNA 病毒， 基因组约 4700-5400 碱基对， 编码结构蛋白和抗原。自 Gross 于 1953 年发现鼠多瘤病毒可引发鼠肿瘤以来， 多瘤病毒一直被怀疑是人类肿瘤的致 病因素。 然而， 虽然多瘤病毒感染能够在动物模型中诱发肿瘤， 但是一直没有发现引起人类 肿瘤的确切证据。在动物中， 多瘤病毒 DNA 整合入宿主基因组经常先于肿瘤形成。 0003 截 止 2013 年 3 月，已 发 现 的 人 多 瘤 病 毒 有 12 种。1971 年 报 道 的 BK polyo。
9、mavirus(BKPyV) 和 JC polyomavirus(JCPyV) 被 视 为 最 早 发 现 的 人 多 瘤 病 毒。 BKPyV 被认为与肾病和膀胱炎有关 ； JCPyV 则与进行性多灶性脑白质病有关 ； 2007 年， KI polyomavirus(KIPyV) 和 WU polyomavirus(WUPyV) 从呼吸道分离出来， 但其致病性仍不 清楚。美国学者 Feng 于 2008 年在 Science 杂志首次报道， 从人类 Merkel 细胞瘤 ( 简 称 MCC) 样本中检测到未知病毒 T 抗原和人酪氨酸磷酸酶受体的融合基因转录本。经过 鉴定和序列分析发现其为一个。
10、之前未知的多瘤病毒， 含有 5387 个碱基对基因组， 他们将 之定名为 Merkel 细胞多瘤病毒 （Merkel cell polyomavirus， MCV 或 MCPyV)， 成为首个 被确定为与恶性肿瘤相关的人类多瘤病毒 （Feng et al.2008） 。由于 MCPyV 存在的拷 贝数极其低， 平均一个细胞仅含有一个病毒颗粒， 一般技术难以检测到。美国国立肿瘤 研究所 （NCI）的学者 Schowalter 等发明了一种改进的滚动循环扩增 （rolling circle amplification， RCA） 技术， 从皮肤拭抹样本中分离到环型 DNA 病毒基因组， 完整的 M。
11、CPyV 基因组可以从 40%(14/35) 的健康成人中获得。RCA 分析还揭示了 2 个以前未知的多瘤病 毒称为 human polyomavirus6(HPyV6)and HPyV7， 在健康人样本中检测到 HPyV6（5/35） 和 HPyV7DNA（4/35） 。经血清学研究发现， 在 95 名献血员的血清中检出 61%(58/95)MCPyV 阳性， 69%(66/95)HPyV6 和 35%（33/95） HPyV7 阳性， 该结果表明， 这 3 种病毒的单独感染 或共感染非常普遍 (Schowalter et al.,2010)。荷兰莱顿大学的学者 van der Meijde。
12、n 于 2010 年从心脏移植病人面部粉刺皮肤病中分离到一种多瘤病毒 trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus(TSPyV) （van der Meijden et al.,2010） ， 成为第 8 种人类多瘤病毒。 德国学者Scuda于2010年从肾移植免疫抑制治疗病人的血浆中检测到一 个新的多瘤病毒， 序列分析显示最靠近的亲缘关系为非洲绿猴起源的淋巴多瘤病毒， 该病 毒自然地感染人类， 被命名为 HPyV9(Scuda et al.,2011)。2012 年， 美国学者分别从粪便， 患 WHIM 综合征， 包括特征性的疣 (war。
13、ts)、 低丙种球蛋白血症 (hypogammaglobulinemia)、 细 菌 感 染 (recurrent bacterial infection) 和 先 天 性 骨 髓 粒 细 胞 缺 乏 症 (myelokathexis)病人皮肤中发现了第10种多瘤病毒MW polyomavirus(MWPyV),HPyV10和 MX polyomavirus(MXPyV) （Lim et al.,2012,Buck et al.,2012,Yu et al.,2012)。序列 分析表明 MWPyV,HPyV10 和 MXPyV 属于同一种人多瘤病毒。美国华盛顿大学 Lim 于 2012 年 说。
14、 明 书 CN 103276107 A 3 2/8 页 4 从美国和非洲儿童粪便中检出一种新的多瘤病毒 STL polyomavirus(STLPyV)， 检出率约为 1%， 成为第 11 种人多瘤病毒 （Lim et al.2012） 。2013 年， 德国学者 Korup 等从人类肝组织 中发现第 12 种人多瘤病毒， HPyV12(Korup,et al.2013)。 0004 在已发现的 12 种人多瘤病毒中， 至今已有 4 种人多瘤病毒确定与人类疾病相关 （BKPyV,JCPyV,MCPyV 和 TSPyV） ， 并且发现存在多种多瘤病毒共同感染的状况。然而， 目前 的人多瘤病毒 D。
