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1、(10)申请公布号 CN 103122330 A (43)申请公布日 2013.05.29 CN 103122330 A *CN103122330A* (21)申请号 201210590470.9 (22)申请日 2012.12.31 CGMCC No. 6423 2012.08.13 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/425(2006.01) (71)申请人 陈秀蓉 地址 730000 甘肃省兰州市安宁区营门村 1 号 申请人 杨成德 (72)发明人 陈秀蓉 杨成德 满百膺 李振东 李鹏 荆卓群 。
2、杨淑君 高晓星 邹雨坤 王辰月 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 代理人 高松 (54) 发明名称 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 和 其应用及以其制备的微生物菌剂和制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种能够抑制多种病原菌的高 寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010， 并公开 了以其制备的微生物菌剂及其制备方法。本发 明的有益效果为 ： 本发明提供的普城沙雷氏菌株 GH010 及以其制备的微生物菌剂， 对多种病原菌 均有良好的抑制效果， 其抑制结果为辣椒立枯病 菌 67.5%， 油菜菌核病菌 69.5%， 棉花立枯病菌、 茄 子菌核病菌、 。
3、番茄灰霉病菌、 黄瓜枯萎病菌、 玉米 大斑病菌、 玉米小斑病菌或小麦长蠕孢的抑菌率 均为大于等于 57.5%， 且对紫花苜蓿等作物有促 生作用， 以其制备的微生物农药和微生物肥料环 保性好， 不易产生抗药性， 安全性良好。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103122330 A CN 103122330 A *CN103122330A* 1/1 页 2 1. 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010， 。
4、菌株 GH010 为沙雷氏菌属 （Serratia plymuthica） ， 于 2012 年 08 月 13 日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 菌种保藏编 号为 CGMCC NO.6423。 2. 根据权利要求 1 所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 在抑制病原菌中 的应用， 其特征在于， 所述病原菌为辣椒立枯病菌或油菜菌核病菌 ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 的抑菌率分别为辣椒立枯病菌 67.5%， 油菜菌核病菌 69.5%。 3.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌中的 应用， 其特征在于， 所述病原菌为棉花立枯病菌、 茄子。
5、菌核病菌、 番茄灰霉病菌、 黄瓜枯萎病 菌、 玉米大斑病菌、 玉米小斑病菌或小麦长蠕孢菌 ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 的抑菌率均 为大于等于 57.5%。 4.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌中的 应用， 其特征在于， 所述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 在含有色氨酸和不含色 氨酸的金氏培养基中分泌吲哚乙酸的量分别为 63.82mg/L 和 5.38mg/L， 在无机磷和有机磷 培养液中， 有效磷增量分别为 88.63 mg/L 和 86.05 mg/L。 5. 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的微生物菌剂， 其特征在。
6、于， 所述 微生物菌剂的组成按照重量百分比计为普城沙雷氏菌株 GH010 5-10%， 普城沙雷氏菌株 GH010 培养基 90%-95%。 6.根据权利要求5所述的微生物菌剂， 其特征在于， 所述普城沙雷氏菌株GH010培养基 包括以重量百分比计的以下组分 ： 玉米粉 1.5-2.5%， 黄豆粉 1-1.5%， 蛋白胨 0.2-0.5%， 蒸馏 水或去离子水 1000ml ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 培养基的 pH 值为 7.5-8.5。 7.根据权利要求6所述的微生物菌剂， 其特征在于， 所述普城沙雷氏菌株GH010培养基 包括以重量百分比计的以下组分 ： 玉米粉 2%， 黄豆粉 。
