制备降解多氯联苯工程菌株的二羟基联苯双加氧酶基因 技术领域 本发明属微生物基因工程领域， 具体涉及一种制备降解多氯联苯工程菌株的二羟 基联苯双加氧酶基因。
背景技术 多氯联苯 (Polychlorinated biphenyls， PCBs) 是通过联苯直接氯代反应， 形 成的最多带有十个氯元素的复杂化合物 【Furukawa， J Gen Appl Microbiol.2000， 46 ： 283-296】 。通过这样的过程， 理论上可以制造出 209 种同分异构体。PCBs 的热化学稳定 性， 抗氧化性和耐低压等性质使得它们被广泛应用于工业生产中， 包括火焰阻化剂， 石油冷 凝器， 绝缘体， 可塑剂， 热交换器， 以及液压油等。一些研究主要是利用了单个的 PCBs 化合 物， 它们简写为 CBp、 DCBp、 TCBp、 TeCBp、 PeCBp、 HCBp、 HeCBp 和 OCBp， 分别代表了一氯联苯 到八氯联苯 【Jim 和 Field， Environmental Pollution， 2008， 155 ： 1-12】 。1930 年， PCBs 第一次生产了 1000 吨， 但是随着用途的广泛扩大， 制造量也在 1975 年以指数方式达到了 20 万吨的顶峰 【Abraham 等， Curr Opin Microbiol， 2002， 5： 246-253】 。随着工业的生产 和应用， 多氯联苯被持续排放到环境中。由于它们的疏水性， PCBs 非常容易被土壤、 沉淀 物和淤泥中的有机物质所吸收， PCBs 主要被排放到水生环境中 【Wiegel 和 Wu， 2000， FEMS MicrobiologyEcology 32 ： 1-15 ； Jim 和 Field， Environmental Pollution， 2008， 155 ： 1-12】 。另外， 各种 PCBs 化合物的辛醇 / 水分离系数很高， 这就导致了他们很容易被脂肪组 织所吸收。因此， PCBs 对自然环境和人类健康都存在着较大的威胁， 降解和修复 PCBs 污染 迫在眉睫。
生物降解是指从微生物到植物， 或者它们的衍生物通过自身有机体降解污染物的 过程。生物降解主要分为微生物降解、 植物修复、 微生物 - 植物共同修复三个方面。微生 物降解与传统的污染降解技术 ( 例如焚烧 ) 相比， 它的主要优点是降低了大量的费用。不 仅如此， 微生物降解对污染物是永久的降解， 而不像非生物降解一样， 有时污染物会由一种 形态转变为另一种形态， 即二次污染 【Kuiper 等， Mol Plant-Microbe Interact， 2004， 17 ： 6-15】 。因此， 利用微生物降解法来解决多氯联苯的污染问题即经济又实效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种制备降解多氯联苯工程菌株的的二羟 基联苯双加氧酶基因， 以进一步分析该基因在制备降解有机污染物多氯联苯工程微生物中 的作用与功能。
本发明的技术方案如下 ：
所述制备降解多氯联苯工程菌株的二羟基联苯双加氧酶基因， 采用两步连续延伸 PCR 方法合成， 其碱基序列如 SEQ ID No 1 所示， 其编码的蛋白质的氨基酸序列如 SEQ ID No 2 所示。
所述二羟基联苯双加氧酶基因为 RRBPHCI 基因。所述 RRBPHCI 基因其编码阅读框由 888bp 组成， 编码成一个含 295 个氨基酸的蛋白质。 所述的基因用于制备降解多氯联苯工程菌株， 以及用于降解有机污染物多氯联苯 工程微生物。
本发明所述的二羟基联苯， 可以为任意位次的二羟基联苯， 例如 2， 2- 二羟基联 苯， 2， 3- 二羟基联苯， 2， 4- 二羟基联苯， 或者 4， 4- 二羟基联苯等。
本发明有益效果 ：
本发明设计并合成了一种制备降解多氯联苯工程菌株的二羟基联苯双加氧酶基 因 RRBPHCI， 它能在大肠杆菌中成功表达， 可用于制备降解多氯联苯微生物。
附图说明 图 1 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的合成示意图。
图 2 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的扩增产物电泳图， 其中 A 为 RRBPHCI 基因扩增产物。
图 3 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达电泳图， 其中 A 为二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因。
图 4 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物的最适反应 图 5 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物的最适反应 图 6 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物的热稳定性温度图。
pH 图。
图。 图 7 为金属离子对本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物 的影响图。
图 8 为过氧化氢对本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物 的影响图。
图 9 为为十二烷基磺酸钠对本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌 表达产物的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不限于本发明所列举的实施例。
下述实施例中， 所用的试验材料及其来源包括 ：
大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 由上海市农业科学院生物技术研究所植物基 因工程研究室保存。 克隆载体 pMD-18-Simple T、 各类限制性内切酶、 连接酶、 dNTP、 10×PCR buffer 和 DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化 学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA 测序试剂盒购 自美国应用系统公司。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行 【Sambook J， FretsE F， Mannsdes T et al.In ： Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring HarborLaboratoryPress， 1989】 。
实施例 1
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的引物设计和合成
( 一 ) 试验方法 ：
本发明基因合成采取 PTDS 方法 【Xiong’ aisheng 等， 2004， Nucl Acids Res32， e98】 ， 共设计 22 根引物用于基因的合成， 每个引物的长度为 60bp。 参见表 1。 引物两端分别 引入 Bam H I 和 Sac I 的酶切位点。 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成 (http:// www.sangon， com/)。
表1
合成的示意图参见图 1。 其中扩增片段 1(Fragment 1) ： 在 50μl 反应体系中， 内侧 引物 (RRBPHCI-2 ～ RRBPHCI-9) 的添加量为 1.5pmol， 外侧引物 (RRBPHCI-1 和 RRBPHCI-10) 添加量为 30pmol， 扩增条件为 ： 94 ℃预热 10min ； 94 ℃， 30s ； 52 ℃， 30s ； 72 ℃， 30s ； 30 个循 环； 最后 72℃延伸 10min。使用的 Taq DNA 聚合酶为 pyrobest taq 酶 (Takara 公司大连 ) 扩增目的基因。
扩 增 片 段 2(Fragment 1) ： 在 50μl 反 应 体 系 中， 内 侧 引 物 (RRBPHCI-11 ～ RRBPHCI-23) 的 添 加 量 为 1.5pmol， 外 侧 引 物 (RRBPHCI-11 和 RRBPHCI-22) 添 加 量 为 30pmol， 扩增条件为 ： 94 ℃预热 10min ； 94 ℃， 30s ； 52 ℃， 30s ； 72 ℃， 30s ； 30 个循环 ； 最后
72℃延伸 10min。使用的 Taq DNA 聚合酶为 pyrobest taq 酶 (Takara 公司大连 ) 扩增目的 基因。
全长基因的扩增 ： 在 50μl 反应体系中， 扩增片段 1 和扩增片段 2 分别加入 100ng， 最外侧引物 (RRBPHCI-1 和 RRBPHCI-22) 添加量为 30pmol。扩增条件为 ： 94℃预热 10min ； 94℃， 30s ； 52℃， 30s ； 72℃， 1min 30s ； 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min。 使用的 Taq DNA 聚 合酶为 KOD FX taq 酶 (Toyobo 公司日本 ) 扩增目的基因。
PCR 结束后， 1％琼脂糖胶回收， 取 10μL 直接与 T/A 克隆载体相连 ( 大连宝生物公 司 )。4℃连接过夜， 高效转化 DH5α 感受态中。获得阳性克隆。鉴定正确的阳性克隆即为 本发明的二羟基联苯双加氧酶基因， 命名为 RRBPHCI 基因， 并对其进行测序， -20℃保存待 用。
( 二 ) 试验结果 ：
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因扩增产物电泳图参见图 2。其 DNA 序列测定 分析结果表明 ： 本发明设计并合成的制备降解多氯联苯工程菌株的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因开放阅读框为 888bp( 参见 SEQ ID No1)， 其编码的蛋白质共 295 个氨基酸 ( 参 见 SEQ ID No 2)。 实施例 2
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达
( 一 ) 试验方法 ：
上述鉴定正确的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的阳性克隆用 BamH I 和 Sac I 酶切后， 连入相同酶切的载体 pET-28a(NEB 公司 )， 得到重组质粒 pET-RRBPHCI， 并将其转化 大肠杆菌 BL21(DE3)(Novagen 公司 )， 将转化子涂布在 LB 固体培养基中培养 24 小时。用凝 胶 - 蛋白纯化试剂盒 HisTrap HP(Amersham Biosciences 公司 ) 对其进行蛋白表达纯化， SDS-PAGE 电泳检测。
( 二 ) 试验结果 ：
经 SDS-PAGE 电泳检测， 蛋白大小约 31kDa， 与预测值相符 ( 参见图 3)。
实施例 3
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物的酶性质测定
( 一 ) 试验方法 ：
一、 二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物的活力测定
酶活测定采用荧光分析法， 具体操作如下 ： 测定系统总体积为 2mL， 含有 Tris-HCI 缓冲溶液 (50mmol/L， pH8.0)， 加入 100μmol/L 底物 2， 3- 二羟基联苯， 酶反应温度为 30℃。 酶活力单位定义为 ： 每 min 内生成 1μmol 开环产物所需的酶量。
二、 二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物的酶特性的测定
最适反应温度 ： 在不同温度 (20-80℃ ) 下进行酶促反应， 然后按照荧光分析法测 定酶的活性。
最适反应 pH ： 在不同 pH 下进行酶促反应， 然后按照荧光分析法测定酶的活性。
热稳定性 ： 将酶液在温度 60 ℃下处理 30min， 然后加入底物， 在 30 ℃进行酶促反 应， 荧光分析法测定酶的活性。
金属离子的影响 ： 在不同金属离子的缓冲液中进行酶促反应， 然后按照荧光分析
法测定酶的活性。
过氧化氢的影响 ： 在含有不同过氧化氢浓度的缓冲液中进行酶促反应， 然后按照 荧光分析法测定酶的活性。
十二烷基磺酸钠的影响 ： 在含有不同十二烷基磺酸钠浓度的缓冲液中进行酶促反 应， 然后按照荧光分析法测定酶的活性。
( 二 ) 试验结果 ：
二羟基联苯双加氧酶酶活为 80U/mg， 最适反应温度为 40℃ ( 参见图 4)， 最适反应 pH 为 8.0( 参见图 5)， 60℃处理 5 分钟和 30 分钟后分别保留约 20％和 0％的酶活性 ( 参见 图 6)。
金属离子中， 钙离子的存在能够较大幅度的提高酶活性， 而铜、 钴、 镍、 镉、 锰、 铅和 锌对二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物酶活性有强的抑制作用 ( 参见图 7)。
过氧化氢对二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物酶活性 也有强的抑制作用， 在含有 0.001mmol/L 的过氧化氢缓冲液中， 酶活性被抑制达到 85％， 当 缓冲液中含有 0.1mmol/L 的过氧化氢时， 酶活性几乎被完全抑制 ( 参见图 8)。 十二烷基磺酸钠同样也抑制了二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中 的表达产物酶活性。在含有 1mmol/L 的十二烷基磺酸钠缓冲液中， 酶活性约下降 40％ ( 参 见图 9)。
最后应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。
背景技术 多氯联苯 (Polychlorinated biphenyls， PCBs) 是通过联苯直接氯代反应， 形 成的最多带有十个氯元素的复杂化合物 【Furukawa， J Gen Appl Microbiol.2000， 46 ： 283-296】 。通过这样的过程， 理论上可以制造出 209 种同分异构体。PCBs 的热化学稳定 性， 抗氧化性和耐低压等性质使得它们被广泛应用于工业生产中， 包括火焰阻化剂， 石油冷 凝器， 绝缘体， 可塑剂， 热交换器， 以及液压油等。一些研究主要是利用了单个的 PCBs 化合 物， 它们简写为 CBp、 DCBp、 TCBp、 TeCBp、 PeCBp、 HCBp、 HeCBp 和 OCBp， 分别代表了一氯联苯 到八氯联苯 【Jim 和 Field， Environmental Pollution， 2008， 155 ： 1-12】 。1930 年， PCBs 第一次生产了 1000 吨， 但是随着用途的广泛扩大， 制造量也在 1975 年以指数方式达到了 20 万吨的顶峰 【Abraham 等， Curr Opin Microbiol， 2002， 5： 246-253】 。随着工业的生产 和应用， 多氯联苯被持续排放到环境中。由于它们的疏水性， PCBs 非常容易被土壤、 沉淀 物和淤泥中的有机物质所吸收， PCBs 主要被排放到水生环境中 【Wiegel 和 Wu， 2000， FEMS MicrobiologyEcology 32 ： 1-15 ； Jim 和 Field， Environmental Pollution， 2008， 155 ： 1-12】 。另外， 各种 PCBs 化合物的辛醇 / 水分离系数很高， 这就导致了他们很容易被脂肪组 织所吸收。因此， PCBs 对自然环境和人类健康都存在着较大的威胁， 降解和修复 PCBs 污染 迫在眉睫。
生物降解是指从微生物到植物， 或者它们的衍生物通过自身有机体降解污染物的 过程。生物降解主要分为微生物降解、 植物修复、 微生物 - 植物共同修复三个方面。微生 物降解与传统的污染降解技术 ( 例如焚烧 ) 相比， 它的主要优点是降低了大量的费用。不 仅如此， 微生物降解对污染物是永久的降解， 而不像非生物降解一样， 有时污染物会由一种 形态转变为另一种形态， 即二次污染 【Kuiper 等， Mol Plant-Microbe Interact， 2004， 17 ： 6-15】 。因此， 利用微生物降解法来解决多氯联苯的污染问题即经济又实效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种制备降解多氯联苯工程菌株的的二羟 基联苯双加氧酶基因， 以进一步分析该基因在制备降解有机污染物多氯联苯工程微生物中 的作用与功能。
本发明的技术方案如下 ：
所述制备降解多氯联苯工程菌株的二羟基联苯双加氧酶基因， 采用两步连续延伸 PCR 方法合成， 其碱基序列如 SEQ ID No 1 所示， 其编码的蛋白质的氨基酸序列如 SEQ ID No 2 所示。
所述二羟基联苯双加氧酶基因为 RRBPHCI 基因。所述 RRBPHCI 基因其编码阅读框由 888bp 组成， 编码成一个含 295 个氨基酸的蛋白质。 所述的基因用于制备降解多氯联苯工程菌株， 以及用于降解有机污染物多氯联苯 工程微生物。
本发明所述的二羟基联苯， 可以为任意位次的二羟基联苯， 例如 2， 2- 二羟基联 苯， 2， 3- 二羟基联苯， 2， 4- 二羟基联苯， 或者 4， 4- 二羟基联苯等。
本发明有益效果 ：
本发明设计并合成了一种制备降解多氯联苯工程菌株的二羟基联苯双加氧酶基 因 RRBPHCI， 它能在大肠杆菌中成功表达， 可用于制备降解多氯联苯微生物。
附图说明 图 1 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的合成示意图。
图 2 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的扩增产物电泳图， 其中 A 为 RRBPHCI 基因扩增产物。
图 3 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达电泳图， 其中 A 为二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因。
图 4 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物的最适反应 图 5 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物的最适反应 图 6 为本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物的热稳定性温度图。
pH 图。
图。 图 7 为金属离子对本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物 的影响图。
图 8 为过氧化氢对本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌表达产物 的影响图。
图 9 为为十二烷基磺酸钠对本发明的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因大肠杆菌 表达产物的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不限于本发明所列举的实施例。
下述实施例中， 所用的试验材料及其来源包括 ：
大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 由上海市农业科学院生物技术研究所植物基 因工程研究室保存。 克隆载体 pMD-18-Simple T、 各类限制性内切酶、 连接酶、 dNTP、 10×PCR buffer 和 DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化 学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA 测序试剂盒购 自美国应用系统公司。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行 【Sambook J， FretsE F， Mannsdes T et al.In ： Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring HarborLaboratoryPress， 1989】 。
实施例 1
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的引物设计和合成
( 一 ) 试验方法 ：
本发明基因合成采取 PTDS 方法 【Xiong’ aisheng 等， 2004， Nucl Acids Res32， e98】 ， 共设计 22 根引物用于基因的合成， 每个引物的长度为 60bp。 参见表 1。 引物两端分别 引入 Bam H I 和 Sac I 的酶切位点。 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成 (http:// www.sangon， com/)。
表1
合成的示意图参见图 1。 其中扩增片段 1(Fragment 1) ： 在 50μl 反应体系中， 内侧 引物 (RRBPHCI-2 ～ RRBPHCI-9) 的添加量为 1.5pmol， 外侧引物 (RRBPHCI-1 和 RRBPHCI-10) 添加量为 30pmol， 扩增条件为 ： 94 ℃预热 10min ； 94 ℃， 30s ； 52 ℃， 30s ； 72 ℃， 30s ； 30 个循 环； 最后 72℃延伸 10min。使用的 Taq DNA 聚合酶为 pyrobest taq 酶 (Takara 公司大连 ) 扩增目的基因。
扩 增 片 段 2(Fragment 1) ： 在 50μl 反 应 体 系 中， 内 侧 引 物 (RRBPHCI-11 ～ RRBPHCI-23) 的 添 加 量 为 1.5pmol， 外 侧 引 物 (RRBPHCI-11 和 RRBPHCI-22) 添 加 量 为 30pmol， 扩增条件为 ： 94 ℃预热 10min ； 94 ℃， 30s ； 52 ℃， 30s ； 72 ℃， 30s ； 30 个循环 ； 最后
72℃延伸 10min。使用的 Taq DNA 聚合酶为 pyrobest taq 酶 (Takara 公司大连 ) 扩增目的 基因。
全长基因的扩增 ： 在 50μl 反应体系中， 扩增片段 1 和扩增片段 2 分别加入 100ng， 最外侧引物 (RRBPHCI-1 和 RRBPHCI-22) 添加量为 30pmol。扩增条件为 ： 94℃预热 10min ； 94℃， 30s ； 52℃， 30s ； 72℃， 1min 30s ； 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min。 使用的 Taq DNA 聚 合酶为 KOD FX taq 酶 (Toyobo 公司日本 ) 扩增目的基因。
PCR 结束后， 1％琼脂糖胶回收， 取 10μL 直接与 T/A 克隆载体相连 ( 大连宝生物公 司 )。4℃连接过夜， 高效转化 DH5α 感受态中。获得阳性克隆。鉴定正确的阳性克隆即为 本发明的二羟基联苯双加氧酶基因， 命名为 RRBPHCI 基因， 并对其进行测序， -20℃保存待 用。
( 二 ) 试验结果 ：
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因扩增产物电泳图参见图 2。其 DNA 序列测定 分析结果表明 ： 本发明设计并合成的制备降解多氯联苯工程菌株的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因开放阅读框为 888bp( 参见 SEQ ID No1)， 其编码的蛋白质共 295 个氨基酸 ( 参 见 SEQ ID No 2)。 实施例 2
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达
( 一 ) 试验方法 ：
上述鉴定正确的二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因的阳性克隆用 BamH I 和 Sac I 酶切后， 连入相同酶切的载体 pET-28a(NEB 公司 )， 得到重组质粒 pET-RRBPHCI， 并将其转化 大肠杆菌 BL21(DE3)(Novagen 公司 )， 将转化子涂布在 LB 固体培养基中培养 24 小时。用凝 胶 - 蛋白纯化试剂盒 HisTrap HP(Amersham Biosciences 公司 ) 对其进行蛋白表达纯化， SDS-PAGE 电泳检测。
( 二 ) 试验结果 ：
经 SDS-PAGE 电泳检测， 蛋白大小约 31kDa， 与预测值相符 ( 参见图 3)。
实施例 3
二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物的酶性质测定
( 一 ) 试验方法 ：
一、 二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物的活力测定
酶活测定采用荧光分析法， 具体操作如下 ： 测定系统总体积为 2mL， 含有 Tris-HCI 缓冲溶液 (50mmol/L， pH8.0)， 加入 100μmol/L 底物 2， 3- 二羟基联苯， 酶反应温度为 30℃。 酶活力单位定义为 ： 每 min 内生成 1μmol 开环产物所需的酶量。
二、 二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物的酶特性的测定
最适反应温度 ： 在不同温度 (20-80℃ ) 下进行酶促反应， 然后按照荧光分析法测 定酶的活性。
最适反应 pH ： 在不同 pH 下进行酶促反应， 然后按照荧光分析法测定酶的活性。
热稳定性 ： 将酶液在温度 60 ℃下处理 30min， 然后加入底物， 在 30 ℃进行酶促反 应， 荧光分析法测定酶的活性。
金属离子的影响 ： 在不同金属离子的缓冲液中进行酶促反应， 然后按照荧光分析
法测定酶的活性。
过氧化氢的影响 ： 在含有不同过氧化氢浓度的缓冲液中进行酶促反应， 然后按照 荧光分析法测定酶的活性。
十二烷基磺酸钠的影响 ： 在含有不同十二烷基磺酸钠浓度的缓冲液中进行酶促反 应， 然后按照荧光分析法测定酶的活性。
( 二 ) 试验结果 ：
二羟基联苯双加氧酶酶活为 80U/mg， 最适反应温度为 40℃ ( 参见图 4)， 最适反应 pH 为 8.0( 参见图 5)， 60℃处理 5 分钟和 30 分钟后分别保留约 20％和 0％的酶活性 ( 参见 图 6)。
金属离子中， 钙离子的存在能够较大幅度的提高酶活性， 而铜、 钴、 镍、 镉、 锰、 铅和 锌对二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物酶活性有强的抑制作用 ( 参见图 7)。
过氧化氢对二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中的表达产物酶活性 也有强的抑制作用， 在含有 0.001mmol/L 的过氧化氢缓冲液中， 酶活性被抑制达到 85％， 当 缓冲液中含有 0.1mmol/L 的过氧化氢时， 酶活性几乎被完全抑制 ( 参见图 8)。 十二烷基磺酸钠同样也抑制了二羟基联苯双加氧酶 RRBPHCI 基因在大肠杆菌中 的表达产物酶活性。在含有 1mmol/L 的十二烷基磺酸钠缓冲液中， 酶活性约下降 40％ ( 参 见图 9)。
最后应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。
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