基于液相芯片检测病毒性神经坏死病病毒的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103173571 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173571 A *CN103173571A* (21)申请号 201310116865.X (22)申请日 2013.04.03 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 中华人民共和国烟台出入境检验检 疫局 地址 264000 山东省烟台市北马路 66 号 (72)发明人 尹伟力 方绍庆 刘宁 王颖 许红岩 段效辉 耿金培 李金庆 (74)专利代理机构 北京纪。

2、凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 基于液相芯片检测病毒性神经坏死病病毒的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种基于液相芯片检测病毒性 神经坏死病病毒的方法。本发明提供了辅助鉴定 病毒性神经坏死病病毒的特异引物对， 由序列表 的序列 1 所示的单链 DNA 分子和序列表的序列 2 所示的单链 DNA 分子组成。本发明还保护辅助鉴 定病毒性神经坏死病病毒的引物探针组合物， 由 所述特异引物对和探针 T1 组成 ； 所述探针 T1 的 核苷酸序列如序列表的序列 3 所示。采用本发明 提供的特异引物对鉴定病毒性神经坏死病病毒具 有良好的特异性。采用本发明提供的引。

3、物探针组 合物结合液相芯片鉴定病毒性神经坏死病病毒， 具有特异性好、 灵敏度高、 操作简便、 所需时间短、 不污染环境、 不存在对人的健康威胁， 可以进行高 通量检测的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103173571 A CN 103173571 A *CN103173571A* 1/1 页 2 1. 辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的特异引物对， 由序列表的序列 1 所示的单链 DNA 分子和序。

4、列表的序列 2 所示的单链 DNA 分子组成。 2. 辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的引物探针组合物， 由权利要求 1 所述特异引物对 和探针 T1 组成 ； 所述探针 T1 的核苷酸序列如序列表的序列 3 所示。 3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在制备辅助鉴定病毒 性神经坏死病病毒的试剂盒中的应用。 4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在辅助鉴定病毒性神 经坏死病病毒中的应用。 5. 辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的试剂盒， 包括权利要求 1 所述特异引物对或权利 要求 2 所述引物探针组合物。 6. 一种辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的方法， 包括。

5、如下步骤 ： 以待测病毒的总 RNA 为模板， 用权利要求 1 所述特异引物对进行 RT-PCR 扩增 ； 如果所述 RT-PCR 扩增得到了扩 增产物， 待测病毒为候选的病毒性神经坏死病病毒 ； 如果所述 RT-PCR 扩增没有得到扩增产 物， 待测病毒为候选的非病毒性神经坏死病病毒。 7. 一种辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的方法， 包括如下步骤 ： 以待测病毒的总 RNA 为模板， 用权利要求 1 所述特异引物对进行 RT-PCR 扩增后与权利要求 2 所述引物探针组合 物中的探针 T1 进行杂交， 如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的病毒性神经坏死病病毒， 如果杂交结果为阴性待测病毒为候选。

6、的非病毒性神经坏死病病毒。 权 利 要 求 书 CN 103173571 A 2 1/8 页 3 基于液相芯片检测病毒性神经坏死病病毒的方法 技术领域 0001 本发明涉及辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的引物对、 引物探针组合物以及它们 的应用， 具体涉及基于液相芯片检测病毒性神经坏死病病毒的方法。 背景技术 0002 病毒性神经坏死病 (viral nervous neerosis， VNN) 又称病毒性脑病和视网膜病 (Viral encephazopathy and retinopathy， VER)， 是发生在尖吻鲈、 赤点石斑鱼、 棕点石斑 鱼、 巨石斑鱼、 红鳍多纪魨、 条斑星鲽、 。

7、牙鲆和大菱鲆等多种海水鱼类中一种严重的疾病。 病 毒性神经坏死病是由病毒性神经坏死病病毒引起的。 0003 VNN 的临床症状为 ： 不同程度的神经异常表现和中枢神经组织空泡化， 通常在视 网膜的中心层会出现空泡， 鱼苗受害情况尤为严重。 Hegde等在患病的淡水观赏鱼孔雀花鳍 中也分离出 VNNV， Fukuda 等从七带石斑鱼的成鱼体内检出 VNNV， 表明 VNNV 已经从海水鱼 传到淡水鱼， 从幼鱼传到成鱼。 0004 VNN 已在除非洲以外的世界其它地方迅速蔓延开来， 给各国海水养殖业造成巨大 的损失。因此， 迫切需要建立快速、 灵敏、 准确的牙鲆弹状病毒的检测方法。 0005 目前。

8、鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、 免疫学诊断技术、 分子生物 学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、 组织病理切片及电 镜观察， 操作繁琐、 检测周期长且灵敏度低。免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、 免疫 点杂交， 具有特异性强、 敏感性高的优点， 但步骤繁琐， 不适宜对大量样品进行检测。 分子生 物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应 （PCR） ， 快速、 灵敏， 但是需要进行琼脂糖凝胶电泳 并通过溴化乙锭染色观察结果， 溴化乙锭是致癌物， 对人体和环境有危害， 交叉污染问题比 较严重。 发明内容 0006 本发明的目的是提供辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的引。

9、物对、 引物探针组合物 以及它们的应用， 具体涉及基于液相芯片检测病毒性神经坏死病病毒的方法。 0007 本发明提供了辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的特异引物对， 由序列表的序列 1 所示的单链 DNA 分子和序列表的序列 2 所示的单链 DNA 分子组成。 0008 本发明还提供了辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的引物探针组合物， 由所述特异 引物对和探针 T1 组成 ； 所述探针 T1 的核苷酸序列如序列表的序列 3 所示。 0009 所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于制备辅助鉴定病毒性神经坏死病 病毒的试剂盒。 0010 所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于辅助鉴定病毒性神经坏死病病。

10、毒。 0011 本发明还保护一种辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的试剂盒， 包括所述特异引物 对或所述引物探针组合物。 0012 本发明还保护一种辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的方法， 包括如下步骤 ： 以待 说 明 书 CN 103173571 A 3 2/8 页 4 测病毒的总RNA为模板， 用所述特异引物对进行RT-PCR扩增 ； 如果所述RT-PCR扩增得到了 扩增产物， 待测病毒为候选的病毒性神经坏死病病毒 ； 如果所述 RT-PCR 扩增没有得到扩增 产物， 待测病毒为候选的非病毒性神经坏死病病毒。所述扩增产物的大小可为 250-500bp 之间， 具体可为389bp。 所述待测病毒为病。

11、毒性神经坏死病病毒、 鲤春病毒血症病毒、 传染性 造血器官坏死病毒、 病毒性出血性败血症病毒或传染性胰脏坏死病病毒。 0013 本发明还保护另一种辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒的方法， 包括如下步骤 ： 以 待测病毒的总 RNA 为模板， 用所述特异引物对进行 RT-PCR 扩增后与所述探针 T1 进行杂交， 如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的病毒性神经坏死病病毒， 如果杂交结果为阴性待测 病毒为候选的非病毒性神经坏死病病毒。所述待测病毒为病毒性神经坏死病病毒、 鲤春病 毒血症病毒、 传染性造血器官坏死病毒、 病毒性出血性败血症病毒或传染性胰脏坏死病病 毒。 0014 所述辅助鉴定病毒性神经坏死。

12、病病毒的方法具体包括如下步骤 （液相芯片法） ： 0015 （1） 以待测病毒的总 RNA 为模板， 用所述特异引物对进行 RT-PCR 扩增 ； 0016 （2） 制备微球悬液 0017 将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡 20s， 取 75L（约含 3106个微球） 置 于 1.5mL 离心管中， 10000g 离心 1min， 弃上清 ； 0018 在步骤的离心管中加入 50L0.1mol/LN- 甲基咪唑水溶液 （pH4.5） ， 漩涡混 合， 超声波处理 30-60 秒 （400W 的功率 , 每超声 9 秒停 6 秒） ； 0019 在步骤的离心管中加入 1.0nmol 所述探针 。

13、T1， 漩涡混合 ； 0020 在步骤的离心管中加入 2.5L 碳二亚胺溶液 （碳二亚胺溶液的制备方法 ： 将 10mg 碳二亚胺粉末加入 1.0mL 的灭菌纯水， 现用现配） 充分混匀， 室温避光孵育 30min ； 0021 在步骤的离心管中加入 2.5L 碳二亚胺溶液 （碳二亚胺溶液的制备方法同 上） 充分混匀， 室温避光孵育 30min ； 0022 在步骤的离心管中加入 1.0mL 0.02g/100mL Tween-20 水溶液， 混匀， 10000g 离心 1min， 弃上清 ； 0023 在步骤的离心管中加入 1.0mL 0.1g/100mL SDS 水溶液， 混匀， 1000。

14、0g 离心 1min， 弃上清 ； 0024 在步骤的离心管中加入 100L 0.1mol/L N- 甲基咪唑水溶液 （pH4.5） ， 重 悬， 得到微球悬液 ； 0025 （3） 将步骤 （1） 的产物和步骤 （2） 得到的微球悬液进行杂交即为实验组， 用 TE 缓冲 液代替步骤 （1） 的产物即为对照组 ； 将杂交体系混合均匀后于 98变性 10min， 然后在与杂 交温度相同的温度下孵育 15min， 18000g 离心 2min， 弃上清 ； 然后加入 50L 用 1TMAC 杂 交液稀释至 500 倍体积的 SA-PE， 48 -54（优选为 52） 杂交 15min， 18000。

15、g 离心 2min， 弃上清 ； 然后加入50L 1TMAC杂交液， 漩涡混合使微球重悬， 置于BD FACSArray液相芯 片仪中进行分析 ； 如果 LQRR 3， 检测结果为阳性 ； 如果 LQRR 2， 检测结果为阴性 ； LQRR MFIS/MFIB， MFIS 为实验组的荧光强度中位值， MFIB 为对照组的荧光强度中位值。 0026 RT-PCR 扩增的反应程序 ： 50 30min ； 94 2min ； 94 30sec、 58 30sec、 72 30sec， 30 个循环 ； 72延伸 5min ； 4保温。 0027 液相芯片是一种新型快速检测技术， 集流式细胞术、 纳。

16、米荧光微球、 荧光信号数字 说 明 书 CN 103173571 A 4 3/8 页 5 处理和传统化学发光技术为一体， 具有所需样本量少、 检测周期短的优点。 0028 采用本发明提供的特异引物对鉴定病毒性神经坏死病病毒具有良好的特异性。 采 用本发明提供的引物探针组合物结合液相芯片鉴定病毒性神经坏死病病毒， 除了良好的特 异性外， 还具有灵敏度高、 操作简便、 所需时间短、 不污染环境、 不存在对人的健康威胁， 可 以进行高通量检测的优点。本发明非常适合对进出境水生动物进行检测。 附图说明 0029 图 1 为实施例 2 中的电泳图。 0030 图 2 为杂交温度为 52时， BD FAC。

17、SArray 液相芯片仪的输出图谱。 具体实施方式 0031 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 0032 N- 甲基咪唑 （TE） 、 碳二亚胺购置美国 BD 公司。DL2000 marker 购于大连宝生物 公司。RNA 提取试剂盒 （TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver4.0） ： 大 连宝生物公司， 货。

18、号为 DV819A。RT-PCR 试剂盒 （PrimeScript RT-PCR Kit） ： 大连宝生物 公司， 货号为 DRR014S。表面羧基化的荧光编码微球 ： 美国 BD 公司， 货号为 558578。TMAC （temtrameihyl-ammdnium chloride） ： 美国 Sigma 公司， 货号为 87718 ； 按照产品说明书配 制 1TMAC 杂交液和 1.5TMAC 杂交液。SA-PE（链霉菌抗生物素蛋白藻红蛋白） ： 美国 Sigma 公司， 货号为 S6940。Alphamager TM 2200 凝胶成像系统 ： 美国 AP 公司。梯度 PCR 扩 增仪 。

19、（Eppendorf Mastercycler Gradient） ： 德国 Eppendorf 公司。BDFACSArray 液相芯片 仪 ： 美国 BD 公司。 0033 病毒性神经坏死病病毒(VNNV)， RNA病毒， 参考文献 ： 刘荭;史秀杰;高隆英等.鱼 病毒性神经坏死病病毒 (VNNV) 不同基因型鉴别方法的建立及在 VNN 检疫和监测中的应 用 .J 水产学报 2004(06)。 0034 鲤春病毒血症病毒 （SVCV)， RNA 病毒， 参考文献 ： 付峰 ； 刘荭 ； 黄倢 ； 蔡生力鲤春病 毒血症病毒 (SVCV) 的研究进展 J 中国水产科学 .2006(02)。 00。

20、35 传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） ， RNA 病毒 ： 参考文献 ： 岳志芹 ； 刘荭 ； 梁成珠等 实时定量 RT-PCR 检测鱼类传染性造血器官坏死病毒方法的建立与应用 J. 水生生物学 报 .2008(01)。 0036 病毒性出血性败血症病毒 （VHSV） ， RNA病毒， 参考文献 ： 倪穗;余晓巍;王建平等; 应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒 (VHSV)J 海洋与湖沼 2009(07)。 0037 传染性胰脏坏死病病毒 （IPNV） ， RNA 病毒， 参考文献 ： 徐晔 ; 段宏安 ; 周毅实时荧 光定量 RT-PCR 检测鱼类传染性胰脏坏死病。

21、病毒方法的建立安徽农业科学 2011(11)。 0038 实施例 1、 特异引物对和特异探针的设计 0039 通过大量序列比对和扩增效果比较， 设计用于扩增病毒性神经坏死病病毒的特异 说 明 书 CN 103173571 A 5 4/8 页 6 引物对和特异探针。 0040 特异引物对如下 （靶序列为 389bp） ： 0041 F1（序列表的序列 1） ： 5 -ACGCAAAGGTGAGAAGAAA-3 ； 0042 R1（序列表的序列 2） ： 5 -TTGGGTCAGGCAGGAAGC-3 。 0043 特异探针的核苷酸序列 （序列表的序列 3） 如下 ： 0044 5 -TGTATC。

22、GCTGGAAGATTCGGCT-3 。 0045 实施例 2、 应用特异引物对辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒 0046 分别将病毒性神经坏死病病毒、 鲤春病毒血症病毒、 传染性造血器官坏死病毒、 病 毒性出血性败血症病毒和传染性胰脏坏死病病毒作为待测病毒进行如下实验 ： 0047 1、 采用 RNA 提取试剂盒提取待测病毒的总 RNA。 0048 2、 以步骤 1 得到的总 RNA 为模板， 采用 F1 和 R1 组成的引物对， 采用 RT-PCR 试剂 盒， 在梯度 PCR 扩增仪上进行 RT-PCR 扩增， 得到 RT-PCR 扩增产物。 0049 RT-PCR 扩 增 的 反 应 体 系。

23、 ： 在 0.2mLPCR 反 应 管 中，依 次 加 入 10RT-PCR buffer2.5L、 dNTP（各 2.5mmol/L） 2.0L、 10pmol/L F1 1L、 10pmol/L R1 1L、 Inhibiter0.5L、 AMV XL 0.5L、 AMV Taq(5U/L) 0.25L、 25mmol/L MgCl2 5.0L、 总 RNA 5.0L（约 300ng） ， 加入双蒸水使反应体积达到 25L。以上反应体系中， 除了引物、 总 RNA 和双蒸水， 其它组分均为 RT-PCR 试剂盒的组分。 0050 RT-PCR 扩增的反应程序 ： 50 30min ； 94。

24、 2min ； 94 30sec、 58 30sec、 72 30sec， 30 个循环 ； 72延伸 5min ； 4保温。 0051 3、 将步骤 2 得到的 RT-PCR 扩增产物进行 2% 琼脂糖凝胶电泳。 0052 电泳图见图1， 泳道1至泳道5依次为病毒性神经坏死病病毒、 鲤春病毒血症病毒、 传染性造血器官坏死病毒、 病毒性出血性败血症病毒和传染性胰脏坏死病病毒， 泳道 M 为 DL2000marker。以病毒性神经坏死病病毒的总 RNA 为模板， 采用 F1 和 R1 组成的引物对进 行 RT-PCR， 得到了大小在 250-500bp 之间扩增产物， 其它四种病毒均未得到任何扩。

25、增产物。 将病毒性神经坏死病病毒的扩增产物进行测序， 测序结果表明， 扩增产物的大小为 389bp。 0053 实施例 3、 应用引物探针组合物辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒 0054 一、 引物和探针的制备 0055 制备如下引物和探针 ： 0056 F2 ： 5 -biotin- ACGCAAAGGTGAGAAGAAA-3 ； 0057 R2 ： 5 -biotin- TTGGGTCAGGCAGGAAGC-3 。 0058 探针 T1 ： 5 -NH2-TGTATCGCTGGAAGATTCGGCT-3 。 0059 F2 是在 F1 的 5 末端进行生物素标记得到的， R2 是在 R1 的 。

26、5 末端进行生物素标 记得到的。探针 T1 是在序列表的序列 3 所示单链 DNA 片段的 5 末端进行氨基化修饰得到 的。 0060 二、 液相芯片检测体系的建立 0061 1、 采用 RNA 提取试剂盒提取病毒性神经坏死病病毒的总 RNA。 0062 2、 以步骤 1 得到的总 RNA 为模板， 采用 F2 和 R2 组成的引物对， 采用 RT-PCR 试剂 盒， 在梯度 PCR 扩增仪上进行 RT-PCR 扩增， 得到 RT-PCR 扩增产物。 0063 RT-PCR 扩 增 的 反 应 体 系 ： 在 0.2mLPCR 反 应 管 中，依 次 加 入 10RT-PCR 说 明 书 CN。

27、 103173571 A 6 5/8 页 7 buffer2.5L、 dNTP（各 2.5mmol/L） 2.0L、 10pmol/L F2 1L、 10pmol/L R2 1L、 Inhibiter0.5L、 AMV XL 0.5L、 AMV Taq(5U/L) 0.25L、 25mmol/L MgCl2 5.0L、 总 RNA 5.0L（约 300ng） ， 加入双蒸水使反应体积达到 25L。以上反应体系中， 除了引物、 总 RNA 和双蒸水， 其它组分均为 RT-PCR 试剂盒的组分。 0064 RT-PCR 扩增的反应程序 ： 50 30min ； 94 2min ； 94 30sec。

28、、 58 30sec、 72 30sec， 30 个循环 ； 72延伸 5min ； 4保温。 0065 3、 寡核苷酸探针与微球共价偶联 0066 将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡 20s 以使其充分分散， 取 75L（约含 3106个微球） 置于 1.5mL 离心管中， 10000g 离心 1min， 弃上清。 0067 在步骤的离心管中加入 50L 0.1mol/L N- 甲基咪唑水溶液 （pH4.5） ， 漩涡 混合， 超声波处理 30-60 秒 （400W 的功率 , 每超声 9 秒停 6 秒） 。 0068 在步骤的离心管中加入 1.0nmol 探针 T1， 漩涡混合。 0069。

29、 在步骤的离心管中加入 2.5L 碳二亚胺溶液 （碳二亚胺溶液的制备方法 ： 将 10mg 碳二亚胺粉末加入 1.0mL 的灭菌纯水， 现用现配） 充分混匀， 室温避光孵育 30min。 0070 在步骤的离心管中加入 2.5L 碳二亚胺溶液 （碳二亚胺溶液的制备方法同 上） 充分混匀， 室温避光孵育 30min。 0071 在步骤的离心管中加入 1.0mL 0.02g/100mL Tween-20 水溶液， 混匀， 10000g 离心 1min， 弃上清。 0072 在步骤的离心管中加入 1.0mL 0.1g/100mL SDS 水溶液， 混匀， 10000g 离心 1min， 弃上清。 0。

30、073 在步骤的离心管中加入 100L 0.1mol/L N- 甲基咪唑水溶液 （pH4.5） ， 重悬 微球 （探针已偶联至微球表面） ， 得到微球悬液， 2-8避光保存， 待用。 0074 4、 杂交 0075 实验组的杂交体系 ： 由 1.5L 步骤 3 得到的微球悬液、 33L 1.5TMAC 杂交液、 14.5L TE 缓冲液和 2.5L 步骤 2 得到的 RT-PCR 扩增产物 （即 25 微升 RT-PCR 扩增产物 的十分之一） 组成。 0076 空白对照组的杂交体系 ： 用等体积的TE缓冲液代替RT-PCR扩增产物， 其它同实验 组的杂交体系。 0077 将杂交体系混合均匀后。

31、于 98变性 10min， 然后在与杂交温度相同的温度下孵育 15min， 18000g 离心 2min， 弃上清 ； 然后加入 50L 用 1TMAC 杂交液稀释至 500 倍体积 的 SA-PE， 选定温度下杂交 15min（分别采用 48、 50、 52、 54或 56的杂交温度） ， 18000g 离心 2min， 弃上清 ； 然后加入 50L 1TMAC 杂交液， 漩涡混合使微球重悬， 置于 BD FACSArray 液相芯片仪中进行分析。 0078 每个杂交温度的实验组设置三个重复处理， 每个杂交温度的空白对照组设置三个 重复处理。 0079 每个重复处理中 ： 参与计数的荧光编码。

32、微球均在 100 个以上， 表明用于计算的荧 光编码微球数量有效， 所产生的荧光强度中位值 （MFI） 可信 ； 3 个空白对照组的荧光编码微 球的 MFI 值均小于 500， 试验可进行结果判断。 0080 采 用 48 的 杂 交 温 度， 对 照 组 处 理 的 MFI 为 181， 实 验 组 处 理 的 MFI 为 说 明 书 CN 103173571 A 7 6/8 页 8 546326.9。 0081 采 用 50 的 杂 交 温 度， 对 照 组 处 理 的 MFI 为 176， 实 验 组 处 理 的 MFI 为 594131.5。 0082 采 用 52 的 杂 交 温 度。

33、， 对 照 组 处 理 的 MFI 为 177， 实 验 组 处 理 的 MFI 为 644819.3。 0083 采 用 54 的 杂 交 温 度， 对 照 组 处 理 的 MFI 为 183， 实 验 组 处 理 的 MFI 为 527913.5。 0084 采 用 56 的 杂 交 温 度， 对 照 组 处 理 的 MFI 为 180， 实 验 组 处 理 的 MFI 为 263135.7。 0085 结果表明 ： 采用 48 -54的杂交温度， 实验组处理的 MFI 变动幅度不大， 采用高 于 54的杂交温度时， 实验组处理的 MFI 下降剧烈， 最佳杂交温度为 52。 0086 杂交。

34、温度为 52时， BD FACSArray 液相芯片仪的输出图谱见图 2。图 2 中 ： A ： 荧 光编码微球的数量及范围 ； B ： 采用52的杂交温度， 实验处理组在Red-A、 Yellow-A通道下 的相对荧光强度 ； C ： 采用 52的杂交温度， 实验处理组在 Red-A 通道下相对荧光强度 ； D ： 采用 52的杂交温度， 实验处理组在 Yellow-A 通道下相对荧光强度。从图 2 可以观察到， 偶联在微球上的探针 T1 与病毒性神经坏死病病毒的 RT-PCR 扩增产物在 Red-A、 Yellow-A 检测通道下均有荧光信号， 表明液相芯片构建成功。 0087 三、 液相。

35、芯片检测体系重复性验证 0088 重复进行三次步骤二， 杂交温度均采用 52， 计算各批次间检测得到的 MFI 的变 异系数。结果显示， 变异系数在 4% 以内， 表明步骤二的方法具有良好的可重复性。 0089 四、 液相芯片检测体系的特异性验证 0090 分别将病毒性神经坏死病病毒、 鲤春病毒血症病毒、 传染性造血器官坏死病毒、 病 毒性出血性败血症病毒和传染性胰脏坏死病病毒作为待测病毒进行步骤二， 杂交温度均采 用 52， 结果见表 1。 0091 表 1 特异性检测结果 0092 样本平均荧光强度值 （MFI）LQRR结果 VNNV667546.537.29+ SVCV2216.81.2。

36、3 IHNV20916.31.17 IPNV19517.21.09 VHSV1856.91.03 MFIB179 0093 结果表明， 步骤二的方法对病毒性神经坏死病病毒的检测结果为阳性， 而对其它 四种病毒的检测结果均为阴性， 具有很好的特异性。 说 明 书 CN 103173571 A 8 7/8 页 9 0094 五、 液相芯片检测体系灵敏度验证 0095 1、 采用 RNA 提取试剂盒提取病毒性神经坏死病病毒的总 RNA。 0096 2、 以步骤 1 得到的总 RNA 为模板， 采用 F2 和 R2 组成的引物对， 采用 RT-PCR 试剂 盒， 在梯度 PCR 扩增仪上进行 RT-P。

37、CR 扩增， 得到 RT-PCR 扩增产物。 0097 RT-PCR 扩 增 的 反 应 体 系 ： 在 0.2mL PCR 反 应 管 中， 依 次 加 入 10RT-PCR buffer2.5L、 dNTP（各 2.5mmol/L） 2.0L、 10pmol/L F2 1L、 10pmol/L R2 1L、 Inhibiter0.5L、 AMV XL 0.5L、 AMV Taq(5U/L) 0.25L、 25mmol/L MgCl2 5.0L、 总 RNA 5.0L（含约 100ng、 10ng、 1ng、 100pg、 10pg、 1pg 或 100fg RNA） ， 加入双蒸水使反应体。

38、 积达到 25L。以上反应体系中， 除了引物、 总 RNA 和双蒸水， 其它组分均为 RT-PCR 试剂盒 的组分。 0098 RT-PCR 扩增的反应程序 ： 50 30min ； 94 2min ； 94 30sec、 58 30sec、 72 30sec， 30 个循环 ； 72延伸 5min ； 4保温。 0099 3、 寡核苷酸探针与微球共价偶联 0100 同步骤二的 3。 0101 4、 杂交 0102 同步骤二的 4。杂交温度采用 52。 0103 结果见表 2, 最低检测限为 100pg。 0104 表 2 灵敏度检测结果 0105 RT-PCR 初始时总 RNA 的加入量 0。

39、.1平均荧光强度值 （MFI）LQRR结果 10ng279514.813.37+ 1ng104311.34.99+ 100pg72612.13.47+ 10pg2826.51.35 1pg27116.31.30 100fg18910.70.90 10fg21110.71.01 MFIB209 0106 实施例 4、 应用引物探针组合物辅助鉴定病毒性神经坏死病病毒 （寡核苷酸探针与 微球共价偶联采用常规方法） 0107 1、 同实施例 3 的步骤二的 1。 0108 2、 同实施例 3 的步骤二的 2。 0109 3、 寡核苷酸探针与微球共价偶联 说 明 书 CN 103173571 A 9 8。

40、/8 页 10 0110 同实施例 3 的步骤二的 1 的。 0111 同实施例 3 的步骤二的 1 的。 0112 同实施例 3 的步骤二的 1 的。 0113 在步骤的离心管中加入 5.0L 碳二亚胺溶液 （碳二亚胺溶液的制备方法 ： 将 10mg 碳二亚胺粉末加入 1.0mL 的灭菌纯水， 现用现配） 充分混匀， 室温避光孵育 30min。 0114 同实施例 3 的步骤二的 1 的。 0115 同实施例 3 的步骤二的 1 的。 0116 同实施例 3 的步骤二的 1 的。 0117 4、 杂交 0118 同实施例 3 的步骤二的 4， 杂交温度均采用 52。 0119 MFI 为 319716.8。 说 明 书 CN 103173571 A 10 1/2 页 11 0001 序 列 表 CN 103173571 A 11 2/2 页 12 0002 序 列 表 CN 103173571 A 12 1/2 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 103173571 A 13 2/2 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 103173571 A 14 。