7、1.25%， 蛋白胨 0.35%， 蒸馏水或去离子 水 1000ml ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 培养基的 pH 值为 7.5。 8. 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的微生物菌剂的制备方法， 其特征 在于， 是将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 在普城沙雷氏菌株 GH010 培养基上液 体发酵 16-22 小时得到的 ； 所述液体发酵条件为温度 25-29， 转速 200-300r/min， 通气量 800-1000L/h ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 的活菌数为 9.861011cfu/mL-1.061013cfu/ mL。 9.根据权利要求8所述的。
8、高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂 的制备方法， 其特征在于， 所述液体发酵条件为温度 27， 转速 250r/min， 通气量 900L/h， 发酵时间 19 小时。 10. 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的微生物菌剂在制备微生物农药或 微生物肥料中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103122330 A 2 1/10 页 3 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 和其应用及以其 制备的微生物菌剂和制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生防领域， 具体涉及高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 和其应 用及以其制备的微生物菌剂和制备方法。。
9、 背景技术 0002 化学杀菌剂在环境和农产品中可以残留， 加之病原对化学杀菌剂逐渐产生抗性， 使用药量逐渐增大， 更加重了残留量， 且对非目标生物如人、 家畜、 益虫和野生动物等的毒 害。在我国， 近年来农产品安全受到人们的关注， 特别是农产品农药残留超标问题， 其严重 影响着全民的身心健康， 同时影响生态环境及农业贸易。 0003 随着人们生活水平的提高和环保意识的增强， 在国际或国内市场， 对蔬菜产品实 行准入制， 要进入市场的蔬菜必须是无公害蔬菜。蔬菜农药残留量超标， 则面临 “绿色贸易 壁垒” ， 在 WTO 的大环境下无法进入国际市场。这就要求人们对农药品种和性能进行调整， 向无公。
10、害农药方向发展。生物农药则是生产无公害农产品过程中防治病害的优良选项。 0004 微生物农药是公认的 “无公害农药” ， 可以通过直接或间接的作用方式来防治病 害， 其防治效果较好， 对人畜无毒， 不污染环境， 无残留 ； 具较强的选择性， 不伤害有益生物 及天敌， 不破坏生态平衡， 不易产生抗药性 ； 生产原料和有效成分为天然产物， 易降解， 可回 归大自然， 保证可持续发展 ； 还可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改造， 不断提 高性能和质量， 更好地发挥生物农药的环保性。 随着环境保护法的贯彻执行， 以及参与国际 市场竞争， 微生物农药将作为一种高新技术， 在保护环境、 保证人类健。
11、康， 在农业可持续发 展中， 发挥愈来愈重要的作用。 0005 化肥定位试验结果表明 , 磷、 钾化肥的施用会导致重金属在土体中累积、 资源与 能源大量消耗、 环境污染 ； 施入的氮磷肥利用率低， 未被吸收利用的氮肥在农田中流失或 挥发， 对地下水资源、 土壤和空气造成了严重污染， 使农畜产品的有毒物质超标， 给人类健 康带来了极大的危害， 同时化肥的长期大量施用破坏土壤团粒结构， 造成土壤板结， 肥力下 降。 0006 微生物肥料作为一种新型肥料， 施入土壤后， 通过其特定菌株的快速繁殖， 能固定 大气中的氮素、 释放土壤中固定态的磷、 钾元素， 使得环境的养分潜力得以充分发挥， 并为 作物。
12、生长营造一个良好的土壤微生物环境， 在减少化肥用量、 降低环境污染、 提高农作物品 质等方面具有重要意义。 尤其是集固氮、 解磷、 解钾和作物生长素于一身的复合微生物肥料 的研发 , 在农业可持续发展中有举足轻重的作用。 0007 目前， 国内外虽然对微生物农药和微生物肥料方面都投入了巨大的人力及物力， 但数量而言化学农药和肥料远远多于生物农药和肥料 ； 另外， 生物农药和肥料对环境的要 求较高。 因此， 开发符合当地环境条件的微生物农药和肥料尤为重要， 促进当地绿色农业的 发展、 参与国际农产品市场的竞争、 保护环境和保证人类健康就显得尤为重要。 说 明 书 CN 103122330 A 3。
13、 2/10 页 4 发明内容 0008 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷， 提供了能够抑制多种病原菌的高 寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010。 0009 为了实现上述目的， 本发明提供的技术方案为 ： 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌 株 GH010， 菌株 GH010 为沙雷氏菌属 （Serratia plymuthica） ， 于 2012 年 08 月 13 日保藏于 中国普通微生物菌种保藏管理中心， 地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 菌种保 藏编号为 CGMCC NO.6423。 0010 本发明的第二个目的是提供了上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 在。
