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1、(10)申请公布号 CN 103146637 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146637 A *CN103146637A* (21)申请号 201310045809.1 (22)申请日 2013.02.01 C12N 5/04(2006.01) A61K 36/488(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 13/08(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 5/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 。
2、29/00(2006.01) A61P 37/08(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/12(2006.01) (71)申请人 杭州华缔投资管理有限公司 地址 310013 浙江省杭州市西湖区万塘路 69 号华星科技苑 B 楼 202 室 (72)发明人 周天琼 周正兵 高留根 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 赵青朵 冯琼 (54) 发明名称 一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法 (57) 摘要 本发明涉及细胞工程领域， 具体公开了一种 通过培养葛根细胞制备黄酮的方法。该方法将 葛根愈伤组织细胞接种在培养基上在 23。
3、-27温 度、 800-1200lx 光照强度下， 以每天 8-12 小时光 照时间培养15-20天， 然后分离获得黄酮。 本发明 通过优化培养条件和选择优良培养体系， 以培养 葛根细胞的生物技术手段来制备黄酮， 收率明显 高于现有乙醇浸提法、 水提取法等常规方法的黄 酮收率， 开拓了制备黄酮的新途径。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103146637 A CN 103146637 A *CN103146637A* 1/1 页 。
4、2 1. 一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法， 其特征在于， 将葛根愈伤组织细胞接种在 灭菌后的培养基上， 并在23-27温度、 800-1200lx光照强度下， 以每天8-12小时光照时间 培养 15-20 天， 然后分离提取获得黄酮 ； 所述培养基由 NH4NO3、 KNO3、 MgSO47H2O、 CaCl22H2O、 KH2PO4、 FeSO47H2O、 EDTA-Na2、 KI、 CoCl26H2O、 H3BO3、 Na2MoO22H2O、 MnSO4H2O、 CuSO45H2O、 ZnSO47H2O、 6-（苄胺基） 嘌呤、 2,4 二氯苯氧乙酸、 蔗糖、 琼脂组成， pH 值为 。
5、5.8。 2. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于， 所述培养基由以下方法制备获得 ： 以质量百分浓度计， 配制由 8.25% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余 量水组成的第一溶液 ； 配制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 配制由 0.85% 的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 配 制 由 0.00415% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H。
6、3BO3、 0.00125% 的 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和 余量水组成的第五溶液 ； 配制由 0.5% 的肌醇、 0.0025% 的烟酸、 0.0025% 的盐酸吡哆醇、 0.0005% 的盐酸硫氨素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 分别取第一溶液、 第二溶液、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和第六溶液各 20mL， 然后加 入 6-（苄胺基） 嘌呤、 2,4 二氯苯氧乙酸、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄胺基） 嘌呤浓度为 10。
7、-6M， 2,4 二氯苯氧乙酸浓度为 1.510-5M， 蔗糖质量百分浓度为 3%， 琼脂质 量百分浓度为 0.75%， 然后调 pH 值为 5.8 高压灭菌后即得培养基。 3. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于， 所述葛根愈伤组织细胞通过将葛根外植体 进行培养， 然后进行愈伤组织培养后获得。 4. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于， 所述光照强度为 1000lx。 5. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于， 所述光照时间为 10 小时。 6. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于， 所述温度为 25。 7. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于， 所述培养时间为。