15、NA 检测方法， 还停留在单个病毒特异性 PCR 或荧光定量 PCR 检测阶段， 尚未 见有囊括多种人类多瘤病毒检测的方法报道。由于检测通量低， 严重影响了人多瘤病毒与 人类疾病关系的深入研究。 发明内容 0005 本发明提供了一种高灵敏度、 高通量可同时检测 12 种人多瘤病毒的方法。 0006 本发明检测的 12 种人类多瘤病毒包括 ： BKPyV、 JCPyV、 KIPyV、 WUPyV、 MCPyV、 HPyV6、 HPyV7、 TSPyV、 HPyV9、 MWPyV、 STLPyV 和 HPyV12， 检测部位为病毒基因组中编码病毒 衣壳蛋白的晚期编码区 VP1。 0007 本发明的。
16、检测方法， 包括以下步骤 ： 0008 1、 引物设计 ： 涵盖 2013 年 3 月之前公开发表的 12 种人类多瘤病毒， 包括 ： BKPyV、 JCPyV、 KIPyV、 WUPyV、 MCPyV、 HPyV6、 HPyV7、 TSPyV、 HPyV9、 MWPyV、 STLPyV 和 HPyV12 型。根据 待测人多瘤病毒全序列， 获取 VP1 基因区， 选择每种病毒的特异性保守序列， 设计一对 PCR 引物， 在引物的 5 端带有 10 个碱基 （ACGTTGGATG） 任意组合的标签序列， 使总长度达到 30 个碱基以上， 用以从分子量上将引物与探针区别开。各种人多瘤病毒的扩增引物。
17、序列见表 1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针， 探针的长度为 14-28 个碱基， 在探 针的 3 末端， 允许延伸一个经设计确定的碱基， 作为该基因型特异性序列标记， 单碱基延伸 后总长度不超过29个碱基， 每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。 各种人多瘤病 毒扩增引物序列见表 1， 其对应的碱基延伸探针见表 2。 0009 2、 PCR 反应 : 在 PCR 过程中引入尿嘧啶 N 糖基化酶 （UNG 酶） 技术， 在首次 PCR 反 应体系中， 采用以 dUTP 替代常规 PCR 的 dTTP， 使产物中掺入大量 dU。在再次进行 PCR 扩增 前， 用 UNG 酶。
18、处理 PCR 混合液即可消除 PCR 产物的残留污染。由于 UNG 酶在 PCR 循环中的 变性一步便可被灭活， 因此不会影响含 dU 的新的 PCR 反应及产物， 彻底排除了 PCR 扩增产 物污染引起的假阳性问题。通过第一轮 PCR 扩增， 获得待测样本中靶序列扩增产物。 0010 3、 虾碱性磷酸酶 （SAP） 处理 ： 使未结合的剩余核酸 （dNTPs） 脱磷酸失活， 预防干扰 下一步碱基延伸反应。 0011 4、 碱基延伸反应 ： 在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的 3 端， 延伸一个序列特 异性单核苷酸， 作分子量标记， 得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的 分子量差。
19、异不小于 16Da， 0012 5、 树脂脱盐 ： 纯化延伸反应产物。 0013 6、 质谱检测 ： 将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF-MASS） 系统进行分子量检测， 根据分子量标记确定待测人多瘤病毒类别， 软件 自动处理报告每种病毒的检测结果和可信程度。 0014 本发明的检测方法， 优选的包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 103276107 A 4 3/8 页 5 0015 (1) 用一对 PCR 引物， 在引物的 5 端带有 ACGTTGGATG 碱基的任意组合的标签序 列， 使总长度达到 30 个碱基以上， 以区别于探针 ； 在扩增区中的保守序。
20、列设计一条单碱基 延伸探针， 探针的长度为 14-28 个碱基， 在探针的 3 末端， 允许延伸一个经设计确定的碱 基， 作为该基因型特异性序列标记， 单碱基延伸后总长度不超过 29 个碱基 ； 0016 （2） 第一次 PCR 扩增反应， 将 dUTP/dNTP 混合物、 UNG 酶、 Tag 酶和多重 PCR 引物一 同加入 PCR 反应体系中， 先进行 dUTP 的消化， 降解 PCR 扩增产物， 然后灭活 UNG 酶， 随后作 45 个循环 PCR 扩增， 获得待测样本中靶序列扩增产物 ； 0017 （3） 用虾碱性磷酸酶处理， 使第一轮反应中剩余 dNTP 脱磷酸失活 ； 0018 。
