一种用于填充与修复受损组织的可注射温敏凝胶 技术领域 本发明涉及一种用于填充与修复受损组织的可注射温敏凝胶的制备方法， 属于医 用材料制造方法技术领域。
背景技术 可注射的填充和修复材料是一种智能高分子材料， 是近十年来发展起来的一个较 新的研究领域， 是智能高分子材料的一个非常热门的研究课题。温敏性可注射的材料与常 规可注射的材料相比， 是利用仿生学的原理， 以自然界中的生物体为蓝本， 开发出在功能上 接近甚至超过生物体组织的温敏高分子材料， 从而实现无生物活性的生物材料向有生物活 性的生物材料的过渡 ； 增大其响应敏感度， 改善其通—断特性。 材料的热力学可逆性使材料 在常温下流动性增强， 利于注射， 而体内温度材料固化， 其定型性和可塑性增强。此外可注 射凝胶在体内与修复组织之间嵌合性好， 实现原位注射达到微创目的， 成为软组织修复、 重 建、 填充的热点。因此， 温敏性可注射的凝胶材料的应用具有显著的优势。
近年来， 面部皮肤充填剂的发展非常迅速， 其产品市场的年增长率为 16.9％， 2012 年则有望超过 16 亿美金， 其中透明质酸产品所占比重最大。在已有的可注射填充物及其 制备方法的技术中， 常采用的注射填充物是交联的透明质酸和胶原蛋白为主的凝胶其盐溶 液。例如 ： 由瑞典 Q-Med 公司开发并生产的透明质酸皮肤填充剂瑞蓝 (restvlane)。
玻尿酸 ( 透明质酸 ) 是一种广泛存在于生物和组织类型的多聚糖。 1934 年哥伦比 亚大学 Karl Meyer 首先发现了透明质酸， 是细胞外基质的主要成分之一， 化学结构上各物 种间无差异。在皮肤中透明质酸是吸附和维持水分的主要结构， 在储存水分及锁水功能方 面， 能有效地吸收储存多达 3000 倍水分体积， 非一般保湿因子所能提供。透明质酸除了可 以使肌肤保持水分、 还可以使眼睛保持润滑、 关节保持弹性。 因此， 透明质酸在眼科手术、 关 节炎治疗和整形手术等领域有着十分优良的使用记录。但是纯 HA 易溶于水、 吸收迅速和在 组织中停留时间短等物理和生物特性， 限制其作为功能成分载体的使用， 需要使用化学交 联修饰， 以增大其分子量、 延长降解时间， 提高稳定性。
但是透明质酸的单纯交联并不能缓解其快速的降解。仍需多次填充达到修复效 果， 因此对患者造成一定的经济负担。 就构建皮肤填充剂和组织修复的材料而言， 材料的热 力学的可逆性是至关重要。 透明质酸虽是促进组织生长的生物材料但是不具备热力学的可 逆性。 本发明制备的一种可注射温敏凝胶， 此凝胶体系具有玻尿酸和壳聚糖的协同作用， 不 光延长了注射部位修复的时间， 而且更易于注射， 并具有抗菌、 抗凝血， 生物体内成型性好 等性质。
发明内容
本发明提供了一种温敏凝胶的制备方法。本发明的显著特征是 ： 壳聚糖经过处理 与化学反应， 引入温敏官能团， 制备温敏凝胶。透明质酸不经过交联直接用高碘酸钠处理， 得到活性醛基， 通过化学反应与壳聚糖上的氨基基团进行反应， 得到具有温敏性能的复合凝胶。该制造方法中， 复合凝胶不需交联聚合， 简化了生产步骤， 节约了生产成本。同时温 敏性质使其在常温下流动性好， 易于注射 ； 生物体内成型性好， 降解缓慢。
为实现上述目的， 本发明的技术方案如下 ：
本发明的目的是提供一种通过化学反应制备温敏复合凝胶的制备方法。
发明人通过接枝上异丙基丙酰胺制备温敏壳聚糖以及活性醛基透明质酸的制备， 通过化学反应制备具有温敏性质的凝胶， 从而具有易注射与持久的性质。
易注射温敏凝胶的制备方法包括以下步骤 ：
(1) 活性醛基透明质酸制备
将原料透明质酸 (HA) 及去离子水配成溶液。加入高碘酸钠水溶液， 在避光、 室温 条件下搅拌反应。加入乙二醇溶液终止未反应的高碘酸钠。
上述原料透明质酸 (HA) 及去离子水配成浓度为为 0.01 ～ 20g/100ml ；
上述高碘酸钠水溶液浓度为 0.1 ～ 10M， 体积为 1 ～ 100ml
(2) 将步骤 (1) 制得的凝胶用无水乙醇浸泡、 洗涤、 抽提， 除去未反应单体及其它 杂质， 然后溶液透析纯化， 冷冻干燥获得纯净的凝胶产物。
(3) 温敏壳聚糖制备 将适量的壳聚糖溶于 1 ～ 98％的乙酸溶液中， 缓慢加入一定量 N- 异丙基丙酰胺 (NIPAAm) 和引发剂， 室温搅拌溶解后， 通入氮气在一定温度下搅拌反应。 将上述反应物用丙 酮沉淀， 过滤。真空干燥， 制得具有温敏性质的凝胶产物 ；
上述添加剂 N- 异丙基丙酰胺 (NIPAAm) 与壳聚糖按质量比为 1 ∶ 90 ～ 90 ∶ 1。
上述引发剂 ： 包括过硫酸钾 (KPS)、 偶氮二异丁腈、 过氧化二酰、 过氧化苯甲酰、 或 过氧化二叔丁基的一种。
上述引发剂与壳聚糖的质量比为 0.02％～ 10％。
(4) 复合凝胶的制备
室温下， 将步骤 (2) 和 (3) 中二种凝胶按一定质量比配成均匀水溶液， 室温下搅拌 反应制备复合凝胶。然后此凝胶溶液透析纯化， 冷冻干燥获得纯净的凝胶产物。将上述二 种凝胶于室温下用缓冲液 PBS 充分溶胀， 配成注射液， 并通过针管， 以恒定速度推动匀化， 得到可注射的水凝胶。
上述复合凝胶中透明质酸与壳聚糖的配比为 1 ∶ 9 ～ 9 ∶ 1
上述复合凝胶与缓冲液 PBS 的浓度为 0.01 ～ 30mg/ml
(5) 对上述共聚方法中的各因素 ( 如不同单体、 引发剂、 温度、 反应时间等 ) 对产物 性能的影响规律进行研究， 采用正交试验法， 对各因素进行评价， 在深入了解影响规律的基 础上， 对合成过程进行计算机模拟。
有益效果 ：
1. 本发明制备易注射温敏凝胶是通过温敏壳聚糖的制备以及活性醛基透明质酸 的制备， 通过化学反应作用下将壳聚糖与透明质酸结合起来， 制得具有温敏性质的凝胶， 制 得的凝胶为常温下流动的液体， 在体内温度下为凝胶态。 具有溶胀性、 温敏性、 易推动性、 抗 菌、 持久性、 生物相容性好等特点， 是一种理想的填充与修复的材料。本发明制备的温敏性 凝胶减少了交联剂对人体及注射部位的损害。该凝胶体系不仅能延长其在体内的存留时 间， 而且可不断刺激机体产生应答， 即促进组织的原位再生修复， 以提高充填质量。同时由
于壳聚糖的加入降低了细菌的侵入以及过敏反应低等优点。 可广泛应用于各种受损器官的 修复物、 愈合用器材、 假体、 体内植入物、 药物释放体系和医疗与美容等方面。
2. 复合凝胶具有高纯度、 无毒害、 无刺激性、 化学稳定性好、 降解、 不引起炎症、 无 过敏反应、 生物相容性好、 不致癌、 重金属含量低、 PH 值小， 不引起溶血和凝血等性能。复合 凝胶还应该具有所需的物理、 力学性能和加工性能、 并能经受高温消毒处理。
3. 复合凝胶的协同作用， 具有一定强度和抗弯刚度， 能抵抗人体缺损体压的组织 修补能力。 另外， 单纯交联透明质酸得到的凝胶， 由于其半衰期短， 快速降解。 因此需要多次 注射， 需要较大的经济成本。 但是复合凝胶由于壳聚糖的抗菌性， 有利于受创部位的愈合而 不易引起受创部位的感染。同时由于其具有温敏性质具有较好的可注射性和生物相容性。 而其较长的半衰期使其具有长久性， 不需多次注射， 降低患者的经济压力与多次注射痛苦。 另外由于复合凝胶是可降解的， 当注射部位发生变形或不理想时， 可用溶解酶溶化， 不需经 手术去除， 减少患者的痛苦。 附图说明
