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1、(10)申请公布号 CN 103103202 A (43)申请公布日 2013.05.15 CN 103103202 A *CN103103202A* (21)申请号 201310015062.5 (22)申请日 2013.01.16 CGMCC No.6699 2012.10.22 C12N 15/31(2006.01) C07K 14/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) A01N 47/44(2006.01) A01P 21/00(2006.01) A01P 1/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/38(2006.01) 。
2、(71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)发明人 高学文 张岩 伍辉军 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 傅婷婷 (54) 发明名称 Harpin 编 码 基 因hrpZPsgS1或 其 表 达 的 harpinZPsgS1蛋白的应用 (57) 摘要 本发明公开了 Harpin 编码基因hrpZPsgS1或 其表达的 harpinZPsgS1蛋白的应用。本发明所获 得 harpinZPsgS1蛋白处理烟草， 可以促进烟草的生 长， 显著提高烟草对烟草花叶病毒、 烟草疫霉病的 抗性， 而且该抗性不仅局。
3、限于 harpinZPsgS1处理的 部位， 也包括处理周边的叶片及整株植物， 并且 该过程伴随着 PR 蛋白的表达， 说明 harpinZPsgS1 可以诱导植物系统获得抗病性， 以上结论证明 harpinZPsgS1具有开发成生物源农药的应用价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103103202 A CN 103103202 A *CN103103202A* 1/1 页 2。
4、 1.harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白在促进烟草的生长， 提高烟草 抗病性中的应用， 其中， 所述的 harpin 编码基因hrpZPsgS1的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所 示， harpinZPsgS1蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 harpin 编码基因hrpZPsgS1或其表达的 harpinZPsgS1蛋白在促进烟草的生长， 有效提高烟草对烟草花叶病毒病和烟草疫霉病的抗性 中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于所述的 harpinZPsgS。
5、1蛋白通过如下方法制 备 ： （1）根据 Genbank 中登录号为 L41862 的hrpZ序列， 设计完整开放阅读框引物 hrpZPsgS1-P1: SEQ ID No.3/ hrpZPsgS1-P2: SEQ ID No.4; （2） 将 -70保藏的保藏号为 CGMCC No.6699 的大豆细菌性斑点病菌 S1 菌株在 KB 固 体培养基上 28条件下培养 24 小时后转入 KB 液体培养基， 继续震荡培养 24h 后， 收集 新鲜的菌液提取基因组 DNA， 以活化的基因组 DNA 为模板， 以hrpZPsgS1-P1: SEQ ID No.3/ hrpZPsgS1-P2: SEQ 。
6、ID No.4 为引物进行 PCR 扩增反应条件 ： 94预变性 4min， 94变性 1min， 56退火 1min， 72延伸 90s， 循环 35 次， 72延伸 10min; （3） 将 PCR 产物与 pMD18-T 载体连接， 转化到大肠杆菌 DH5 中， 经质粒 PCR 和酶切验 证得到阳性转化子 , 提取重组质粒 DNA 并测序 ; （4） 以测序正确的阳性重组质粒 pMD18-T-hrpZPsgS1为模板， PCR 扩增 , 扩增产物回收后 经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET41a(+)上， 使得hrpZPsgS1基因与pET41a(+) 上的还原型谷胱甘肽。
7、GST标签融合， 进而得到重组质粒pET41a(+)-hrpZPsgS1,将重组质粒和 pET41a(+) 转入大肠杆菌 BL21 后经质粒 PCR 和酶切鉴定出阳性重组菌株 ; （5） 重组菌株 BL21/pET41a(+)-hrpZPsgS1在含 km50g /ml 的 LB 液体培养基中， 37、 200rpm/min 振荡培养过夜， 次日按照 1% 的比例转接到 km50 的液体 LB 中， 37振荡培养约 2-3h， 至 OD600=0.6 0.8， 加入终浓度为 0.1mM 的 IPTG， 37振荡培养 2-3h， 取诱导的菌液 离心收集菌体， 用 PH7.4 的终浓度为 0.1M。
