作为 TRPM8 调节剂的硫酰胺 相关专利申请的交叉引用 不适用。技术领域
本发明涉及用作 TRPM8 受体调节剂的硫酰胺类。本发明还涉及用于制备硫酰胺类 的方法及其用于治疗多种疾病、 综合征和障碍的用途， 包括造成发炎或神经性疼痛、 寒冷耐 受不良或冷痛敏、 外周血管疼痛、 搔痒、 尿失禁、 慢性阻塞性肺部疾病 (COPD)、 肺动脉高压和 焦虑症的那些， 包括其它压力 - 相关障碍， 以及它们的组合。背景技术
瞬时受体电位 (TRP) 通道是由多种刺激激活的非选择性阳离子通道。至今已鉴 定出离子通道家族的许多成员， 包括冷 - 薄荷醇受体， 也称为 TRPM8(McKemy D.D. 等人， Nature 2002， 416(6876)， 52-58)。总体上， TRP 通道及相关的 TRP 样受体意味着对完整连 续性热暴露的感觉响应， 选择性地响应介于有害热至有害冷之间的阈值温度以及响应模拟 这些感觉的某些化学物质。特定而言， TRPM8 可受到冷至热温度以及化学药剂如薄荷醇与 伊西林素 (icilin) 的刺激， 其为这些药剂引起的治疗性冷却感觉的原因。
TRPM8 位于初级伤害感受神经元 (A-δ 纤维和 C- 纤维 ) 上， 并且也受到炎症 介 导 的 第 二 信 使 信 号 的 调 控 (Abe， J. 等 人， Neurosci Lett 2006， 397(1-2)， 140-144 ； Premkumar， L.S. 等 人， J.Neurosci， 2005， 25(49)， 11322-11329)。TRPM8 位 于 A-δ 纤 维 和 C- 纤维两者上可能为病理学状况中的异常冷敏感提供基础， 在病理学状况中这些神 经元被改变， 从而导致疼痛， 常为烧灼性质的疼痛 (Kobayashi， K. 等人， J Comp Neurol， 2005， 493(4)， 596-606 ； Roza， C. 等人， Pain， 2006， 120(1-2)， 24-35 ； 以及 Xing， H.， 等人， J Neurophysiol， 2006， 95(2)， 1221-30)。 由化学致冷或热致冷诱导的寒冷耐受不良和反常烧 灼感与广泛范围的临床病症中所见的症状极度相似， 因而提供了用于开发 TRPM8 调节剂作 为新型抗痛觉过敏剂或抗异常性疼痛剂的有力理论根据。 TRPM8 也已知是在脑、 肺、 膀胱、 肠 胃道、 血管、 前列腺和免疫细胞中表达， 从而提供了治疗性调节广泛范围的疾病的可能性。
来自 Bayer Healthcare AG 的国际专利申请 WO 2006/040136 A1 中据称描述了用 于治疗泌尿疾病的作为冷薄荷醇受体 -1(CMR-1) 拮抗剂的经取代的 4- 苄氧基 - 苯基甲基 酰胺衍生物。来自 Bayer Healthcare AG 的国际专利申请 WO 2006/040103 A1 据称描述了 用于治疗和 / 或预防呼吸系统疾病或障碍的方法和药物组合物。 来自 Bayer HealthCare AG 的国际专利申请 WO 2007/017092A1、 WO 2007/017093A1 和 WO 2007/017094A1 据称描述了 用于治疗与冷薄荷醇受体 (CMR)( 又名 TRPM8) 相关的疾病的苄氧基苯基甲基氨基甲酸酯、 经取代的 2- 苄氧基苯甲酰胺和经取代的 4- 苄氧基苯甲酰胺衍生物。
本领域中仍存在对可用于治疗哺乳动物中的疾病、 综合征或病症的 TRPM8 拮抗剂 的需求， 其中所述疾病、 综合征或病症是受 TRPM8 受体调节的影响， 例如疼痛、 造成这类疼 痛的疾病以及肺或血管功能障碍。发明内容
本发明尤其提供式 (I) 化合物以及它们的对映体、 非对映体、 溶剂化物及可药用盐
其中Y是：
(i)H ；
(ii) 溴 ；
(iii) 氯 ；
(iv) 氟 ；
(v) 碘 ；
(vi)C3-6 环烷基 ； 或
(vii)C1-6 烷基 ；
R1 为 ：
(i)C3-6 环烷基 ；
(ii) 被一个 C6-10 芳基且任选被一个选自羟基和氧代基的额外取代基取代的 C1-6 烷 基， 其中所述 C6-10 芳基任选被 1 至 3 个取代基取代， 所述取代基独立地选自氯、 氟、 溴、 C1-4 烷 基、 任选被 1 至 3 个氟取代基取代的 C1-4 烷氧基、 羟基、 C1-4 烷氧基羰基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲 基硫基、 氰基、 三氟甲基、 氨基羰基、 C1-3 烷基氨基羰基、 二 (C1-3) 烷基氨基羰基、 任选被 1 至 3 个氟取代基取代的 C1-3 烷基磺酰基、 硝基、 氨基、 C1-3 烷基氨基、 二 (C1-3) 烷基氨基和 C1-3 烷 基羰基 ； 其前提条件是所述取代基中不超过两个选自被 1 至 3 个氟取代基取代的 C1-4 烷氧 基、 C1-4 烷氧基羰基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基、 氨基羰基、 C1-3 烷基氨基羰 基、 二 (C1-3) 烷基氨基羰基、 任选被 1 至 3 个氟取代基取代的 C1-3 烷基磺酰基、 硝基、 氨基、 C1-3 烷基氨基、 二 (C1-3) 烷基氨基和 C1-3 烷基羰基 ；
(iii) 被苯基取代的 C1-6 烷基， 其中苯基被 4 或 5 个氟取代基取代 ； 或苯基被甲氧 基和 3 至 4 个氟取代基取代 ；
(iv) 任选被 C3-6 环烷基或三氟甲基取代的 C1-6 烷基 ； 或
(v) 被 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基、 2， 2- 二 氟 - 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基或 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二氧杂环己烯 (dioxin)-6- 基取代的亚甲基 ； 2
R 为(i) 氢，
(ii) 氟，
(iii) 氯，
(iv) 甲氧基， 或
(v) 甲基 ；
R3 为 ：
(i) 氢，
(ii) 氟，
(iii) 氯， 或
(iv) 甲基 ；
R4 为 ：
(i) 氢，
(ii)C1-6 烷基，
(iii) 三氟甲基，
(iv)C1-4 烷氧基，
(v) 溴，
(vi) 氯，
(vii) 氟， 或
(viii) 羟基 ；
RA 是在末端碳原子被取代基取代的 C1-6 烷基， 所述取代基选自羧基、 C1-4 烷氧基羰 基、 C1-3 烷氧基和羟基 ；
RB 是氢或 C1-6 烷基 ；
或者， RA 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成含有一个杂原子的 6 元环， 所 述杂原子选自 O、 S 和 S(O2) ； A
或者， R 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成可任选含有一个额外 N 原子的 5 元或 6 元环， 以形成
(i) 哌嗪 -1- 基， 其中哌嗪基氮被 RC 取代 ；
(ii) 吡咯烷 -1- 基， 其任选在 3- 位被 NRDRE 取代 ； 其中 RD 和 RE 独立地选自氢和 C1-4 烷基 ； 或者， RD 和 RE 与它们二者均连接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ； 或者
(iii) 哌啶 -1- 基， 其任选被羧基、 C1-3 烷氧基羰基或 C1-4 烷基取代， 所述 C1-4 烷基 在末端碳原子被选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基的取代基取代 ；
或哌啶基任选在 4- 位被以下基团取代 ：
(i)C(O)NRYRZ ； 其中 RY 是氢或 C1-6 烷基 ； 并且 RZ 是氢或任选被氨基、 C1-2 烷基氨基 Y Z 或二 (C1-2 烷基 ) 氨基取代的 C1-6 烷基 ； 或者， R 和 R 与它们二者均连接的氮原子合在一起 形成 5 元或 6 元环， 并且所述 6 元环可任选含有 O 或 4-N( 甲基 ) ； H J
(ii)NR R ； 其中 RH 和 RJ 独立地选自氢和 C1-4 烷基， 或者， RH 和 RJ 与它们二者均连 接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ； 或者
(iii) 经由所述环的碳原子结合的螺环稠合的吡咯烷基环， 其中吡咯烷基氮原子 任选被 C1-4 烷基、 C3-6 环烷基 (C1-3) 烷基或 CH2CF3 取代 ；并且其中哌啶基环任选苯并稠合而形成 1， 2， 3， 4- 四氢 - 异喹啉 -1- 基， 其中所述 1， 2， 3， 4- 四氢 - 异喹啉 -1- 基任选在所述环的杂环基部分上被 1 至 2 个独立地选自甲基和 氟的取代基取代 ；
或者， 所述 1， 2， 3， 4- 四氢 - 异喹啉 -1- 基的杂环基部分未被取代， 并且所述环的 苯并部分任选被 1 至 2 个取代基取代， 所述取代基独立地选自氟、 氯、 溴、 碘、 甲基、 三氟甲 基、 氰基、 乙氧基羰基、 羧基和甲氧基 ； 前提条件是所述取代基中不超过一个是羧基或乙氧 基羰基 ；
RC 是
(i) 氢 ；
(ii)C1-8 烷基 ；
(iii)C3-6 环烷基 ；
(iv)C3-6 环烷基 (C1-4) 烷基 ；
(v)CH2CF3 ；
(vi) 任选独立地被 1 至 2 个选自甲基、 甲氧基、 氯、 氟和三氟甲基的取代基取代的 苯基 ；
(vii)C(O)R1a， 其中 R1a 是 C1-6 烷基， C3-6 环烷基或苯基 ； 或者 2a 2a
(viii)SO2R ， 其中 R 是甲基或苯基。
本发明还特别提供了一种药物组合物， 该药物组合物包含下列物质、 由下列物质 组成和 / 或基本上由下列物质组成 ： 可药用载体、 可药用赋形剂和 / 或可药用稀释剂以及式 (I) 化合物或其可药用盐形式。
还提供了用于制备药物组合物的方法， 该方法包括如下步骤、 由如下步骤组成和 / 或基本上由如下步骤组成 ： 将式 (I) 化合物与可药用载体、 可药用赋形剂和 / 或可药用稀释 剂混合。
本发明还特别提供了用式 (I) 的化合物治疗或改善受试者 ( 包括哺乳动物和 / 或 人 ) 中的 TRPM8 调节的疾病的方法， 其中所述疾病、 综合征或病症受 TRPM8 受体调节的影 响， 例如疼痛、 造成这类疼痛的疾病以及肺或血管功能障碍。具体来讲， 本发明的方法涉及 用式 (I) 化合物治疗或改善 TRPM8 受体调节的疾病， 包括炎性疼痛、 寒冷耐受不良或冷性异 常性疼痛、 外周血管疼痛、 搔痒、 尿失禁、 慢性阻塞性肺疾病、 肺动脉高压和焦虑症， 包括其 他应激相关的障碍。
本发明还特别提供了用于制备本发明化合物及其药物组合物和药剂的方法。 具体实施方式
术语 “独立地” 意指在可能有不止一种这类取代基时， 这种取代基可彼此相同或不 同。
不论是单独使用还是作为取代基的部分使用， 术语 “烷基” 指具有 1 至 8 个碳原子 或该范围内的任何数目的碳原子的直链或分支碳链。因此， 碳原子的指定数目 ( 如 C1-8) 应 独立地指烷基部分中的碳原子数目或指较大的含有烷基的取代基的烷基部分的碳原子数 目。在具有多个烷基的取代基如 (C1-6 烷基 )2 氨基 - 中， 该二烷基氨基的 C1-6 烷基可相同或 不同。术语 “烷氧基” 指 O- 烷基取代基， 其中烷基是如上面所定义的。就取代方面来讲， 烷基和烷氧基链可在碳原子上被取代。
术语 “烯基” 和 “炔基” 指具有 2 个或更多个碳原子的直链和分支碳链， 其中烯链 在链中具有至少一个双键， 炔链在链中具有至少一个三键。
术语 “环烷基” 指 3 至 14 个碳原子成员的饱和的或部分不饱和的、 单环或多环烃 环。这种环的例子包括但不限于环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基、 环庚基和金刚烷基。类似 地， “环烯基” 指在环中含有至少一个双键的环烷基。另外， “苯并稠合的环烷基” 是稠合至 苯环的环烷基。 “杂芳基稠合的环烷基” 是稠合至 5 元或 6 元杂芳环 ( 含有 O、 S 或 N 中的一 者， 并且任选含有一个额外的氮 ) 的环烷基环。
术语 “杂环基” 指 5 元至 7 元 ( 其中 1 至 2 个成员为氮 ) 的非芳族环， 或 5 元至 7 元 ( 其中零个、 一个或两个成员是氮并且最多两个成员是氧或硫 ) 的非芳族环 ； 其中任选 地， 环含有零个至一个不饱和键， 并且任选地， 当环含具有 6 个或 7 个成员时， 其含有最多两 个不饱和键。本文所用的 “苯并稠合的杂环基” 包括稠合至苯环的 5 元至 7 元单环杂环。本 文所用的 “杂芳基稠合的杂环基” 指稠合至 5 元或 6 元杂芳环 ( 含有 O、 S 或 N 中的一者， 并 且任选含有一个额外的氮 ) 的 5 元至 7 元单环杂环。本文所用的 “环烷基稠合的杂环基” 指 稠合至 5 元至 7 元环烷基环或环烯基环的 5 元至 7 元单环杂环。此外， 本文所用的 “杂环基 稠合的杂环基” 指稠合至 5 元至 7 元杂环 ( 具有同上的相同定义， 但没有进一步稠合的环的 选项 ) 的 5 元至 7 元单环杂环。对于本发明的化合物， 形成杂环基环的碳原子环员是完全 饱和的。本发明的其他化合物可具有部分饱和的杂环基环。本文所用的 “杂环基” 还包括 桥接而形成双环的 5 元至 7 元单环杂环。这类化合物不认为是完全芳族的并且不称为杂芳 族化合物。杂环基包括但不限于吡咯啉基 ( 包括 2H- 吡咯、 2- 吡咯啉基或 3- 吡咯啉基 )、 吡咯烷基、 2- 咪唑啉基、 咪唑烷基、 2- 吡唑啉基、 吡唑烷基、 哌啶基、 吗啉基、 硫代吗啉基和 哌嗪基。
术语 “芳基” 指具有 6 个碳员的不饱和的芳族单环或指具有 10 至 14 个碳员的不 饱和的芳族多环。这类芳环的例子包括且不限于苯基、 萘基或蒽基。用于实践本发明的优 选芳基是苯基和萘基。
术语 “杂芳基” 指 5 元或 6 元的芳环， 其中环由碳原子组成并且具有至少一个杂原 子成员。适合的杂原子包括 N、 O 或 S。就 5 元环而言， 杂芳环包含 N、 O 或 S 中的一个成员， 此外可含有最多 3 个额外的氮原子。就 6 元环而言， 杂芳环可含有 1 至 3 个氮原子。在其 中 6 元环具有三个氮原子的情况下， 至多两个氮原子为相邻的。
可任选的是， 杂芳基环融合至苯环而形成 “苯并稠合的杂芳基” ； 类似地， 杂芳基环 任选稠合至 5 元或 6 元杂芳基环 ( 含有 O、 S 或 N 中的一者， 任选地， 含有一个额外的氮原 子 ) 以形成 “杂芳基稠合的杂芳基” ； 类似地， 杂芳基环任选稠合至 5 元至 7 元环烷基环或 5 元至 7 元杂环 ( 如上文所定义， 但缺少进一步稠合的环的选项 ) 以形成 “环烷基稠合的杂 芳基” 。杂芳基的例子包括但不限于呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 唑基、 噻唑基、 咪唑基、 吡唑 基、 噻唑基、 异噻唑基、 二唑基、 三唑基、 噻二唑基、 吡啶基、 哒嗪基、 嘧啶基或吡嗪基 ； 具有 任选稠合的苯环的杂芳基的例子包括吲哚基、 异吲哚基、 二氢吲哚基、 苯并呋喃基、 苯并噻 吩基、 吲唑基、 苯并咪唑基、 苯并噻唑基、 苯并 唑基、 苯并异 唑基、 苯并噻二唑基、 苯并三 唑基、 喹嗪基、 喹啉基、 异喹啉基或喹唑啉基。术语 “芳烷基” 意指用芳基取代的烷基 ( 如苄基、 苯乙基 )。类似地， “芳基烷氧基” 指用芳基取代的烷氧基 ( 如苄氧基 )。
术语 “卤素” 指氟、 氯、 溴和碘。用多个卤素取代的取代基是以可提供稳定的化合 物的方式被取代。
当术语 “烷基” 或 “芳基” 或其前缀词根的任一者出现于取代基 ( 例如， 芳基烷基、 烷基氨基 ) 的名称中时， 该名称应解释为包括上述对 “烷基” 和 “芳基” 给予的那些限制。碳 原子的指定数目 ( 如 C1-C6) 独立地指烷基部分、 芳基部分或其中烷基以其前缀词根出现的 较大取代基的烷基部分的碳原子数目。对于烷基和烷氧基取代基， 碳原子的指定数目包括 所规定的给定范围内的所有独立成员。例如 C1-6 烷基将包括独立的甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 戊基和己基以及它们的亚组合 ( 例如 C1-2、 C1-3、 C1-4、 C1-5、 C2-6、 C3-6、 C4-6、 C5-6、 C2-5 等 )。
一般而言， 根据贯穿本公开内容使用的标准命名原则， 指定侧链的末端部分首先 被描述， 接着描述朝向连接点的相邻官能团。因此， 例如， “苯基 C1-C6 烷基酰胺基 C1-C6 烷 基” 取代基指下式基团 ：
除非另外指明， 否则在分子内特定位置上任何取代基或变量的定义意与其在该分 子内其他位置的定义无关。应当了解， 本发明化合物上的取代基和取代模式可由本领域的 普通技术人员选择， 以提供化学上稳定且可通过本领域已知技术及本文所示的那些方法容 易合成的化合物。
本文所用的术语 “受试者” 指已成为治疗、 观察或实验的目标的动物， 优选哺乳动 物， 最优选人类。
如本文所用， 术语 “治疗有效量” 指在组织系统、 动物或人中引发生物学或医学反 应的活性化合物或药剂的量， 所述生物学或医学反应为研究人员、 兽医、 医师或其他临床医 师所寻求的， 其包括缓解或部分缓解所治疗的疾病、 综合征、 病症或障碍的症状。
本文所用的术语 “组合物” 旨在涵盖包含治疗有效量的特定成分的产品， 以及可由 特定量的特定成分的组合直接或间接得到的任何产品。
术语 “拮抗剂” 是用于指能够视情况而定产生 TRPM8 离子通道的功能性拮抗作用 的化合物， 包括 ( 但不限于 ) 竞争性拮抗剂、 非竞争性拮抗剂、 脱敏激动剂和部分激动剂。
本文所用的 “炎性超敏反应” 用于指表征为炎症的一种或多种标志 ( 包括浮肿、 红 斑、 体温过高和疼痛 ) 和 / 或表征为对一种或超过一种类型的刺激 ( 包括热刺激、 机械刺激 和 / 或化学刺激 ) 的过度的生理或病理生理性反应的病症。
术语 “TRPM8 调节的” 用于指受 TRPM8 受体调节所影响的病症， 包括但不限于由 TRPM8 受体所介导的状态。
本发明的一个实施例是在受试者中治疗或预防选自如下的疾病、 综合征和病症中 的至少一种的方法 ： 偏头痛、 疱疹后神经痛、 外伤后神经痛、 化疗后神经痛、 I 型和 II 型复杂 性局部疼痛综合征 (CRPS I/II)、 纤维肌痛、 炎性肠疾病、 瘙痒症、 哮喘、 慢性阻塞性肺疾病、
牙痛、 骨痛和发热 (pyresis)， 该方法包括如下步骤， 由如下步骤组成和 / 或基本上由如下 步骤组成 ： 向需要这种治疗或预防的受试者 ( 包括动物、 哺乳动物和人 ) 施用治疗有效量的 TRPM8 拮抗剂， 其为式 (I) 化合物。
本发明的另一个实施例是在受试者中治疗或预防选自如下的疾病、 综合征和病症 中的至少一种的方法 ： 高血压、 外周血管性疾病、 雷诺病、 再灌注损伤或冻伤， 该方法包括向 需要这种治疗或预防的受试者 ( 包括动物、 哺乳动物和人 ) 施用治疗有效量的 TRPM8 拮抗 剂， 其为式 (I) 化合物。
本发明的另一实施例是在受试者 ( 包括动物、 哺乳动物和人 ) 中加速麻醉后恢复 或降温后恢复的方法， 该方法包括向需要这种加速恢复的受试者 ( 包括动物、 哺乳动物和 人 ) 施用治疗有效量的 TRPM8 拮抗剂， 其为式 (I) 化合物。
在一个实施方案中， 本发明涉及式 (I) 化合物以及其对映体、 非对映体、 溶剂化物 和可药用盐
其中
a)Y 是氢 ； 溴； 氯； 氟； 碘； C3-6 环烷基或 C1-4 烷基 ；
b)Y 是氢 ； 甲基 ； 异丙基 ； 氯； 环丙基 ； 环丁基 ； 环戊基或溴 ；
c)Y 是氢 ； 甲基 ； 异丙基 ； 氯； 环丙基或溴 ； 1
d)R 是
(i)C3-6 环烷基 ；
(ii)C1-6 烷基， 其被一个 C6-10 芳基取代， 其中所述 C6-10 芳基任选被 1 至 3 个取代基 取代， 所述取代基独立地选自氯、 氟、 溴、 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基、 羟基、 C1-4 烷氧基羰基、 C1-3 烷 硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基、 任选被 1 至 3 个氟取代基取代的 C1-3 烷基磺酰基、 硝 基和 C1-3 烷基羰基 ； 前提条件是所述取代基中不超过两个选自 C1-4 烷氧基、 C1-4 烷氧基羰基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基、 C1-3 烷基磺酰基、 硝基和 C1-3 烷基羰基 ；
(iii) 被苯基取代的 C1-6 烷基， 其中苯基被 4 或 5 个氟取代基取代 ； 或苯基被甲氧 基和 3 至 4 个氟取代基取代 ； 或者
(iv) 任选被环丙基或三氟甲基取代的 C1-3 烷基 ；
