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1、(10)申请公布号 CN 103160496 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103160496 A *CN103160496A* (21)申请号 201310111107.9 (22)申请日 2013.04.02 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院北京畜牧兽医研究 所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 申请人 哈尔滨体育学院 (72)发明人 李向臣 何晓红 白春雨 张颖 王紫娟 李克良 孙婷婷 关伟军 (54) 发明名称 一种大型实验动物血液总 RNA 提取和纯化方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种血液总 RNA 提。
2、取和纯化方 法， 具体地说是利用一种大型实验动物血液为样 本， 用改良的红细胞裂解液裂解红细胞， 通过异硫 氰酸胍法提取总RNA并运用改进oligo(dT)-纤维 素层析法对总 RNA 进行纯化， 最终获得大型实验 动物血液 poly(A)+RNA。而本发明获得的纯化后 的 poly(A)+RNA 可以在研究基因功能及其表达调 控、 阐明疾病发生机理、 寻找药物治疗靶点等诸多 方面均具有重要的、 不可替代的应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 10。
3、3160496 A CN 103160496 A *CN103160496A* 1/1 页 2 1. 一种大型实验动物血液总 RNA 的提取方法， 用改良的红细胞裂解液裂解红细胞获得 白细胞， 将裂解液成分中 NaHCO3 换成 KHCO3， 更加充分的裂解红细胞。 2.一种大型实验动物血液总RNA的纯化方法， 运用改进的oligo(dT)-纤维素层析法过 柱纯化总 RNA， 2x 装柱缓冲液中用 Licl 代替 Nacl 可以避免月桂基肌氨基酸钠在室温低于 18时阻止柱液的流出这一问题。 权 利 要 求 书 CN 103160496 A 2 1/3 页 3 一种大型实验动物血液总 RNA 提。
4、取和纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及一种血液总 RNA 提取和纯化方法， 具体地说是利用一种大型实验动物 血液为样本， 改良的红细胞裂解液裂解红细胞， 通过异硫氰酸胍法提取总 RNA 并运用改进 的oligo(dT)-纤维素层析法对总RNA进行纯化， 最终获得大型实验动物血液poly(A)+RNA。 此发明属于基础生命科学、 动物遗传资源学及分子生物学的交叉学科领域。 背景技术 0002 实验动物是现代生命科学研究的重要组成部分， 是生物医学乃至整个生命科学的 基础和重要支撑条件。实验动物是以科学实验为目的， 经人工饲养、 繁殖， 对其携带的微生 物或寄生虫进行控制， 遗传背景明确、 。
5、来源清楚， 而应用于科学研究、 教学、 生产和鉴定以及 其他科学试验的动物。动物实验已被广泛用于科学研究的各个领域， 尤其在生物医学研究 中更是非常重要的研究手段。 随着现代生物学技术迅猛发展， 特别是转基因技术、 基因敲除 技术、 克隆技术等其他分子技术在实验动物模型制作中得到广泛应用， 从而使实验动物品 种、 品系及具有人类疾病特征的模型动物种类数量快速增长。 重视动物实验问题， 既是自然 科学发展的必然趋势， 也是社会科学发展的必然结果。当前， 基因工程技术的飞速发展， 实 验动物科学也迎来一个革命性时代， 这使得在实验动物活体内集整体水平、 细胞水平和分 子水平于一体的研究成为可能， 。