8、 的 PBS 润洗三次菌体， 重溶于 1/20 原菌体培养 体积的 PBS 中， 向菌体悬浮液中加入终浓度为 100g/ml 的溶菌酶， 终浓度为 0.1mM 的蛋白 酶抑制剂 PMSF， 经超声波破碎后离心取上清即为粗提蛋白， 使用 GSTrap FF 对标签蛋白进 行纯化， 具体操作参照说明书进行， 得到纯化的 harpinZPsgS1蛋白。 权 利 要 求 书 CN 103103202 A 2 1/6 页 3 Harpin 编码基因hrpZPsgS1或其表达的 harpinZPsgS1蛋白的 应用 技术领域 0001 本发明属于生物基因工程领域， 涉及 Harpin 编码基因hrpZPs。
9、gS1或其表达的 harpinZPsgS1蛋白的应用。 背景技术 0002 大豆细菌性斑点病是我国尤为北方大豆产区的一种主要病害， 给农业生产带来巨 大损失， 其致病菌丁香假单胞菌大豆致病变种 （Pseudomonas syringae pv. glycinea） 也 是世界范围内重要的植物病原细菌。同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样，Pseudomonas syringae pv. glycinea 拥有保守的hrp基因簇， 决定着病原菌在非寄主植物和抗病植物 上的过敏反应 （hypersensitive response, HR） 和在感病寄主上致病性 （pathogenicity） 。 h。
10、rp基因簇的特定基因编码产物 harpins 是一类非特异性蛋白质激发子， 该蛋白质富含甘 氨酸， 不含半胱氨酸， 对热稳定， 对蛋白酶 K 敏感， 可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应， 并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制， 是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋 白。Wei（1992） 首次从梨火疫 （E. amylovora） 中分离得到一种能引起过敏反应的蛋白激 发子 HrpN， 随后 harpin 在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中得到了鉴定。 0003 国外已从P. syringae 5个致病变种中克隆出相应的hrp基因， 并证实其 活性， 但国内对来源于丁香假单胞菌 （P. 。
11、syringae） 的hrp 基因方面的研究较少， 不同菌株 编码的 harpin 蛋白的活性和功能也不尽相同， 并且体外高效表达纯化的 harpin 蛋白用于 指导生物防治还没有得到广泛的应用。 因此， harpin 蛋白作为新型微生物蛋白农药的代 表具有广泛的应用前景。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种新的 harpin 编码基因hrpZPsgS1或其表达的 harpinZPsgS1 蛋白的应用。 0005 本发明的目的可通过如下技术方案实现 ： harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白在促进烟草的生长， 提高烟 草抗病性中的应用， 其中， 所。
12、述的 harpin 编码基因hrpZPsgS1的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示， harpinZPsgS1蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 0006 所述的 harpin 编码基因hrpZPsgS1或其表达的 harpinZPsgS1蛋白优选在促进烟草的 生长， 有效提高烟草对烟草花叶病毒病和烟草疫霉病的抗性中的应用。 0007 其中， 所述的 harpinZPsgS1蛋白优选通过如下方法制备 ： （1） 提取大豆细菌性斑点病菌 S1 菌株的基因组 DNA， 根据 Genbank 中登录号为 L41862 的hrpZ序列， 设计完整开放阅读框引物hrpZPsgS1。
13、-P1: SEQ ID No.3/ hrpZPsgS1-P2: SEQ ID No.4; （2） 将 -70保藏的保藏号为 CGMCC No.6699 的大豆细菌性斑点病菌 S1 菌株在 KB 固 说 明 书 CN 103103202 A 3 2/6 页 4 体培养基上28条件下培养24小时后转入KB液体培养基， 继续震荡培养24h后， 收集新鲜 的菌液提取基因组 DNA， 以活化的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 反应条件 ： 94预变性 4min， 94变性 1min， 56退火 1min， 72延伸 90s， 循环 35 次， 72延伸 10min; （3） 将 PCR 产物与。