14、 抑制病原菌中的应用， 所述病原菌为辣椒立枯病菌或油菜菌核病菌 ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 的抑菌率分别为辣椒立枯病菌 67.5%， 油菜菌核病菌 69.5%。 0011 进一步的， 上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 在抑制病原菌中的应 用， 所述病原菌为棉花立枯病菌、 茄子菌核病菌、 番茄灰霉病菌、 黄瓜枯萎病菌、 玉米大斑 病菌、 玉米小斑病菌或小麦长蠕孢菌 ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 的抑菌率均为大于等于 57.5%。 0012 进一步的， 上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 在抑制病原菌中的应 用， 所述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH01。
15、0 在含有色氨酸和不含色氨酸的金氏培养 基中分泌吲哚乙酸的量分别为 63.82mg/L 和 5.38mg/L， 在无机磷和有机磷培养液中， 有效 磷增量分别为 88.63 mg/L 和 86.05 mg/L。 0013 本发明的第三个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的 微生物菌剂， 所述微生物菌剂的组成按照重量百分比计为普城沙雷氏菌株 GH010 5-10%， 普 城沙雷氏菌株 GH010 培养基 90%-95%。 0014 进一步的， 上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的微生物菌剂， 所 述普城沙雷氏菌株 GH010 培养基包括以重量百分比计的以。
16、下组分 ： 玉米粉 1.5-2.5%， 黄豆 粉 1-1.5%， 蛋白胨 0.2-0.5%， 蒸馏水或去离子水 1000ml ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 培养 基的 pH 值为 7.5-8.5。 0015 进一步的， 上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的微生物菌剂， 所述普城沙雷氏菌株 GH010 培养基包括以重量百分比计的以下组分 ： 玉米粉 2%， 黄豆粉 1.25%， 蛋白胨 0.35%， 蒸馏水或去离子水 1000ml ； 所述普城沙雷氏菌株 GH010 培养基的 pH 值为 7.5。 0016 本发明的第四个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH0。
17、10 制备 的微生物菌剂的制备方法， 是将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 在普城沙雷氏 菌株 GH010 培养基上液体发酵 16-22 小时得到的 ； 所述液体发酵条件为温度 25-29， 转 速 200-300r/min， 通 气 量 800-1000L/h ； 所 述 普 城 沙 雷 氏 菌 株 GH010 的 活 菌 数 为 9.861011cfu/mL-1.061013cfu/mL。 0017 进一步的， 上述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的微生物菌剂的 制备方法， 所述液体发酵条件为温度 27， 转速 250r/min， 通气量 900L/h， 发酵时。
18、间 19 小 时。 0018 本发明的第五个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 制备的 微生物菌剂在制备微生物农药或微生物肥料中的应用。 说 明 书 CN 103122330 A 4 3/10 页 5 0019 本发明的具体操作过程如下 ： 一、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 GH010 Serratia plymuthica（CGMCC No.6423） 的形态鉴定。 0020 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）接种于在牛肉膏蛋白胨平板培养基 （牛肉膏 3g， 蛋白胨 5g， 琼脂 10-1。
19、2g， 水 1000ml， pH7.0-7.2） 上， 28培养 5d 的培养性状为 ： 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 Serratia plymuthica GH010 （CGMCC No.6423） 菌落呈圆形， 边缘整齐， 脐状凸起， 表面有光 泽， 奶油色。在 NA 液体培养基 （牛肉膏 3g， 蛋白胨 5g， 水 1000ml， pH7.0-7.2） ， 28摇床培 养 3d 后， 生长丰富， 高度混浊， 匀质， 絮状沉淀， 振荡完全分散， 表面无生长， 有气味， 革兰氏 染色呈阴性， 短杆状。 0021 二、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica。