6、从而促进生物医学的整体研究。 0003 实验动物是科学研究的基础和重要支撑条件。在医学、 化工、 农业、 轻工、 环保、 航 空、 商检、 军工等众多领域的科学研究、 安全评价、 效果验证和新技术方法的探索中， 实验动 物作为重要的自然科技资源发挥着其他手段不可替代的作用。因此， 实验动物资源的合理 开发与科学利用与社会经济发展和科技进步有着密切的内在联系。 作为一种科技含量较高 的生物技术产品， 实验动物及其相关研究是一项基础性强的、 高新技术发展活跃的研究领 域， 其发展和应用程度已成为衡量一个国家或地区科学技术水平高低的重要标志之一。 0004 DNA， RNA 和蛋白质是三种重要的生物。
7、大分子， 是生命现象的分子基础。DNA 的遗传 信息决定生命的主要性状， 而 mRNA 在信息传递中起很重要的作用。其它两大类 RNA， rRNA 和 tRNA， 同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此 mRNA、 rRNA、 tRNA 在 遗传信息由 DNA 传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。大型实验动物身上的特 异基因是及其珍贵的遗传资源。 实验动物遗传工程技术的发展、 完善， 为推动生命科学飞跃 发展提供了有力工具。实验动物遗传工程在研究基因功能及其表达调控、 阐明疾病发生机 理、 寻找药物治疗靶点等诸多方面均具有重要的、 不可替代的应用价值 . 发明内容 000。
8、5 本发明是提供大型实验动物血液总 RNA 和 poly(A)+RNA 0006 本发明提供大型实验动物血液总 RNA 的提取方法， 其中利用大型实验动物血液作 为样本， 通过异硫氰酸胍法提取总 RNA 0007 本发明提供大型实验动物血液总 RNA 纯化方法， 其中利用大型实验动物总 RNA 为 说 明 书 CN 103160496 A 3 2/3 页 4 样本， 通过改进的 oligo(dT)- 纤维素层析法纯提取 poly(A)+RNA 具体实施方式 0008 1. 总 RNA 的提取 0009 (1) 取新鲜血液加入改进的红细胞裂解液 (155mmol/LNH4CL、 0.1mmol/。
9、LEDTA 和 12mmol/LKHCO3)， 3000rpm/min 离心 15min， 获得白细胞 0010 (2) 加入 1ml 异硫氰酸胍， 转移到 1.5ml 离心管中， 混匀后室温静置 5min ； 0011 (3) 加入 0.2ml 苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25 24 1)， 漩涡振荡器振荡 15s 混匀， 室温静置 2 3min ； 0012 (4)4 12000r/min 离心 15min ； 0013 (5) 取上层水相到另一离心管中， 加入 400l 异丙醇， 混匀后室温静置 10min ； 0014 (6)4 12000r/min 离心 10min， 去上清， 用。
10、 1ml75乙醇洗涤沉淀两次 ； 0015 (7)37 5 10min 晾干乙醇 ； 0016 (8) 将 RNA 溶于 50 100l 无 Rnase 的 DEPC 处理过的水中。 ； 0017 (9) 紫外分光光度计测定 OD260/OD280 检测提取总 RNA 的纯度 0018 2. 甲醛变性电泳 0019 (1) 电泳槽用 0.3 H2O2 浸泡 30min， DEPC 水冲洗晾干。 0020 (2)铺胶(20ml) ： 琼脂糖0.24g(1MOPS 2.0ml无RNase水17.4ml 10MOPS 2.0ml 37甲醛 0.6ml EB 1ml 将琼脂糖加水融化后， 加 10MO。
11、PS， 待胶冷却至 60左右， 再加甲 醛和 EB。( 若铺大胶可将上述各试剂的量加大 2 倍 )。 0021 (3)RNA 样品处理 ( 以一条泳道为例 ) 0022 10MOPS 1.0l 0023 37甲醛 3.5l 0024 甲酰胺 10.0l 0025 RNA 样品 4.5l(20g/ml) 0026 与 55变性 15min， 冰浴 5min 0027 (4) 加 2.0ml 甲醛凝胶加样缓冲液 (10) 0028 (5) 加样和电泳 0029 将凝胶预电泳 5min， 电压降为 5v/cm。随后加样品和标准物， 以 3-4v/cm 电压降电 泳， 电泳液为 1MOPS 电泳缓冲液。