14、 pMD18-T 载体连接， 转化到大肠杆菌 DH5 中， 经质粒 PCR 和酶切验 证得到阳性转化子 , 提取重组质粒 DNA 并测序 ; （4） 以测序正确的阳性重组质粒 pMD18-T-hrpZPsgS1为模板， PCR 扩增 , 扩增产物回收后 经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET41a(+)上， 使得hrpZPsgS1基因与pET41a(+) 上的还原型谷胱甘肽GST标签融合， 进而得到重组质粒pET41a(+)-hrpZPsgS1,将重组质粒和 pET41a(+) 转入大肠杆菌 BL21 后经质粒 PCR 和酶切鉴定出阳性重组菌株 ; （5） 重组菌株 BL21/p。
15、ET41a(+)-hrpZPsgS1在含 km50g /ml 的 LB 液体培养基中， 37、 200rpm/min 振荡培养过夜， 次日按照 1% 的比例转接到 km50 的液体 LB 中， 37振荡培养约 2-3h， 至 OD600=0.6 0.8， 加入终浓度为 0.1mM 的 IPTG， 37振荡培养 2-3h， 取诱导的菌液 离心收集菌体， 用 PH7.4 的终浓度为 0.1M 的 PBS 磷酸缓冲液润洗三次菌体， 重溶于 1/20 原 菌体培养体积的磷酸缓冲液中， 向菌体悬浮液中加入终浓度为 100g/ml 的溶菌酶， 终浓 度为 0.1mM 的蛋白酶抑制剂 PMSF， 经超声波破。
16、碎后离心取上清即为粗提蛋白， 使用 GSTrap FF 对标签蛋白进行纯化， 具体操作参照说明书进行， 得到纯化的 harpinZPsgS1蛋白。 0008 有益效果 1. 本发明公开了一种大豆细菌性斑点病 S1 菌株的hrpZPsgS1基因序列及其所编码的蛋 白质， 采用基因工程方法利用 GST 融合表达 harpin 蛋白， 显著提高其在大肠杆菌中的表达 量。并通过 GSTrap FF 对目的蛋白进行纯化， 纯蛋白浓度可达 1.1mg/ml。 0009 2.本发明所获得harpinZPsgS1富含甘氨酸， 不含半胱氨酸， 对热稳定， 对蛋白酶K敏 感， 可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，。
17、 并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑 制。 0010 3. 本发明所获得 harpinZPsgS1处理烟草， 可以促进烟草的生长， 显著提高烟草对烟 草花叶病毒、 烟草疫霉病的抗性， 而且该抗性不仅局限于harpinZPsgS1处理的部位， 也包括处 理周边的叶片及整株植物， 并且该过程伴随着PR蛋白的表达， 说明harpinZPsgS1可以诱导植 物系统获得抗病性， 以上结论证明 harpinZPsgS1具有开发成生物源农药的应用价值。 附图说明 0011 图 1. 重组质粒 pET41a(+)-hrpZPsgS1PCR 及酶切验证 A 重 组 质 粒 pET41a(+)-hrpZPsg。
18、S1的 PCR 扩 增， 其 中 M1 为 DNA marker -HindIII ； M2 为 DNA marker DL2000 ； 1 为 pET41a(+)-hrpZPsgA1； 2 为 pET41a(+)-hrpZPsgS1 ； B 重组质粒pET41a(+)-hrpZPsgS1的酶切验证， 其中M1为DNA marker DL2000 ； 1为hrpZPsgA1； 2 为hrpZPsgS1； 3 为清水对照。 0012 图 2. harpinZPsgS1的表达及纯化 其中 1 为大肠杆菌 BL21 ； 2 为 BL21/PET-41a(+) ； 3 为 harpinZPsgS1粗提。
19、蛋白 ； 4 为结合液 ； 5 为 PBS 洗脱一次 ； 6 为 PBS 洗脱二次 ； 7 为纯化的 harpinZPsgS1蛋白。 0013 图 3. harpinZPsgS1的生物活性检测 其中 1 为 harpinZPsgS1； 2 为清水处理 ； 3 为 harpinZPsgS1经沸水浴处理 10min ； 4 说 明 书 CN 103103202 A 4 3/6 页 5 为 harpinZPsgS1经蛋白酶 K 处理 ； 5 为 harpinZPsgS1与氯化镧混合液 ； 6 为 harpinZPsgS1与钒酸 钠混合液 ； 7 为 harpinZPsgS1与环乙酰亚胺混合液。 00。
20、14 图 4. harpinZPsgS1对烟草种子的促生作用 图 5. harpinZPsgS1诱导烟草抵抗烟草花叶病毒 （TMV） 侵染 A 烟草花叶病毒病在不同叶片上引起的病变数目示意图 ； 1 为清水处理 ； 2 为 harpinZPsgS1处理叶片之下叶片 ； 3 为 harpinZPsgS1处理叶片之上叶片， 4 为 harpinZPsgS1处理 的叶片 ； B 烟草花叶病毒病在不同叶片上引起的病斑数目统计 ； a 为清水处理 ； b、 c 为 harpinZPsgS1处理叶片之上叶片 ； d、 e 为 harpinZPsgS1处理叶片之下叶片 ； f 为 harpinZPsgS1处。
21、 理的叶片。 0015 图 6. harpinZPsgS1诱导烟草抗烟草疫霉病功能检测 图 7. harpinZPsgS1诱导苯丙氨酸解氨酶Pal基因表达情况 图 8. harpinZPsgS1诱导 HCD 标志基因hsr515表达情况 图 9. harpinZPsgS1诱导PR-1a基因表达情况 生物材料保藏信息 S1 菌株， 分类命名为丁香假单胞菌大豆致病变种 （Pseudomonas syringae pv. glycinea） ， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.6699， 地址为北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 保藏日期为。
22、2012年10月 22 日。 具体实施方式 0016 本发明中使用的缩略语 ： LB ： 细菌培养基， 酵母粉 5g/L+ 胰蛋白胨 10g/L+Nacl10g/L， PH7.0 ； KB ： 假单胞菌培养基， 胰蛋白胨 10g/L+ 甘油 10g/L+K2HPO4 1.5 g/L +MgSO47H2O 1.5 g/L ； Km50 ： 50g /ml 的卡那霉素 ； IPTG ： 异丙基硫代 - 半乳糖苷 ； PMSF ： 蛋白酶抑制剂 苯甲基黄酰氟 实施例 1 ： 大豆细菌性斑点病菌 S1 菌株hrpZPsgS1基因的克隆与测序 大豆细菌性斑点病菌 S1 菌株 （CGMCC No.6699。
23、， 下同） 首先在 KB 固体培养基上 筛选， 该菌株能分泌荧光色素， 并能在紫外光下检测到荧光。将选取的单克隆菌落， 于 28 条件下在 KB 液体培养基中震荡培养 24h， 用于提取基因组 DNA。根据 Genbank 中登录号为 L41862 的hrpZ序列， 设计完整开放阅读框 （ORF） 引物， 在 5 端分别引入BamH1 和EcoR1 酶 切位点 ； hrpZPsgS1-P1 ： 5-GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC（SEQ ID No.3） ； hrpZPsgS1-P2 ： 5-GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG（SEQ ID No。
24、.4） 。 0017 以S1菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增， 反应条件 ： 94预变性4min， 94变 性 1min， 56退火 1min， 72延伸 90s， 循环 35 次， 72延伸 10min。将 PCR 产物与 pMD18-T 载体连接， 转化到大肠杆菌 DH5 中， 经质粒 PCR 和酶切验证得到阳性转化子。提取重组 质粒 DNA 送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。对重组质粒 pMD18-T-hrpZPsgS1序列测 说 明 书 CN 103103202 A 5 4/6 页 6 定结果显示，hrpZPsgS1基因大小为 1038bp， 编码 345 个氨基酸， 其编码的。
25、蛋白质富含甘氨酸 （12.75%） ， 不含半胱氨酸。 0018 实施例 2 ： harpinZPsgS1蛋白的表达及纯化 2.1 hrpZPsgS1基因工程表达菌株的构建 以测序正确的阳性重组质粒 pMD18-T-hrpZPsgS1为模板， PCR 扩增。扩增产物 回收后经BamH1 和EcoR1 双酶切后连接到表达载体 pET41a(+) 上， 使得hrpZPsgS1基因与 pET41a(+) 上的还原型谷胱甘肽 GST 标签融合， 进而得到重组质粒 pET41a(+)-hrpZPsgS1。将 重组质粒和 pET41a(+) 转入大肠杆菌 BL21 后经质粒 PCR 及酶切鉴定出阳性菌株 。
26、（图 1） 。 0019 2. 2 harpinZPsgS1蛋白的表达 （1）活化原种 ： 重组菌株 BL21/pET41a(+)-hrpZPsgS1接种于 LB 液体培养基 （km50g /ml） 中 37（200rpm/min） 振荡培养过夜， 次日按照 1% 的比例转接到 km50 的液 体 LB 中， 37振荡培养约 2-3h， 至 OD600=0.6 0.8， 加入终浓度为 0.1mM 的 IPTG， 37振荡 培养 2-3h。 0020 （2） 破碎细胞 ： 收集菌液 8000rpm/min， 4离心 10min 收集菌体， 用 PBS（磷酸缓 冲液） 洗三次， 重溶于1/20原菌。
27、体培养体积的磷酸缓冲液中， 向菌体悬浮液中加入终浓度为 100g/ml的溶菌酶， 终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂PMSF。 10000rpm/min， 4离心15min， 收集上清， 即为harpinZPsgS1的粗提蛋白。 SDS-PAGE检测融合蛋白大小为62kDa， harpinZPsgS1 大小为 35kDa， GST 标签大小为 27kDa（图 2） 。 0021 2.3 harpinZPsgS1的纯化 使用 GSTrap FF 对标签蛋白进行纯化， 具体步骤按照说明书显示的方法， 纯化 之前， 用 0.45m 滤膜过滤 harpinZPsgS1粗提蛋白， 去除粗提蛋白中一些细胞碎。