21、（4） 第二次单碱基延伸扩增， 将 ddNTPs 加入反应体系中， 使之在单碱基延伸探针 的 3 端， 延伸一个序列特异性单核苷酸， 作分子量标记， 扩增 200 个循环， 每个探针的延伸 产物之间分子量相差至少 16Da ； 0019 （5） 采用阳离子交换树脂吸附盐离子， 纯化延伸反应产物 ； 0020 （6） 纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测， 根据分子量标记确定待测 HPyV 基 因的类型。 0021 其中所述步骤 （1） 引物设计中每一种待测人多瘤病毒， 采用一种衣壳蛋白晚期转 录区 VP1 基因区。引物序列为 SEQ ID NO.1 至 SEQ ID NO.24， 探针序列为 。
22、SEQ ID NO.27 至 SEQ ID NO.38。 0022 所述步骤 （1） 中， 优选的采用 球蛋白基因作为样品质量控制参照， 引物序列为 SEQ ID NO.25 和 SEQ ID NO.26， 探针序列为 SEQ ID NO.39。 0023 优选的在每次反应中加入阴性对照， 所述阴性对照为去离子双蒸水。 0024 本发明的方法， 检测浓度低至 10 拷贝 /ul。 0025 表 1 0026 序列编号引物序列人类多瘤病毒 SEQ ID NO.1ACGTTGGATGAATCTACTGATGTGGGAGGCBKPyV 正向引物 SEQ ID NO.2ACGTTGGATGGACCCT。
23、GCATGAAGGTTAAGBKPyV 反向引物 SEQ ID NO.3ACGTTGGATGAGGAGAAAATGTTCCTCCAGJCPyV 正向引物 SEQ ID NO.4ACGTTGGATGTTGCAAAGTGGCCCAACACCJCPyV 反向引物 SEQ ID NO.5ACGTTGGATGATGGGAGCTGTACAGAATGGKIPyV 正向引物 SEQ ID NO.6ACGTTGGATGAGCCAGACCATGTACAACACKIPyV 反向引物 SEQ ID NO.7ACGTTGGATGTAGCCCACTTAAAACTGCTGWUPyV 正向引物 SEQ ID NO.8ACGT。
24、TGGATGCAACCTGTGACAAGCTGTAGWUPyV 反向引物 SEQ ID NO.9ACGTTGGATGAACTGTAGGAGTRTGAGAGCMCPyV 正向引物 说 明 书 CN 103276107 A 5 4/8 页 6 SEQ ID NO.10ACGTTGGATGGTATGGTGTCCTGATCCTTCMCPyV 反向引物 SEQ ID NO.11ACGTTGGATGAAGTGGAGGCAATTRTGCTGHPyV6 正向引物 SEQ ID NO.12ACGTTGGATGGTGTCAGTAAAGGTGTAGGGHPyV6 反向引物 SEQ ID NO.13ACGTTGGAT。
25、GAGGAGGCGTTGAAGTRTTGGHPyV7 正向引物 SEQ ID NO.14ACGTTGGATGTTTGGCAGCAACACTGCTTCHPyV7 反向引物 SEQ ID NO.15ACGTTGGATGACCCAAGCCTGTTCCAAAACTSPyV 正向引物 SEQ ID NO.16ACGTTGGATGATACTGTCAGGGCCTGTAACTSPyV 反向引物 SEQ ID NO.17ACGTTGGATGGAGGCCTACCTAAATCCAAGHPyV9 正向引物 SEQ ID NO.18ACGTTGGATGTATCACTAGCCTTGCTGGAGHPyV9 反向引物 SEQ。
26、 ID NO.19ACGTTGGATGTGGTATGGCTACAGTGATCCHPyV10 正向引物 SEQ ID NO.20ACGTTGGATGTAGCTGTACTYTAAGTGGGCHPyV10 反向引物 SEQ ID NO.21ACGTTGGATGCCTCACAGACATGTCCAATGSTLPyV 正向引物 SEQ ID NO.22ACGTTGGATGACAGACAGACTTTTGGCACGSTLPyV 反向引物 SEQ ID NO.23ACGTTGGATGATAGCTGTGCTAGAATCACCHPyV12 正向引物 SEQ ID NO.24ACGTTGGATGCAGCTTCCCAC。
27、ATAGGTAGGHPyV12 反向引物 SEQ ID NO.25ACGTTGGATGACTGTGCTTGACCTAGGAAC 球蛋白正向引物 SEQ ID NO.26ACGTTGGATGAAAGCAGCACTTGACTAGAG 球蛋白反向引物 0027 表 2. 0028 序列编号基因型别碱基延伸探针序列延伸碱基 SEQ ID NO.27BKPyVCAATGACATGCTAGTTATTCG SEQ ID NO.28JCPyVGGCTGCAACACTGTTGT SEQ ID NO.29KIPyVTACCAGAGTTGCTTGTTGT SEQ ID NO.30WUPyVCTCGAAGCTGCTA。