12、。直至溴酚蓝迁移至胶下游的 3/4 处。 0030 (6)电泳结束后， 在紫外灯下， 仔细测量28S rRNA和18S rRNA至加样孔的距离， 并 同荧光尺一起拍照， 以记录标准物的位置。 0031 3.Poligo(dT)- 纤维素层析法提取 poly(A)+RNA 0032 (1) 取 oligo(dT)- 纤维素 0.5 1.0g， 用 0.1mol/L NaOH 重悬。 0033 (2) 用 oligo(dT)- 纤维素 (0.5 1.0ml 柱体积 ) 灌注 DEPC 处理过的一次性柱子 ( 或塞以无菌玻璃毛的巴式滴管， 300烘烤灭菌 4h)。用 3 倍柱体积 DEPC 处理过的。
13、水洗涤 柱子。 0034 (3) 用无菌的 1 装柱缓冲液 ( 用无菌的 DEPC 处理过的水稀释 2 的贮存液 ) 洗 涤柱子， 直到流出液的 pH 值 8.0。用 pH 试纸测试 说 明 书 CN 103160496 A 4 3/3 页 5 0035 (4)用双蒸灭菌的水溶解RNA， 65， 5min处理溶液。 将溶液快速冷却到室温， 并加 入 1 倍体积的 2 装柱缓冲液。 0036 柱上 poly(A)+ 的恢复 0037 (5)将RNA溶液加到柱上， 并立即用无菌的管子收集流出液。 当所有的RNA溶液进 入柱子时， 用 1 倍体积的 1 装柱缓冲液洗柱， 继续收集流出液。 0038 。
14、(6) 当所有的液体流出柱子后， 65加热收集液 5min， 重新加到柱子中。再次收集 流出液。 0039 (7) 用 5 10 倍柱体积的 1 装柱缓冲液洗涤柱子， 用无菌塑料管 ( 如微量离心 管 ) 收集 1ml 洗涤液。 0040 (8) 按 1 20 比例稀释各部分收集液， 用石英杯或处理过的异丁烯杯测量 260nm 出的吸收值， 以 1 装柱缓冲液作为空白对照。 0041 (9) 将包含大多数 OD260 物质的部分用 2.5 倍体积的乙醇沉淀。从柱中洗脱 poly(A)+RNA 0042 (10)用23倍柱体积的无菌、 无RNA酶的洗脱缓冲液从oligo(dT)-纤维素柱上 洗脱。
15、 poly(A)+RNA。收集相当多于 1/2 1/3 柱体积的流出液。 0043 (11)用石英杯或处理过的异丁烯杯测量各部分收集液在260mn处的吸光值。 混合 包含洗脱 RNA 的部分。RNA 的进一步纯化 ( 可选 ) 经过一轮 oligo(dT)- 纤维素柱的层析得 到的物质通常会包含大约相同数量的多聚腺苷酸和不含多聚腺苷酸 RNA， 可以按下面的步 骤进一步纯化。 0044 (12) 为进一步纯化 poly(A)+RNA， 65加热准备的 RNA 3min， 然后迅速冷却到室 温。用 5mol/L NaCl 调整洗脱 RNA 中的 NaCl 浓度至 0.5mol/L， 在同一个 o。
16、ligo(dT)- 纤维 素柱上进行第二轮层析 ( 重复步骤 3 和 5 11)。 0045 (13) 对于第二轮 oligo(dT)- 纤维素柱层洗脱下来的 poly(A)+RNA， 加入 3mol/L 的乙酸钠 (pH5.2) 至终浓度 0.3mol/L。混合均匀。加入 2.5 倍体积冰冷的乙醇， 混合， 将该 溶液置于冰上至少 30min。 0046 (14) 在 10000g( 相当于 Sorvall SS-34 转子 9000r/min)， 4下离心 15min。小心 弃掉上清， 用 70乙醇洗涤沉淀 ( 通常是不可见的 )。稍做离心， 吸出上清， 将敞口的管子 倒置几分钟， 使大部分剩余酒精蒸发。不要使沉淀干燥。 0047 (15) 重新将潮湿的 RNA 沉淀用小体积的无菌、 DEPC 处理过的水溶解。用石英杯 或处理过的异丁烯杯测量每一部分柱子收集液在 260nm 处的吸光值。将含有 RNA 的部分混 合。 0048 (16) 保存制备好的 poly(A)+RNA。 说 明 书 CN 103160496 A 5 。