28、片或其它杂 质， 以免阻塞纯化柱， 纯化时使用蠕动泵上样。纯化的样品经超滤柱超滤、 浓缩， 利用 BCA 蛋 白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度， 纯蛋白于 -70保存。 0022 实施例 3 ： harpinZPsgS1蛋白的生物活性检测 将纯化的 harpinZPsgS1（浓度 100g/ml） 分成 5 份， 每份 100l， 进行如下处 理 ：（1） 100沸水浴 10 min ；（2） 加入蛋白酶 K（终浓度 20g/ml） ， 37温育 15 min ；（3） 加入钒酸钠 （终浓度为 510-5mol/L） ；（4） 加入氯化镧 （终浓度为 210-3mol/L） ；（5） 加入 环乙酰。
29、亚胺 （终浓度为 110-4mol/L） 。同时以 harpinZPsgS1和清水处理为对照， 用无头的注 射器向烟草叶背面细胞间隙注射， 36 h 内观察叶片 HR 发展情况。 0023 结果表明纯化的 harpinZPsgS1经 100沸水浴处理 10min， 仍可在烟草上激发 HR ； harpinZPsgS1经蛋白酶 K 处理， 则丧失在烟草上激发 HR 的能力 ； harpinZPsgS1与氯化镧、 钒酸 钠、 环己酰亚胺混合后注射烟草则丧失激发 HR 的能力， 表明 haprin 蛋白激发 HR 活性可以 被真核生物代谢抑制剂所抑制 （图 3） 。 0024 实施例 4 ： har。
30、pinZPsgS1蛋白质的应用 4.1 harpinZPsgS1促进烟草的生长 将纯化的harpinZPsgS1稀释后浸泡烟草种子， 同时以清水为对照。 12h后吸出蛋 白液， 加入 30% 的 NaClO 表面消毒 5min， 灭菌水清洗三次后倒置于灭菌的滤纸上， 待种子吸 干水后用灭菌牙签点入含 MS 培养基的方形培养皿中， 置于光照培养箱中， 垂直培养， 每个 处理设置 5 个重复。20d 后观察， 测定根长和鲜重， 应用 SPSS 软件对数据进行统计分析。 说 明 书 CN 103103202 A 6 5/6 页 7 0025 经过 3 次独立生物学重复得出 50-200g/ml 的 。
31、harpinZPsgS1对烟草有明显的促生 作用 （图4， 表1） ， 与清水对照组存在显著性差异， 100g/ml的harpinZPsgS1促进根部生长率 最高为35.6%， 三个浓度之间并无显著性差异 （表1） ， 不同浓度的harpinZPsgS1对烟草鲜重也 有促进作用， 与清水对照组均存在显著性差异， 200g/ml 的 harpinZPsgS1促进鲜重增长率 达 78.8%， 与另外两个浓度均存在显著性差异。 0026 4.2 harpinZPsgS1诱导烟草抗烟草花叶病毒 使用 100g/ml 纯化的 harpinZPsgS1预先喷雾处理烟草中部叶片， 以清水喷雾 处理为对照。6。
32、h 后在处理叶及其上、 下各 2 张叶片摩擦接种烟草花叶病毒。在本实验之前， 我们确定烟草花叶病毒的用量是能在每片没接种 harpinZPsgS1叶子上引起 200 个左右的病 斑。3 天后， 我们观察病斑的数目及直径。 0027 结果显示， 经 harpinZPsgS1处理后的烟草叶片， 其上形成的病斑数要明显少于清水 处理组， 并且处理叶片的上下叶片的病斑数也要明显少于清水处理组， 处理之下部叶面数 量略多于上部叶片， 但并无显著差异， 同时各个处理的病斑直径也明显小于清水处理组， 病 斑抑制率可达 80% 以上。上述结果证明 harpinZPsgS1可诱导烟草产生一种可上下移动的信 号，。
33、 从处理部位移动到非处理部位并激活其防卫反应， 是一种系统获得性抗性 （图 5） 。 0028 4.3 harpinZPsgS1诱导烟草抗烟草疫霉病 使用 100g/ml 纯化的 harpinZPsgS1预先喷雾处理烟草中部茎秆及其上下各 一片叶子， 以清水喷雾处理为对照。6h 后以菌圆片夹茎法接种烟草疫霉病菌。 0029 结果显示， 接种 3d 后， 对照组的烟草上病菌深入扩展到髓部， 茎杆干缩使茎部的 水分运输受阻， 接种处茎秆凋零， 而 harpinZPsgS1预处理过的的烟草茎杆在接种部位轻微病 变发黑。接种 5d 后， 对照组接种部位病菌已经扩展到顶端叶片， 并出现倒伏症状， 全株自。
34、下 而上依次凋萎变黄， 处理组顶端叶片仍可以正常生长。接种 7d 后， 对照组烟草全株枯萎死 亡， 处理组仍可正常生长 （图 6） 。 0030 4. harpinZPsgS1诱导植物体内防卫反应相关基因的表达 选取 56 叶期长势一致的三生烟， 分别挑取中部的 2 片叶子， 将纯化的 harpinZPsgS1稀释成 100g/ml， 加入 Tween20（0.5% w/v） ， 喷雾处理烟草叶正面， 同时以清 水喷雾作对照。于 0h、 3h、 6h、 8h、 12h、 24h， 分别取样， 提取叶部 RNA， 通过 Real-timePCR 检 测烟草中防卫反应基因Pal、hsr515、PR。
35、-1a的表达情况。结果表明 harpinZPsgS1可以激活植 物体内一系列防卫反应相关基因， 使植物系统性获得抗病性， 赋予烟草对烟草花叶病毒病、 烟草疫霉病等的抗性 （图 79） 。 0031 以上实例表明本发明从大豆细菌性斑病菌 S1 菌株克隆得到的 harpinZPsgS1可以 在非寄主植物烟草上激发过敏反应， 并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制。本发 说 明 书 CN 103103202 A 7 6/6 页 8 明所获得 harpinZPsgS1富含甘氨酸， 不含半胱氨酸， 对热稳定， 对蛋白酶 K 敏感。本发明的 harpinZPsgS1处理烟草， 可以促进烟草的生长， 有效。
36、提高烟草对烟草花叶病毒病、 烟草疫霉病 的抗性， 而且抗性不仅局限于harpinZPsgS1处理的部位， 也包括处理周边的叶片及整株植物， 并且该过程伴随着PR蛋白的表达， 说明harpinZPsgS1可以诱导植物系统获得抗病性， 以上结 论证明 harpinZPsgS1具有开发成生物源农药的应用价值。 说 明 书 CN 103103202 A 8 1/3 页 9 南京农业大学 Harpin 编码基因hrpZPsgS1或其表达的 harpinZPsgS1蛋白的应用 4 1 1037 DNA Pseudomonas syringaepv.glycinea hrpZPsgS1基因 1 atgcag。
37、agtc tcagtcttaa cagcagcacg ctgcaaagcc cgtcgatggc gctcgttctg 60 atccgtcctg aaaccgagac aaccgggccg agtacatcca gccgggcgct tcaggaagtg 120 attgcgcagc ttgcccagga gctgactcac aatggtcaac tggacgagag ttcgccattg 180 ggcaagttgc tcggcaaagc gatggccgcc agtggcaagg ctggcggcgg cctcgaggac 240 atcaaggctg cgctggacac gctta。
38、tccac gaaaagctgg gcgacaattt tggcgcttct 300 gccgacaacg cctcggatac cggacaacac gacttgatga cacaggtgct caatggcctg 360 gccaagtcga tgctgaatga tcttctgacc aagcaggatg acggaactcg tttttccgag 420 gacgacatgc cgatgctgaa aaagatcgcg gagttcatgg acgacaaccc cgcacagttt 480 cccaaaccgg actcgggttc gtgggtgaac gaactcaagg aag。
39、ataactt cctcgacggc 540 gacgaaacag cgcagttccg ctcggcactc gacatcatcg gccagcaatt gggcagtcaa 600 cagaatgcag ccggcggtct ggcgggcgat agcagcggtg gtggcctggg cagccctgtg 660 agcaatacgg aaaattcgcc tggttcactg ggtgatccgc ttatcgacgc taacaccggc 720 cccgccagca acagcaattc caatggtgat gtgggccagt tgatcggtga gctgatagac 7。
40、80 cggggactgc aatcggtatt ggccggtggc ggcttgggga cacctgtgag caccgccaat 840 actgcccttg tgcctggcgg cgaacagccg aatcaggacc tgggtcagtt actcggtggc 900 ttgttgcaga aaggtctgga gcgacgcttc aggatgctgg ccagaccggg accggcgtgc 960 agtccagcac tgctcaagtt gccttgctgc tggtcaacat gctgctgcaa agcactaaaa 1020 accaggctgc tgcct。
41、ga 1037 1 345 PRT Pseudomonas syringaepv.glycinea 序 列 表 CN 103103202 A 9 2/3 页 10 hrpZPsgS1蛋白 2 Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Thr Leu Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15 Met Ala Leu Val Leu Ile Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Pro 20 25 30 Ser Thr Ser Ser Arg Ala Leu Gln Glu Val Ile Ala Gln Leu Ala 35 40。
42、 45 Gln Glu Leu Thr His Asn Gly Gln Leu Asp Glu Ser Ser Pro Leu 50 55 60 Gly Lys Leu Leu Gly Lys Ala Met Ala Ala Ser Gly Lys Ala Gly 65 70 75 Gly Gly Leu Glu Asp Ile Lys Ala Ala Leu Asp Thr Leu Ile His 80 85 90 Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ala Ser 95 100 105 Asp Thr Gly Gln Hi。
43、s Asp Leu Met Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu 110 115 120 Ala Lys Ser Met Leu Asn Asp Leu Leu Thr Lys Gln Asp Asp Gly 125 130 135 Thr Arg Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met Leu Lys Lys Ile Ala 140 145 150 Glu Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro Lys Pro Asp Ser 155 160 165 Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Ly。
44、s Glu Asp Asn Phe Leu Asp Gly 170 175 180 Asp Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile Gly Gln 185 190 195 Gln Leu Gly Ser Gln Gln Asn Ala Ala Gly Gly Leu Ala Gly Asp 200 205 210 Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asn Thr Glu Asn 215 220 225 Ser Pro Gly Ser Leu Gly Asp Pro Leu Ile As。
45、p Ala Asn Thr Gly 230 235 240 Pro Ala Ser Asn Ser Asn Ser Asn Gly Asp Val Gly Gln Leu Ile 245 250 255 Gly Glu Leu Ile Asp Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly 260 265 270 Gly Leu Gly Thr Pro Val Ser Thr Ala Asn Thr Ala Leu Val Pro 序 列 表 CN 103103202 A 10 3/3 页 11 275 280 285 Gly Gly Glu Gln Pro A。
46、sn Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Gly Gly 290 295 300 Leu Leu Gln Lys Gly Leu Glu Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Gln 305 310 315 Thr Gly Thr Gly Val Gln Ser Ser Thr Ala Gln Val Ala Leu Leu 320 325 330 Leu Val Asn Met Leu Leu Gln Ser Thr Lys Asn Gln Ala Ala Ala 335 340 345 3 29 DNA 人工序列 引物hrpZPsgS1-P1 3 gg。
47、ggatccat gcagagtctc agtcttaac 29 4 27 DNA 人工序列 引物hrpZPsgS1-P2 4 gggaattctc aggcagcagc ctggttg 27 序 列 表 CN 103103202 A 11 1/5 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103103202 A 12 2/5 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103103202 A 13 3/5 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103103202 A 14 4/5 页 15 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103103202 A 15 5/5 页 16 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103103202 A 16 。