20、 GH010（CGMCC No.6423） 的 16S rDNA 基因序列鉴定。 0022 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的 16S rDNA 基因序列在 Genebank 中与Serratia plymuthica（EU266583） 16S rDNA 基因序列进行同源性比较。比较结果表明， 普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010 （CGMCC No.6423） 与Serratia plymuthica（EU266583） 的同源性可以达到99%以上， 可 以证明高寒草地牧草内生普城。
21、沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的确属于沙雷氏菌Serratia。 0023 三、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的室内抑菌活性进行测定。 0024 首次筛选出高寒草地牧草内生菌普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010 （CGMCC No.6423） 拮抗菌株， 将该拮抗菌株接种于 GH010（CGMCC No.6423） 培养基中进行培 养 ； 同时， 将指示菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂 （即 PDA） 培养基 （马铃薯 200。
22、g， 萄萄糖 20g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1000m1， pH6.7-7.0） 中进行培养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养 基中培养活化后， 分别用打孔器打成直径为 7mm 的菌饼。选取拮抗菌株的菌饼一块， 置于 PDA 培养基中 ； 具体的， 可以将该菌饼接种于盛装 PDA 培养基的平皿的中央位置 （平皿直径 9cm） ； 再选取由指示菌株得到的菌饼四块， 根据对峙法， 将该四块菌饼等距接种于距该平皿 中央位置为 3.5cm 的圆周上。将该培养皿在 26的环境温度下培养 5 天后， 用十字法多次 重复测定该 PDA 培养基中上述菌株的抑菌圈直径， 在本试验中， 重复测定 3 次。 0。
23、025 高 寒 草 地 牧 草 内 生 普 城 沙 雷 氏 菌 株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的无菌液对部分病原菌抑菌能力的测定结果可以参见表 1。 说 明 书 CN 103122330 A 5 4/10 页 6 0026 由表 1 可知， 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010 （CGMCC No.6423） 对表 1 中的辣椒立枯丝核病菌抑菌率达到 67.5%， 油菜菌核病菌抑菌率达 到 69.5%， 对其余 7 种常见植物病菌的抑制率至少可以达到 57.5%， 开发前景较好。 0027 四、 。
24、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的产生吲哚乙酸及溶磷能力检测及促生能力测定。 0028 1、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的产生吲哚乙酸 （IAA） 能力测定。 0029 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 接种于含有 100mg/L 色氨酸 （或者不含色氨酸） 的金氏 （King） 培养液 （蛋白胨 20g， K2HPO4 1.15g， MgSO4.。
25、7H2O 1.5g， 丙三醇 15ml， L- 色氨酸 100mg( 或不加色氨酸） ） 培养 12 天 后对菌悬浮液和空白对照离心10 min ， 转速为10000 r/min， 取上清液4 mL分别加入等量 比色液， 黑暗中静置 30min 后立即用分光光度计测定 OD530 值， 普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 在含有色氨酸和不含色氨酸的金氏培养基中分泌 IAA 的量分别为 63.82mg/L 和 5.38mg/L。 0030 2、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMC。
26、C No.6423） 的溶磷能力测定。 0031 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 接种于 PKO（或蒙金娜） 培养液 （Ca3(P04)23.0-5.0g， 蔗糖 10.0g， (NH4)2SO40.5g， NaCl 0.2g， MgSO4.7H2O 0.1g， KC1 0.2g， 酵母粉 0.5g,MnSO41mL(0.004 g/L)， FeSO4(Fe. EDTA) 0.1mL (0.002g/L)， 琼脂 15g， pH 值 7.0） 中， 装液量为 50/150ml， 121灭菌 20min， 以不接菌。
27、的基础培养液为对照。然后置于 28、 160 r/min 恒温振荡器中培养 10d 后离心 15 min， 转速为 10000 r/min， 上清液采用钼锑抗比色法测定有效磷增量， 普城沙雷氏菌株 Serratia plymuthica GH010 （CGMCC No.6423） 在无机磷和有机磷培养液中， 有效磷增量分 别为 88.63 mg/L 和 86.05 mg/L。 0032 3、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC 说 明 书 CN 103122330 A 6 5/10 页 7 No.6423） 促生能力测定。 0033 。