(v) 被 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基、 2， 2- 二 氟 - 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基或 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二氧杂环己烯 -6- 基取代的亚甲基 ；
e)R1 是
(i)C1-6 烷基， 其被一个 C6-10 芳基取代， 其中所述 C6-10 芳基任选被 1 至 3 个取代基 取代， 所述取代基独立地选自氯、 氟、 溴、 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基、 羟基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫 基、 氰基、 三氟甲基和 C1-3 烷基羰基 ； 前提条件是所述取代基中不超过两个选自 C1-4 烷氧基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基和 C1-3 烷基羰基 ；
(ii) 被苯基取代的 C1-3 烷基， 其中苯基被 4 或 5 个氟取代基取代 ； 或苯基被甲氧基 和 3 至 4 个氟取代基取代 ；
(iii) 任选被环丙基或三氟甲基取代的 C1-3 烷基 ； 或者
(iv) 被 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基、 2， 2- 二 氟 - 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基或 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二氧杂环己烯 -6- 基取代的亚甲基 ； 2
f)R 是
(i) 氢或
(ii) 氟 ；
g)R3 是
(i) 氢或 (ii) 氟 ；
h)R4 是
(i) 氢 ；
(ii) 甲基 ； 或
(iii) 氟 ；
i)RA 是在末端碳原子被取代基取代的 C1-4 烷基， 所述取代基选自羧基、 C1-3 烷氧基 和羟基 ；
j)RB 是氢或 C1-4 烷基 ；
或者， RA 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成含有一个杂原子的 6 元环， 所 述杂原子选自 O、 S 和 S(O2) ； A
或者， R 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成可任选含有一个额外 N 原子的 5 元或 6 元环， 以形成
(i) 哌嗪 -1- 基， 其中哌嗪基氮被 RC 取代 ；
(ii) 吡咯烷 -1- 基， 其任选在 3- 位被 C1-4 烷基或 NRDRE 取代 ； 其中 RD 和 RE 独立地 或者， RD 和 RE 与它们二者均连接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ； 选自氢和 C1-4 烷基 ； 或者
(iii) 哌啶 -1- 基， 其任选被羧基、 C1-3 烷氧基羰基或 C1-4 烷基取代， 所述 C1-4 烷基 在末端碳原子被选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基的取代基取代 ；
或哌啶基任选在 4- 位被以下基团取代 ：
(i)C(O)NRYRZ ； 其中 RY 是氢或 C1-6 烷基 ； 并且 RZ 是氢或任选被氨基、 C1-2 烷基氨基 Y Z 或二 (C1-2 烷基 ) 氨基取代的 C1-6 烷基 ； 或者， R 和 R 与它们二者均连接的氮原子合在一起 形成 5 元或 6 元环， 并且所述 6 元环可任选含有 O 或 4-N( 甲基 ) ； 或者 H J H J
(ii)NR R ； 其中 R 和 R 独立地选自氢和 C1-4 烷基， 或者， RH 和 RJ 与它们二者均连 接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ；
RC 是 (i) 氢 ； (ii)C1-8 烷基 ； (iii)C3-6 环烷基 ； (iv)C3-6 环烷基 (C1-4) 烷基 ； (v)CH2CF3 ； 或者 (vi) 任选独立地被 1 至 2 个选自甲基、 甲氧基、 氯、 氟和三氟甲基的取代基取代的苯基 ； 以及上面实施例 a) 至 j) 的任何组合， 前提条件是应该理解， 其中相同取代基的不 同实施例进行组合的组合结构排除在外。
本发明的另一个实施例涉及式 (I) 化合物以及它们的对映体、 非对映体、 溶剂化 物及可药用盐
其中
Y 是氢 ； 溴； 氯； 氟； 碘； C3-6 环烷基或 C1-4 烷基 ； 1
R 为：
(i)C3-6 环烷基 ；
(ii)C1-6 烷基， 其被一个 C6-10 芳基取代， 其中所述 C6-10 芳基任选被 1 至 3 个取代基 取代， 所述取代基独立地选自氯、 氟、 溴、 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基、 羟基、 C1-4 烷氧基羰基、 C1-3 烷 硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基、 任选被 1 至 3 个氟取代基取代的 C1-3 烷基磺酰基、 硝
基和 C1-3 烷基羰基 ； 前提条件是所述取代基中不超过两个选自 C1-4 烷氧基、 C1-4 烷氧基羰基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基、 C1-3 烷基磺酰基、 硝基和 C1-3 烷基羰基 ；
(iii) 被苯基取代的 C1-6 烷基， 其中苯基被 4 或 5 个氟取代基取代 ； 或苯基被甲氧 基和 3 至 4 个氟取代基取代 ；
(iv) 任选被 C3-6 环烷基或三氟甲基取代的 C1-6 烷基 ； 或者
(v) 被 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基、 2， 2- 二 氟 - 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基或 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二氧杂环己烯 -6- 基取代的亚甲基 ； 2
R 为
(i) 氢或(ii) 氟 ； R3 为 ： (i) 氢或 (ii) 氟 ； R4 为 ： (i) 氢 ； (ii) 甲基 ； 或 (iii) 氟 ； RA 是在末端碳原子被取代基取代的 C1-4 烷基， 所述取代基选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基 ； RB 是氢或 C1-4 烷基 ；
或者， RA 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成含有一个额外杂原子的 6 元环， 所述杂原子选自 O、 S 和 S(O2) ； A
或者， R 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成可任选含有一个额外 N 原子的 5 元或 6 元环， 以形成
(i) 哌嗪 -1- 基， 其中哌嗪基氮被 RC 取代 ；
(ii) 吡咯烷 -1- 基， 其任选在 3- 位被 C1-4 烷基或 NRDRE 取代 ； 其中 RD 和 RE 独立地 选自氢和 C1-4 烷基 ； 或者， RD 和 RE 与它们二者均连接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ； 以及
(iii) 哌啶 -1- 基， 其任选被羧基、 C1-3 烷氧基羰基或 C1-4 烷基取代， 所述 C1-4 烷基 在末端碳原子被选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基的取代基取代 ；
或哌啶基任选在 4- 位被以下基团取代 ：
(i)C(O)NRYRZ ； 其中 RY 是氢或 C1-6 烷基 ； 并且 RZ 是氢或任选被氨基、 C1-2 烷基氨基 Y Z 或二 (C1-2 烷基 ) 氨基取代的 C1-6 烷基 ； 或者， R 和 R 与它们二者均连接的氮原子合在一起 形成 5 元或 6 元环， 并且所述 6 元环可任选含有 O 或 4-N( 甲基 ) ； 或者 H J H J
(ii)NR R ； 其中 R 和 R 独立地选自氢和 C1-4 烷基， 或者， RH 和 RJ 与它们二者均连 接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ；
RC 是
(i) 氢 ；
(ii)C1-8 烷基 ；
(iii)C3-6 环烷基 ；
(iv)C3-6 环烷基 (C1-4) 烷基 ；
(v)CH2CF3 ； 或者
(vi) 任选独立地被 1 至 2 个选自甲基、 甲氧基、 氯、 氟和三氟甲基的取代基取代的 苯基。
本发明的另一个实施例涉及式 (I) 化合物以及它们的对映体、 非对映体、 溶剂化 物及可药用盐
其中
Y 是氢 ； 甲基 ； 异丙基 ； 氯； 环丙基 ； 环丁基 ； 环戊基或溴 ； 1
R 为：
(i)C1-6 烷基， 其被一个 C6-10 芳基取代， 其中所述 C6-10 芳基任选被 1 至 3 个取代基 取代， 所述取代基独立地选自氯、 氟、 溴、 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基、 羟基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫 基、 氰基、 三氟甲基和 C1-3 烷基羰基 ； 前提条件是所述取代基中不超过两个选自 C1-4 烷氧基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基和 C1-3 烷基羰基 ；
(ii) 被苯基取代的 C1-3 烷基， 其中苯基被 4 或 5 个氟取代基取代 ； 或苯基被甲氧基 和 3 至 4 个氟取代基取代 ；
(iii) 任选被环丙基或三氟甲基取代的 C1-3 烷基 ； 或者
(iv) 被 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基、 2， 2- 二 氟 - 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基或 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二氧杂环己烯 -6- 基取代的亚甲基 ； 2
R 为
(i) 氢或
(ii) 氟 ；
R3 为 ：
(i) 氢或
(ii) 氟 ；
R4 为 ：
(i) 氢 ； (ii) 甲基 ； 或 (iii) 氟 ； RA 是在末端碳原子被取代基取代的 C1-4 烷基， 所述取代基选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基 ； RB 是氢或 C1-4 烷基 ；
或者， RA 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成含有一个杂原子的 6 元环， 所 述杂原子选自 O、 S 和 S(O2) ； A
或者， R 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成任选含有一个额外的 N 原子的 5 元或 6 元环， 其选自 ：
(i) 哌嗪 -1- 基， 其中哌嗪基氮被 RC 取代 ；
(ii) 吡咯烷 -1- 基， 其任选在 3- 位被 C1-4 烷基或 NRDRE 取代 ； 其中 RD 和 RE 独立地 选自氢和 C1-4 烷基 ； 或者， RD 和 RE 与它们二者均连接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ； 以及
(iii) 哌啶 -1- 基， 其任选被羧基、 C1-3 烷氧基羰基或 C1-4 烷基取代， 所述 C1-4 烷基 在末端碳原子被选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基的取代基取代 ；
或着， 哌啶基任选在 4- 位被以下基团取代 ：
(i)C(O)NRYRZ ； 其中 RY 是氢或 C1-6 烷基 ； 并且 RZ 是氢或任选被氨基、 C1-2 烷基氨基 Y Z 或二 (C1-2 烷基 ) 氨基取代的 C1-6 烷基 ； 或者， R 和 R 与它们二者均连接的氮原子合在一起 形成 5 元或 6 元环， 并且所述 6 元环可任选含有 O 或 4-N( 甲基 ) ； 或者 H J H J
(ii)NR R ； 其中 R 和 R 独立地选自氢和 C1-4 烷基， 或者， RH 和 RJ 与它们二者均连 接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ；
RC 是
(i) 氢 ；
(ii)C1-8 烷基 ；
(iii)C3-6 环烷基 ；
(iv)C3-6 环烷基 (C1-4) 烷基 ；
(v)CH2CF3 ； 或者
(vi) 任选独立地被 1 至 2 个选自甲基、 甲氧基、 氯、 氟和三氟甲基的取代基取代的 苯基。
本发明的另一个实施例涉及式 (I) 化合物以及它们的对映体、 非对映体、 溶剂化 物及可药用盐
其中
Y 是氢 ； 甲基 ； 异丙基 ； 氯； 环丙基或溴 ； 1
R 为：
(i)C1-6 烷基， 其被一个 C6-10 芳基取代， 其中所述 C6-10 芳基任选被 1 至 3 个取代基 取代， 所述取代基独立地选自氯、 氟、 溴、 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基、 羟基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫
基、 氰基、 三氟甲基和 C1-3 烷基羰基 ； 前提条件是所述取代基中不超过两个选自 C1-4 烷氧基、 C1-3 烷硫基、 三氟甲基硫基、 氰基、 三氟甲基和 C1-3 烷基羰基 ；
(ii) 被苯基取代的 C1-3 烷基， 其中苯基被 4 或 5 个氟取代基取代 ； 或苯基被甲氧基 和 3 至 4 个氟取代基取代 ；
(iii) 任选被环丙基或三氟甲基取代的 C1-3 烷基 ； 或者
(iv) 被 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基、 2， 2- 二 氟 - 苯 并 [1， 3] 二 氧 杂 环 戊 烯 -5- 基或 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二氧杂环己烯 -6- 基取代的亚甲基 ； 2
R 为
(i) 氢或
(ii) 氟 ；
R3 为 ：
(i) 氢或
(ii) 氟 ；
R4 为 ：
(i) 氢 ；
(ii) 甲基 ； 或 (iii) 氟 ； RA 是在末端碳原子被取代基取代的 C1-4 烷基， 所述取代基选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基 ； RB 是氢或 C1-4 烷基 ；
或者， RA 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成含有一个杂原子的 6 元环， 所 述杂原子选自 O、 S 和 S(O2) ； A
或者， R 和 RB 与它们连接的氮原子结合在一起形成任选含有一个额外的 N 原子的 5 元或 6 元环， 其选自 ：
(i) 哌嗪 -1- 基， 其中哌嗪基氮被 RC 取代 ；
(ii) 吡咯烷 -1- 基， 其任选在 3- 位被 C1-4 烷基或 NRDRE 取代 ； 其中 RD 和 RE 独立地 选自氢和 C1-4 烷基 ； 或者， RD 和 RE 与它们二者均连接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ； 以及
(iii) 哌啶 -1- 基， 其任选被羧基、 C1-3 烷氧基羰基或 C1-4 烷基取代， 所述 C1-4 烷基 在末端碳原子被选自羧基、 C1-3 烷氧基和羟基的取代基取代 ；
或哌啶基任选在 4- 位被以下基团取代 ：
(i)C(O)NRYRZ ； 其中 RY 是氢或 C1-6 烷基 ； 并且 RZ 是氢或任选被氨基、 C1-2 烷基氨基 Y Z 或二 (C1-2 烷基 ) 氨基取代的 C1-6 烷基 ； 或者， R 和 R 与它们二者均连接的氮原子合在一起 形成 5 元或 6 元环， 并且所述 6 元环可任选含有 O 或 4-N( 甲基 ) ； 或者 H J H J
(ii)NR R ； 其中 R 和 R 独立地选自氢和 C1-4 烷基， 或者， RH 和 RJ 与它们二者均连 接的氮原子合在一起形成 5 元或 6 元环 ；
RC 是
(iv) 氢 ；
(v)C1-8 烷基 ；
(vi)C3-6 环烷基 ； (vii)C3-6 环烷基 (C1-4) 烷基 ； (viii)CH2CF3 ； 或 (ix) 任选独立地被 1 至 2 个选自甲基、 甲氧基、 氯、 氟和三氟甲基的取代基取代的 本发明的另一个实施例涉及式 (I) 化合物苯基。
其选自 ：
其中 Y 是溴， R1 是 4- 氟 -3- 三氟甲基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， RA 是 H， 并且 RB 是 羧甲基的化合物 ；
其中 Y 是溴， R1 是 4- 氟 -3- 三氟甲基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， RA 是 H， 并且 RB 是 3- 羧丙基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 氟 -3- 三氟甲基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， RA 是 H， 并且 RB 是 3- 羧丙基的化合物 ；
其中 Y 是溴， R1 是 4- 氟 -3- 三氟甲基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， RA 是 H， 并且 RB 是 4- 羧丁基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4- 甲基哌嗪 -1- 基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4- 羧基哌啶 -1- 基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基羰基 ) 哌啶 -1- 基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4-(2- 二甲基氨基 - 乙基氨基羰基 ) 哌啶 -1- 基的化合 物；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成哌嗪 -1- 基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4- 异丙基 - 哌嗪 -1- 基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4-(3- 甲基 - 丁基 )- 哌嗪 -1- 基的化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4-(2， 2， 2- 三氟乙基 )- 哌嗪 -1- 基的式 (I) 化合物 ； 1
其中 Y 是甲基， R 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4-( 二甲基氨基 ) 哌啶 -1- 基的式 (I) 化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成 4-( 吡咯烷 -1- 基 ) 哌啶 -1- 基的式 (I) 化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成哌啶 -1- 基的式 (I) 化合物 ；
其中 Y 是甲基， R1 是 4- 三氟甲氧基苯甲基， R2、 R3 和 R4 是 H， 并且 RA 和 RB 与它们 二者均连接的氮原子合在一起形成吗啉 -4- 基的式 (I) 化合物 ；
以及它们的对映体、 非对映体、 溶剂化物及可药用盐。
对于在医学中的使用， 式 (I) 化合物的盐指非毒性的 “可药用盐” 。然而， 其他盐 可用于制备式 (I) 化合物或它们的可药用盐。式 (I) 化合物的合适可药用盐包括酸加成 盐， 所述的酸加成盐可 ( 例如 ) 通过将所述化合物的溶液与诸如盐酸、 硫酸、 富马酸、 马来 酸、 琥珀酸、 乙酸、 苯甲酸、 柠檬酸、 酒石酸、 碳酸或磷酸之类的可药用酸的溶液混合而形成。 此外， 如果式 (I) 化合物带有酸性部分， 则其合适的可药用盐可包括碱金属盐， 如钠盐或钾 盐； 碱土金属盐， 如钙盐或镁盐 ； 以及与合适的有机配体形成的盐， 如季铵盐。因而， 代表性 的可药用盐包括醋酸盐、 苯磺酸盐、 苯甲酸盐、 碳酸氢盐、 硫酸氢盐、 酒石酸氢盐、 硼酸盐、 溴 化物、 依地酸钙盐、 右旋樟脑磺酸盐、 碳酸盐、 氯化物、 克拉维酸盐、 柠檬酸盐、 二盐酸盐、 依 地酸盐、 乙二磺酸盐、 丙酸酯十二烷基硫酸盐、 乙磺酸盐、 延胡索酸盐、 葡庚糖酸盐、 葡糖酸 盐、 谷氨酸盐、 对羟乙酰氨基苯胂酸盐、 己基间苯二酚盐、 海巴明、 氢溴酸盐、 盐酸盐、 羟萘酸 盐、 碘化物、 异硫代硫酸盐、 乳酸盐、 乳糖醛酸盐、 月桂酸盐、 苹果酸盐、 马来酸盐、 扁桃酸盐、 甲磺酸盐、 甲基溴化物、 甲基硝酸盐、 甲基硫酸盐、 粘液酸盐、 萘磺酸盐、 硝酸盐、 N- 甲基葡糖 胺铵盐、 油酸盐、 双羟萘酸盐 ( 扑酸盐 )、 棕榈酸盐、 泛酸盐、 磷酸盐 / 二磷酸盐、 聚半乳糖醛 酸盐、 水杨酸盐、 硬脂酸盐、 硫酸盐、 碱式乙酸盐、 琥珀酸盐、 鞣酸盐、 酒石酸盐、 茶氯酸盐、 甲 苯磺酸盐、 三乙基碘化物和戊酸盐。
可用于制备可药用盐的代表性酸和碱包括 ： 酸， 所述酸包括乙酸、 2， 2- 二氯乙酸、 酰化氨基酸、 己二酸、 藻酸、 抗坏血酸、 L- 天冬氨酸、 苯磺酸、 苯甲酸、 4- 乙酰氨基苯甲酸、 (+)- 樟脑酸、 樟脑磺酸、 (+)-(1S)- 樟脑 -10- 磺酸、 癸酸、 己酸、 辛酸、 肉桂酸、 柠檬酸、 环拉 酸、 十二烷基硫酸、 乙烷 -1， 2- 二磺酸、 乙磺酸、 2- 羟基 - 乙磺酸、 甲酸、 富马酸、 半乳糖二 酸、 龙胆酸、 葡庚糖酸、 D- 葡萄糖酸、 D- 葡糖醛酸、 L- 谷氨酸、 α- 氧代 - 戊二酸、 乙醇酸、 马尿酸、 氢溴酸、 盐酸、 (+)-L- 乳酸、 (±)-DL- 乳酸、 乳糖酸、 马来酸、 (-)-L- 苹果酸、 丙二 酸、 (±)-DL- 扁桃酸、 甲磺酸、 萘 -2- 磺酸、 萘 -1， 5- 二磺酸、 1- 羟基 -2- 萘酸、 烟酸、 硝酸、 油酸、 乳清酸、 草酸、 棕榈酸、 扑酸、 磷酸、 L- 焦谷氨酸、 水杨酸、 4- 氨基 - 水杨酸、 癸二酸、 硬 脂酸、 琥珀酸、 硫酸、 鞣酸、 (+)-L- 酒石酸、 硫氰酸、 对甲苯磺酸和十一碳烯酸 ； 和碱， 所述碱 包括氨、 L- 精氨酸、 苯乙苄胺、 苄星、 氢氧化钙、 胆碱、 丹醇、 二乙醇胺、 二乙胺、 2-( 二乙基 氨基 )- 乙醇、 乙醇胺、 乙二胺、 N- 甲基 - 葡糖胺、 海巴明、 1H- 咪唑、 L- 赖氨酸、 氢氧化镁、4-(2- 羟基乙基 )- 吗啉、 哌嗪、 氢氧化钾、 1-(2- 羟乙基 )- 吡咯烷、 仲胺、 氢氧化钠、 三乙醇 胺、 氨基丁三醇和氢氧化锌。本发明的实施例包括式 (I) 化合物的前药。通常， 这种前药会 是化合物的官能衍生物， 其在体内可容易地转化成所需的化合物。因此， 在本发明的治疗 或预防实施例的方法中， 术语 “施用” 涵盖了治疗或预防对具体描述的化合物或未具体描述 的化合物所叙述的多种疾病、 病症、 综合征和障碍， 但所述未具体描述的化合物在施用至患 者后会于体内转化成所指定的化合物。例如， 在 “Design of Prodrugs” ， H.Bundgaard( 编 辑 )， Elsevier， 1985 中描述了用于选择和制备合适的前药衍生物的常规程序。根据本发明 实施例的化合物具有至少一个手性中心时， 它们可因此作为对映体存在。如果化合物具有 两个或更多个手性中心， 则它们可另外还作为非对映体存在。 应当理解， 所有的这类异构体 及其混合物涵盖在本发明的范围内。 此外， 化合物的某些结晶形式可作为多晶型物存在， 并 因此旨在包括在本发明内。此外， 某些化合物可与水形成溶剂化物 ( 即水合物 ) 或与普通 有机溶剂形成溶剂化物， 这类溶剂化合物也旨在涵盖于本发明的范围内。 技术人员将理解， 本文所使用的术语化合物是表示包括溶剂化的式 I 化合物。
如果用于制备根据本发明某些实施例的化合物的工艺产生立体异构体的混合物， 则可通过诸如制备型色谱法之类的常规技术分离这些异构体。化合物可制备为外消旋形 式， 或者单独的对映体可通过对映体特异性合成或通过拆分制备。例如， 可通过标准的技 术， 如通过与光学活性酸 ( 如 (-)- 二对甲基苯甲酰基 -d- 酒石酸和 / 或 (+)- 二对甲基苯 甲酰基 -1- 酒石酸 ) 形成盐来形成非对映体对， 然后分步结晶并再生游离碱而将化合物拆 分成它们的组分对映体。也可通过形成非对映体酯或酰胺， 然后进行色谱分离并移除手性 助剂而拆分化合物。作为另一种选择， 可用手性 HPLC 柱拆分化合物。
本发明的一个实施例涉及一种组合物， 包括药物组合物， 其包含式 (I) 化合物的 (+)- 对映体、 由其组成和 / 或基本上由其组成， 其中所述组合物基本上不含所述化合物的 (-)- 异构体。 在本文中， 基本上不含意指少于约 25％， 优选少于约 10％， 更优选少于约 5％， 更优选少于约 2％， 并且更优选少于约 1％的 (-)- 异构体， 其可如下计算 ：
本发明的另一个实施例为一种组合物， 包括药物组合物， 其包含式 (I) 化合物 的 (-)- 对映体、 由其组成和基本上由其组成， 其中所述组合物基本上不含所述化合物的 (+)- 异构体。 在本文中， 基本上不含表示少于约 25％， 优选少于约 10％， 更优选少于约 5％， 更优选少于约 2％， 且更优选少于约 1％的 (+)- 异构体， 其可如下计算 ：
在用于制备本发明多个实施例的化合物的任何工艺过程中， 可能有必要和 / 或期 望保护所涉及的任何分子上的敏感性或反应性基团。这可使用常规保护基团实现， 例如在 如下文献中所描述的那些 ： Protective Groups in Organic Chemistry J.F.W.McOmie( 编 辑 )， Plenum Press， 1973 ； 和 T.W.Greene & P.G.M.Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis， John Wiley & Sons， 1999。 可使用本领域已知的方法在方便的后续阶段移除保 护基团。尽管本发明实施例的化合物 ( 包括它们的可药用盐和可药用溶剂化物 ) 可单独施 用， 但它们一般与可药用载体、 可药用赋形剂和 / 或可药用稀释剂 ( 根据施用途径和标准药 用或兽医实践而选择 ) 混合施用。因此， 本发明的某些实施例涉及药用和兽医用组合物， 其 包含式 (I) 化合物和至少一种可药用载体、 可药用赋形剂和 / 或可药用稀释剂。
举例来说， 在本发明实施例的药物组合物中， 可将式 (I) 化合物与任何合适的粘 合剂、 润滑剂、 助悬剂、 包衣剂、 增溶剂以及它们的组合混合。视情况而定， 含有本发明化合物的固体口服剂型 ( 如片剂或胶囊剂 ) 可一次以至 少一种剂型施用。也可以持续释放制剂施用该化合物。
本发明化合物可以其施用的其他口服形式包括酏剂、 溶液剂、 糖浆剂和混悬剂 ； 各 任选含有调味剂和着色剂。
作为另一种选择， 式 (I) 化合物可通过吸入 ( 气管内或鼻内 ) 施用或者以栓剂或 阴道栓剂形式施用， 或者它们可以洗剂、 溶液剂、 霜膏、 油膏剂或扑粉的形式局部施用。例 如， 它们可以掺入霜膏中， 所述霜膏包含聚乙二醇或液态石蜡的水性乳液， 由其组成和 / 或 基本上由其组成。以霜膏的重量计， 它们也可以约 1％至约 10％的浓度掺入油膏剂中， 所述 油膏剂包含白蜡或白软石蜡碱以及任何稳定剂和防腐剂 ( 有可能需要 )， 由其组成和 / 或基 本上由其组成。替代的施用方式包括通过使用皮肤贴剂或透皮贴剂来透皮施用。本发明的 药物组合物 ( 以及单独的本发明化合物 ) 也可通过非肠道注射， 例如海绵体内、 静脉内、 肌 内、 皮下、 皮内或鞘内注射。 在这种情况下， 组合物还将包含至少一种合适的载体、 合适的赋 形剂以及合适的稀释剂。
对于非肠道施用， 本发明的药物组合物最好以无菌水溶液形式使用， 其可含有其 他物质， 例如足够的盐和单糖以制备与血液等渗的溶液。
对于颊面或舌下施用， 本发明的药物组合物可以片剂或锭剂形式施用， 所述片剂 或锭剂可以常规方式配制。
举个另外的例子， 含有至少一种式 (I) 化合物作为活性成分的药物组合物可根据 常规药用混合技术， 通过将化合物与可药用载体、 可药用稀释剂和 / 或可药用赋形剂混合 而制备。载体、 赋形剂和稀释剂可采用各种各样的形式， 这取决于所需施用途径 ( 例如口 服、 非肠道施用等 )。因此， 对于液态口服制剂如混悬剂、 糖浆剂、 酏剂和溶液剂， 合适的载 体、 赋形剂和稀释剂包括水、 二醇类、 油类、 醇类、 调味剂、 防腐剂、 稳定剂、 着色剂等 ； 对于固 态口服制剂如散剂、 胶囊剂和片剂， 合适的载体、 赋形剂和稀释剂包括淀粉、 糖类、 稀释剂、 粒化剂、 润滑剂、 粘合剂、 崩解剂等。 固态口服制剂也可任选用诸如糖之类的物质包衣， 或用 肠衣包覆， 以便调节吸收和崩解的主要部位。对于非肠道施用， 载体、 赋形剂和稀释剂通常 包括无菌水， 并且可加入其他成分以增加组合物的溶解度和可保存性。注射用混悬剂或溶 液剂也可用水性载体与适当添加剂如增溶剂和防腐剂一起制备。
式 (I) 化合物或其药物组合物的治疗有效量包括 ： 在每日约 1 至 4 次的用药法中， 对于一般 (70kg) 的人而言， 范围为约 0.1mg 至约 3000mg、 特别是约 1mg 至约 1000mg、 更特 别是约 10mg 至约 500mg 的活性成分的剂量 ； 但是对于本领域技术人员来说显而易见的是， 本发明活性化合物的治疗有效量将随所治疗的疾病、 综合征、 病症和障碍而有所变化。
对于口服施用， 药物组合物优选以含有约 0.01、 约 10、 约 50、 约 100、 约 150、 约 200、 约 250 和约 500 毫克活性化合物作为活性成分的片剂形式提供。
有利的是， 式 (I) 的化合物可以单次日剂量施用， 或者每日总剂量可以每日两次、 三次和四次的分剂量施用。待施用的式 (I) 化合物的最佳剂量可容易确定， 并且将随所使 用的具体化合物、 施用模式、 制剂强度以及疾病、 综合征、 病症或障碍的进程而变化。另外， 与待治疗的具体受试者相关的因素 ( 包括受试者年龄、 体重、 饮食和施用时间 ) 将导致有需 要调整剂量以实现适当的治疗水平。因而上述剂量是一般情况的示例。当然， 可能会存在 其中较高或较低剂量范围是有益的的个别情况， 并且这类情况也在本发明的范围内。式 (I) 化合物可以在任何上述组合物和给药方案中施用， 或者借助于本领域已确 立的那些组合物和给药方案施用， 只要式 (I) 的化合物的使用是需要它的受试者所要求 的。作为 TRPM8 离子通道的拮抗剂， 式 (I) 化合物可用于治疗和预防受试者中的疾病、 综合 征、 病症或障碍的方法， 受试者包括动物、 哺乳动物和人类， 其中所述疾病、 综合征、 病症或 障碍是受 TRPM8 受体的调节所影响。这类方法包括将治疗有效量的式 (I) 化合物、 盐或溶 剂化物施用给受试者、 由其组成或基本上由其组成， 所述受试者包括需要此类治疗或预防 的动物、 哺乳动物和人类。具体地讲， 式 (I) 化合物可用于预防或治疗疼痛， 或造成这类疼 痛的疾病、 综合征、 病症或障碍， 或肺或血管功能障碍。更具体地讲， 式 (I) 化合物可用于预 防或治疗炎性疼痛、 炎性超敏病症、 神经性疼痛、 焦虑症、 抑郁症， 以及因冷而恶化的心血管 疾病， 包括外周血管疾病、 高血压、 肺动脉高压、 雷诺病和冠状动脉疾病， 这通过将治疗有效 量的式 (I) 化合物施用给所需要的受试者来实现。
炎性疼痛的例子包括由于包括如下疾病、 病症、 综合征、 障碍或疼痛状态所致的疼 痛： 炎性肠疾病、 内脏疼痛、 偏头痛、 术后疼痛、 骨关节炎、 类风湿性关节炎、 背痛、 下腰痛、 关 节痛、 腹痛、 胸痛、 产痛、 肌肉骨骼疾病、 皮肤病、 牙痛、 发热、 烧伤、 晒伤、 蛇咬伤、 毒蛇咬伤、 蜘蛛咬伤、 昆虫叮咬、 神经源性膀胱、 间质性膀胱炎、 泌尿道感染、 鼻炎、 接触性皮炎 / 超敏 反应、 瘙痒、 湿疹、 咽炎、 粘膜炎、 肠炎、 过敏性肠综合征、 胆囊炎、 胰腺炎、 乳房切除术后疼痛 综合征、 痛经、 子宫内膜异位、 窦性头痛、 紧张性头痛或蛛网膜炎。
一种类型的炎性疼痛为炎性痛觉过敏， 其可被进一步区别为炎性身体痛觉过敏或 炎性内脏痛觉过敏。 炎性身体痛觉过敏表征为存在炎性痛觉过敏状态， 其中存在对热、 机械 和 / 或化学刺激的超敏反应。炎性内脏痛觉过敏的特征也在于存在炎性痛觉过敏状态， 其 中存在增加的内脏过敏性。
炎性痛觉过敏的例子包括疾病、 综合征、 病症、 障碍或疼痛状态， 其包括炎症、 骨关 节炎、 类风湿性关节炎、 背痛、 关节痛、 腹痛、 肌肉骨骼疾病、 皮肤病、 术后痛、 头痛、 牙痛、 烧 伤、 晒伤、 昆虫叮咬、 神经原性膀胱、 尿失禁、 间质性膀胱炎、 泌尿道感染、 咳嗽、 哮喘、 慢性阻 塞性肺疾病、 鼻炎、 接触性皮炎 / 超敏反应、 搔痒、 湿疹、 咽炎、 肠炎、 过敏性肠综合征、 包括 克隆氏病或溃疡性结肠炎在内的炎性肠疾病。
本发明的一个实施例涉及用于治疗其中存在对热、 机械和 / 或化学刺激的超敏反 应的炎性身体痛觉过敏的方法， 该方法包括将治疗有效量的式 (I) 的化合物、 盐或溶剂化 物施用给需要该治疗的哺乳动物的步骤。
本发明的另一个实施例涉及用于治疗其中存在内脏过敏增加的炎性内脏痛觉过 敏的方法， 该方法包括将治疗有效量的式 (I) 的化合物、 盐或溶剂化物施用给需要该治疗 的受试者的步骤、 由该步骤组成和 / 或基本上由该步骤组成。
本发明的另一个实施例涉及用于治疗其中存在对冷刺激的超敏反应的神经病性 冷性异常性疼痛的方法， 该方法包括将治疗有效量的式 (I) 的化合物、 盐或溶剂化物施用 至需要该治疗的受试者的步骤、 由该步骤组成和 / 或基本上由该步骤组成。
炎性超敏病症的例子包括尿失禁、 良性前列腺肥大、 咳嗽、 哮喘、 鼻炎和鼻超敏反 应、 搔痒、 接触性皮炎和 / 或皮肤过敏， 以及慢性阻塞性肺疾病。
神经性疼痛的例子包括由于疾病、 综合征、 病症、 障碍或疼痛状态所致的疼痛， 该 疾病、 综合征、 病症、 障碍或疼痛状态包括癌症、 神经障碍、 脊神经和周围神经手术、 脑肿瘤、外伤性脑损伤 (TBI)、 脊髓创伤、 慢性疼痛综合征、 纤维肌痛、 慢性疲劳综合征、 神经痛 ( 三 叉神经痛、 舌咽神经痛、 疱疹后神经痛和灼痛 )、 狼疮、 结节病、 周围神经病变、 双侧周围神 经病变、 糖尿病性神经病变、 中枢性疼痛、 与脊髓损伤相关的神经病变、 中风、 肌萎缩侧索硬 化 (ALS)、 帕金森氏病、 多发性硬化症、 坐骨神经炎、 下颌关节神经痛、 周围神经炎、 多发性神 经炎、 残肢痛、 幻肢痛、 骨折、 口部神经性疼痛、 夏科氏痛 (Charcot’ s pain)、 I 型和 II 型 复杂性局部疼痛 (complex regional pain) 综合征 (CRPS I/II)、 神经根病变、 格 - 巴二氏 综合征、 感觉异常性股痛、 灼口综合征、 视神经炎、 发热后神经炎、 游走性神经炎、 节段性神 经炎、 贡博氏神经炎 (Gombault’ s neuritis)、 神经元炎、 颈臂神经痛、 颅部神经痛、 膝状神 经节神经痛、 舌咽神经痛、 偏头痛性神经痛、 特发性神经痛、 肋间神经痛、 乳房神经痛、 摩顿 氏神经痛 (Morton’ s neuralgia)、 鼻睫神经痛、 枕神经痛、 红斑性肢痛病、 斯路德氏神经痛 (Sluder’ s neuralgia)、 蝶腭神经痛、 眶上神经痛、 外阴痛或翼管神经痛。
一种类型的神经性疼痛为神经病性冷性异常性疼痛， 其表征为存在神经病变相关 的异常性疼痛状态 ( 其中存在对冷刺激的超敏反应 )。神经病性冷性异常性疼痛的例子包 括由于疾病、 病症、 综合征、 障碍或疼痛状态所致的异常性疼痛， 该疾病、 病症、 综合征、 障碍 或疼痛状态包括神经性疼痛 ( 神经痛 )、 源自脊神经和周围神经手术或创伤、 外伤性脑损伤 (TBI)、 三叉神经痛、 疱疹后神经痛、 灼痛、 周围神经病变、 糖尿病性神经病变、 中枢性疼痛、 中风、 周围神经炎、 多发性神经炎、 I 型和 II 型复杂性局部疼痛综合征 (CRPS I/II) 或神经 根病变的疼痛。 焦虑症的例子包括社交焦虑症、 创伤后应激障碍、 恐惧症、 社交恐惧症、 特殊恐惧 症、 惊恐性障碍、 强迫症、 急性应激障碍、 离别焦虑障碍和泛焦虑症。
抑郁症的例子包括重度抑郁症、 双相性精神障碍、 季节性情感障碍、 产后抑郁症、 躁狂抑郁症和双相抑郁症。
一般合成方法
本发明的代表性化合物可根据下文所述的和在之后的方案和实例中说明的一般 合成方法合成。由于方案是举例说明性的， 所以本发明不应理解为受到方案中所述的化学 反应和条件的限制。 用于方案和实例中的不同起始物质可商购获得或者可通过精通本领域 的技术人员熟知的方法制备。变量是如本文所定义的。
用于本说明书， 特别是方案和实例中的缩写如下 ：
LC-MS/HPLC 方法 ：
方 法 1(HPLC) ：仪 器 ：带 有 DAD 检 测 的 HP 1100，柱 ： Gemini C18， 110A， 30×4.60mm， 3.0μ ； 洗脱液 A ： 水 (0.1 ％ TFA)， 洗脱液 B ： 乙腈 (0.1 ％ TFA) ； 梯度 ： 0 分钟 96％ A → 8.5 分钟 95％ B ； 流速 ： 1.2mL/ 分钟 ； UV 检测 ： 210 和 254nm。
方 法 2(LC-MS) ： MS 仪 ： Micromass LCZ ； HPLC 仪 ： Agilent 1100 系 列 ； 柱 ： SupelcoCosil ABZ+PLUS 3μ， 3.3cm×2.1mm ； 洗脱液 ： 水 (0.1 ％ TFA)， 洗脱液 B ： 乙腈
(0.1％ TFA) ； 梯度 ： 0.0 分钟 100％ A → 6.5 分钟 100％ B ； 流速 0.5ml/ 分钟 ； UV 检测 ： 210 和 254nm。
方 法 3(RP-HPLC) ： HPLC 仪 ： Gilson， 215 液 体 处 理 器， 306 泵 ； 柱： Gemini AXIA， C18， 110A， 5μ， 100×30.0mm ； 洗脱液 A ： 水 (0.1％ TFA)， 洗脱液 B ： 乙腈 (0.1％ TFA) ； 梯度 ： 0.0 分钟开始％ A → 12 分钟结束％ B ； 流速 32ml/ 分钟 ； UV 检测 ： 210 和 254nm。
方案 A 示出了本发明某些中间体的合成路线， 其中 YA 是氢或烷基 ； R2、 R3 和 R4 是如 本文所定义的。
式 A1 化合物可商购获得或可通过科学文献中所描述的已知方法制备。可使式 A1 化合物 ( 其中 XA 为氯或氟， 且 YA 为氢或烷基 ) 在存在碱的情况下与 R- 取代的巯基乙醇酸 酯 ( 其中 R 为 C1-6 烷基 ) 反应而得到式 A2 化合物， 式 A2 化合物可用本领域技术人员已知 的常规化学皂化而得到式 A3 化合物。可用二苯基磷酰基叠氮化物、 叔丁醇和有机碱将将式 A3 化合物转化成式 A4 化合物。 通过 HCl 或另一无机酸的作用， 或通过有机酸如三氟乙酸的 作用， 将式 A4 化合物转化成对应的胺， 即式 A5 化合物。
方案 B 示出了式 (I)-B 化合物的合成路线， 其中 RA 和 RB 合在一起形成经任选取代 的吡咯烷基或哌啶基环。
可用非质子有机溶剂中的硫酰氯将化合物 B1 转化为化合物 B2。可将化合物 B2 在存在三氟甲磺酸甲酯的情况下甲基化而形成化合物 B3。可用式 B4 环胺处理化合物 B3， 以形成式 B5 的化合物。随后用三氟甲磺酸甲酯的处理可形成式 B6 甲基化产物， 其可与式 A5 化合物反应而形成式 B7 化合物。可用碱如氢化钠、 双 ( 三甲基硅烷基 ) 氨基锂、 正丁基 1 锂、 碳酸钾或叔丁醇钾处理式 B7 化合物， 之后用式 R X 化合物 ( 其中 X 为离去基团， 例如溴、 氯、 碘、 甲苯磺酸根、 甲磺酸根等 ) 使其烷化， 以得到式 (I)-B 化合物。或者， 可用三芳基膦 如三苯膦、 三邻甲苯基膦、 三 -2- 呋喃基膦等 ； C1-6 二烷基偶氮二羧酸酯如二乙基 -、 二异丙 1 基 - 或二 - 叔丁基 - 偶氮二羧酸酯等 ； 以及适当取代的醇， R OH 处理式 B7 化合物， 以得到 式 (I)-B 化合物。
方案 C 示出了式 (I)-C1 和式 (I)-C2 的化合物的合成路线， 其中 RA 和 RB 合在一起 而形成含有额外杂原子 G 的经任选取代的环 (G 选自 O、 S、 S(O2)、 N(PG) 和 N(RC)， 其中 PG 是 常规氨基保护基。
可用式 C1 环胺处理化合物 B3， 以形成式 C2 化合物。式 C2 化合物与三氟甲磺酸甲 酯的甲基化作用得到式 C3 化合物。用式 A5 化合物处理得到式 C4 化合物， 式 C4 的化合物 可根据方案 B 所述的方法烷化而形成式 (I)-C1 化合物 ( 其中 G 是 O、 S 或 S(O2))。作为另 一种选择， G 可以是受保护的氨基， N(PG)。当 G 是 N(PG) 时， 该保护基可用常规化学来移除 C 而得到式 C5 胺， 所述胺可用适当的 R - 取代的试剂使用常规的还原性胺化、 烷化或酰化化 C 学进行烷化或酰化， 以形成式 (I)-C2 化合物， 其中 R 如本文所定义。
方案 D 示出了式 (I)-D 化合物的合成路线， 其中 RA 和 RB 合在一起以形成在 4- 位 被 NRDRE 取代的哌啶基环。
式 D1 化合物可根据方案 B 中所述的方法 ( 用 1， 4- 二氧杂 -8- 氮杂 - 螺 [4， 5] 癸 烷代替式 B4 化合物 ) 来制备。用硝酸铈铵 (CAN) 处理得到式 D2 酮。在存在氢化物源 ( 例 如三乙酰氧基硼氢化钠 ) 的情况下与式 D3 胺进行还原性胺化得到式 (I)-D 化合物。
方案 E 示出了式 (I)-E 化合物的合成路线， 其中哌啶 -1- 基用 4-C(O)NRYRZ 代替， 其中 RY 和 RZ 如本文所定义， 并且任选合在一起形成 5 元或 6 元环， 其中所述 6 元环任选含
有 O 或 N- 甲基。
式 E1 化合物可根据方案 B 中所述的方法 ( 用 4- 乙氧基羰基 - 哌啶代替式 B4 化 合物 ) 来制备。式 E1 化合物的常规皂化得到式 E2 羧酸。在存在偶联剂 ( 例如， HBTU、 DCC、 HATU、 EDC 等 ) 的情况下在非质子溶剂中使该酸与式 E3 胺偶联， 得到式 (I)-E 酰胺。 A
方案 F 示出了式 (I)-F 化合物的合成路线， 其中 R 是在末端碳原子被取代基取代 的 C1-6 烷基， 所述取代基选自羧基和 C1-4 烷氧基羰基。
式 F1 化合物可商购获得或可通过科学文献中所描述的已知方法制备。可在存在 碱和叔丁基醇的情况下用二苯基磷酰基叠氮化物处理式 F1 化合物， 以形成式 F2 的 Boc 保 护的胺， 然后可根据方案 B 中所述的方法使该 Boc 保护的胺烷化， 以形成式 F3 的 R1 取代的化合物。Boc 保护基可用常规化学来移除， 例如通过 HCL 或另一无机酸的作用或通过有机 酸 ( 例如， 三氟乙酸 ) 的作用， 以形成式 F4 化合物。在存在叔丁基醇的情况下用氯磺酰异 氰酸酯处理式 F4 酰胺得到式 F5 硫酰胺。可在存在式 F6 的 RA 取代的烷化剂的情况下通过 碱的作用而使式 F5 化合物烷化， 其中 LG 是离去基团， 例如溴化物、 碘化物、 甲苯磺酸根等。 最后移除 Boc 氨基保护基得到式 (I)-F 化合物。
具体实例
试剂购自商业来源。 氢原子的核磁共振 (NMR) 谱是以 (TMS) 为内标， 在指定溶剂中 于 Bruker Avance 400MHz 谱仪上测量。值表示向 TMS 低场方向偏移的 ppm。质谱 (MS) 是 利用电喷雾技术在 Agilent 质谱仪上测量， 表示为 (ESI)m/z(M+H+)。除非另外指明， 否则用 于实例中的材料是从容易获得的供应商获得或通过化学合成领域的技术人员已知的标准 方法合成。 除非另外指明， 否则在不同实例之间不同的取代基是氢。 当反应在微波反应器中 TM 进行时， 使用了 Personal Chemistry Smith Synthesizer 。 在 Gemini C-18 柱 (100×30mm 内径 ； 5μ) 上进行所有反相半制备 HPLC 纯化， 用 MeCN-H2O 梯度洗脱， 使用或不使用 TFA 添 加剂。
实例 1A. 叔丁基 -3- 甲基苯并 [b] 噻吩 -2- 基氨基甲酸酯 (1-B)。将装配有顶置式机 械搅拌器、 N2 入口 / 出口转接器、 回流冷凝器、 加热套和热电偶的 5L 4 颈烧瓶装入叔丁醇 (2.11L)、 化合物 1-A(225.0g， 1.17mol) 和二异丙基乙胺 (225mL， 1.29mol)。将二苯基磷 酰基叠氮化物 (304mL， 1.4mol) 与甲苯 (300mL) 预混合， 然后用 10 分钟逐滴加入。将反应 混合物搅拌回流 21 小时， 冷却至 22℃， 然后真空蒸发。将残余物溶解于 CH2Cl2(1L) 中， 用 1N NaOH(500mL)、 盐水 (500mL) 洗涤， 分离有机层， 将其在 MgSO4 上干燥， 过滤， 并真空蒸发 得到暗桔色油状物 (557g)。将该粗残余物通过用庚烷 -EtOAc 洗脱的快速柱层析 (SiO2) 纯化， 得到 265g 化合物 1-B 的淡黄色固体。1H-NMR(CDCl3) ： δ7.71(d， 1H)， 7.54(d， 1H)， 7.36-7.31(m， 1H)， 7.30-7.20(m， 1H)， 6.75(br s， 1H)， 2.23(s， 3H)， 1.55(s， 9H)。
B.3- 甲基苯并 [b] 噻吩 -2- 胺盐酸盐 (1-C)。将装配有顶置式机械搅拌器、 N2 进 口 / 出口转接器和热电偶的 5L 3 颈烧瓶装入二 烷 (3.1L) 中的 4M HCl、 化合物 1-B(265g，
1.0mol)， 在 22℃下搅拌 18 小时。 过滤收集白色沉淀， 用二乙醚 (3×500mL) 洗涤， 在低真空 1 下于 40℃干燥 48 小时， 以得到 174g 化合物 1-C 的白色固体。 H-NMR(DMSO-d6) ： δ8.7(br s， 3H)， 7.71(d， 1H)， 7.44(d， 1H)， 7.29(t， 1H)， 7.14(t， 1H)， 2.184(s， 3H)。
C.1， 1’ - 双 - 咪唑 -1- 磺酰 (1-E)。向冷却至 0℃的化合物 1-D(20.0g， 294mmol) 在无水 CH2Cl2(210mL) 中的溶液逐滴添加硫酰氯 (5.0mL， 61.6mmol) 在 CH2Cl2(28mL) 中的溶 液。让反应混合物升温至环境温度并搅拌 16 小时。过滤反应混合物， 在低压下蒸发溶剂， 将所得的固体从异丙醇 (100mL) 结晶。滤出白色针状物， 用冷异丙醇洗涤并在低压下干燥， 1 以得到 7.81g(64％ ) 化合物 1-E 的白色固体。 H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ8.50-8.51(d， 2H)， 7.92(s， 2H)， 7.24-7.23(d， 2H) ； MS( 方法 2)m/z 198.9(M+1)。D.1， 1’ - 双 -(3- 甲基 - 咪唑 )-1- 磺酰三氟甲磺酸盐 (1-F)。向冷却至 0℃的化 合物 1-E(1.26g， 6.36mmol) 在 CH2Cl2(10mL) 中的溶液添加三氟甲基磺酸甲酯 (0.719mL， 6.36mmol)。让反应混合物升温至环境温度并搅拌 18 小时。在低压下蒸发溶剂以得到化合 物 1-F 的白色固体。
E.1-( 咪唑 -1- 磺酰基 )- 哌啶 (1-H)。 向溶于 MeCN(1mL) 中的化合物 1-F(0.375g， 1.03mmol) 添加哌啶 (1-G)(0.123mL， 1.24mmol)， 在室温下搅拌反应混合物 18 小时。通过 用 30％至 50％梯度 ( 无 TFA 添加剂 ) 洗脱的反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化反应混合物， 得到 79.6mg(36％ ) 化合物 1-H 的白色固体。MS( 方法 2) ： m/z 216.0(M+1)。
F.1- 甲基 -3-( 哌啶 -1- 磺酰基 )-3H- 咪唑 -1- 鎓三氟甲磺酸盐 (1-I)。向冷却 至 0 ℃的化合物 1-H(79.6mg， 0.37mmol) 在 CH2Cl2(2mL) 中的溶液添加三氟甲基磺酸甲酯 (46μL， 0.407mmol)。让反应混合物升温至环境温度并搅拌 3 小时。在低压下蒸发溶剂以 得到化合物 1-I 的白色固体。MS( 方法 2) ： m/z 229.9(MH+)。
G. 哌 啶 -1- 磺 酸 (3- 甲 基 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )- 酰 胺 (1-J)。 向 化 合 物 1-I(85.2mg， 0.37mmol) 在 MeCN(1.0mL) 中 的 溶 液 添 加 化 合 物 1-C(120.8mg， 0.74mmol) 在 MeCN(1.0mL) 中的溶液， 在 140℃的微波辐射下加热反应化合物 10 分钟。通过用 45 ％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 65％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗脱的反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯 化 反 应 混 合 物， 得 到 46mg 化 合 物 1-J 的 膜。1H-NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ7.71-7.73(t， 1H)， 7.63-7.66(t， 1H)， 7.34-7.40(m， 2H)， 6.28(s， 1H)， 3.27-3.29(m， 4H)， 2.39(s， 3H)， 1.53-1.73(m， 6H) ； MS( 方法 2) ： m/z311.0(M+1)。
H. 哌 啶 -1- 磺 酸 (3- 甲 基 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-(4- 三 氟 代 甲 氧 基 - 苄 基 )- 酰胺， 化合物 1。向化合物 1-J(46mg， 0.148mmol) 在 DMF(1.5mL) 中的溶液添加碳酸钾 (30.7mg ； 0.222mmol)， 将反应混合物在室温下搅拌 30 分钟。 逐滴添加 4- 三氟代甲氧基苄基 溴 (1-K)(45.3mg， 0.178mmol)， 并将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。 将反应混合物在 H2O 和 EtOAc 之间分配， 有机相用 H2O、 盐水洗涤， 在 Na2SO4 上干燥、 过滤， 在低压下蒸发溶剂而得 到黄色油状物。 通过用 65％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 85％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗脱的 1 反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化该粗残余物， 得到 40.6mg 化合物 1 的半固体。 H-NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ7.71-7.73(m， 1H)， 7.52-7.58(m， 1H)， 7.34-7.37(m， 2H)， 7.27-7.31(m， 2H)， 6.99-7.21(m， 2H)， 4.72(s， 2H)， 3.24-3.27(m， 4H)， 1.97(s， 3H)， 1.52-1.62(m， 6H) ； MS( 方 法 2) ： m/z 485.0(M+1)。
按照上面实例 1 中所述工序， 置换适当的试剂、 起始物质和本领域技术人员已知 的纯化方法来制备本发明的下列化合物 ：
吗啉 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 酰 胺， 化合物 2。用吗啉代替实例 1 的步骤 E 中的哌啶来制备化合物 2， 以得到 32.6mg 的半 1 固 体。 H-NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ7.71-7.75(m， 1H)， 7.54-7.64(m， 1H)， 7.34-7.40(m， 2H)， 7.27-7.29(m， 2H)， 6.99-7.16(m， 2H)， 4.76(s， 2H)， 3.68-3.70(m， 4H)， 3.11-3.30(m， 4H)， 1.97(s， 3H) ； MS( 方法 2) ： m/z 487.0(M+1)。
实例 2
A.4-[(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 哌 嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (2-A)。用 N-boc 哌嗪代替实例 1 的步骤 E 中的哌啶并用步骤 F 至 H 中 所概括的化学来制备化合物 2-A(159.9mg(80％ )， 白色泡沫 )。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ 7.86-7.88(m ， 1H) ， 7.64-7.66(m ， 1H) ， 7.35-7.41(m ， 4H) ， 7.27-7.29(m ， 2H) ， 4.77(s ， 2H)， 3.38-3.40(m， 4H)， 3.25-3.27(m， 4H)， 1.99(s， 3H)， 1.40(s， 9H) ； MS( 方 法 2) ： m/z + 485.9(M-Boc ) ； HPLC( 方法 1) ： Rt ＝ 7.76 分钟。
B. 哌嗪 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 氨
磺酰 ]- 酰胺， 化合物 3。向化合物 2-A(159.9mg， 0.273mmol) 的溶液添加二烷 (4mL) 中的 4N 盐酸盐溶液， 并将反应混合物在室温下搅拌 3 小时。在低压下蒸发溶剂， 通过用 40％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 60％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗脱的反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化该粗反应混合物， 以得到 129.2mg(79％ ) 化合物 3 的蜡质白色固体。MS( 方法 2) ： m/z + 485.9(MH ) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.18 分钟。
C.4- 异丙基 - 哌嗪 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧 基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 酰胺， 化合物 4。 向化合物 3(38.4mg， 0.066mmol) 在二氯甲烷 (0.8mL) 中的溶液添加三乙基胺 (10μL， 0.073mmol) 和丙酮 (2-B)(24μL， 0.33mmol)， 并将反应混 合物在室温下搅拌 30 分钟。添加三乙酰氧基硼氢化钠 (21mg， 0.099mmol)， 并将反应混合 物搅拌 18 小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释， 用 H2O 洗涤， 在 Na2SO4 上干燥、 过滤并在 低压下蒸发溶剂。通过用 40％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 60％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗 脱的反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化粗反应混合物， 得到 28.2mg 化合物 4 的澄清半固体。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.72-7.84(m， 1H)， 7.57-7.70(m， 1H)， 7.29-7.46(m， 4H)， 7.17(d， 2H)， 4.76(s， 2H)， 3.98(s， 1H)， 3.43-3.64(m， 4H)， 3.32-3.39(m， 4H)， 1.98(s， 3H)， 1.35(d， 6H) ； MS( 方法 2) ： m/z 528.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 4.94 分钟。
按照上面实例 2 中所述工序， 置换适当的试剂、 起始物质和本领域技术人员已知 的纯化方法来制备本发明的下列化合物 ：
4-(3- 甲基 - 丁基 )- 哌嗪 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟 代甲氧基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 酰胺， 化合物 5。用戊醛替换实例 2 的步骤 B 中的丙酮来 制备化合物 5， 得到 34.2mg 的澄清半固体。1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.73-7.86(m， 1H)， 7.54-7.69(m， 1H)， 7.28-7.45(m， 4H)， 7.17(d， 2H)， 4.76(s， 2H)， 3.98(s， 1H)， 3.43-3.64(m，424H)， 3.32-3.39(m， 4H)， 3.06-3.25(m， 3H)， 1.98(s， 3H)， 1.53-1.74(m， 3H)， 0.98(d， 6H) ； MS( 方法 2) ： m/z 556.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.33 分钟。
4- 甲基 - 哌嗪 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄 基 )- 氨磺酰 ]- 酰胺， 化合物 6。用甲醛代替实例 2 的步骤 B 中的丙酮来制备化合物 6， 得 1 到 3.6mg 的澄清半固体。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.75-7.79(m， 1H)， 7.61-7.63(m， 1H)， 7.34-7.41(m， 4H)， 7.16-7.18(d， 2H)， 4.76(s， 2H)， 3.43-3.64(m， 4H)， 3.32-3.39(m， 4H)， 2.92(s， 3H)， 1.98(s， 3H) ； MS( 方法 2) ： m/z 500.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.29 分钟。
实例 3
4-(2， 2， 2- 三氟 - 乙基 )- 哌嗪 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三 氟代甲氧基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 酰胺， 化合物 7。向化合物 3(38.4mg， 0.066mmol) 在甲苯 (1.0mL) 中的溶液添加二异丙基胺 (14μL， 0.083mmol)， 然后添加三氟甲磺酸 2， 2， 2- 三氟 甲酯 (30mg， 0.128mmol)， 并将反应混合物在 82℃下加热 18 小时。将反应混合物冷却并在 低压下蒸发溶剂。通过用 50％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 70％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗 脱的反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化该粗反应混合物， 得到 21.8mg 化合物 7 的白色固体。 1 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.70-7.86(m， 1H)， 7.60(m， 1H)， 7.26-7.43(m， 4H)， 7.15(d， 2H)， 4.79(s， 2H)， 3.32-3.43(m， 4H)， 3.10(m， 2H)， 2.65-2.81(m， 4H)， 1.96(s， 3H) ； MS( 方 法 2) ： + m/z 567.9(MH ) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 7.29 分钟。
实例 4
A.1， 4- 二 氧 杂 -8- 氮 杂 - 螺 [4， 5] 癸 烷 -8- 磺 酸 (3- 甲 基 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 酰胺 (4-A)。用 1， 4- 二氧杂 -8- 氮杂 - 螺 [4， 5] 癸 烷代替实例 1 的步骤 E 中的哌啶并使用步骤 F 至 H 中所概括的化学来制备化合物 4-A， 以得
1 到 204.1mg(54％ ) 的白色泡沫。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.74-7.76(m， 1H)， 7.54-7.60(m， 1H)， 7.28-7.37(m， 4H)， 7.13-7.15(m， 2H)， 4.76(s， 2H)， 3.93(m， 4H)， 3.41-3.42(m， 4H)， + 1.96(s， 3H)， 1.70-1.73(m， 4H) ； MS( 方法 2) ： m/z 542.8(MH ) ； HPLC( 方法 1) ： Rt6.77 分钟。
B.4- 氧 代 - 哌 啶 -1- 磺 酸 (3- 甲 基 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-(4- 三 氟 代 甲 氧 基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 酰胺 (4-B)。向加热至 70℃的化合物 4-A(204.1mg， 0.376mmol) 在 乙腈 (3.0mL) 中的溶液添加硝酸铈铵 (515.5mg， 0.94mmol) 在 H2O(2.0mL) 中的溶液， 并将反 应混合物在 70℃下加热 1 小时。将反应混合物冷却， 用 EtOAc 稀释， 将有机相用 H2O、 盐水 洗涤， 在 Na2SO4 上干燥， 过滤， 并在低压下蒸发溶剂。通过用 100％庚烷至 50％庚烷 -50％ EtOAc 洗脱的快速柱层析 (SiO2) 纯化该粗反应混合物， 得到 67.9mg(36％ ) 化合物 4-B 的 1 澄清油状物。H-NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ7.71-7.75(m， 1H)， 7.57-7.66(m， 1H)， 7.35-7.40(m， 2H)， 7.21-7.27(m， 2H)， 7.04-7.16(m， 2H)， 4.77(s， 2H)， 3.58-3.64(m， 4H)， 2.50-2.53(m， 4H)， 1.99(s， 3H) ； MS( 方法 2) ： m/z 499.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.82 分钟。
C.4- 二甲基氨基 - 哌啶 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲 氧基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 酰胺， 化合物 8。向化合物 4-B(33.9mg， 0.068mmol) 在二氯甲烷 (1.0mL) 中的溶液添加二甲胺在 THF 中的 2M 溶液 (4-C)(170μL， 0.34mmol)， 将反应混合物 在室温下搅拌 30 分钟。 添加三乙酰氧基硼氢化钠 (22mg， 0.102mmol)， 并将反应混合物搅拌 18 小时。添加额外部分的二甲胺 -THF(0.5mL) 和三乙酰氧基硼氢化钠 (22mg)， 并将反应混 合物在室温下搅拌额外的 18 小时。 将反应混合物用二氯甲烷稀释， 用 H2O 洗涤， 在 Na2SO4 上 干燥、 过滤并在低压下蒸发溶剂。 通过用 40％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 60％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗脱的反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化该粗反应混合物， 得到 19.2mg 化合物 8 的 1 澄清半固体。H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.73-7.78(m， 1H)， 7.59-7.63(m， 1H)， 7.32-7.39(m， 4H)， 7.15-7.17(d， 2H)， 4.79(s， 2H)， 3.95-3.98(m， 2H)， 2.91-3.13(m， 2H)， 2.84(m， 7H)， 2.07-2.10(m， 2H)， 1.98(s， 3H)， 1.66-1.77(m， 2H) ； MS( 方法 2)m/z 528.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.29 分钟。
按照如上实例 4 所述工序， 置换适当的试剂、 起始物质和本领域技术人员已知的 纯化方法来制备本发明的下列化合物 ：
4- 吡咯烷 -1- 基 - 哌嗪 -1- 磺酸 (3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧 基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 酰胺， 化合物 9。用吡咯烷代替实例 4 的步骤 B 中的二甲胺来制备化 1 合物 9， 得到 13.2mg 的澄清半固体。 仅需要用吡咯烷处理一次来完成该反应。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.73-7.77(m， 1H)， 7.59-7.62(m， 1H)， 7.32-7.39(m， 4H)， 7.15-7.17(d， 2H)， 4.79(s， 2H)， 3.91-3.94(m， 3H)， 3.42-3.48(m， 2H)， 3.10-3.12(m， 2H)， 2.93-2.96(t， 2H)， 2.14-2.20(m， 4H)， 1.98(s， 3H)， 1.65-1.72(m， 2H) ； MS( 方法 2) ： m/z 554.0(M+1) ； HPLC( 方 法 1) ： Rt 5.38 分钟。
实例 5
A.1-[(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 哌 啶 -4- 甲酸乙酯 (5-A)。用哌啶 -4- 甲酸乙酯代替实例 1 的步骤 E 中的哌啶并用步骤 F 至 H 中所概括的化学来制备化合物 5-A， 以得到 27mg(60 ％ ) 的油状物。1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ 7.71-7.86(m ， 1H) ， 7.54-7.61(m ， 1H) ， 7.29-7.42(m ， 4H) ， 7.10-7.23(m ， 2H) ， 4.72-4.85(br s ， 2H) ， 4.07-4.23(q ， 2H) ， 3.63-3.79(m ， 2H) ， 2.95-3.11(m ， 2H) ， 2.44-2.61(m， 1H)， 1.99(s， 3H)， 1.87-1.96(m， 2H)， 1.60-1.81(m， 2H)， 1.15-1.31(t， 4H) ； MS m/z 557.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 7.60 分钟。
B.1-[(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 哌 啶 -4- 甲酸， 化合物 10。向溶于 MeOH(1.0mL) 的化合物 5-A(27mg， 0.049mmol) 的溶液添加 3N NaOH(24μL， 0.073mmol)， 并将反应混合物回流 18 小时。将反应冷却并在低压下蒸发溶 剂。将残余固体在 H2O 和 EtOAc 之间分配， 收集有机层， 在 Na2SO4 上干燥， 过滤， 并在低压下 蒸发溶剂。通过用 50％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 70％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗脱的反 相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化该粗物质， 得到 11.2mg 化合物 10 的白色固体。1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.71-7.86(m， 1H)， 7.54-7.61(m， 1H)， 7.29-7.42(m， 4H)， 7.10-7.23(m， 2H)， 4.72-4.85(br s， 2H)， 3.63-3.79(m， 2H)， 2.95-3.11(m， 2H)， 2.44-2.61(m， 1H)， 1.99(s， + 3H)， 1.87-1.96(m， 2H)， 1.60-1.81(m， 2H) ； MS( 方法 2) ： m/z 528.9(MH ) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.68 分钟。
C.4-(4- 甲 基 - 哌 嗪 -1- 羰 基 )- 哌 啶 -1- 磺 酸 -3- 甲 基 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 酰胺， 化合物 11。向溶于二氯甲烷 (2.0mL) 的 化合物 10(49mg， 0.093mmol) 的溶液添加 EDC(27mg， 0.139mmol) 和 N- 甲基 - 哌嗪 (5-B) (12μL， 0.111mmol)， 并将反应混合物搅拌 18 小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释， 用 H2O 洗涤， 在 Na2SO4 上干燥、 过滤并在低压下蒸发溶剂。通过用 38％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 至 58 ％ MeCN-H2O(0.1 ％ TFA) 梯度洗脱的反相半制备 HPLC( 方法 3) 纯化该粗物质， 得到 1 17.6mg 化 合 物 11 的 油 状 物。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.70-7.82(m， 1H)， 7.53-7.67(m， 1H) ， 7.27-7.43(m ， 4H) ， 7.10-7.23(m ， 2H) ， 4.70-4.84(br s ， 2H) ， 3.82-3.90(m ， 2H) ， 3.40-3.65(m， 3H)， 2.89-3.07(m， 3H)， 2.92(s， 3H)， 2.76-2.89(m， 1H)， 1.87-2.00(m， 4H)， 1.63-1.85(m， 5H) ； MS( 方法 2) ： m/z 611.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.24 分钟。
按照上面实例 5 中所述工序， 置换适当的试剂、 起始物质和本领域技术人员已知
的纯化方法来制备本发明的下列化合物 ：
1-[(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-(4- 三氟代甲氧基 - 苄基 )- 氨磺酰 ]- 哌 啶 -4- 羧酸 (2- 二甲基氨基 - 乙基 )- 酰胺， 化合物 12。用二甲基氨基 - 乙胺代替实例 5 的步骤 B 中的 n- 甲基 - 哌嗪来制备化合物 12， 得到 25.0mg 的油状物。1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ 7.69-7.86(m ， 1H) ， 7.53-7.67(m ， 1H) ， 7.28-7.45(m ， 4H) ， 7.08-7.23(m ， 2H) ， 4.69-4.83(br s ， 2H) ， 3.83-3.91(m ， 2H) ， 3.74-3.83(m ， 2H) ， 3.46-3.61(m ， 2H) ， 3.18-3.27(m， 8H)， 2.25-2.45(m， 1H)， 1.90-2.00(m， 4H)， 1.80-1.90(m， 2H)， 1.60-1.80(m， 2H) ； MS( 方法 2) ： m/z 599.1(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.31 分钟。
实例 6
A.(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁酯 (6-B)。将装配有顶置式 机械搅拌器、 N2 进口 / 出口转接器、 回流冷凝器、 加热套和热电偶的 5L 4 颈烧瓶装入叔丁 醇 (2.11L)、 化合物 6-A(225.0g， 1.17mol) 和二异丙基乙胺 (225mL， 1.29mol)。将二苯基磷 酰基叠氮化物 (304mL， 1.4mol) 与甲苯 (300mL) 预混合， 然后用 10 分钟内逐滴加入。将反 应混合物搅拌回流 21 小时， 冷却至 22℃， 然后低压蒸发。将残余物溶解于 CH2Cl2(1L) 中，
用 1N NaOH(500mL)、 盐水 (500mL) 洗涤， 分离有机层， 将其在 MgSO4 上干燥， 过滤， 并低压蒸 发得到暗桔色的油状物 (557g)。将该粗残余物通过用庚烷 -EtOAc 梯度洗脱的快速柱层析 (SiO2) 纯化， 得到 265g 化合物 6-B 的淡黄色固体。1H-NMR(CDCl3) ： δ7.71(d， 1H)， 7.54(d， 1H)， 7.36-7.31(m， 1H)， 7.30-7.20(m， 1H)， 6.75(br s， 1H)， 2.23(s， 3H)， 1.55(s， 9H)。
B.(4- 氟 -3- 三氟甲基 - 苄基 )-(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁 酯 (6-C)。向冷却至 0℃的化合物 6-B(2.0g， 7.59mmol) 在 DMF(20mL) 中的溶液添加 60％ NaH(0.334g， 8.35mmol)， 将该反应混合物搅拌 15 分钟。在 0℃下逐滴添加 4- 氟 -3- 三氟甲 基苄基溴 (1.26mL， 8.35mmol)， 并将反应混合物搅拌 1 小时。将反应混合物倾注到冰水中， 用乙酸乙酯萃取， 将有机相用 H2O、 盐水洗涤， 在 MgSO4 上干燥， 过滤， 并低压蒸发溶剂。通过 用 0％ EtOAc- 庚烷至 25％ EtOAc- 庚烷梯度洗脱的快速柱层析 (SiO2) 纯化该粗油状物， 得 到化合物 6-C 的澄清油状物。将化合物 6-C 用于下一步骤而无需进一步纯化。
C.(4- 氟 -3- 三氟甲基 - 苄基 )-(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )- 胺盐酸盐 (6-D)。 向化合物 6-C 添加 4N HCl 在二 烷 (20mL) 中的溶液， 并将该反应混合物搅拌 3 小时。 将该 反应混合物用乙醚稀释， 滤出固体， 用乙醚洗涤， 并在真空下干燥而得到 1.86g 化合物 6-D 1 的白色固体。 H NMR(CD3OD， 300MHz) ： δ7.61-7.83(m， 3H)， 7.52(d， 1H)， 7.26-7.39(m， 2H)， + 7.10-7.26(m， 1H)， 4.57(s， 2H)， 2.22(s， 3H) ； MS( 方法 2) ： m/z 340.0(MH ) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.78 分钟。
D.N-(4- 氟 -3- 三氟苄基 )-N-(3- 甲基 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-[N’ - 叔丁氧羰 基 ]- 磺酰胺 (6-E)。 向氯磺酸异氰酸酯 (0.720mL， 3.91mmol) 在 CH2Cl2(7.0mL) 中的溶液添 加 CH2Cl2(4.0mL) 中的叔丁醇 (0.793mL， 3.91mmol)， 让该反应物在 0℃下搅拌 30 分钟 ( 在 添加叔丁醇时， 反应放热 )。然后将所制备的溶液逐滴添加至化合物 6-D(1.47g， 3.91mmol) 在 CH2Cl2(7.0mL) 和 TEA(1.63mL， 11.73mmol) 中的冷 (0℃ ) 溶液， 让该反应混合物升温至 环境温度维持 18 小时。将该反应混合物用 EtOAc 稀释， 用 1N HCl、 H2O、 盐水洗涤， 在 Na2SO4 上干燥， 过滤， 并低压蒸发溶剂。通过用庚烷 -EtOAc 梯度洗脱的快速柱层析 (SiO2) 纯化 粗残余物， 得到 813mg 化合物 6-E 的白色泡沫。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ11.65(s， 1H)， 7.91-7.93(m， 1H)， 7.68-7.62(m， 2H)， 7.61-7.65(m， 4H)， 7.37-7.48(m， 3H)， 5.00(br s， 2H)， 2.01(s， 3H)， 1.52(s， 9H) ； MS( 方 法 2) ： m/z 541.0(M+Na) ； HPLC( 方 法 1) ： Rt 6.79 分 钟。
E.N-(4- 氟 -3- 三氟甲基 - 苄基 )-N-(3- 甲基 - 苯并 [b]- 噻吩 -2- 基 )-N’ -( 丁 酸乙酯 )-N-( 叔丁氧羰基 )- 磺酰胺 (6-F)。在室温下向化合物 6-E(200mg， 0.386mmol) 在 DMF(2.0mL) 中的溶液添加 1.0M KOtBu 在 THF 中的溶液 (0.579mL， 0.579mmol)， 并让该悬 浮液在室温下搅拌 30 分钟。将 4- 溴丁酸乙酯 (0.221mL， 1.54mmol) 逐滴添加至反应混合 物， 并让其搅拌 18 小时。反应混合物是不完全的， 添加 K2CO3(53mg)， 然后添加 4- 溴丁酸乙 酯 (0.1mL)， 并将反应混合物在 65℃下搅拌 18 小时。将反应混合物用 EtOAc 稀释， 用 H2O、 盐水洗涤， 在 Na2SO4 上干燥， 过滤， 并低压蒸发溶剂。通过用庚烷 -EtOAc 梯度洗脱的快速 柱层析 (SiO2) 纯化粗残余物， 得到 186.6mg 化合物 6-F 的粘稠油状物。MS( 方法 2) ： m/z 533.1((M-Boc)+1)/655.2(M+Na) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 7.36 分钟。
F.N-(4- 氟 -3- 三氟甲基 - 苄基 )-N-(3- 甲基 - 苯并 [b]- 噻吩 -2- 基 )-N’ -( 丁 酸乙酯 )- 磺酰胺 (6-G)。向化合物 6-F(186mg， 0.296mmol) 添加 4N HCl 在二 烷 (4.0mL)中的溶液， 将该反应混合物在室温下搅拌 24 小时。低压蒸发溶剂， 将残余物与 CH2Cl2(2X) 共沸， 将残余物真空干燥， 得到 164.4mg 化合物 6-G 的黄色油状物。HPLC( 方法 1) ： Rt 6.49 分钟。
G.N-(4- 氟 -3- 三氟甲基 - 苄基 )-N-(3- 甲基 - 苯并 [b]- 噻吩 -2- 基 )-N’ -( 丁 酸 )- 磺酰胺， 化合物 13。向化合物 6-G(164.4mg， 0.309mmol) 在 MeOH(3.0mL) 中的溶液 添加 3N NaOH(0.206mL， 0.617mmol)， 将该反应混合物回流 18 小时。冷却该反应混合物， 通过用 60 ％ MeCN-H2O(0.1 ％ TFA) 至 80 ％ MeCN-H2O(0.1 ％ TFA) 梯度洗脱的反相半制备 HPLC( 方 法 3) 纯 化 粗 残 余 物， 得 到 44.8mg 化 合 物 13 的 澄 清 油 状 物。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ12.09(s， 1H)， 7.99(m， 1H)， 7.83-7.88(m， 1H)， 7.62-7.69(m， 2H)， 7.34-7.45(m， 3H)， 4.76(s， 2H)， 3.07-3.17(m， 2H)， 2.06-2.07(m， 4H)， 1.23-1.77(t， 2H) ； MS( 方法 2) ： m/z 505.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.31 分钟。
实例 7
A.N-(4- 氟 -3- 三氟苄基 )-N-( 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-[N’ - 叔丁氧羰基 ]- 磺酰 胺 (7-A)。用苯并 [b] 噻吩 -2- 甲酸代替实例 6 的步骤 A 中的化合物 6-A 并用步骤 B 至 D 中所概括的化学来制备化合物 7-A， 得到 654mg 的橙色油状物。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ11.76(s， 1H)， 7.87-7.91(m， 1H)， 7.69-7.80(m， 3H)， 7.46-7.51(t， 1H)， 7.33-7.38(m， 2H)， 7.29(s， 1H)， 5.13(s， 2H)， 1.48(s， 9H) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.71 分钟。
B.N-(3- 溴 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-N-(4- 氟 -3- 三 氟 苄 基 )-[N’ - 叔丁氧羰 基 ]- 磺酰胺 (7-B)。在室温下向化合物 7-A(654mg， 1.29mmol) 在 DCE(6.0mL) 中的溶液添 加 NBS(254mg， 1.42mmol)， 并让该反应物在室温下搅拌 18 小时。 添加额外的 NBS(100mg)， 并 将该反应混合物在室温下搅拌 18 小时。 将该反应混合物用 EtOAc 稀释， 用 H2O、 盐水洗涤， 在 Na2SO4 上干燥， 过滤， 并蒸发溶剂。 通过用庚烷 -EtOAc 梯度洗脱的快速柱层析 (SiO2) 纯化该 粗残余物， 得到 565mg 化合物 7-B 的褐色固体。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ11.80(s， 1H)， 8.00-8.03(m， 1H)， 7.70-7.77(m， 2H)， 7.62-7.66(m， 1H)， 7.49-7.54(m， 2H)， 7.41-7.45(t， 1H)， 5.06(s， 2H)， 1.51(s， 9H) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.87 分钟。
C.N-(3- 溴 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-N-(4- 氟 -3- 三 氟 苄 基 )-[N’ - 叔丁氧羰 基 ]- 磺酰胺 (7-B)。在室温下向化合物 7-A(654mg， 1.29mmol) 在 DCE(6.0mL) 中的溶液添
加 NBS(254mg， 1.42mmol)， 并让该反应物在室温下搅拌 18 小时。 添加额外的 NBS(100mg)， 并 将该反应混合物在室温下搅拌 18 小时。 将该反应混合物用 EtOAc 稀释， 用 H2O、 盐水洗涤， 在 Na2SO4 上干燥， 过滤， 并蒸发溶剂。 通过用庚烷 -EtOAc 梯度洗脱的快速柱层析 (SiO2) 纯化该 粗残余物， 得到 565mg 化合物 7-B 的褐色固体。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ11.80(s， 1H)， 8.00-8.03(m， 1H)， 7.70-7.77(m， 2H)， 7.62-7.66(m， 1H)， 7.49-7.54(m， 2H)， 7.41-7.45(t， 1H)， 5.06(s， 2H)， 1.51(s， 9H) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.87 分钟。
D.N-(3- 溴 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-N-(4- 氟 -3- 三 氟 苄 基 )-(N- 乙 酸 乙 酯 )-[N’ - 叔 丁 氧 羰 基 ]- 磺 酰 胺 (7-D)。 在 室 温 下 向 化 合 物 7-B(92mg， 0.158mmol) 在 DMF(0.5mL) 中的溶液添加 60 ％ NaH(8.0mg， 0.205mmol)， 并让该悬浮液在室温下搅拌 30 分钟。将溴代乙酸乙酯 (7-C)(21μL， 0.190mmol) 逐滴添加至该反应混合物， 并让其搅拌 18 小时。将反应混合物用额外的 60 ％ NaH(8mg) 处理， 然后用溴代乙酸乙酯 (21μL) 处 理， 并将该反应混合物在室温下搅拌 18 小时。将反应混合物用 EtOAc 稀释， 用 H2O、 盐水 洗涤， 在 Na2SO4 上干燥， 过滤， 并在低压下蒸发溶剂。通过用庚烷 -EtOAc 梯度洗脱的快 速柱层析 (SiO2) 纯化粗残余物， 得到 34.6mg 化合物 7-D 的黄色油状物。1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.73-7.82(m， 2H)， 7.67-7.69(m， 1H)， 7.45-7.55(m， 3H)， 7.16-7.21(t， 1H)， 5.15(s， 2H)， 4.23(s， 2H)， 4.12-4.21(m， 2H)， 1.57(s， 9H)， 1.15-1.29(m， 3H) ； MS( 方 法 2) ： m/z 570.6((M-Boc)+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 7.79 分钟。
E.N-(3- 溴 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-N-(4- 氟 -3- 三氟苄基 )-(N- 乙酸乙酯 )- 磺 酰胺 (7-E)。向化合物 7-D(34.6mg， 0.052mmol) 添加 CH2Cl2(2mL)， 然后添加 TFA(2mL)， 并 将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。低压蒸发溶剂并干燥。通过用庚烷 -EtOAc 梯度洗脱 的快速柱层析 (SiO2) 纯化粗残余物， 得到 23.9mg 化合物 7-E 的油状物。MS( 方法 2) ： m/z 570.6(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.58 分钟。
F.N-(3- 溴 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-N-(4- 氟 -3- 三 氟 苄 基 )-(N- 乙 酸 )- 磺 酰 胺， 化 合 物 14。 向 化 合 物 7-E(23.9mg， 0.042mmol) 在 MeOH(0.5mL) 中 的 溶 液 添 加 3NNaOH(21μL， 0.062mmol)， 并将该反应混合物回流 2 小时。将该反应混合物冷却， 通过用 55％至 75％ MeCN-H2O(0.1％ TFA) 梯度洗脱的反相半制备 HPLC(Gemini， C-18 柱 ； 100×30mm 1 内径 ； 5μ) 纯化粗残余物， 得到 9.8mg 化合物 14 的澄清油状物。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.68-7.79(m， 3H)， 7.54-7.56(m， 1H)， 7.40-7.45(m， 2H)， 7.12-7.17(m， 1H)， 4.00(s， 2H) ； MS( 方法 2) ： m/z 543.0(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.81 分钟。
按照上面实例 7 中所述工序， 置换适当的试剂、 起始物质和本领域技术人员已知 的纯化方法来制备本发明的下列化合物 ：
N-(3- 溴 - 苯并 [b] 噻吩 -2- 基 )-N-(4- 氟 -3- 三氟苄基 )-(N- 丁酸 )- 磺酰胺， 化合物 15。 用 4- 溴丁酸乙酯代替实例 7 的步骤 B 中的溴代乙酸乙酯来制备化合物 15， 得到 1 17.6mg 的油状物。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ7.38-7.79(m， 6H)， 7.11-7.23(m， 1H)， 5.45(s， 2H)， 2.32-2.41(m， 2H)， 1.75-1.88(m， 2H) ； MS( 方法 2) ： m/z 570.9(M+1) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 5.91 分钟。
N-(3- 溴 - 苯 并 [b] 噻 吩 -2- 基 )-N-(4- 氟 -3- 三 氟 苄 基 )-(N- 己 酸 )- 磺 酰 胺， 化合物 16。用 5- 溴代戊酸乙酯代替实例 7 的步骤 B 中的溴代乙酸乙酯来制备化合 物 16， 得 到 17.6mg 的 油 状 物。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： δ12.06(s， 1H)， 8.15-8.18(m，1H)， 7.94-7.98(m， 1H)， 7.64-7.75(m， 3H)， 7.40-7.51(m， 3H)， 4.81(s， 2H)， 3.02-3.16(m， 2H)， 2.21-2.34(m， 2H)， 1.54-1.55(m， 4H) ； MS( 方法 2) ： m/z 585.0(M+2) ； HPLC( 方法 1) ： Rt 6.54 分钟。
根据本文所述的方案和实例制备了表 1 所示的式 (I) 化合物 1 至 16。
表1
生物学实例
实例 1
犬 TRPM8 的体外功能性测定
式 (I) 化 合 物 的 功 能 活 性 可 通 过 用 Ca2+ 敏 感 性 荧 光 染 料 测 量 细 胞 内 钙 浓 度 的 变 化 来 测 量。 荧 光 信 号 的 变 化 可 通 过 荧 光 读 板 器 FLIPRTM(Molecular Devices) 或 FDSS(Hamamatsu) 监测。在用伊西林素激活后细胞内 Ca2+ 浓度的增加容易被检测到。
在测定前 24 小时， 将稳定表达犬 TRPM8 的 HEK293 细胞接种于黑色壁、 透明底部 的聚 D- 赖氨酸包被的 384 孔平板 (BD Biosciences， NJ， USA) 中的培养基中， 并将其在 37 ℃ 5 ％的 CO2 下培养过夜。在测定当天， 移除培养除并在 37 ℃于 5 ％ CO2 下将钙 3 染料 (Calcium 3 Dye， Molecular Devices) 载入细胞 35 分钟， 然后在室温和大气气氛下保持 25 分钟。随后， 用 FLIPRTM 或 FDSS 测试细胞的激动剂诱导的细胞内 Ca2+ 水平增加。用式 (I) 化合物 ( 在不同浓度下 ) 攻击细胞并测量细胞内 Ca2+5 分钟， 然后添加伊西林素至所有孔以 达到产生大约 80％最大响应的最终浓度。 本发明化合物的 EC50 或 IC50 值可由八点剂量 - 反 应究测定。对每一数据点使用四个重复孔的平均值产生曲线。所得数据在表 2 中示出。
表2
IC50 值是基于单次测定
体内模型
实例 3
抑制啮齿类动物中由伊西林素诱导的行为
伊西林素最初由 Delmar Chemicals Ltd. 作为 “超冷” 化合物研发。后来， 其显示 为最强效的已知 TRPM8 激动剂之一 (McKemy DD 等人， Nature 2002， 416(6876) ： 52-8)， 刺 激钙离子流入 TRPM8 转染细胞中时， EC50 ＝ 0.2μM(Behrendt HJ 等人， Brit J Pharmacol
*2004， 141(4) ： 737-45)。最初的伊西林素体内测试显示其可引起大鼠的 “湿狗样” 抖动。类 似的抖动或跳跃行为在小鼠、 兔、 猫、 狗和猴中也很明显。 在人中， 伊西林素在与粘膜接触时 会产生凉爽的感觉， 当将 0.1mg 滴在舌上时会产生冷刺痛， 并且当经口摄入 5-10mg 时口部、 咽部和胸部的冷感会持续 30-60 分钟 (WeiET， SeidDA， J Pharm Pharmacol.1983， 35， 110)。 抑制或逆转啮齿类动物中由伊西林素诱导的颤抖行为为式 (I)TRPM8 拮抗剂在治疗或预防 受试者中的疾病、 综合征、 障碍或病症的实用性提供了证据， 其中所述疾病、 综合征、 障碍或 病症是受 TRPM8 受体的调节所影响。
实例 3a
抑制大鼠中伊西林素诱导的 “湿狗样” 抖动可将将雄性斯普拉 - 道来 (Sprague Dawley) 大鼠 (220-450g， Charles River Labs， n ＝ 6-9/ 处理 ) 用于评价所选的式 (I) 化合物阻断伊西林素诱导的 “湿狗样” 抖动 (WDS) 的能力。可将式 (I) 化合物在合适的溶媒如羟丙基 -β- 环糊精 (HPβCD)、 甲基纤维 素、 10％聚乙二醇硬脂酸酯 (Solutol) 或 H2O 等中， 通过合适的途径 ( 腹膜内注射或口服 ) 在施用伊西林素之前的 30-120 分钟施用。可将伊西林素在 PEG-400 或 10％聚乙二醇硬脂 酸酯 /H2O 中， 以 1.0 或 3.0mg/kg 经腹膜内注射施用， 并在施用伊西林素后 10-20 分钟可对 自发性 “湿狗样” 抖动进行计数。
实例 3b
逆转大鼠中伊西林素诱导的行为
可将雄性斯普拉 - 道来大鼠 (225-450g， Charles River Labs， n ＝ 4-6/ 处理 ) 用 于评价所选式 (I) 化合物逆转伊西林素诱导的 “湿狗样” 抖动 (WDS) 的能力。可将伊西林 素在 PEG-400 或 10％聚乙二醇硬脂酸酯 /H2O 中， 以 1.0 或 3.0mg/kg 经腹膜内注射施用， 并 在施用伊西林素后 10-20 分钟可对自发性 “湿狗样” 抖动 (WDS) 进行计数。可将可显示 10 次或更多次抖动的动物随机分组成治疗组， 并可立即通过适当途径如腹膜内注射或口服施 用适当溶媒如羟丙基 -β- 环糊精 (HP βCD)、 甲基纤维素、 10％聚乙二醇硬脂酸酯或 H2O 等 中的式 (I) 化合物。在化合物施用 60-70 分钟后可对自发性 “湿狗式” 抖动进行计数。
实例 4
亚急性炎性疼痛的体内模型 ： 角叉菜胶诱导的痛觉过敏
将角叉菜胶经足底注射至大鼠的后爪， 造成强的急性炎性反应， 其表征为发红、 肿 胀和对热和机械刺激物脚爪的超敏反应， 通常在施用后 3-6 小时达峰值并且在 12-24 小时 后消退。
实例 4a
大鼠角叉菜胶诱导的辐射热超敏反应
为了评估式 (I) 测试化合物对炎性痛觉过敏的影响， 可在足底注射角叉菜胶 (λ， IV 型， 200uL) 至雄性斯普拉 - 道来大鼠的单个后爪后 3 小时评估辐射热的反应潜伏期。可 在角叉菜胶注射前 2 小时或在注射后 1 小时可施用测试化合物。目的是确定该化合物是否 可预防或延缓与该致发炎原 (inflammogen) 相关的超敏反应。基线热反应潜伏期可在任何 处理前测定， 并且在角叉菜胶注射后 3 小时再次进行测定。可根据下式计算两种化合物处 理方式的过敏反应的逆转百分比 (％ R) ：
％ R ＝ ( 化合物处理后的潜伏期 - 溶媒处理后的潜伏期 )/(( 基线潜伏期 - 溶媒 处理后的潜伏期 )×100％。
实例 5
用于慢性炎性疼痛的体内模型 ： 弗氏完全佐剂 (CFA) 诱导的痛觉过敏
啮齿动物中弗氏完全佐剂 (CFA) 的足底注射可导致长时间持续的炎性反应， 其表 征为对热和机械刺激物两者的显著超敏反应。这种超敏反应在注射后 24-72 小时间达到峰 值并且可持续数周。 为了评估测试的式 (I) 化合物是否会逆转已建立的超敏反应， 将 CFA 的 100μL 足跖内注射液 ( 悬浮于盐水与矿物油中的热杀死的结核分支杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 的 1 ∶ 1 乳剂中 ) 注射进斯普拉 - 道来大鼠 ( 通常是范围为 150-350g 的雄 性 ) 的单个后爪中。该范例也可以设计用以改变痛觉过敏发展的过程的多次给药或预防性给药方案进行。该测试可预测许多有效临床药剂， 包括对乙酰氨基酚、 NSAIDS 如阿司匹林 和布洛芬， 以及阿片类如吗啡的止痛、 抗痛觉超敏和抗痛觉过敏作用。
实例 5a
CFA 诱导的脚爪辐射热超敏反应
可将每只大鼠置于温热的玻璃表面上的测试箱中， 并让其适应大约 10 分钟。然后 可使辐射热刺激 ( 光束 ) 透过玻璃依次聚焦于各后爪的跖面上。当移开脚爪或达到截止时 间 ( 对于约 5Amp 下辐射热为 20 秒 ) 时， 可通过光电继电器自动关闭热刺激。可记录每只 动物在注射 CFA 之前对热刺激物的最初 ( 基线 ) 反应潜伏期。在足底注射 CFA 后 24 小时， 可再次评估动物对热刺激物的反应潜伏期， 并将其与动物基线反应时间比较。只有显示反 应潜伏期至少降低了 25％ ( 即痛觉过敏 ) 的大鼠被用于进一步的分析。在 CFA 注射后的潜 伏期评估后， 即刻可将测试化合物或溶媒 ( 通常为乙二醇硬脂酸酯、 羟丙基甲基纤维素， 羟 丙基 β- 环糊精或 PEG-400) 腹膜内注射或口服施用至大鼠中。可以固定的时间间隔 ( 通 常为 30、 60 和 120 分钟 ) 评估化合物处理后的缩爪潜伏期。超敏反应的逆转百分比 (％ R) 可根据下式计算 ：
％逆转＝ ( 处理反应 -CFA 反应 )/( 基线反应 -CFA 反应 )×100。
实例 5b
CFA 诱导的脚爪冷性异常性疼痛反应
在足底 CFA 注射之前， 可将小鼠或大鼠单独置于具有丝网地板的升高观察箱中。 透过网状地板， 可将丙酮的三次连续施用物 (0.04-0.10mL/ 施用 ) 用多剂量注射器装置喷 洒在爪底部上。阳性反应形式可以是突然缩爪并且舔舐爪子。可记录三次试验中每一次的 累积舔舐持续时间， 然后将其平均得到个体的反应。在 CFA 注射后二十四小时， 丙酮舔舐持 续时间会显著升高， 从而暗示对冷的超敏反应。可在系统施用式 (I) 测试化合物后评估其 使丙酮诱发的舐爪持续时间恢复至 CFA 处理之前的水平 ( 通常接近为零 ) 的能力。抑制百 分比可如下计算 ：
％抑制＝ [1-( 处理舔舐持续期间 / 溶媒舔舐持续期间 )]×100。
实例 6
化学诱导的内脏痛的腹部刺激模型
可将化学刺激物 ( 如乙酸、 高岭土、 缓激肽、 苯基 -p-( 苯并 ) 奎宁、 溴 - 乙酰胆碱 或酵母聚糖 ) 腹膜内注射进小鼠中， 造成腹部肌肉组织收缩， 其表征为身体延伸至后肢的 伸长。这类反应的次数可以量化并可通过止痛剂预处理来减少， 因此形成了筛选试验的基 础 (Collier HO 等人， Br J Pharmacol Chemother 1968， 32(2) ： 295-310)。此类型的腹部 刺激试验已用于预测许多临床上有效的药剂的止痛效果， 其在腹部刺激试验中的效力相当 于缓解临床疼痛所需的剂量大小。这类药剂包括对乙酰氨基酚、 NSAIDS 如阿司匹林和布洛 芬、 阿片类药物如吗啡和可待因以及其他中枢作用镇痛剂如曲马多。
内脏痛的化学诱导的腹部刺激模型的一种改进形式为用已知在腹膜内注射后可 诱导炎症应答的药剂 ( 如 LPS、 酵母聚糖或硫代乙醇酸酯 ) 预处理动物。在急性化学刺激 物攻击前数小时或数天施用时， 腹膜内小剂量的这类致发炎原已显示会增加所观察到的腹 部收缩次数 (Ribeiro RA 等人， Eur J Pharmacol 2000， 387(1) ： 111-8)。虽然某些止痛剂 在减轻急性内脏化学性伤害感受方面是有效的， 但其他药剂， 特别是依赖受体诱导的那些药剂在预防或逆转由预处理的发炎刺激物而导致的行为反应增强方面更有效。 因为炎症中 TRPM8 受体上调， 所以可有效降低平均收缩次数的 TRPM8 拮抗剂预计可在人临床使用中提 供止痛作用。
可如下研究在预处理的发炎刺激物后， 式 (I) 化合物减轻化学刺激物诱导的腹部 收缩的能力。 可将硫代乙醇酸酯 (3％， w/v， 2-3mL， 腹膜内注射 ) 以最大剂量体积 80mL/kg 注 射至雄性 CD1 小鼠 (20-40g， Charles River Labs) 中， 以诱导腹膜发炎。 在二十四小时发炎 前周期后， 可将这些小鼠用式 (I) 化合物 (30mg/kg， n ＝ 10) 或溶媒 ( 具有 2％ Tween80 的 HPMC ； n ＝ 9) 经口给药， 然后在一小时后使其受到腹部刺激物乙酸 (1％， 10mL/kg， 腹膜内注 射 ) 的攻击。在注射乙酸后， 可立即单独将小鼠单独置于钟形玻璃罐 ( 直径为大约 15cm) 中， 以对接下来的 15 分钟内的腹部收缩进行计数。可统计各处理组的腹部收缩总次数， 并 将其用于下式中以计算抑制百分比 (％ I) ：
％ I ＝ [1-( 测试化合物收缩 / 溶媒收缩 )]×100。
实例 7
神经性疼痛的体内模型
坐骨神经为 ( 后 ) 腿和足的主要感觉运动神经支配。坐骨神经或其组分脊神经受 损经常会造成与疼痛相关的行为。在大鼠和小鼠中， 用丝线紧结扎 L5 脊神经、 用丝线部分 紧结扎坐骨神经或用铬肠线松散结扎坐骨神经， 每一者都会在人中造成使得联想到神经性 疼痛的行为。这些损伤 ( 每只动物一种 ) 可在麻醉的啮齿类动物中通过外科手术进行。脊 神经和坐骨神经损伤两者均会导致异常性疼痛 ( 一种对通常无害的刺激的疼痛反应 ) 以及 痛觉过敏 ( 一种对通常有害的刺激的过度反应 )。 重要的是须注意， 这些疼痛相关行为均可 由测试程序诱发， 除了脚爪偶尔 “防卫” 外， 脚爪的正常使用 ( 例如行走 ) 是相对不受影响。 在外科手术后， 除了受影响的脚爪的超敏反应 ( 如上面定义的 ) 以外， 受试者的行为 ( 例如 理毛行为、 摄食以及体重增加 ) 是正常的。
除了受意外创伤或外科手术所致的神经损伤诱发以外， 神经性疼痛还可由糖尿病 诱发 (Fox， A 等人， Pain 81 ： 307-316， 1999) 或者由用化学治疗剂如紫杉醇或长春新碱处理 诱发 (Yaksh， TL 等人， Pain 93 ： 69-76， 2001)。
在临床上减弱神经性疼痛的药剂在啮齿动物神经性疼痛模型中也是有效的。 这些 药剂包括最近批准的欣百达 (Cymbalta)( 度洛西汀 (Duloxetine)， Iyengar， S. 等人， JPET 2004 311 ： 576-584)、 吗啡 (Suzuki， R 等人， Pain 1999 80 ： 215-228) 和加巴喷丁 (Hunter， JC 等人， Eur J Pharmacol 1997 324 ： 153-160)。TRPV1/TRPM8 受体双重拮抗剂 BCTC 会 降低慢性缩窄性损伤的啮齿动物神经性疼痛模型中的机械性痛觉过敏和触觉异常性疼痛 (Pomonis， JD 等人， JPET 2003 306 ： 387-393 ； Behrendt， H 等人， Brit J Pharm 2004 141 ： 737)。 冷性异常性疼痛是神经性疼痛病症的特别使人虚弱的症状 (Jorum E 等人， Pain 2003 101 ： 229-235)。 在该啮齿动物模型中式 (I) 化合物的抗异常性疼痛效果可预测这些新药剂 的临床作用。
实例 7a
慢性缩窄性损伤 (CCI) 诱导的神经性疼痛模型 - 丙酮诱导的超敏反应
可雄性斯普拉 - 道来大鼠 (225-450g ； n ＝ 5-8/ 处理 ) 用于评价所选的式 (I) 化 合物逆转 CCI 诱导的冷性异常性疼痛反应的能力。可将四条 4-0 铬肠线的松散结扎线在吸入麻醉下通过外科手术设置在左坐骨神经周围， 如 Bennett 等人所述 (Bennett GJ， Xie YK.Pain 1988， 33(1) ： 87-107)。在 CCI 手术后十四至 35 天， 可将受试者置于带有丝网地板 的升高观察箱中， 并可使用多剂量注射器将五次的丙酮施用物 (0.05mL/ 施用， 间隔大约 5 分钟 ) 喷洒于脚爪的足跖表面上。脚爪突然回缩或抬起可被视为阳性反应。可在五次试验 中记录每只大鼠的阳性反应次数。在测定基线缩爪后， 可将合适溶媒 ( 如羟丙基 -β- 环糊 精 (HPβCD)、 甲基纤维素、 Methocel、 10％聚乙二醇硬脂酸酯或 H2O 等 ) 中的式 (I) 化合物 通过合适的途径 ( 腹膜内注射或口服 ) 施用。可在化合物施用 1 至 3 小时后再次测定缩爪 的次数。结果可表示为颤抖的抑制百分比， 对于每个受试者而言其是以 [1-( 测试化合物缩 爪 / 测试前缩爪 )]×100 来计算然后以处理次数进行平均。
实例 7b
慢性缩窄性损伤 (CCI) 诱导的神经性疼痛模型 - 冷板诱导的超敏反应
在雄性 SD 大鼠 (175-325g) 中， 将四根 4-0 铬肠线的松散结扎线在吸入麻醉下通 过外科手术设置于左坐骨神经周围， 如 Bennett 等人所述 (Bennett GJ， Xie YK.Pain 1988， 33(1) ： 87-107)。在慢性缩窄性损伤 (CCI) 手术后七至 21 天， 将受试者置于由 peltier 元 件冷却的市售冷板装置上， 使得表面温度维持在 1℃。让各受试者经受 6 分钟的适应期， 之 后为 3 分钟的评估期， 在评估期间记录总的后爪抬起持续时间。在全身性药物施用之前和 之后以数个间隔时间重复该过程。可评估式 (I) 化合物使脚爪抬起的持续时间恢复至损伤 前水平的能力。将在施用测试化合物后 3 分钟测试周期期间的脚爪抬起持续时间是作为用 测试化合物处理前 3 分钟测试周期期间的脚爪抬起持续时间的百分比取值。
实例 7c
慢性缩窄性损伤 (CCI) 诱导的神经性疼痛模型 - 机械性异常性疼痛 (von Frey 实 验)
在雄性 SD 大鼠 (175-325g) 中， 将四根 4-0 铬肠线的松散结扎线在吸入麻醉下通 过外科手术设置于左坐骨神经周围， 如 Bennett 等人所述 (Bennett GJ， Xie YK.Pain 1988， 33(1) ： 87-107)。在慢性缩窄性损伤 (CCI) 手术后七至 21 天， 将受试者置于带丝网或其 他类型穿孔地板的有机玻璃箱的升高架上。机械性异常性疼痛的测量可使用 von Frey 丝 (Semmes-Weinstein Monofilaments， Stoelting Co.， IL) 进行， 其中可使大鼠在实验开始 前习惯于丝网底的笼子。 通过用 von Frey 丝以递增的力等级 (1.2、 1.5、 2.0、 3.6、 5.5、 8.5、 12、 15、 29 和 76g) 接触后爪的跖面持续最多 6 秒或直到可引发脚爪退缩反应为止， 可检测未 受限制的大鼠的静态异常性疼痛现象。将引发反应所需的最小力记录为以 log g 表示的缩 爪阀值。在全身性药物施用之前和之后以数个间隔时间重复该过程。可评估式 (I) 化合物 使引发脚爪抬起的阀值力量恢复至损伤前水平的能力。
实例 8
发热 / 退热的致炎剂诱导模型
可根据先前记载和验证过的方法， 例如由 Kozak 等人描述的那些方法 (Kozak W， Fraifeld V.Front Biosci 2004， 9： 3339-55)， 在发热的动物模型中测试式 (I) 化合 物。发烧是炎性疾病最常见的伴随症状。动物模型利用酵母和其他致炎剂的发热性质， 皮 下注射酵母悬浮液或其他试剂 (Tomazetti J 等人， J Neurosci Methods 2005， 147(1) ： 29-35) ； Van Miert AS， Van Duin CT.Eur J Pharmacol 1977， 44(3) ： 197-204)。例如， 可将雄性 Wistar 大鼠 (75-100g) 以四只一组圈养于笼子中， 处于受控温度 (23±1 ℃ ) 下， 采用 12 小时光照 ： 12 小时黑暗循环 ( 在 07:00 时开灯 ) 且可随意获得标准实验室食物和 自来水。所有测量温度均是在 08:00 和 19:00 时之间获取。每一只动物仅可用于一个研 究中。直肠温度 (TR) 可通过将润滑的热敏电阻器探头 ( 外径 ： 3mm) 插入动物直肠 2.8cm 来测量。探头可连接至数字装置， 其显示探头顶端的温度， 精度为 0.1 ℃并且随时间推对 值进行记录。在测量了初始的基础直肠温度后， 立刻给动物注射悬浮于不含热原的 0.9％ NaCl(0.05-0.25g/kg， 腹膜内注射 ) 或 0.9％ NaCl(10ml/kg) 中的市售的干 baker 酵母 ( 酿 酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae))。 可每小时至最多 12 小时记录 TR 变化， 并且表示为 与基础值的差值。由于先前已报导处理和测量温度相关的应激反应会改变直肠温度， 所以 在进行实验前可让这些动物习惯于注射和测量操作 2 天。在这些时间段， 让动物经受上述 相同温度测量程序， 并且可腹膜内注射 (i.p.)0.9％ NaCl(10ml/kg)。
为了评估潜在退热化合物对基础直肠温度的影响， 可对研究动物进行 TR 测量 4 小 时， 并且在第四次 TR 测量后， 可用溶媒 ( 如无菌水中的 10％聚乙二醇硬脂酸酯， 5ml/kg) 或 制备于溶媒中的式 (I) 化合物对它们进行皮下 (s.c.) 注射。然后可在注射化合物后， 可 每小时至最多 8 小时记录 TR。为了评估式 (I) 化合物对 baker 酵母诱导的体温过高的影 响， 可以测量研究动物的基础 TR， 然后注射致热剂量的 baker 酵母 ( 例如 0.135g/kg)。当 施用潜在的退热剂如式 (I) 表示的那些化合物时， 可每小时至最多 4 小时记录 TR 变化。然 后， 监测后续 8 小时内的直肠温度。基础直肠温度和直肠温度的变化可以表示为与 07:00 时的 TR 的差值的平均值 ±S.E.M.。可通过双因素方差分析 (ANOVA) 分析数据， 将测量时 间处理为受试者内因素 (within subject factor)， 视实验设计而定。事后分析 (Post hoc analysis) 可根据需要， 通过 F 检验 ( 对于简单效应 ) 以及 Student-Newman-Keuls 检验进 行。P 值＜ 0.05 可视为在统计上显著。
也可通过直肠遥测术或其他体温测量法监测治疗剂对后续发热反应的改变。 在这 些模型中， 数种临床上相关的药剂如对乙酰氨基酚、 阿司匹林和布洛芬可减轻发烧。TRPM8 拮抗剂 ( 如式 (I) 化合物 ) 在这些试验中的退热作用也可预测它们的临床作用。
实例 9
CFA 诱导的类风湿性关节炎模型
可根据先前已记载和验证过的方法， 例如由 Nagakura 等人 (Nagakura 等人， J Pharmacol Exp Ther 2003， 306(2) ： 490-7) 描述的那些方法， 在类风湿性关节炎的动物模 型中测试式 (I) 化合物。 例如， 可在大鼠 ( 雄性 Lewis 大鼠， 150-225g ； Charles River) 中通 过 CFA 接种诱导关节炎。 简而言之， 可将 100mg 乳酪分枝杆菌 (Mycobacterium Butyricum) (Difco， Detroit， MI) 与 20mL 石蜡油充分混合。然后将混合物在 120℃下高压灭菌 20 分 钟。可将各个大鼠在吸入麻醉下在右足垫 ( 后爪 ) 中注射 0.1mL 体积的该混合物。将用作 对照的大鼠注射 0.1mL 盐水。在刚接种之前和接种后最多 28 天， 在用 CFA 处理或用盐水处 理的大鼠中测量疼痛和其他疾病发展参数。疼痛参数的测量可针对机械终点和温度 ( 热 或冷 ) 终点两者进行。机械性异常性疼痛的测量可使用 von Frey 丝 (Semmes-Weinstein Monofilaments， Stoelting Co.， IL) 进行， 其中可使大鼠在实验开始前习惯于丝网底的笼 子。通过用 von Frey 丝以递增的力等级 (1.2、 1.5、 2.0、 3.6、 5.5、 8.5、 12、 15、 29 和 76g) 接 触后爪的跖面持续最多 6 秒或直到可引发脚爪退缩反应为止， 可检测未受限制的大鼠的静态异常性疼痛现象。将引发反应所需的最小力记录为以 log g 表示的缩爪阀值。可使用辐 射热测试评估热痛觉过敏， 在该测试中将可移动的辐射热源置于大鼠放置其上的玻璃表面 下。 可使光束聚焦于后爪上， 脚爪缩回的潜伏期定义为大鼠后爪从热源移开所花费的时间。 关节痛觉过敏的测量可通过先前报导的方法 (Rupniak NMJ 等人， Pain 1997， 71 ： 89-97) 的 改进方法来进行。用左手掌从背部控制住大鼠的躯干， 并且用右手指使足踝在其运动范围 限制内进行弯曲和伸展 ( 一个接一个的， 并且在每个方向进行五次 )。记录各脚爪在操作 ( 弯曲和伸展， 每个方向五次 ) 后发出的嘶叫总次数 ( 各脚爪的最高得分为 10)。
灵活性打分可通过 Butler 等人所报导的评价量表 (Butler SH 等人， Pain 1992， 48 ： 73-81) 进行 ： 6 分， 正常行走 ； 5 分， 对同侧后爪保护性地行走 ( 同侧后爪完全接触地 板)； 4 分， 对同侧后爪保护性地行走 ( 仅后爪脚趾接触地板 ) ； 3 分， 对两只后爪保护性地 行走 ( 对侧后爪完全接触地板 ) ； 2 分， 对两只后爪保护性地行走 ( 仅对侧后爪脚趾接触地 板)； 1 分， 仅用前爪爬行 ； 0 分， 不移动。可在市售的容积测量仪装置中通过电解质溶液的 体积置换来测量脚爪体积。可浸入后爪至多毛皮肤的连接处， 在数字显示器上读取体积。 关节僵直度的打分可如下进行 ： 用左手掌从背部控制各大鼠的躯体， 并且用右手指使得足 踝在动作范围限制内的进行弯曲和伸展 ( 每个方向一次 )。可预先确定的是在自然的大鼠 中弯曲和伸展操纵中足踝关节的运动没有限制， 可根据 Butler 所报导的评价量表 (Butler SH 等人， Pain 1992， 48 ： 73-81) 进行打分 ： 2 分， 在弯曲和伸展两方面足踝运动的整个范围 有限制 ； 1 分， 在弯曲或伸展方面足踝运动的整个范围有限制 ； 0 分， 无限制。可测量两只后 爪的脚爪体积和关节僵直度。
可如下评估式 (I) 化合物的抗痛觉过敏功效 ： 将待用 CFA 处理的三十二只大鼠 ( 每种剂量 8 只大鼠， 每种化合物四种剂量 ) 和用作天然对照的其他八只大鼠用于各药物评 价。可在接种后第 9 天 ( 这时机械性异常性疼痛、 热痛觉过敏、 关节痛觉过敏和关节僵直在 同侧脚爪中达到几乎最大时 ) 评估止痛效果， 但是对侧脚爪的那些参数仅有些微改变， 并 且由灵活性得分的改变显示的全身性干扰较小。在评价的前一天， 可测量待用于化合物评 价的 32 只大鼠的体重、 机械性异常性疼痛、 热痛觉过敏和关节痛觉过敏。将大鼠分配为四 组 ( 每组八只大鼠 )， 使得组间的那些参数的平均值的差异变小。 所有的止痛效果评价和行 为观察可由对药物处理不了解的观察者进行。
数据可表示为平均值 +/-S.E.M.。可对机械性异常性疼痛、 热痛觉过敏、 关节 痛觉过敏、 体重和脚爪体积的时间 - 过程曲线进行带有事后 t 检验的双因素重复测量方 差分析。在评价式 (I) 化合物的实验中， 溶媒处理组和天然对照组之间的得分差异性可 由 Student’ s t 检验分析， 以确认在同侧脚爪中疼痛参数的显著变化。止痛效果可由 Dunnett’ s t 检验分析， 并且在每种情况下可将药物处理组与溶媒处理组相比较。在各统 计分析中， 可对对应侧的脚爪进行比较。P ＜ 0.05 被视为在统计上显著。在该模型中， 中枢 作用性止痛剂吗啡和曲马多可完全缓解疼痛， 而 NSAID 类、 吲哚美辛和双氯芬酸部分有效， 从而证明该模型的临床预测性。在该测试中式 (I) 化合物的止痛效果可预测它们在治疗关 节炎中的临床有效性。
实例 10
关节炎的体内模型 ： 致炎原诱导的膝关节痛觉过敏
可根据先前记载和验证过的方法， 如 Sluka 等人所描述的那些方法 (Sluka KA，Westlund KN.Pain 1993， 55(3) ： 367-77)， 在骨关节炎的动物模型中测试式 (I) 化合物。 例 如， 可将重 225 至 350g 的雄性斯普拉 - 道来大鼠 (Harlan， Indianapolis， IN) 用汽化氟烷 暂时麻醉， 然后将 3％角叉菜胶与 3％高岭土的混合物 (0.9％无菌盐水中 100μL) 注射进一 个膝盖的关节腔中。注射后， 将动物放回其笼子中直至测试时为止。对于行为测试， 将动物 置于单独的在限制运动的升高丝网表面顶部上的透明塑胶笼内。 在测试前应让动物适应大 约 1 小时。然后， 将如上所述的 Von Frey 丝用于测试对机械刺激的增强反应。可穿过丝网 将细丝连续垂直施加于第三和第四节趾骨肉趾中间的足跖表面。 对机械刺激的反应阀值的 测定可在膝关节发炎之前进行 ； 在发炎后 4 小时进行以确定痛觉过敏的发展 ； 在施用测试 化合物如式 (I) 化合物后即刻 ( 即发炎后 5 小时 ) 进行 ； 以及在发炎后 8、 12 和 24 小时进 行。
Kruskal-Wallis 检验为一种非参数检验， 可用于分析在基线、 发炎后 4 小时和化 合物处理后 ( 发炎后 5 小时、 8 小时、 12 小时和 24 小时 ) 对机械刺激的反应的频率、 强度和 组的影响。组之间的进一步事后检验可用曼 - 惠特尼 U 检验 (Mann-Whitney signed rank test) 进行。数据可表示为具有 25 和 75 百分位数的中位数。显著性为 P ≤ .05。
此外， 可将动物的步态或其他疼痛相关行为打分为关节炎对动物活动的疼痛作 用的因变量度 (Hallas B， Lehman S， Bosak A 等人， J Am Osteopath Assoc 1997， 97(4) ： 207-14)。测试药物对动物正常行为的影响可从零 ( 表示无反应 ) 至三 ( 表示失能损害 ) 来量化。有效的止痛处理包括临床上使用的吲哚美辛 (Motta AF 等人， Life Sci 2003， 73(15) ： 1995-2004)。因而， 式 (I) 化合物在该模型中的有益效果将预示其临床相关性。
实例 11
肉瘤细胞诱导的骨癌疼痛模型
可根据先前已记载和验证过的方法， 例如在科学文献 (E1 Mouedden M， Meert TF.Pharmacol Biochem Behav 2005， 82(1) ： 109-19 ； Ghilardi JR， 等人 J Neurosci 2005， 25(12) ： 3126-31) 中所述的那些方法， 在骨癌疼痛的动物模型中测试式 (I) 化合物。为了 准备细胞接种和肿瘤诱导， 可将溶骨性鼠肉瘤细胞 (NCTC 2472， 美国典型培养物保藏中心 (ATCC)， Rockville， MD， USA) 在含有 10％马血清 (Gibco) 的 NCTC 135 培养基 (Invitrogen) 中培养， 并根据 ATCC 指导原则每周传代 2 次。对于它们的施用， 可通过刮擦使细胞脱离， 然后以 1000×g 离心。将片状沉淀物悬浮于新鲜的 NCTC 135 培养基中 (2.5×106 个细胞 /20μL)， 然后用于髓内股骨接种。 将雄性 C3H/HeNCrl 小鼠 (25-30g， Charles River Labs) 用于这类实验。在用甲苯噻嗪 (10mg/kg， 腹膜内施用 ) 和氯胺酮 (100mg/kg， 腹膜内施用 ) 引起全身麻醉后， 将左后爪剃毛并用聚维酮碘、 接着用 70％乙醇消毒。 然后在覆盖膝盖骨的 膝盖上方切出 1cm 的浅表切口。随后切开髌韧带， 从而暴露股骨远端的髁突。插入 23 号针 至髁间窝和股骨髓腔的程度， 以产生用于注射细胞的腔室。然后用注射器将二十微升培养 基 ( 假手术动物 ) 或含有肿瘤细胞的培养基 ( 大约 2.5×106 个细胞 ) 注射进骨腔中。为 了防止细胞泄漏出骨外， 可用牙科用丙烯酸类树脂密封注射部位， 并用皮肤缝线缝合伤口。
可在具有确认的痛觉过敏 ( 通过自发的提起行为评估 ) 的单独的假手术小鼠组和 骨癌小鼠组 (n ＝ 6) 中评价疼痛行为。可在肿瘤接种之前和之后的 3 周期间内对动物进行 行为测试。在整个实验期间记录小鼠的体重， 以帮助监测一般健康状态。为了测量自发的 提起， 可让动物习惯处于置于水平表面上的直径为 20cm 的透明丙烯酸类树脂圆筒中， 之后在 4 分钟期间观察左后爪的自发提起行为。在自发提起行为评估后， 可将动物立即置于速 度为 16rpm 的小鼠转轮 ( 例如 ENV-575M\， Med Associates Inc.， GA， USA) 上 2 分钟， 其中 对强制走动期间的四肢使用情况进行打分 ： 4 ＝正常 ； 3 ＝跛行 ； 2 ＝部分不使用左后爪 ； 1 ＝基本上不使用左后爪 ； 0 ＝不使用左后爪。可通过使小鼠的同侧后爪暴露于 5 次重复丙 酮施用 (20μL)， 并量化提起 / 舔舐频率和 / 或持续时间来评价冷性异常性疼痛。 骨组织破 坏的死后评价可通过 ACT 处理， 之后用诸如用于小动物成像的 Skyscan 1076 显微断层摄影 系统 (Skyscan 1076\， Skyscan， Aartselaar， Belgium) 之类的系统进行扫描来评估。随后 可将所测量的骨组织破坏的组织形态学参数与行为终点相关联。
可在这种骨癌疼痛的鼠模型中于独立的组 ( 每剂量组 n ＝ 6) 中测试式 (I) 化合 物的抗痛觉过敏、 抗痛敏和疾病调节作用。可对确认为痛觉过敏 ( 通过自发或丙酮诱发的 提起来评定 ) 的动物进行行为测试， 例如， 在股骨远端肿瘤接种后第 15 和 22 天， 在全身性 施用溶媒 ( 如无菌水中的 20 ％ HPbCD) 或式 (I) 化合物之前和施用后 1 小时进行行为测 试。可通过单因素 ANOVA 进行统计分析， 以比较实验组间的行为测量结果和骨参数。为了 比较假手术动物和荷瘤动物之间的行为测量结果和骨参数， 可使用曼 - 惠特尼 U 检验。P ＜ 0.05( 双尾检验 ) 时结果被视为在统计上是显著的。数据表示为平均值 +/-S.E.M.。
骨癌会造成人强烈疼痛， 将其在啮齿动物的骨癌疼痛动物模型中进行了模拟， 例 如如上所述的。在该模型中有效的止痛治疗剂包括 COX-2 抑制剂 (Sabino MA， Ghilardi JR， Jongen JL 等人， Cancer Res 2002， 62(24) ： 7343-9) 和高剂量的吗啡 (Luger NM 等人， Pain 2002， 99(3) ： 397-406)、 临床上用于为经历骨癌疼痛的患者缓解疼痛的药剂。由于这 种模型如此接近地模拟人的疾病状态， 冷性异常性疼痛是显著症状的这一发现 (Lee， Seong 等人， Yonsei Med J 2005， 46(2) ： 252-9) 有力地支持这样一种观念 ： 本发明的 TRPM8 拮抗 剂将会缓解与人骨癌相关的疼痛。
实例 12
呼吸性刺激物诱导的咳嗽模型
可根据先前已记载和验证过的方法， 例如在如下文献中所描述的那些方法在动 物模型中测试式 (I) 化合物 ： Tanaka， M. 和 Maruyama， K.J Pharmacol.Sci 2005， 99(1)， 77-82 ； Trevisani， M. 等 人， Throax 2004， 59(9)， 769-72 ； 以 及 Hall， E. 等 人， J Med. Microbiol 1999， 48 ： 95-98。测试是在具有 400mL/ 分钟恒定气流的透明通风箱中进行。咳 嗽药剂 ( 柠檬酸 0.25M 或辣椒碱 30mM) 可经由 0.4mL/ 分钟输出的微超声波雾化器雾化。 可使用领夹麦克风检测咳嗽的出现， 并且可通过动物的特征性姿势确认。可录下咳嗽声音 并数字化储存。随后盲法观察者对引发的咳嗽费力的次数进行计数。在一些情况下， 可通 过预先暴露于某些药剂如卵清蛋白来使动物致敏。 可在刺激物诱导的咳嗽高峰时施用测试 化合物， 以评价该化合物的止咳作用。 此外， 预防性或多次给药方案可用于评价测试化合物 对刺激物诱导的咳嗽的发作和持续时间的调节。 这些测试的变型形式可预测有效临床药剂 ( 包括 NMDA 拮抗剂如右羟吗喃和右美沙芬、 阿片类如可待因、 β2 激动剂如沙丁胺醇以及抗 毒蕈碱类如异丙托铵 ) 的止咳作用 (Bolser， D.C. 等人， Eur J Pharmacol 1995， 277(2-3)， 159-64 ； Braga， P.C.Drugs Exper Clin Res 1994， 20， 199-203)。 薄荷醇在豚鼠和人两者中 的止咳作用 (Eccles R.Curr Allergy Asthma Rep 2003， 3(3) ： 210-4 ； Laude EA 等人， Pulm Pharmacol 1994， 7(3) ： 179-84 ； Morice AH 等人， Thorax 1994， 49(10) ： 1024-6) 可预测式(I) 化合物作为止咳药剂的临床实用性。
实例 13
化学刺激物诱导的皮肤过敏、 超敏反应和 / 或炎症的瘙痒、 接触性皮炎、 湿疹和其 他表现的模型
可根据先前已记载和验证过的方法， 例如在如下科学文献中所描述的那些方 法， 在接触性皮炎或搔痒的动物模型中测试式 (I) 化合物 (Saint-Mezard P 等人， Eur J Dermatol 2004， 14(5) ： 284-95 ； Thomsen J.S. 等人， J Exp Dermatol 2002， 11(4) ： 370-5 ； Weisshaar E 等 人， Arch Dermatol Res 1998， 290(6) ： 306-11 ； Wille JJ 等 人， Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 1999， 12(1-2) ： 18-27)。可将小鼠 ( 或诸如豚鼠或大鼠之 类的物种 ) 用涂于剃毛的背侧皮肤的 25mL 0.5％二硝基氟苯溶液 ( 在施用前立刻稀释于 4 ∶ 1 的丙酮∶橄榄油中的 DNFB， 或其他半抗原如 12- 肉荳蔻酸酯 -13- 乙酸酯、 苦基氯、 唑酮、 辣椒碱、 花生四烯酸、 乳酸、 反式视黄酸或月桂基硫酸钠 ) 致敏或未处理 ( 对照 )。 五天后， 将 10mL 0.2％ DNFB( 无刺激性剂量 ) 施用于右耳的两侧上， 并将相同量的溶剂单 独施用至左耳上。用卡尺每日监测耳朵厚度。在发炎峰值时施用式 (I) 化合物， 以评价化 合物的抗过敏活性。此外， 可利用预防性或多次给药方案来评价测试化合物对发作的调 节和抗过敏活性的持续时间。这些试验的变型形式可预测有效临床药剂的抗过敏和搔痒 活性。血清素诱导搔痒的跨物种能力所支持了这些模型预测化合物对人皮肤病症的疗效 的能力 (Weisshaar E， Gollnick H.Skin Therapy Lett 2000， 5(5) ： 1-2， 5)。另外， 在这 些模型中商业上重要的药剂的接触致敏性质和离子通道调节剂预防和治疗皮肤致敏的能 力 (Kydonieus， A. 等人， Proceedings of the International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials 24th ： 23-24， 1997) 证明了式 (I) 化合物在皮肤致敏中 的治疗效用。
实例 14
化学刺激物诱导的鼻超敏反应和 / 或鼻炎以及其他表现的模型
可 根 据 先 前 已 记 载 和 验 证 过 的 方 法， 例如在科学文献中描述的那些方法 (Hirayama， Y 等人， Eur J Pharmacol 2003， 467(1-3)， 197-203 ； Magyar， T 等人， Vaccine 2002， 20(13-14)， 1797-802 ； Tiniakov R 等人， J Appl Physiol 2003， 94(5)， 1821-8)， 在鼻 炎的动物模型中测试式 (I) 化合物。可在响应用一种或多种刺激物如冷空气、 辣椒碱、 缓激 肽、 组胺、 花粉、 硫酸葡聚醣、 2， 4- 甲苯二异氰酸酯、 支气管败血性博德特氏菌 (Bordetella bronchiseptica)、 出血败血性巴斯德氏菌 (Pasteurella multodica) 或乙酸进行的鼻内攻 击的小鼠、 豚鼠、 狗或人中进行测试。在一些情况下， 可通过预先暴露于某些试剂 ( 包括但 不限于豕草或卵清蛋白 ) 来使动物致敏。在施加刺激物之前或之后， 通过肠或肠胃外途径， 使被测受试者分别接受一次或多次式 (I) 化合物或溶媒对照的预防性或治疗性施用。测试 化合物处理的受试者较于溶媒处理的受试者的鼻炎或致敏的显著差异可作为抗鼻炎活性 的证据。 自变量包括剂量、 频率和施用途径、 预防性或治疗性测试化合物的施用和刺激物攻 击之间的时间间隔以及被测受试者的性别和非性别遗传型。 神经源性炎症在这些超敏反应 状态中的本质作用证实式 (I) 化合物会使这些疾病状态根本的致敏作用脱敏或阻断该致 敏作用。
实例 15冲突诱导的焦虑、 惊恐性障碍和其他非适应性应激或恐惧反应的模型
可根据先前已记载和验证过的方法， 例如由 Cryan 和 Holmes 描述的那些方法 (Cryan JF， Holmes A.Nat Rev Drug Discov 2005， 4(9) ： 775-90) 或 Braw 等人描述的那 些方法 (Y.Braw 等人， Behav Brain Res 2006， 167 ： 261-269)， 在焦虑、 惊恐性障碍和其 他非适应性反应的动物模型中测试式 (I) 化合物。具体地讲， 对于在大鼠中的研究， 可利 用下列装置 ： 由不透明壁 (30cm 高 ) 圈起的空旷场所 (62cm×62cm)， 以及由两个开放臂 (50cm×10cm) 和具有开放顶的两个封闭臂 (50cm×10cm×40cm) 组成的十字迷宫， 该迷宫 的布置方式使得每种类型的两个臂彼此相对。 将该迷宫升高至 70cm 高度。 封闭臂的壁由黑 色树脂玻璃制成， 而底板由白色树脂玻璃制成。 可用 ‘Observer’ 系统 (Noldus Information Technology) 分析录像带记录。 将受试大鼠从其饲养笼移出， 测量体重并轻轻地放在所述空 旷场所的中央。让大鼠自由地探索该空旷场所， 同时将其行为录像 5 分钟。之后， 将其转移 至十字迷宫并放置在中央， 面对封闭臂。可再次将大鼠的行为录像 5 分钟， 之后将其放回其 饲养笼中。在用大鼠进行实验之间， 用 70％乙醇溶液清洁装置。
可将空旷场所测量和十字迷宫测量分成两种行为类型， 即 “焦虑样行为” 和 “活跃 性” 。空旷场所行为测量可包括 ： 1) 焦虑测量 ： 在中央方格的％时间， 进入中央方格的％次 数 ( 与所进入的总方格数相比 )，％站立不动时间， 至第一次站立不动的潜伏期 ( 当受试 者处于不移动状态至少 3 秒时对站立不动进行评分 ) ； 以及 2) 活跃性测量 ： 所进入的总方 格数， 直立次数 ( 以两只后腿站立 )， 第一次直立的潜伏期。十字迷宫测量可包括 ： 1) 焦虑 ： 在开放臂中的％时间， 进入开放臂的％次数 ( 与总进入次数相比 )， 无防备的头向下探究次 数， 至进入开放臂的潜伏期 ； 以及 2) 活跃性 ： 进入所有臂的总次数。 对于每次受试者间的比 较， 可通过对每次测量的单因素 ANOVA 来分析焦虑样行为和活跃性。可以类似方式进行十 字迷宫分析。
还以该方式在小鼠或大鼠中进行测试以测量对其他厌恶性环境刺激的回避， 例如 Geller 或 Vogel 抗冲突实验、 明 / 暗实验和洞板实验 ( 参见 Cryan JF， Holmes A.Nat Rev Drug Discov 2005， 4(9) ： 775-90)。在暴露环境之前， 可通过肠或肠胃外途径， 使被测受试 者接受一次或多次式 (I) 化合物或溶媒对照 ( 例如无菌水中的 10％聚乙二醇硬脂酸酯 ) 的预防性施用。可测量在厌恶行为上所花费的累积时间或次数。测试化合物处理的受试者 较于溶媒处理的受试者的这些测量结果中的一种或多种的显著差异可作为抗焦虑活性的 证据。由于临床上有用的抗焦虑剂的有效性在药理学验证了这些模型 (Cryan JF， Holmes A.Nat Rev Drug Discov 2005， 4(9) ： 775-90)， 所以它们可用于检测式 (I) 抗焦虑化合物。
实例 16
膀胱压力和肥大诱导的尿失禁模型
可根据先前已记载和验证过的方法， 例如在科学文献中描述的那些方法 (Kaiser S， Plath T， Metagen Pharmaceuticals GmbH， 德国， 德国专利 10215321 ； McMurray G 等 人， Br J Pharmacol 2006， 147 Suppl 2 ： S62-79)， 在尿失禁的动物模型中测试式 (I) 化合 物。TRPM8 在人前列腺、 睾丸、 精小管、 阴囊皮肤和炎性膀胱中表达 (Stein RJ 等人， J Urol 2004， 172(3) ： 1175-8 ； Stein RJ 等人， J Urol 2004， 172(3) ： 1175-8 ； Mukerji 等人， BMC Urology 2006， 6： 6)。通过冷却或施加薄荷醇来使 TRPM8 受体兴奋可导致膀胱收缩和排尿 阈体积降低 (Tsukimi Y， Mizuyachi K 等人， Urology 2005， 65(2) ： 406-10)。为了评估式(I) 化合物的潜在尿失禁活性， 通过外科手术给斯普拉 - 道来大鼠植入膀胱导管， 从而使得 能传送流体 ( 通常是盐水 ) 和监测压力 ( 利用压力传感器 )。膀胱测压记录可用多道记录 仪监测以评价排泄时间间隔、 阈值压力、 膀胱容量、 膀胱顺应性和自发性膀胱收缩的次数。 例如， 可将膀胱导管连接至 Harvard 输注泵， 用盐水以 2mL/h 灌注膀胱过夜。第二天早晨， 可将膀胱导管连接 ( 利用 “T” 型连接器 ) 至 Statham 压力传感器 (P23Db 型 ) 以及连接至 Harvard 输注泵。 可将连接至肌张力变位换能器 (Grass FTO3) 的塑料烧杯放置于大鼠笼下 以收集和记录尿量。可通过输注盐水 (20mL/h) 来开始膀胱功能的膀胱内压测量评价， 并且 在第一次排尿后维持输注 20 分钟。在第一次膀胱内压测量周期后两小时， 给大鼠经口施用 式 (I) 化合物并在施用测试化合物后 30 分钟至 4 小时之间进行第二次膀胱内压测量。可 以类似方式将适当的溶媒 ( 如无菌水中的 10％聚乙二醇硬脂酸酯 ) 施用给用作对照的大 鼠， 并在相同的各个时间点进行膀胱内压测量。
还可在膀胱肥大和不稳定的情况下评价式 (I) 化合物。处于麻醉情况下， 将结扎 丝线绑在啮齿动物的近端尿道， 从而导致出口梗阻以及在 6-9 周内后续发展为肥大膀胱 (Woods M. 等人， J Urology 2001， 166 ： 1142-47)。 然后如上所述评价膀胱内压测量记录。 这 种临床前处理对具有治疗尿失禁的临床效用的化合物敏感 (Soulard C 等人， J Pharmacol Exp Ther 1992， 260(3) ： 1152-8)， 并且式 (I) 化合物在该模型中的活性将可预测临床实用 性。
实例 17
冷增强的中枢性疼痛状态的体内模型
脑或脊髓损伤， 例如创伤、 血流阻断或神经变性疾病所致的那些损失常常会促成 中枢性疼痛病症。部分表征为对冷刺激超敏反应的这类损伤的例子包括 ： 多发性硬化症 (Morin C， 等人 Clin J Pain 2002， 18(3) ： 191-5 ； Svendsen KB， 等人 Pain 2005， 114(3) ： 473-81)、 中 风 或 脑 缺 血 (Greenspan JD， 等 人 Pain.2004， 109(3) ： 357-66) 和 脊 髓 损 伤 (Defrin R， Ohry A， Blumen N， Urca G-Pain 2001， 89(2-3) ： 253-63 ； Defrin R， 等人 Brain 2002， 125(Pt 3) ： 501-10 ； Finnerup NB， 等人 Anesthesiology 2005， 102(5) ： 1023-30)。 这 些病症中的每一者都可容易地产生动物模型， 用于评价式 (I) 化合物缓和超敏反应状态的 能力。例如， 脊髓损伤 (SCI) 可在手术时体重为 150-200g 的成年斯普拉 - 道来大鼠中进行 (Erichsen 等人， Pain 2005， 116 ： 347-358)。 可用水合氯醛 (300mg/kg， 腹膜内施用， Sigma， USA) 将大鼠麻醉， 并将导管插入颈静脉中。然后， 可沿背部作一个中线皮肤切口， 以暴露 T11-L2 椎骨。 将动物置于可调氩离子激光器 (Innova model 70， Coherent Laser Products Division， CA， USA) 下， 该激光器在 514nm 波长下操作， 平均功率为 0.17W。使激光聚焦成覆 盖单个 T13 椎骨的细光束， 可照射该椎骨 10 分钟。在照射之前， 立即将赤藓红 B(Aldrich， 32.5mg/kg， 溶于 0.9％盐水中 ) 经由颈部导管静脉内注入。由于赤藓红 B 快速代谢， 可在 5 分钟后重复注射以维持足够的血液浓度。在照射期间， 可通过加热垫使体中心温度维持在 37-38℃。照射后， 使伤口闭合于组织层中并将皮肤缝合在一起。
可按常规测试 SCI 大鼠在手术后 3-4 周疼痛样行为的出现。可将动物的毛在皮肤 疼痛阀值检验之前至少一天剃掉， 以避免皮肤受体致敏。 在测试期间， 可由实验者将大鼠轻 轻地保持处于站立姿势， 并可检验肋腹区域和后肢对感觉性刺激的超敏反应。在药物测试 当天， 根据实验计划给 SCI 大鼠施用药物， 并测量疼痛样行为的时间过程。为了测试冷性异常性疼痛的存在， 可将氯乙烷或丙酮喷洒至动物皮肤上， 通常动物已事先通过 von Frey 丝测试确定为对机械性刺激敏感。可观察对冷刺激的后续反应并根据下列等级分类 ： 0， 无 可见反应 ； 1， 局部反应 ( 皮肤颤搐 ) 而无嘶叫 ； 2， 短暂嘶叫 ； 3， 持续嘶叫。可使用基于秩的 Kruskal Wallis ANOVA 来分析在用式 (I) 化合物或溶媒预处理后响应冷刺激而获得的非参 数性数据的总体效应。
实例 18
麻醉后寒战的体内模型
类似寒战的自发性麻醉后战栗常见于麻醉后恢复期间。 术后患者的风险包括代谢 速率增加至高达 400％、 低氧血症、 伤口裂开、 牙齿损伤以及精细手术修补的破坏。 自发性麻 醉后震颤的病因最常归因于响应手术中体温过低的正常热调节性颤抖。 在大部分手术室和 恢复室内， 寒战可通过使用增湿器、 热毯和吸入潮湿加热氧来控制。然而， 药理控制是有效 的备选处理方式 (Bhatnagar S 等人， Anaesth Intensive Care 2001， 29(2) ： 149-54 ； Tsai YC， Chu KS.Anesth Analg 2001， 93(5) ： 1288-92)。可通过使用动物模型例如 Nikki 等人 (Nikki P， Tammisto T.Acta Anaesthesiol Scand 1968， 12(3) ： 125-34) 和 Grahn(Grahn， DA， 等人 J Applied Physiology 1996， 81 ： 2547-2554) 所描述的模型， 评估式 (I) 的化合物 缓解麻醉后诱导的颤抖的能力。例如， 可将 EG/EMG 记录阵列手术植入 Wistar 大鼠 ( 雄性， 重 250-450g) 中， 以评估麻醉后的战栗活动。 EEG 电极被双侧设置在离中线 2mm 处且邻近前 囟和人字缝尖。在一周的恢复期后， 在整个实验期间使用铜 - 康铜热电偶监测额枕 EEG、 原 直肠和水毯的温度 ) 和麻醉后的环 始 EMG 和积分 EMG 活动， 以及三种温度 ( 麻醉期间皮肤、 境温度。可在多道生理记录纸 (5mm/ 秒， Grass 7E 型多道记录仪 ) 上记录 EEG 和 EMG 信号， 并且在麻醉恢复期间， 以 10 秒间隔时间将 EEG 用电脑记为同步的脑电图 ： 慢波睡眠特征性 (SWS 样 ) 的高振幅 (.100μV)、 低频率 ( 主要 1-4Hz) 活动， 或者记为不同步的脑电图 ： 清醒 和快速眼动睡眠特征性 (W 样 ) 的低振幅 (75μV)、 高频率 ( 主要 5-15Hz) 活动。可将 EMG 活动量化为平均的总计电压 / 时间间隔， 这通过将 EMG 信号通过积分器 (Grass model 7P3， 0.5s 时间常数 ) 处理来实现。在实验当天， 将动物置于小丙烯酸类树脂箱 (15×15×15cm) 中， 并暴露于氟烷蒸气 - 空气混合物 (4％氟烷 )。在诱导麻醉后， 立即将动物从箱中移出并 随后经由鼻锥 (nose cone) 使其麻醉。 在麻醉终止后， 对两个恢复阶段进行判断 ： 麻醉苏醒 和行为活动恢复 ( 行为恢复 )。麻醉苏醒可定义为紧张性 EMG 活动增加和 EEG 由 SWS 样模 式变为 W 样模式。在行为上， 当动物由俯伏姿势立起并开始协调运动时则出现恢复。可在 所有动物中测量从麻醉终止到苏醒和行为恢复的时间间隔。 可以对时间间隔数据进行重复 测量方差分析， 并且可使用 Scheffe’ s 方法检测平均值对之间的差异。
实例 19
冷诱发的心血管加压反应
可在动物和人中测试式 (I) 化合物缓解由冷暴露而诱发的心血管加压反应的能 力。季节性环境变冷与全世界范围内人群中的血压升高和冠状动脉事件发生率增加直接 相关 (Barnett， AG 等人， J Epidemiol Community Heath 2005， 59 551-557)。冷诱发的 肺动脉高压和慢性阻塞性肺疾病的遇冷恶化是易受心肺冷敏感性增加影响的临床症候 (Marno P 等人， Eur Respiratory Review 2006， 15(101) ： 185. ； Acikel M 等人， Int J of Cardiol(2004)97 ： 187-192)。临床冷加压测试是在将一只手浸入冰水 2-3 分钟期间评估血压 (BP) 和冷痛知觉的改变。该测试可用于检定止痛化合物 (Koltzenberg M 等人， Pain 2006， 126(1-3) ： 165-74) 和 评 估 冷 性 异 常 性 疼 痛 反 应 (Desmeules JA 等 人， Arthritis Rheum 2003， 48(5) ： 1420-9)。 可在麻醉大鼠冷加压范例中研究式 (I) 化合物， 以确定 TRPM8 拮抗作用是否会干扰对前脚爪冷刺激的血压加压反应。将用戊巴比妥钠麻醉的雄性斯普 拉 - 道来大鼠 (300-450g) 装上颈部导管和连接至压力传感器的留置颈动脉插管。将溶媒 ( 例如无菌水中的 20％ HPbCD) 或测试化合物用一分钟通过静脉内导管灌注 (1mL/kg)。十 分钟后， 将两个前肢包裹于碎冰中 5 分钟。或者， 将测试化合物和溶媒处理物在进行外科套 管插入术和冷攻击之前的适当时间经口施用。 针对溶媒和测试化合物预处理计算响应这种 冷刺激的平均动脉压力的改变百分比。然后， 用下式测定归因于用测试化合物处理的抑制 百分比 ： ％抑制＝ [1-( 测试化合物处理后冷诱发的血压的％变化 / 溶媒处理后冷诱发的 血压的％变化 )]×100。结果在表 11 中示出。
实例 20
冷诱发的血管收缩 ： 组织灌注的后果
当 血 流 受 到 损 害 或 中 断 时， 身 体 组 织 会 发 生 损 伤。 脉 管 损 害 的 原 因 包 括 外 周 血 管 疾 病 (Lamah M 等 人， European journal of vascular and endovascular surgery(1999)， 18(1)， 48-51)、创 伤 前 或 冻 伤、雷 诺 氏 综 合 征 (Lutolf， O 等 人， Microvascular research(1993)， 46(3)， 374-82)、 糖 尿 病 性 神 经 病 变 (Forst T 等 人， Clinical science(London， England ： 1979)(1998)， 94(3)， 255-61.)、 外科手术以及自主 神经失调 (Gherghel D 等人， Investigative ophthalmology & visual science(2004)， 45(10)， 3546-54)。在边缘静止灌注的情况下， 因冷的温度而增加的血管收缩会使症状恶 化并加强组织损伤 (Cankar K 等人， The Journal ofhand surgery(2000)， 25(3)， 552-8 ； LutolfO 等人， Microvascular research(1993)， 46(3)， 374-82.)。这些情况中的一些容易 在动物中模拟， 以评估 TRPM8 拮抗剂如式 (I) 化合物在面临局部冷却的情况下保持组织灌 注的能力。例如， 可在麻醉的大鼠的脚爪中研究皮肤血流的激光多普勒评估 (Hord A H 等 人， Anesthesia and analgesia(1999)， 88(1)， 103-8)， 在该研究中使脚爪接受一系列降温 步骤， 这可通过与计算机控制下的 Peltier 冷却元件物理接触来进行。激光多普勒可测量 在面临冷诱导的血管收缩的情况下的皮肤灌注， 由此产生温度 x 灌注的关系。预期全身性 施用 TRPM8 拮抗剂可使该曲线相对于溶媒预处理向保持低温下的灌注偏移。可设想该活性 在保护组织免受低灌注和缺血影响中具有治疗作用， 从而使相关的症状 ( 例如疼痛 ) 和潜 在的组织损伤最小化。 尽管上述说明书教导了本发明的原理， 以示例为目的提供了实例， 但 应该理解本发明的实施涵盖落入所附的权利要求及它们的等同形式的范围内的所有通常 的变型形式、 改变形式和 / 或修改形式。66