8、 16-19 天。 8. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于， 所述分离提取获得黄酮具体为 ： 步骤 1、 收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组织细胞 ： 50-75% 乙醇 为 1g:15-35mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 20-60min， 然后过滤， 获 得滤液和滤渣， 滤液备用， 滤渣进行步骤 2 ； 步骤 2、 以滤渣 ： 50-75% 乙醇为 1g:15-35mL 的质量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振荡 20-60min， 然后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 滤渣重复本步骤 1-3 次 ； 步骤 3、 合并步骤 1 和步骤 2 。
9、所获得的所有滤液、 浓缩并烘干， 即得黄酮。 9.根据权利要求8所述方法， 其特征在于， 步骤1和步骤2所述质量体积比为1g:20mL。 10. 根据权利要求 8 所述方法， 其特征在于， 步骤 1 和步骤 2 所述乙醇体积百分数为 60%。 权 利 要 求 书 CN 103146637 A 2 1/8 页 3 一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞工程领域， 具体的说是涉及一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方 法。 背景技术 0002 黄酮是植物经光合作用产生的一大类化合物， 其结构母核是以 C6-C3-C6为骨架的 2- 苯基色原酮。它的存在形式有两种， 一种是。
10、游离的苷元 , 另一种是与糖等结合的苷。黄 酮类化合物在植物界分布很广泛， 如银杏叶、 山碴、 沙棘、 蔷薇果、 拘祀、 杜仲、 茶叶、 葛根等。 到目前为止， 已发现有 500 多种植物中有黄酮类和异黄酮类物质， 它们包括黄烷酮、 异黄烷 酮、 黄酮醇、 黄烷酮醇、 双黄酮及其衍生物。 黄酮类物质主要作用有 ： 抗肿瘤， 延缓衰老、 增强 心血管功能、 治疗慢性前列腺炎、 增强免疫力、 调解内分泌系统、 护肝、 抗炎、 抗过敏、 抑菌、 抗病毒等。 0003 葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根， 甘葛藤又习称为粉葛， 葛根是最常用的 称呼。从成分分析结果看， 葛根的葛根素及总黄酮含量显著高于。
11、本属其它植物， 活性物质 主要为大豆素、 大豆甙、 葛根素、 葛根素 -7- 木糖甙等， 是提取黄酮的较优选择。目前提取 黄酮的方法有很多， 如热水提取法、 碱液提取法、 丙酮提取法、 乙醇浸提法、 微波萃取法、 超 声波法等， 但是这些方法的共性是将含黄酮植物粉碎处理后直接进行提取， 黄酮收率因工 艺和原材料的差别而不稳定， 而且提取不够完全， 容易造成黄酮成分的损失， 整体收率都不 高。如文献 葛根总黄酮的提取研究 （李增富， 吴荣峰， 应用化工第 37 卷第 11 期） ， 其收率 为 167.974mg/100g 葛根粉， 即 0.17%。 0004 利用植物细胞、 组织或器官培养来获。
12、得对人类有用的次生代谢物已经成为当今植 物生物技术领域的研究热点之一， 其最大优点就是生产完全在人工控制条件下进行， 可以 通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超整株植物收率的代谢产物。 然而影响植物细 胞培养的因素很多， 如培养基成分， 植物本身的特性， 培养条件， 环境条件， 生物因素， 内部 因素等， 尤其是培养基成分则是关键之关键， 其不仅影响机体的生长还影响机体的次生代 谢产物合成。因此， 提供一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法对于开拓黄酮制备新途径 具有重要意义。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法， 使得 该方法能够提高从葛根。
13、中获取黄酮的收率。 0006 为了实现上述目的， 本发明提供如下技术方案 ： 0007 一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法， 将葛根愈伤组织细胞接种在培养基上在 23-27温度、 800-1200lx 光照强度下， 以每天 8-12 小时光照时间培养 15-20 天， 然后分离 获得黄酮 ； 0008 所述培养基由NH4NO3、 KNO3、 MgSO4 7H2O、 CaCl2 2H2O、 KH2PO4、 FeSO4 7H2O、 EDTA-Na2、 说 明 书 CN 103146637 A 3 2/8 页 4 KI、 CoCl26H2O、 H3BO3、 Na2MoO22H2O、 MnSO4H2O。
14、、 CuSO45H2O、 ZnSO47H2O、 6-（苄胺基） 嘌呤、 2,4 二氯苯氧乙酸、 蔗糖、 琼脂组成， pH 值为 5.8。 0009 其中， 所述葛根愈伤组织细胞可通过本领域常规的植物组织培养和愈伤组织培养 操作制备获得， 即通过将葛根外植体进行培养， 然后进行愈伤组织培养后获得， 所述葛根外 植体取自根部。本发明所述葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。 0010 本发明针对现有提取黄酮收率不高的缺陷， 通过细胞培养技术手段， 优化培养条 件和选择优良培养体系对葛根细胞进行培养， 促使其分泌次生代谢物黄酮， 收率得到提升。 0011 作为优选， 所述培养基由以下方法。
15、制备获得 ： 0012 以质量百分浓度计， 配制由 8.25% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余量水组成的第一溶液 ； 0013 配制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 0014 配制由 0.85% 的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 0015 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 0016 配 制 由 0.00415% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H3BO3、 0.00125% 的。
16、 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和 余量水组成的第五溶液 ； 0017 配制由0.5%的肌醇、 0.0025%的烟酸、 0.0025%的盐酸吡哆醇、 0.0005%的盐酸硫氨 素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 0018 分别取第一溶液、 第二溶液、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和第六溶液各 20mL， 然 后加入 6-（苄胺基） 嘌呤、 2,4 二氯苯氧乙酸、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄 胺基） 嘌呤浓度为 10-6M， 2,4 。
17、二氯苯氧乙酸浓度为 1.510-5M， 蔗糖质量百分浓度为 3， 琼脂质量百分浓度为0.75%， 然后调pH值为5.8高压灭菌后即得培养基。 需要说明的是， 本 发明所述培养基并不局限于配制成 1000mL， 本领域技术人员通过参考本发明所述培养基配 制比例， 能够轻易的扩大或缩小所述培养基的规格， 这也在本发明保护范围内。 0019 在本发明培养葛根细胞的过程中， 作为优选， 所述光照强度为 1000lx， 所述光照时 间为 10 小时， 所述温度为 25， 所述培养时间为 16-19 天。 0020 在本发明所述方法的最后， 从培养基中提取分离黄酮属于本领域常规技术手段， 如采用乙醇进行浸。
18、提提取分离。作为优选， 本发明所述分离提取获得黄酮具体为 ： 0021 步骤 1、 收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组织细胞 ： 50-75% 乙醇为 1g:15-35mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 20-60min， 然后过 滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 滤渣进行步骤 2 ； 0022 步骤2、 以滤渣 ： 50-75%乙醇为1g:15-35mL的质量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振 荡 20-60min， 然后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 滤渣重复本步骤 1-3 次 ； 0023 步骤 3、 合并步骤 1 和步骤 2 所获得的所有滤液、。
19、 浓缩并烘干， 即得黄酮。 0024 其中， 作为优选， 步骤1和步骤2所述质量体积比为1g:20mL， 步骤1和步骤2所述 乙醇体积百分数为 60%， 步骤 1 和步骤 2 所述振荡时间为 40min。 0025 根据现有技术的记载 （见背景技术） ， 现有提取葛根总黄酮的收率为 0.17%， 而经 过本发明所述方法获得的黄酮， 其收率将近 0.5%， 相对于现有技术明显得到提高。同时， 本发明还调整培养基部分组分以及用量， 结果显示， 调整后的培养方法获得的黄酮收率为 说 明 书 CN 103146637 A 4 3/8 页 5 0.36%， 表明随意调整培养基成分易使得黄酮收率降低。 0。
20、026 由以上技术方案可知， 本发明通过优化培养条件和选择优良培养体系， 以培养葛 根细胞的生物技术手段来制备黄酮， 收率明显高于现有乙醇浸提法、 水提取法等常规方法 的黄酮收率， 开拓了制备黄酮的新途径。 附图说明 0027 图 1 所示为不同培养基黄酮收率对比试验折线图 ； 0028 其中， 折线 A 代表本发明培养基的黄酮收率， 折线 B 代表对照培养基的黄酮收率， 横坐标表示时间 （天） ， 纵坐标表示黄酮收率 （%） 。 具体实施方式 0029 本发明实施例公开了一种通过培养葛根细胞制备黄酮的方法。 本领域技术人员可 以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有。
21、类似的替换和改动对本 领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较 佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的 产品及方法进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0030 按照本发明所述方法， 将葛根愈伤组织细胞接种在培养基上在 23-27温度、 800-1200lx 光照强度下， 以每天 8-12 小时光照时间培养 15-20 天， 然后分离获得黄酮 ； 0031 所述培养基由NH4NO3、 KNO3、 MgSO4 7H2O、 CaCl2 2H2O、 KH2PO4、 FeSO4 7H2O、 EDTA-N。
22、a2、 KI、 CoCl26H2O、 H3BO3、Na2MoO22H2O、 MnSO4H2O、 CuSO45H2O、 ZnSO47H2O、 6-（苄胺基） 嘌 呤、 2,4 二氯苯氧乙酸、 蔗糖、 琼脂组成， pH 值为 5.8。 0032 其中， 葛根愈伤组织细胞可采用常规细胞培养方法进行制备， 如切取葛根根部外 植体接种到 MS 培养基中进行植物组织培养， 然后将切口处的愈伤组织接种到诱导愈伤组 织的培养基上进行培养获得愈伤组织细胞， 所述诱导愈伤组织的培养基一般由 MS 培养基、 6-BA、 NAA 组成， 属本领域公知。 0033 为了进一步理解本发明， 下面结合实施例对本发明提供的一。
23、种通过培养葛根细胞 制备黄酮的方法进行详细说明。 0034 实施例 1 ： 通过培养葛根细胞制备黄酮 0035 1、 配制培养基 （质量百分浓度） 0036 配制由 8.25% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余量水组成的第一 溶液 ； 0037 配制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 0038 配制由 0.85% 的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 0039 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 0040 配 制 由 0.004。
24、15% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H3BO3、 0.00125% 的 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和 余量水组成的第五溶液 ； 0041 配制由0.5%的肌醇、 0.0025%的烟酸、 0.0025%的盐酸吡哆醇、 0.0005%的盐酸硫氨 素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 说 明 书 CN 103146637 A 5 4/8 页 6 0042 分别取第一溶液、 第二溶液、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和。
25、第六溶液各 20mL， 然 后加入 6-（苄胺基） 嘌呤 （即 6BA） 、 2,4 二氯苯氧乙酸 （即 2,4 D） 、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄胺基） 嘌呤浓度为 10-6M， 2,4 二氯苯氧乙酸浓度为 1.510-5M， 蔗糖 质量百分浓度为 3%（即 30g/1000mL 培养基） ， 琼脂质量百分浓度为 0.75%（即 7.5g/1000mL 培养基） ， 然后调 pH 值为 5.8， 分装到三角烧瓶中， 121、 0.1Mpa 到 0.15Mpa 下灭菌 15min， 冷却凝固后即得培养基。 0043 2、 制备方法 0044 葛根愈伤组织细胞由浙江工商。
26、大学生物工程实验室提供。 0045 将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上， 并在 25温度、 1000lx 光照强度 下， 以每天 10 小时光照时间 （上午 8 时至下午 6 时） 培养 16 天 ； 0046 收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组织细胞 ： 60% 乙醇为 1g:20mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 40min， 然后过滤， 获得滤液和 滤渣， 滤液备用， 滤渣进行如下步骤 ； 0047 以滤渣 ： 60% 乙醇为 1g:20mL 的质量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振荡 40min， 然 后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 此步。
27、获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡 2 次 ； 0048 合并前述个步骤中所获得的所有滤液、 浓缩并烘干， 即得黄酮， 收率为 0.43%。 0049 实施例 2 ： 通过培养葛根细胞制备黄酮 0050 1、 配制培养基 （质量百分浓度） 0051 配制由 8.25% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余量水组成的第一 溶液 ； 0052 配制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 0053 配制由 0.85% 的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 0054 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O。
28、、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 0055 配 制 由 0.00415% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H3BO3、 0.00125% 的 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和 余量水组成的第五溶液 ； 0056 配制由0.5%的肌醇、 0.0025%的烟酸、 0.0025%的盐酸吡哆醇、 0.0005%的盐酸硫氨 素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 0057 分别取第一溶液、 第二溶液、。
29、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和第六溶液各 20mL， 然 后加入 6-（苄胺基） 嘌呤 （即 6BA） 、 2,4 二氯苯氧乙酸 （即 2,4 D） 、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄胺基） 嘌呤浓度为 10-6M， 2,4 二氯苯氧乙酸浓度为 1.510-5M， 蔗糖 质量百分浓度为 3%（即 30g/1000mL 培养基） ， 琼脂质量百分浓度为 0.75%（即 7.5g/1000mL 培养基） ， 然后调 pH 值为 5.8， 分装到三角烧瓶中， 121、 0.1Mpa 到 0.15Mpa 下灭菌 15min， 冷却凝固后即得培养基。 0058 2、 制备方法 。
30、0059 葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。 0060 将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上， 并在 26温度、 1100lx 光照强度 下， 以每天 11 小时光照时间 （上午 8 时至下午 7 时） 培养 17 天 ； 说 明 书 CN 103146637 A 6 5/8 页 7 0061 收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组织细胞 ： 65% 乙醇为 1g:25mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 60min， 然后过滤， 获得滤液和 滤渣， 滤液备用， 滤渣进行如下步骤 ； 0062 以滤渣 ： 65% 乙醇为 1g:25mL 的质。
31、量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振荡 60min， 然 后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡 3 次 ； 0063 合并前述个步骤中所获得的所有滤液、 浓缩并烘干， 即得黄酮， 收率为 0.47%。 0064 实施例 3 ： 通过培养葛根细胞制备黄酮 0065 1、 配制培养基 （质量百分浓度） 0066 配制由 8.25% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余量水组成的第一 溶液 ； 0067 配制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 0068 配制由 0.85% 。
32、的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 0069 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 0070 配 制 由 0.00415% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H3BO3、 0.00125% 的 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和 余量水组成的第五溶液 ； 0071 配制由0.5%的肌醇、 0.0025%的烟酸、 0.0025%的盐酸吡哆醇、 0.0005%的盐酸。
33、硫氨 素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 0072 分别取第一溶液、 第二溶液、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和第六溶液各 20mL， 然 后加入 6-（苄胺基） 嘌呤 （即 6BA） 、 2,4- 二氯苯氧乙酸 （即 2,4 D） 、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄胺基） 嘌呤浓度为 10-6M， 2,4 二氯苯氧乙酸浓度为 1.510-5M， 蔗糖 质量百分浓度为 3%（即 30g/1000mL 培养基） ， 琼脂质量百分浓度为 0.75%（即 7.5g/1000mL 培养基） ， 然后调 pH 值为 5.8， 分装到三角烧瓶中， 121、 0.1。
34、Mpa 到 0.15Mpa 下灭菌 15min， 冷却凝固后即得培养基。 0073 2、 制备方法 0074 葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。 0075 将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上， 并在 27温度、 1200lx 光照强度 下， 以每天 12 小时光照时间 （上午 8 时至下午 8 时） 培养 18 天 ； 0076 收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组织细胞 ： 70% 乙醇为 1g:30mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 50min， 然后过滤， 获得滤液和 滤渣， 滤液备用， 滤渣进行如下步骤 ； 0077 以滤渣 ：。
35、 70% 乙醇为 1g:30mL 的质量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振荡 50min， 然 后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡 1 次 ； 0078 合并前述个步骤中所获得的所有滤液、 浓缩并烘干， 即得黄酮， 收率为 0.47%。 0079 实施例 4 ： 通过培养葛根细胞制备黄酮 0080 1、 配制培养基 （质量百分浓度） 0081 配制由 8.25% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余量水组成的第一 说 明 书 CN 103146637 A 7 6/8 页 8 溶液 ； 0082 配。
36、制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 0083 配制由 0.85% 的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 0084 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 0085 配 制 由 0.00415% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H3BO3、 0.00125% 的 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和 余量水组成的第五溶液 ； 0086。
37、 配制由0.5%的肌醇、 0.0025%的烟酸、 0.0025%的盐酸吡哆醇、 0.0005%的盐酸硫氨 素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 0087 分别取第一溶液、 第二溶液、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和第六溶液各 20mL， 然 后加入 6-（苄胺基） 嘌呤 （即 6BA） 、 2,4 二氯苯氧乙酸 （即 2,4 D） 、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄胺基） 嘌呤浓度为 10-6M， 2,4 二氯苯氧乙酸浓度为 1.510-5M， 蔗糖 质量百分浓度为 3%（即 30g/1000mL 培养基） ， 琼脂质量百分浓度为 0.75%（即 7.5。
38、g/1000mL 培养基） ， 然后调 pH 值为 5.8， 分装到三角烧瓶中， 121、 0.1Mpa 到 0.15Mpa 下灭菌 15min， 冷却凝固后即得培养基。 0088 2、 制备方法 0089 葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。 0090 将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上， 并在 26温度、 1000lx 光照强度 下， 以每天 10 小时光照时间 （上午 8 时至下午 6 时） 培养 19 天 ； 0091 收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组织细胞 ： 75% 乙醇为 1g:35mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 4。
39、0min， 然后过滤， 获得滤液和 滤渣， 滤液备用， 滤渣进行如下步骤 ； 0092 以滤渣 ： 75% 乙醇为 1g:35mL 的质量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振荡 40min， 然 后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡 2 次 ； 0093 合并前述个步骤中所获得的所有滤液、 浓缩并烘干， 即得黄酮， 收率为 0.48%。 0094 实施例 5 ： 通过培养葛根细胞制备黄酮 0095 1、 配制培养基 （质量百分浓度） 0096 配制由 8.25% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余量。
40、水组成的第一 溶液 ； 0097 配制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 0098 配制由 0.85% 的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 0099 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 0100 配 制 由 0.00415% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H3BO3、 0.00125% 的 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和。
41、 余量水组成的第五溶液 ； 0101 配制由0.5%的肌醇、 0.0025%的烟酸、 0.0025%的盐酸吡哆醇、 0.0005%的盐酸硫氨 素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 0102 分别取第一溶液、 第二溶液、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和第六溶液各 20mL， 然 说 明 书 CN 103146637 A 8 7/8 页 9 后加入 6-（苄胺基） 嘌呤 （即 6BA） 、 2,4 二氯苯氧乙酸 （即 2,4 D） 、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄胺基） 嘌呤浓度为 10-6M， 2,4 二氯苯氧乙酸浓度为 1.510-5M， 蔗糖 质量百。
42、分浓度为 3%（即 30g/1000mL 培养基） ， 琼脂质量百分浓度为 0.75%（即 7.5g/1000mL 培养基） ， 然后调 pH 值为 5.8， 分装到三角烧瓶中， 121、 0.1Mpa 到 0.15Mpa 下灭菌 15min， 冷却凝固后即得培养基。 0103 2、 制备方法 0104 葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。 0105 将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上， 并在 23温度、 800lx 光照强度 下， 以每天 8 小时光照时间 （上午 8 时至下午 4 时） 培养 20 天 ； 0106 收集培养基中的愈伤组织细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组。
43、织细胞 ： 50% 乙醇为 1g:15mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 20min， 然后过滤， 获得滤液和 滤渣， 滤液备用， 滤渣进行如下步骤 ； 0107 以滤渣 ： 50% 乙醇为 1g:15mL 的质量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振荡 20min， 然 后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡 3 次 ； 0108 合并前述个步骤中所获得的所有滤液、 浓缩并烘干， 即得黄酮， 收率为 0.46%。 0109 实施例 6 ： 通过培养葛根细胞制备黄酮 0110 1、 配制培养基 （质量百分浓度） 0111 配制由 8.25。
44、% 的 NH4NO3、 9.50% 的 KNO3、 1.85% 的 MgSO47H2O 和余量水组成的第一 溶液 ； 0112 配制由 2.51% 的 CaCl22H2O 和余量水组成的第二溶液 ； 0113 配制由 0.85% 的 KH2PO4和余量水组成的第三溶液 ； 0114 配制由 0.139% 的 FeSO47H2O、 0.187% 的 EDTA-Na2和余量水组成的第四溶液 ； 0115 配 制 由 0.00415% 的 KI、 0.00012% 的 CoCl26H2O、 0.031% 的 H3BO3、 0.00125% 的 Na2MoO22H2O、 0.0845% 的 MnSO4。
45、H2O、 0.00012% 的 CuSO45H2O、 0.043% 的 ZnSO47H2O 和 余量水组成的第五溶液 ； 0116 配制由0.5%的肌醇、 0.0025%的烟酸、 0.0025%的盐酸吡哆醇、 0.0005%的盐酸硫氨 素、 0.01% 的甘氨酸和余量水组成的第六溶液 ； 0117 分别取第一溶液、 第二溶液、 第三溶液、 第四溶液、 第五溶液和第六溶液各 20mL， 然 后加入 6-（苄胺基） 嘌呤 （即 6BA） 、 2,4 二氯苯氧乙酸 （即 2,4 D） 、 蔗糖以及琼脂定容至 1000mL， 其中 6-（苄胺基） 嘌呤浓度为 10-6M， 2,4 二氯苯氧乙酸浓度为 。
46、1.510-5M， 蔗糖 质量百分浓度为 3%（即 30g/1000mL 培养基） ， 琼脂质量百分浓度为 0.75%（即 7.5g/1000mL 培养基） ， 然后调 pH 值为 5.8， 分装到三角烧瓶中， 121、 0.1Mpa 到 0.15Mpa 下灭菌 15min， 冷却凝固后即得培养基。 0118 2、 制备方法 0119 葛根愈伤组织细胞由浙江工商大学生物工程实验室提供。 0120 将葛根愈伤组织细胞接种在灭菌后的培养基上， 并在 24温度、 900lx 光照强度 下， 以每天 9 小时光照时间 （上午 8 时至下午 5 时） 培养 15 天 ； 0121 收集培养基中的愈伤组织。
47、细胞烘干、 粉碎， 然后以愈伤组织细胞 ： 55% 乙醇为 说 明 书 CN 103146637 A 9 8/8 页 10 1g:20mL 的质量体积比， 向愈伤组织细胞中加入乙醇并振荡 30min， 然后过滤， 获得滤液和 滤渣， 滤液备用， 滤渣进行如下步骤 ； 0122 以滤渣 ： 55% 乙醇为 1g:20mL 的质量体积比， 向滤渣中加入乙醇并振荡 30min， 然 后过滤， 获得滤液和滤渣， 滤液备用， 此步获得的滤渣按照此步处理方式重复加乙醇振荡 2 次 ； 0123 合并前述个步骤中所获得的所有滤液、 浓缩并烘干， 即得黄酮， 收率为 0.40%。 0124 实施例 7 ： 对。
48、比试验 0125 调整本发明所述培养基成分中的蔗糖更换为常规碳源 - 葡萄糖， 同时调整 MnSO4 H2O 质量百分浓度为 0.1115%、 盐酸硫氨素质量百分浓度为 0.0025%， 并且去掉 6- （苄 胺基） 嘌呤、 2,4 二氯苯氧乙酸， 一次配方作为对照培养基进行黄酮的制备， 制备方法参照 实施例 1， 结果见表 1 和图 1。 0126 表 1 不同培养基黄酮收率对比试验结果 0127 0128 由表 1 和图 1 可以直观看出， 本发明所述培养方法在第 15-20 天阶段内， 黄酮收率 处于较高水平， 高于其他培养时间， 同时显著高于对照培养基所获得黄酮的收率。 0129 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出， 对 于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行 若干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。 说 明 书 CN 103146637 A 10 1/1 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 103146637 A 11 。