28、将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）接种于牛肉膏蛋白胨培养液 （牛肉膏 3g， 蛋白胨 5g， 琼脂 10-12g， 水 1000ml， pH7.0-7.2） 中， 28下震荡培养 48h， 用无菌水稀释成 1:30、 1:40、 1:50 的浓度。浸种 24h， 以清水处理为对照， 置于培养皿中的滤纸上， 每皿 100 粒， 每处理重复 3 次， 观察、 记录供试 作物种子的发芽情况。 待供试作物种子露白后， 将已露白的作物种子栽至小花盆， 每天用不 同浓度的菌液浇灌幼苗， 记录其株高的生长状况。结果表明， 1 ： 。
29、50 菌液对作物种子发芽率 和株高有显著的促进作用。 0034 高 寒 草 地 牧 草 内 生 普 城 沙 雷 氏 菌 株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 对部分种子发芽率的测定结果参见表 2。 0035 高 寒 草 地 牧 草 内 生 普 城 沙 雷 氏 菌 株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 对部分作物株高的测定结果参见表 3。 0036 五、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的最适培养基及其微生物菌剂的性能进行检。
30、测。 0037 1、 确定高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的最适培养基。 0038 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 分别接种于标号依次为 A、 B、 C、 D、 E、 F 和 G 的培养基中， 观测普城沙雷氏菌株 Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 在这 7 种培养基中的生长能力。 0039 经观测， 发现高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010 （。
31、CGMCC No.6423） 在这 7 种培养基中均能生长， 但活菌数有差异。其中， 对高寒草地牧草内 生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 在这 7 种培养基中活菌 说 明 书 CN 103122330 A 7 6/10 页 8 数的测定结果可以参见表 4。 0040 在表 4 中，“A” 表示营养琼脂 （Nutrient Agar， 简称 NA） 培养基， 在 NA 培养基中， 包括牛肉胨 5.0g、 蛋白胨 10g、 蔗糖 20g 和蒸馏水 / 去离子水 1000mL ；“B” 表示 PDA 培养基， 在 PDA 培养基中， 包。
32、括马铃薯 200g、 蛋白胨 10g、 蔗糖 20g 和蒸馏水 / 去离子水 1000mL ；“C” 表示营养肉汤 (Nutrient Broth， 简称 NB) 培养基， 在 NB 培养基中， 包括牛肉胨 3g、 蛋白胨 5.0g、 葡萄糖2.5g和蒸馏水/去离子水1000mL ；“D” 表示酵母葡萄糖固体 （即NYDA） 培养基， 在NYDA培养基中， 包括牛肉胨8g、 酵母浸膏5.0g、 葡萄糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL ； “E” 表示第一玉米淀粉培养基， 在第一玉米淀粉培养基中， 包括玉米淀粉 2.5g、（NH4） 2SO4 10g、 蔗糖10g和蒸馏水/去离子水1000m。
33、L ；“F” 表示第二玉米淀粉培养基， 在第二玉米淀粉 培养基中， 包括玉米淀粉 3.0g、（NH4） 2SO4 10g、 KH2PO4 15g、 蔗糖 10g 和蒸馏水 / 去离子水 1000mL ； “G” 表示蛋白胨培养基， 在蛋白胨培养基中， 包括蛋白胨 10g、 酵母浸膏 5.0g、 NaCl 10g 和蒸馏水 / 去离子水 1000mL。 0041 由表 4 可知， 在相同的条件下， 选择 7 种不同的培养液培养 GH010（CGMCC No.6423） ， 其活菌量有明显差异。培养液 E 中活菌数为 1.921011cfu/mL， 而培养液 A 的活 菌数达到 1.061012c。
34、fu/mL， 是培养液 E 的 5.52 倍， 两者之间存在显著差异。其它 5 种培 养液的活菌数为 9.261011 cfu/mL 6.361011cfu/mL， 均与培养液 A 存在极显著差异。 可见， 培养液 A 较为理想， 因此， 牛肉膏 5.0g/L、 蛋白胨 10g/L、 蔗糖 20g/L 为 GH010 （CGMCC No.6423） 的基础培养基。 0042 在确定 NA 培养基为最适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 生长的培养基的基础上， 进一步利用正交法对 NA 培养基中碳氮源含量和 pH 值进 行优化。 00。