图 1 是本发明实施例 2 制备出的可注射的温敏凝胶反应示意图。
图 2 是本发明实施例 2 制备出的可注射的温敏凝胶的红外光谱图。
图 3 是本发明实施例 2 制备出的可注射的温敏凝胶的相变分析图。
图 4 是本发明实施例 2 制备出的可注射的温敏凝胶的溶胀动力学曲线。 具体实施方式
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
实施例 1
(1) 活性醛基透明质酸的制备 ：
将原料透明质酸及去离子水按配比 0.01g/100ml 混合， 加入 0.1M， 100mL 的高碘酸 钠水溶液， 在室温下避光搅拌反应后加入乙二醇溶液， 在常温下搅拌反应， 制得醛基透明质 酸；
(2) 将制得的凝胶用无水乙醇浸泡、 洗涤、 抽提， 除去未反应单体及其它杂质， 然后 溶液透析纯化， 冷冻干燥获得得到纯净的凝胶产物 ；
(3) 温敏壳聚糖制备 ：
将 0.2g 的 CS 溶于 1％的乙酸溶液中， 缓慢加入 0.2g N- 异丙基丙酰胺 (NIPAAm) 和 4mg 过硫酸钾 (KPS)， 室温搅拌溶解后， 通入氮气搅拌反应。 将上述反应物用丙酮沉淀， 过 滤。真空干燥， 制得具有温敏性质的凝胶产物 ；
(4) 复合凝胶的制备 ：
(4.1) 室温下， 将步骤 (2) 得到的透明质酸凝胶和步骤 (3) 得到的温敏壳聚糖凝 胶， 将上述二种凝胶透明质酸与壳聚糖按质量比 1/9 配成 20mg/mL 的水溶液， 室温下搅拌反 应， 制备复合凝胶 ；(4.2) 将上述步骤 (4.1) 的凝胶溶液透析纯化， 冷冻干燥获得纯净的凝胶产物。 将 上述二种凝胶于室温下用缓冲液 PBS 配制成浓度为 1mg/ml 的溶液充分溶胀， 并通过 2.5ml 的针管， 以恒定速度推动匀化 3 遍。得到可注射的水凝胶。
实施例 2
(1) 活性醛基的透明质酸的制备 ：
将原料透明质酸及去离子水按配比 1g/100ml 混合， 加入 0.5M， 5mL 的高碘酸钠水 溶液， 在室温下避光搅拌反应， 反应结束后加入乙二醇溶液， 在常温下搅拌反应。制得透明 质酸凝胶 ；
(2) 将制得的凝胶用无水乙醇浸泡、 洗涤、 抽提， 除去未反应单体及其它杂质， 然后 溶液透析纯化， 冷冻干燥获得得到纯净的凝胶产物 ；
(3) 温敏壳聚糖制备 ：
将 0.2g 的壳聚糖溶于 5％的乙酸溶液中， 缓慢加入 2g N- 异丙基丙酰胺 (NIPAAm) 和 4mg 偶氮二异丁腈， 室温搅拌溶解后， 通入氮气搅拌反应。将上述反应物用丙酮沉淀， 过 滤。真空干燥， 制得具有温敏性质的凝胶产物 ；
(4) 复合凝胶的制备 ： (4.1) 室温下， 将步骤 (2) 得到的透明质酸和步骤 (3) 得到的温敏壳聚糖凝胶， 将 上述二种凝胶透明质酸与壳聚糖按质量比 1/9 配成 20mg/ml 的水溶液， 室温下反应制备复 合凝胶 ；
(4.2) 将上述步骤 (4.1) 的凝胶溶液透析纯化， 冷冻干燥获得纯净的凝胶产物。 将 上述二种凝胶于室温下用缓冲液 PBS 配制成浓度为 20mg/ml 的溶液充分溶胀， 并通过 2.5ml 的针管， 以恒定速度推动匀化 3 遍。得到可注射的水凝胶。
实施例 3
(1) 活性醛基的透明质酸的制备 ：
将原料透明质酸及去离子水按配比 20g/100ml 混合， 加入 10M， 100ml 的高碘酸钠 水溶液， 在室温下避光搅拌反应， 反应结束后加入乙二醇溶液， 在常温下搅拌反应。制得透 明质酸凝胶 ；
(2) 将制得的凝胶用无水乙醇浸泡、 洗涤、 抽提， 除去未反应单体及其它杂质， 然后 溶液透析纯化， 冷冻干燥获得得到纯净的凝胶产物 ；
(3) 温敏壳聚糖制备 ：
将 0.2g 的 CS 溶于 98％乙酸溶液中， 缓慢加入 18g N- 异丙基丙酰胺 (NIPAAm) 和 1mg 过硫酸钾 (KPS)， 室温搅拌溶解后， 通入氮气搅拌反应。将上述反应物用丙酮沉淀， 过 滤。真空干燥， 制得具有温敏性质的凝胶产物 ；
(4) 复合凝胶的制备 ：
(4.1) 室温下， 将步骤 (2) 得到的透明质酸和步骤 (3) 得到的温敏壳聚糖凝胶， 将 上述二种凝胶透明质酸与壳聚糖按质量比 5/5 配成 20mg/ml 的水溶液， 室温下搅拌反应， 制 备复合凝胶 ；
(4.2) 将上述步骤 (4.1) 的凝胶溶液透析纯化， 冷冻干燥获得纯净的凝胶产物。 将 上述二种凝胶于室温下用缓冲液 PBS 配制成浓度为 50mg/ml 的溶液充分溶胀， 并通过 2.5ml 的针管， 以恒定速度推动匀化 3 遍。得到可注射的水凝胶。
实施例 4
(1) 活性醛基透明质酸的制备 ：
将原料透明质酸及去离子水按配比 10 ∶ 100 混合， 加入 0.5M， 50ml 的高碘酸钠水 溶液， 在室温下避光搅拌反应， 反应结束后加入乙二醇溶液， 在常温下搅拌反应。制得透明 质酸凝胶 ；
(2) 将制得的凝胶用无水乙醇浸泡、 洗涤、 抽提， 除去未反应单体及其它杂质， 然后 溶液透析纯化， 冷冻干燥获得得到纯净的凝胶产物 ；
(3) 温敏壳聚糖制备 ：
将 0.2g 的 CS 溶于 20％的乙酸溶液中， 缓慢加入 2g N- 异丙基丙酰胺 (NIPAAm) 和 2g 过氧化苯甲酰， 室温搅拌溶解后， 通入氮气搅拌反应。将上述反应物用丙酮沉淀， 过滤。 真空干燥， 制得具有温敏性质的凝胶产物 ；
(4) 复合凝胶的制备 ：
(4.1) 室温下， 将步骤 (2) 得到的透明质酸和步骤 (3) 得到的温敏壳聚糖凝胶， 将 上述二种凝胶透明质酸与壳聚糖按质量比 5/5 配成 1mg/ml 的水溶液， 室温下搅拌反应， 制 备复合凝胶 ； (4.2) 将上述步骤 (4.1) 的凝胶溶液透析纯化， 冷冻干燥获得纯净的凝胶产物。 将上述二种凝胶于室温下用缓冲液 PBS 配制成浓度为 0.01mg/ml 的溶液充分溶胀， 并通过 2.5ml 的针管， 以恒定速度推动匀化 3 遍。得到可注射的水凝胶。
实施例 5
(1) 活性醛基的透明质酸的制备 ：
将原料透明质酸及去离子水按配比 1 ∶ 100mg/ml 混合， 加入 0.5M， 5mL 的高碘酸 钠水溶液， 在室温下避光搅拌反应， 反应结束后加入乙二醇溶液， 在常温下搅拌反应。制得 透明质酸凝胶 ；
(2) 将制得的凝胶用无水乙醇浸泡、 洗涤、 抽提， 除去未反应单体及其它杂质， 然后 溶液透析纯化， 冷冻干燥获得得到纯净的凝胶产物 ；
(3) 温敏壳聚糖制备 ：
将 0.2g 的 CS 溶于 50％的乙酸溶液中， 缓慢加入 2g N- 异丙基丙酰胺 (NIPAAm) 和 4mg 过硫酸钾 (KPS)， 室温搅拌溶解后， 通入氮气搅拌反应。将上述反应物用丙酮沉淀， 过 滤。真空干燥， 制得具有温敏性质的凝胶产物 ；
(4) 复合凝胶的制备 ：
(4.1) 室温下， 将步骤 (2) 得到的透明质酸和步骤 (3) 得到的温敏壳聚糖凝胶， 将 上述二种凝胶透明质酸与壳聚糖按质量比 5/5 配成 20mg/ml 的水溶液， 室温下搅拌反应， 制 备复合凝胶 ；
(4.2) 将上述步骤 (4.1) 的凝胶溶液透析纯化， 冷冻干燥获得纯净的凝胶产物。 将 上述二种凝胶于室温下用缓冲液 PBS 配制成浓度为 50mg/ml 的溶液充分溶胀， 并通过 2.5ml 的针管， 以恒定速度推动匀化 3 遍。得到可注射的水凝胶。