28、ATGTTAC 说 明 书 CN 103276107 A 6 5/8 页 7 SEQ ID NO.31MCPyVGATGAAAACAGTAGATACTATGC SEQ ID NO.32HPyV6ACTGCCTCTGGATCCAATA SEQ ID NO.33HPyV7ACCTGAAGTTTTGGATACAGTA SEQ ID NO.34TSPyVAGGACTTATTATGAAGGGCAATATA SEQ ID NO.35HPyV9TACCGAATGGGAAACAATAACCCC SEQ ID NO.36HPyV10TACGTGATCCAATAACAGTAACAAAT SEQ ID NO.37S。
29、TLPyVTCCGATGATCATATTCACATCTTCA SEQ ID NO.38HPyV12CTATGCCCTCCCCTTATTGAA SEQ ID NO.39 球蛋白GACATTTTATTCCCCAAGTGAC 0029 表 1， 表 2 中列出的合成的多核苷酸， 均采用常规的多核苷酸合成方法合成。 0030 与现有检测人多瘤病毒的其它技术和同类技术相比， 本发明技术方案充分发挥了 PCR-质谱联用检测病毒的优势， 对大于10重以上PCR反应产物， 作一次性质谱检测， 不需要 荧光染料标记、 不需要洗涤、 反应在微量体系中进行， 使试剂耗材成本与检测 PCR 重数成反 比， 从而实现以。
30、多种探针， 在一个反应中同时检测 12 种人多瘤病毒的目标。首轮 PCR 扩增 区域为 60-120bp 的基因型特异性片段， 第二轮 PCR 采用特异性探针末端单点法扩增， 可以 允许使用更多循环 , 最大限度地提高了检测灵敏度和特异性， 使检测灵敏度达到 1aM 级单 个拷贝水平， 避免了检测漏诊造成的假阴性问题。同时采用 UNG 酶技术和基因型特异性片 段扩增设计技术， 彻底排除了 PCR 产物污染和同源序列探针错配引起的假阳性问题。为多 瘤病毒致病机理研究提供了可靠的实验方法。 0031 根据本发明的检测方法， 本发明人还设计了一种检测试剂盒， 以期用于临床样品 的检测， 本发明的试剂。
31、盒， 可以包括一种或多种如表 1， 表 2 的合成的多核苷酸试剂。 0032 优选的， 本发明试剂盒包括以下试剂 ： 0033 合成的多核苷酸试剂， 所述多核苷酸为 12 种人类多瘤病毒 （HPyV） 的正向和反向 引物序列 SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24 ； 0034 碱基延伸探针序列 SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.38 ； 0035 质控引物序列为 SEQ ID NO.25 和 SEQ ID NO.26 和探针序列 SEQ ID NO.39。 0036 根据需要， 本发明的试剂盒中还可以包括有利于实验室操作的试剂如 ： 溶剂， 缓冲 溶剂， 辅助材料等。 。
32、0037 本发明的试剂盒， 可以包括以上组分制备而成的试剂， 试剂的配制方法均为常规 技术， 只需要将各种原材料在常温下混合均匀即可， 无需特殊设备和条件。 0038 本发明的试剂盒， 可以将不同试剂分别盛装， 再一同包装在同一包装盒内， 使用时 根据说明书中描述的方法进行操作。 说 明 书 CN 103276107 A 7 6/8 页 8 附图说明 0039 图 1、 13Plex 人多瘤病毒碱基延伸探针质谱峰图 具体实施方式 0040 本发明包括同时检测 12 种已知人多瘤病毒中的一种或多种， 每种基因型采用 VP1 基因区作检测。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明， 并不用于限定本。
33、发明。 0041 本发明实施方式提供的高灵敏度检测和 / 或鉴定人类多瘤病毒的方法， 待检测 12 种人多瘤病毒包括 ： BKPyV、 JCPyV、 KIPyV、 WUPyV、 MCPyV、 HPyV6、 HPyV7、 TSPyV、 HPyV9、 MWPyV、 STLPyV 和 HPyV12。包括如下步骤 : 0042 （1） 根据待测人多瘤病毒全序列， 获取 VP1 基因区， 选择每个型别的特异性保守序 列， 设计一对 PCR 引物， 在引物的 5 端带有 10 个碱基 （ACGTTGGATG） 任意组合的标签序列， 使总长度达到 30 个碱基以上， 用以从分子量上将引物与探针区别开。各种 。
34、HPyV 基因型的 扩增引物序列见表 1。在扩增区中的保守序列区， 设计一条单碱基延伸探针， 探针的长度为 14-28 个碱基， 在探针的 3 末端， 允许延伸一个经设计确定的碱基， 作为该基因型特异性序 列标记， 单碱基延伸后总长度不超过 29 个碱基， 每个探针的延伸产物之间分子量相差至少 30Da。各种 HPyV 探针引物序列见表 2。 0043 （2） 通过 PCR 扩增， 获得待测样本中靶序列扩增产物。 0044 PCR 反应体系配制见表 3. 0045 表 3 0046 试剂最终浓度体积 (1) Water,HPLC gradeN/A0.3L 10X Buffer w/20mM M。
35、gCl22mM MgCl20.5L 25mM MgCl22mM0.4L 25mM dUTP/dNTP Mix500mM0.1L UNG Enzyme（1U/ul）0.5U0.5L 0.5mM Primer mix0.1mM1.0L 5U/ml PCR enzymea1Unit0.2L Template DNA(5-20ng/L) 2.0L Total 5.0L 0047 0048 先用 37 -50 2 分钟， 进行 dUTP 的消化， 然后 94 4 分钟灭活，（同时这一步也 达到预变性的效果） ， 随后作 PCR 扩增。反应条件为 95变性 30 秒， 56退火 30 秒， 72延 说 明。
36、 书 CN 103276107 A 8 7/8 页 9 伸 1 分钟， 共 45 个循环 ； 最终 72延伸 5 分钟， 完成后恒温于 4。 0049 （3） 通过虾碱性磷酸酶 （SAP） 处理， 使未结合的剩余核酸 （dNTPs） 脱磷酸失活， 预 防干扰下一步碱基延伸反应。SAP 消化酶反应体系见表 4。 0050 表 4 0051 试剂体积 / 反应 Water,HPLC grade1.53L 10SAP buffer0.17L SAP enzyme(1.7U/ml)0.3L Total2.0L 0052 反应条件为37孵育40分钟， 去除剩余dNTPs ； 然后用855分钟使SAP酶失。
37、活。 0053 （4） 通过碱基延伸反应， 在单碱基延伸探针的 3 端， 延伸一个序列特异性单核苷 酸， 作分子量标记， 得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异 不小于 16Da， 延伸反应体系见表 5。 0054 表 5 0055 试剂体积 / 反应 Water,HPLC grade0.619L 10iPLEXbuffer plus0.2L iPLEXterminator mix0.2L Primer mix*0.94L iPLEXenzyme0.041L Total2.0L 0056 * 延伸反应探针 mix 的浓度， 按照各型分子量大小进行线性关系调节， 总浓度约为。
38、 8-15M， 最终浓度约为 0.84-1.57M。 0057 循环反应为200个短阶梯程序， 包含两个循环嵌合， 开始为94变性30秒， 随后在 94 5 秒， 52退火 5 秒， 80延伸 5 秒， 共 40 个循环中， 每个插入退火和延伸 5 个小循环 ； 最终 72延伸 3 分钟。 0058 （5） 采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。 0059 （6） 将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检 测， 根据分子量标记确定待测人多瘤病毒类别。图 1 中， 横坐标为分子量， 纵坐标为峰强度。 图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置， 如果不存在该型别探针峰不变 ；。
39、 如 说 明 书 CN 103276107 A 9 8/8 页 10 果被检出型别拷贝数大于 10， 探针可被完全消耗， 左侧峰消失转至右侧 ； 右侧的同色虚线 表示延伸产物分子量位置。用 TYPE4.0 软件阅读谱图， 自动分析和报告结果， 导出数据。数 据解释为， 每一种人多瘤病毒和内参 HBB 的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应分子量 峰， 在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物， 探针分子量峰发生转移为产物分子 量峰， 分析结果报告为阳性。 阳性结果分为四种 ： A、 结果可靠 ； B、 中度可靠 ； C、 一般可靠 ； D、 低度可靠。前三种视为延伸反应有效， 有相应人多瘤病毒感染， 第四种需要人工辅助判断， 观察探针是否消耗， 判断为可疑感染或阴性结果。 对可疑感染样品， 在必要时可作重复性验 证试验。 说 明 书 CN 103276107 A 10 1/1 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 103276107 A 11 。