35、43 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 以5%的接种量， 以140r/min的转速， 在28的温度条件下发酵24h后， 以玉米粉、 马铃薯淀粉、 玉米淀粉、 白砂糖和不加碳源为处理， 测定发酵液中的活菌数。 0044 经综合测定， 用 4 种不同的碳源培养， 其活菌量有明显差异， 而以玉米粉为碳源的 培养基更适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的生长， 活 菌量达到 6.891011cfu/mL， 即玉米粉为筛选出的较优的碳源。 0045 将高寒草地牧。
36、草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 以5%的接种量， 以140r/min的转速， 在28的温度条件下发酵24h后， 以黄豆粉、 NH4Cl、（NH4） 2SO4、 KNO3和不加氮源为处理， 测定发酵液中的活菌数。 0046 经综合测定， 用 4 种不同的氮源培养， 其活菌量有明显差异， 而以黄豆粉为氮源时 说 明 书 CN 103122330 A 8 7/10 页 9 更适合高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的生长， 活菌量达到 7.831011cf。
37、u/mL， 即黄豆粉为筛选出的较优的氮源。 0047 以玉米粉、 黄豆粉、 蛋白胨及 pH 进行正交试验， 经综合测定， 发现优化后的培养基 比上述 NA 培养基更适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的生长和抑菌。其中， 上述优化后的培养基的组份、 含量和 pH 值分别为 ： 玉米粉 2%、 黄豆粉 1.25%、 蛋白胨 0.35%、 pH 值 7.5， 蒸馏水 / 去离子水 1000mL。 0048 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在上述优化后的培养。
38、基中发酵， 发酵液中活菌数可以达到 5.431011 cfu/ mL -7.331012cfu/mL。另外， 将普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在包含玉米粉 2%、 黄豆粉 1.25%、 蛋白胨 0.35%、 pH 值 7.5， 蒸馏水 / 去离子水 1000ml 的培养基中发酵， 发酵液中活菌数可以达到 7.331012cfu/mL。 0049 2、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 微生物菌剂的活性进行检测。 0050 在上述试验一中已确定高寒草地牧。
39、草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010 （CGMCC No.6423） 的最适培养基的基础上， 将保存在斜面培养基中的高寒草地牧草内 生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） ， 在营养琼脂 （Nutrient Agar， 简称 NA） 培养基的平皿上培养活化 24h 后， 接种于营养肉汤 (Nutrient Broth， 简称 NB)培养基中 ； 培养24h之后， 以5%的接种量接入种子发酵罐中培养20h之后， 转接种于10L 的发酵罐中进行发酵， 以发酵液中活菌数为指标， 分别对通气量、 转速、 接种量。
40、和装液量进 行优化， 最终确定高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 在 10L 发酵罐中的最适发酵条件为 ： 温度 25-29， 接种量 5%-10%， pH7.5-8.5， 通气量 800-1000L/h， 转速 200-300 r/min， 培养时间为 16-22h， 活菌数为 9.8591011/ mL-1.061013cfu/mL。 0051 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 在上述发酵条件的发酵罐中发酵， 即可制得到具有良好促生能力。
41、和抑菌能力的 微生物菌剂。其中， 在温度为 28， 接种量为 10%， pH 值为 7.5， 通气量为 1000L/h， 转速为 200r/min 和培养时间为 19h 的发酵条件下， 发酵液中活菌数可以达到 1.061013cfu/mL。 0052 3、 对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 微生物菌剂的质量检测方法进行验证。 0053 平板菌落计数法用于测定平板菌落中活菌体的密度， 比浊法用于测定平板菌落中 活菌体的个数。这里， 分别以平板菌落计数法和比浊法测定平板菌落中活菌体的密度和个 数， 测定结果基本一致， 。
42、即平板菌落上活菌体的密度越大、 个数越多， 紫外分光光度计测定 OD600nm 处的吸收值越高。 0054 可见， 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 微生物菌剂的质量可以采用平板菌落计数法检测， 也可以采用比浊法检测。 0055 本发明的有益效果为 ： 本发明提供的普城沙雷氏菌株 GH010 及以其制备的微生物 菌剂， 对多种病原菌均有良好的抑制效果， 其抑制结果为辣椒立枯病菌 67.5%， 油菜菌核病 菌 69.5%， 棉花立枯病菌、 茄子菌核病菌、 番茄灰霉病菌、 黄瓜枯萎病菌、 玉米大斑病菌、 玉米 小斑病菌或。
43、小麦长蠕孢的抑菌率均为大于等于 57.5%， 且对紫花苜蓿等作物有促生作用， 以 说 明 书 CN 103122330 A 9 8/10 页 10 其制备的微生物农药和微生物肥料环保性好， 不易产生抗药性， 安全性良好。 附图说明 0056 图 1 为本发明提供的普城沙雷氏菌株 GH010 的菌落形态 （左） 及菌体形态 （右） 。 具体实施方式 0057 实施例 1 ： 一株普城沙雷氏菌株， 该普城沙雷氏菌株的拉丁文名称为Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） ， 由中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编 号为 CGMCC No.6。
44、423。 0058 如图 1 所示， 提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的光学显微镜照片图。 0059 实施例 2 ： 普城沙雷氏菌株 GH010 能够对辣椒立枯病菌和油菜菌核病菌等病原菌的抑制， 高寒草 地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 对油菜菌核病 菌的抑菌率为 69.5% ； 对辣椒立枯病菌的抑菌率为 67.5%。 0060 实施例 3 ： 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC 。
45、No.6423） 对 棉花立枯病菌、 茄子菌核病菌、 番茄灰霉病菌、 黄瓜枯萎病菌、 玉米大斑病菌、 玉米小斑病菌 和小麦长蠕孢等病原菌具有抑制作用， 抑菌率至少为 57.5%。 0061 实施例 4 ： 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 的 发酵液可以使紫花苜蓿种子发芽率提高 18.9%， 使株高增加 1.01cm。 0062 实施例 5 ： 一种普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 微生物菌剂， 该 微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括 ： 高寒草。
46、地牧草内生普城沙雷氏菌株 Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 5% 和 GH010（CGMCC No.6423） 培养基余 量。 0063 GH010（CGMCC No.6423） 培养基的组份和含量包括 ： 玉米粉 1.5%、 黄豆粉 1.0%、 蛋 白胨 0.2%、 pH 值 7.5， 蒸馏水 / 去离子水 1000ml。 0064 实施例 6 ： 与上述实施例不同的是， 在本实施例中， 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 微生物菌剂的组份和重量百分比含量包括 ： 高寒。
47、草 地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 8% 和 GH010 （CGMCC No.6423） 培养基余量。 0065 在本实施例中， GH010（CGMCC No.6423） 培养基的组份和含量包括 ： 玉米粉 2%、 黄 豆粉 1.25%、 蛋白胨 0.35%、 pH 值 8.0， 蒸馏水 / 去离子水 1000ml。 0066 实施例 7 ： 与上述实施例不同的是， 在本实施例中， 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia 说 明 书 CN 103122330 A 10 9/10 页 11 plymuthica G。
48、H010（CGMCC No.6423） 微生物菌剂的组份和重量百分比含量包括 ： 高寒草 地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 10% 和 GH010 （CGMCC No.6423） 培养基余量。 0067 在本实施例中， GH010（CGMCC No.6423） 培养基的组份和含量包括 ： 玉米粉 2.5%、 黄豆粉 1.5%、 蛋白胨 0.5%、 pH 值 8.5， 蒸馏水 / 去离子水 1000ml。 0068 实施例 8 ： 一种高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMC。
49、C No.6423） 微生物菌剂的制备方法， 该制备方法包括 ： 将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株 Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 5% 接种于 GH010（CGMCC No.6423） 培养 基中， 在温度为 25、 转速为 200r/min 和通气量为 800L/h 的条件下， 进行液体发酵 16h， 得 到的发酵液可以直接作为高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010 （CGMCC No.6423） 微生物菌剂使用。 0069 在本实施例中， GH010（CGMCC No.6423） 培养基的 pH 值为 7.5， 组份和含量可以包 括 ： 玉米粉 1.0%、 黄豆粉 1.0%、 蛋白胨 0.2%、 pH 值 7.5， 蒸馏水 / 去离子水 1000ml。 0070 经测定， 上述发酵液中高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuth。