多功能抗体缀合物.pdf

本发明涉及多功能抗体缀合物类(MAC)，其包含抗体或其抗原结合部分及接头，所述抗体或其抗原结合部分包含至少轻链κ恒定区(CLκ)的片段，所述片段包含根据Kabat编号的K188，且所述接头包含式X-Y-Z，其中Z是通过K188的侧链与所述抗体共价连接的基团，Y是线性或分支的生物相容性连接链且X是与至少一个效应物部分共价连接的基团。本发明另提供本发明的特定MAC化合物及组合物。

权利要求书一种多功能抗体缀合物(MAC)及其药用可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物和前药，所述多功能抗体缀合物包含
(i)抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含至少轻链κ恒定区(CLκ)的片段，所述片段包含根据Kabat编号的K188；
(ii)接头，其包含式X‑Y‑Z，其中Z是通过K188的侧链与所述抗体共价连接的基团，Y是线性或分支的生物相容性连接链，且X是与至少一个效应物部分共价连接的基团。
权利要求1的MAC，其还包含H189‑CLκ。
前述权利要求中任一项的MAC，其还包含D151‑CLκ。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述CLκ区包含SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的至少残基62至103。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述CLκ区包含SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的至少残基1至106。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述效应物部分仅与所述MAC在K188CLκ处缀合。
权利要求1‑5中任一项的MAC，其中所述效应物部分与所述MAC在至少一条轻链上的K188CLκ处和所述抗体上的另一位置处缀合。
权利要求1‑5中任一项的MAC，其中所述效应物部分与所述MAC在至少一条轻链上的K188CLκ处和所述抗体上的另两个位置处缀合。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述效应物部分与两条轻链上的CLκK188缀合。
权利要求1‑8中任一项的MAC，其中所述效应物部分仅与一条轻链上的CLκK188缀合。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述效应物部分是治疗剂、蛋白质、肽、核酸、适体、小分子、蛋白质激动剂、蛋白质拮抗剂、代谢调节剂、激素、毒素、生长因子或诊断剂。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述至少一个效应物部分是蛋白质或肽。
权利要求12的MAC，其中所述接头的X基团与所述蛋白质或肽的氨基端、羧基端或肽连接残基的侧链共价连接。
权利要求13的MAC，其中所述肽连接残基选自K、R、C、T、Y、S、Dap、Dab、K(SH)、K的同系物和C的同系物。
权利要求14的MAC，其中所述连接残基是K。
前述权利要求中任一项的MAC，其中Y、X‑Y、Y‑Z或X‑Y‑Z选自：

其中m、n及j具有各自独立的范围，所述范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，所述范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30，且其中所述接头的整体长度不超过200个原子。
前述权利要求中任一项的MAC，其包含下式：

其中K188‑CLκ是与所述K188‑CLκ的侧链的共价连接，效应物部分‑LR是与所述效应物部分的共价键接，且m、n及j具有各自独立的范围，所述范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，所述范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30，且其中所述接头的整体长度不超过200个原子。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述接头的整体长度不超过150个原子。
权利要求18的MAC，其中所述接头的整体长度不超过100个原子。
权利要求19的MAC，其中所述接头的整体长度不超过60个原子。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述抗体选自利妥昔单抗、西妥昔单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、雷珠单抗和帕利珠单抗。
权利要求1‑20中任一项的MAC，其中所述抗体是催化醛缩酶抗体。
权利要求22的MAC，其中所述抗体是全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、VH、双价抗体或微型抗体，其包含来自h38c2的VH及VL结构域。
权利要求22的MAC，其中所述抗体包含SEQ ID NO:51及SEQ IDNO:52，或SEQ ID NO:53及SEQ ID NO:54。
权利要求1‑19中任一项的MAC，其中所述抗体包含：含有SEQ IDNO:5的HC区、含有SEQ ID NO:6的VH区、含有SEQ ID NO:16的VL区及含有SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47之一的CL区。
权利要求25的MAC，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3及SEQ IDNO:4。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述效应物部分是Ang2结合肽。
前述权利要求中任一项的MAC，其中所述Ang2结合肽包含选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的序列。
权利要求28的MAC，其中所述Ang2结合肽包含SEQ ID NO:27。
权利要求29的MAC，其中所述肽连接残基是SEQ ID NO:27的K11。
权利要求30的MAC，其包含以下结构：

其中K188‑CLκ是与所述K188‑CLκ的侧链的共价连接，且所述抗体包含SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。
一种包含前述权利要求中任一项的MAC的组合物，其中所述组合物或样品中至少约50%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。
权利要求32的组合物，其中所述组合物或样品中至少约60%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。
权利要求32的组合物，其中所述组合物或样品中至少约70%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。
权利要求32的组合物，其中所述组合物或样品中至少约80%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。
一种包含权利要求1‑31中任一项的MAC的组合物，其中至少约50%的抗体包含与K188‑CLκ共价连接的效应物部分。
权利要求36的组合物，其中至少约60%的抗体包含与K188‑CLκ共价连接的效应物部分。
权利要求36的组合物，其中至少约70%的抗体包含与K188‑CLκ共价连接的效应物部分。
权利要求36的组合物，其中至少约80%的抗体包含与K188‑CLκ共价连接的效应物部分。
一种包含权利要求1‑31中任一项的MAC的组合物，其中至少约70%的重链分子不与所述效应物部分缀合。
权利要求40的组合物，其中至少约80%的重链分子不与所述效应物部分缀合。
权利要求41的组合物，其中至少约90%的重链分子不与所述效应物部分缀合。
一种包含权利要求1‑31中任一项的MAC的组合物，其中包含单个用于所述效应物部分的缀合位点的轻链片段的量为约25‑95%。
一种包含权利要求1‑31中任一项的MAC的组合物，其中每抗体的缀合数为约0.5‑约5。
权利要求44的组合物，其中每抗体的缀合数为约0.5‑约3。
权利要求44的组合物，其中每抗体的缀合数为约0.5‑约1.5。
权利要求44的组合物，其中每抗体的缀合数为约1.5‑约5.0。
权利要求44的组合物，其中每抗体的缀合数为约1.5‑约3.0。
权利要求44的组合物，其中每抗体的缀合数为约1.5‑约2.5。
权利要求44的组合物，其中每抗体的缀合数为约1.7‑约2.3。
一种用于制备权利要求1‑31中任一项的多功能抗体缀合物(MAC)或权利要求32‑50中任一项的组合物的方法，所述方法包含缀合反应，所述缀合反应包括使所述效应物部分共价连接至以下式的离去基团Z*封端的接头且使所形成的效应物部分‑接头‑Z*复合物与所述抗体反应：

其中R1是F或Cl，h=2、3、4或5。
权利要求51的方法，其中R1是F。
权利要求51或52的方法，其中h=3、4或5。
权利要求51‑53中任一项的方法，其中Z*选自：

权利要求51‑54中任一项的方法，其中h=4或5。
权利要求51‑55中任一项的方法，其中Z*具有下式：

权利要求51‑56中任一项的方法，其中所述效应物部分:抗体的比为约1:1至约15:1。
权利要求57的方法，其中所述比为约2:1至约5:1。
权利要求57的方法，其中所述比为约3:1至约6:1。
权利要求57的方法，其中所述比为约3.5:1至约5:1。
权利要求57的方法，其中所述比为约5:1至约15:1。
权利要求57的方法，其中所述比为约5:1至约7:1。
权利要求51‑62中任一项的方法，其中在缀合反应期间的抗体浓度为约1毫克/毫升至约100毫克/毫升。
权利要求51‑62中任一项的方法，其中在缀合反应期间的抗体浓度为至少约5毫克/毫升。
权利要求51‑62中任一项的方法，其中在缀合反应期间的抗体浓度为至少约10毫克/毫升。
权利要求51‑62中任一项的方法，其中在缀合反应期间的抗体浓度为约5毫克/毫升至约50毫克/毫升。
权利要求51‑66中任一项的方法，其中所述反应在约4°C至约40°C的温度下进行。
权利要求51‑66中任一项的方法，其中所述反应在约4°C至约30°C的温度下进行。
权利要求51‑66中任一项的方法，其中所述反应在约15°C至约25°C的温度下进行。
权利要求1‑69中任一项的方法，其中所述反应在约6至约9的pH下进行。
权利要求1‑69中任一项的方法，其中所述反应在约6.5至约8的pH下进行。
权利要求51‑71中任一项的方法，其中所述抗体包含CLλ区，所述方法还包含以SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ IDNO:47的至少残基62‑103取代所述CLλ区的相应部分(根据Kabat编号)的初始步骤。
权利要求72的方法，其中所述抗体的相应的CLλ区被SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的至少残基1‑106取代。
一种MAC，其由权利要求51‑73中任一项的方法产生。
一种组合物，其包含权利要求74的MAC。
一种药物组合物，其包含权利要求1‑31中任一项或权利要求74的MAC，或权利要求32‑50中任一项的组合物，且还包含可接受的载体。
权利要求76的药物组合物，其还包含一或多种选自5‑氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、西妥昔单抗、舒尼替尼和利妥昔单抗的化合物。
一种抑制或减少血管生成或治疗或预防与血管生成紊乱相关的疾病或症状的方法，包括向患者施用治疗有效剂量的权利要求76或77的药物组合物。
权利要求78的方法，其中所述疾病是癌。
权利要求79的方法，其中所述癌是肺癌(NSCLC及SCLC)、头或颈癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肛门区域的癌、胃癌、乳腺癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、甲状腺癌、膀胱癌、脑癌、肾细胞癌、中枢神经系统(CNS)的癌、CNS的肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、脊轴肿瘤、口咽癌、下咽癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、尿道癌、淋巴瘤、肺癌(NSCLC及SCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肛门区域的癌，或一或多种前述癌的组合。

说明书多功能抗体缀合物
背景技术
发展双功能治疗剂具有放大组合式治疗策略的高度潜力。双功能治疗剂可通过一种治疗实体调节二种不同的途径以提供组合式治疗的好处。此外，双功能治疗剂亦可从不同途径之间的协同性获得好处，且相较于单一功能剂显示增加的活性。另外，双功能治疗剂可提供减少制造、储存及运送成本方面的好处，同时减少给予病患的治疗剂数量及简化给药方案。
IGF1R是跨膜异四聚体蛋白质，其具有呈二硫键接的(β‑α‑α‑β)构型的2个胞外α链及2个跨膜β链。IGF1R以高亲和力与IGF1结合。IGF1是70个氨基酸的肽，其主要由肝脏应答生长激素的刺激而生产，但亦可由身体内的几乎任何组织合成并以100至200纳克/毫升的浓度于血清中循环。IGF1R信号转导可能与许多肿瘤类型有关，特别是肺癌。举例来说，IGF1的血浆量升高是与肺癌的风险增加有关。此外，IGF1、IGF2及IGF1R是由正常肺细胞表达，但由肺癌细胞过表达。IGF1R信号转导亦已被认为与乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肉瘤、多发性骨髓瘤及其它恶性病有关。WO02053596、WO2005016967、WO2005005635及WO2009032145揭示IGF1R抗体及其抗原结合部分。
血管生成素1(Ang1)及血管生成素2(Ang2)是内皮细胞受体Tie2的配体，和VEGF及其它血管生成调节剂一起介导血管生成的过程。Ang1刺激Tie2的磷酸化，吸引周细胞至新形成的血管并促进周细胞的成熟。已知Ang2具有血管生成性且在许多癌中过表达。Ang2与Ang1竞争与Tie2的结合，促进周细胞的脱离并导致不稳定的血管。当VEGF及其它血管生成因子存在时，在这些不稳定血管中的内皮细胞增生并迁移以形成新血管。
大约50%的实体肿瘤病患具有增加表达的Ang2，但Ang2于癌组织中的量是高度可变。较高的Ang2表达与不良存活、较晚期疾病和更具侵入性的癌明显相关。Ang1和Ang2间的较低的比值已知亦与卵巢癌的不良预后有关。报告指出Tie2于肝细胞癌、星状细胞瘤、卡波西氏肉瘤、皮肤血管肉瘤及非小细胞肺癌中的表达被上调。Tie2过表达于许多肿瘤的血管上。表达Tie2的单核细胞导致肿瘤血管的形成。新发表的数据显示特别隔离Ang2可抑制肿瘤生长并造成分期肿瘤的消退。WO2008056346揭示Ang2结合肽。
在同一治疗中靶向IGF1R及Ang2二者可能经证实为肿瘤学家在多种治疗设置中使用的有效工具。该等方法已被假设(例如于WO2009088805及WO2010040508)，但到目前为止尚未有被证实。因此有需要提供以IGR‑1R及Ang2二者为目标的选择性肿瘤治疗。
在本说明书中提及任何技术并不是也不应被视为以任何形式承认或建议提及的技术形成普通一般知识的部分。
发明概述
本发明提供多功能抗体缀合物(MAC)，该MAC包含与至少一个效应物部分(Effector Moiety)缀合的抗体或其抗原结合部分，及该MAC的药用可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物和前药。本发明亦提供包含本发明的MAC的药物组合物及样品。
本发明亦提供多功能抗体缀合物(MAC)，该MAC包含与至少一个Ang2结合肽缀合的抗体或其抗原结合部分。
本发明提供多功能抗体缀合物(MAC)，该MAC包含与至少一个Ang2结合肽缀合的抗IGF1R抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，该至少一个Ang2结合肽通过接头与抗体的缀合残基的侧链缀合。
在一些实施方案中，效应物部分与抗体或其抗原结合部分的Fab区中的赖氨酸残基的侧链共价连接。在一些实施方案中，效应物部分与重链恒定区(CH)或轻链恒定区(CL)中的赖氨酸残基的侧链共价连接。效应物部分与抗体的CL结构域的反应是特别期望的，以最小化或防止对该抗体的Fc部分与Fc受体(诸如FcγR及FcRn)的结合或该抗体与其个别靶的结合的任何干扰。相反地，个别效应物部分与抗体的Fc部分的缀合可能降低该抗体于活体内的半衰期和/或其与该免疫系统相互作用的能力(效应物功能)。效应物部分于抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)中的缀合带来减少该抗体与其同源物结合的风险。
在一些实施方案中，效应物部分是与轻链κ恒定区(CLκ)结构域中的赖氨酸残基的侧链共价连接。效应物部分与CLκ结构域的优先缀合通过允许该抗体的CH结构域的同种型转换且不影响该效应物部分与该抗体的缀合部位而简化该MAC同种型的产生。
效应物部分可与轻链κ结构域恒定区(CLκ)(SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47)的K80(根据Kabat编号的K188)的侧链共价连接。在一些实施方案中，效应物部分是与SEQ ID NO:15的K80共价连接。SEQ ID NO:15的K80是位于抗体的重要区域以外，诸如互补位区、FcRn结合结构域、绞链区、FcR结合结构域；这提供好处，即优先地连接这些部位限制当MAC与效应物部分缀合时对抗体‑抗原相互作用的干扰量。
在某些方面中，效应物部分与基序K*HK的K*共价连接。该K*HK基序的K*可对应SEQ ID NO:15的K80。在某些方面中，效应物部分与位于CLκ区的基序K188H的K188共价连接(根据Kabat编号系统)。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基62至103。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47。
在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:15的至少残基62至103。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:15。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:45的至少残基62至103。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:45。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:46的至少残基62至103。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:46。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:47的至少残基62至103。在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:47。
在某些方面中，CLκ区包含SEQ ID NO:45或47。当CLκ区包含部分或完整的SEQ ID NO:45或47，x82可选自K、R、G、A、V、L、I、S、T、C、M、N、Q、D、E、H、F、W或Y。在某些方面中，x82可为G、A、V、L或I。在某些方面中，x82可为K、R、N或Q。在某些方面中，x82可为D或E。在某些方面中，x82可为K、R、G、A、V、L、I、N或Q。在某些方面中，x82可为D或E。在某些方面中，x82可为K、R、G、A、V、L、I、N、Q、D或E。在某些方面中，x82可为D或E。在某些方面中，x82可为H、F、W或Y。在某些方面中，x82不是脯氨酸。在某些方面中，(SEQ ID NO:15、45、46和/或47的)X82是R。在某些方面中，K190‑CLκ是R。
SEQ ID NO:45及47包含在CLκ中鉴别的多态性；V/A153及L/V191(根据Kabat编号)。因此，该三种多态性是：Km(1)：V153/L191、Km(1,2)：A153/L191、及Km(3)A153/V191。在本发明的某些包含SEQ ID NO:45和/或47的方面中，x45是V，且x83是L(Km(1))。在本发明的某些包含SEQ ID NO:45和/或47的方面中，x45是A，且x83是L(Km(1,2))。在本发明的某些包含SEQ ID NO:45和/或47的方面中，x45是A，且x83是V(Km(3))。
在某些方面中，MAC包含与二条轻链上的CLκK188缀合的效应物部分。在某些方面中，MAC包含与仅一条轻链上的CLκK188缀合的效应物部分。在某些方面中，效应物部分仅与MAC的K188CLκ缀合。在某些方面中，效应物部分与MAC的一条轻链上的K188CLκ和抗体的另一个位置缀合。在某些方面中，效应物部分与MAC的一条轻链上的K188CLκ和抗体的另二个位置缀合。在某些方面中，效应物部分与MAC的一条轻链上的K188CLκ和抗体的另三个位置缀合。在某些方面中，效应物部分与MAC的二条轻链上的K188CLκ和另一个位置缀合。在某些方面中，效应物部分与MAC的二条轻链上的K188CLκ和另二个位置缀合。在某些方面中，效应物部分与MAC的二条轻链上的K188CLκ和另三个位置缀合。
本发明的样品及组合物
在某些方面中，本发明提供MAC的组合物或样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体(或其抗原结合部分)，其中在该组合物或样品中至少约50%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物或样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体(或其抗原结合部分)，其中在该组合物或样品中至少约60%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物或样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体(或其抗原结合部分)，其中在该组合物或样品中至少约70%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物或样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体(或其抗原结合部分)，其中在该组合物或样品中至少约80%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物或样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体(或其抗原结合部分)，其中在该组合物或样品中至少约90%的效应物部分与K188‑CLκ缀合。
在某些方面中，本发明提供MAC的组合物(或样品)，该MAC包含抗体(或其抗原结合部分)，其中至少约50%的抗体包含与至少一条轻链上的K188‑CLκ共价连接的效应物部分。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物(或样品)，该MAC包含抗体(或其抗原结合部分)，其中至少约60%的抗体包含与至少一条轻链上的K188‑CLκ共价连接的效应物部分。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物(或样品)，该MAC包含抗体(或其抗原结合部分)，其中至少约70%的抗体包含与至少一条轻链上的K188‑CLκ共价连接的效应物部分。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物(或样品)，该MAC包含抗体(或其抗原结合部分)，其中至少约80%的抗体包含与至少一条轻链上的K188‑CLκ共价连接的效应物部分。在某些方面中，本发明提供MAC的组合物(或样品)，该MAC包含抗体(或其抗原结合部分)，其中至少约90%的抗体包含与至少一条轻链上的K188‑CLκ共价连接的效应物部分。在某些方面中，该效应物部分与二条轻链上的二个K188‑CLκ共价缀合。
在某些方面中，本发明提供MAC的样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体或其抗原结合部分，其中至少约30%的该样品包含与每抗体约二个位置缀合的效应物部分，且其中至少一个效应物部分缀合位点是K188‑CLκ。在某些方面中，该量是约40%。在某些方面中，该量是约50%。在某些方面中，该量是约60%。在某些方面中，该量是约70%。在某些方面中，该量是约80%。在某些方面中，该量是约90%。在某些方面中，该量是约95%。在某些方面中，该量是约99%。
在某些方面中，本发明提供MAC的样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体或其抗原结合部分，其中至少约30%的该样品包含与每抗体约三个位置缀合的效应物部分，且其中至少二个效应物部分缀合位点是在各轻链上的K188‑CLκ。在某些方面中，该量是约40%。在某些方面中，该量是约50%。在某些方面中，该量是约60%。在某些方面中，该量是约70%。在某些方面中，该量是约80%。在某些方面中，该量是约90%。在某些方面中，该量是约95%。在某些方面中，该量是约99%。
在某些方面中，本发明提供MAC的样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体或其抗原结合部分，其中至少约30%的该样品包含与每抗体约四个位置缀合的效应物部分，且其中至少二个效应物部分缀合位置是在各轻链上的K188‑CLκ。在某些方面中，该量是约40%。在某些方面中，该量是约50%。在某些方面中，该量是约60%。在某些方面中，该量是约70%。在某些方面中，该量是约80%。在某些方面中，该量是约90%。在某些方面中，该量是约95%。在某些方面中，该量是约99%。
在某些方面中，本发明提供MAC的样品，该MAC包含与效应物部分共价缀合的抗体或其抗原结合部分，其中至少约30%的该样品包含与每抗体约五个位置缀合的效应物部分，且其中至少二个效应物部分缀合位置是在各轻链上的K188‑CLκ。在某些方面中，该量是约40%。在某些方面中，该量是约50%。在某些方面中，该量是约60%。在某些方面中，该量是约70%。在某些方面中，该量是约80%。在某些方面中，该量是约90%。在某些方面中，该量是约95%。在某些方面中，该量是约99%。
在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少50%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约60%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约65%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约70%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约75%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约80%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约85%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约90%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约95%的轻链分子与至少一个效应物部分缀合。
在某些方面中，本发明提供MAC的样品，其中至少约70%的重链分子不与该效应物部分缀合。在某些方面中，该量是约75%。在某些方面中，该量是约80%。在某些方面中，该量是约85%。在某些方面中，该量是约90%。在某些方面中，该量是约95%。在某些方面中，该量是约99%。在某些方面中，基本上所有重链分子皆不与该效应物部分缀合。
在某些方面中，本发明提供一种包含通过接头与效应物部分共价缀合的抗体或其抗原结合部分的MAC，其特征为该抗体或其抗原结合部分包含基序KHK，且该效应物部分与该K188残基(根据Kabat编号)的侧链缀合。
在某些方面中，未经缀合的个别轻链片段的量具有选自约1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或55%的下限及选自约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%的上限。在某些方面中，在一个位置经缀合的个别轻链片段的量具有选自约25%、30%、35%、40%、45%、50%或55%的下限及选自约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的上限。在某些方面中，在二个位置经缀合的个别轻链片段的量具有选自约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、5%、10%、15%、20%或25%的下限及选自约5%、16%、7%、8%、9%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%的上限。
在某些方面中，未经缀合的个别重链片段的量具有选自约50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的下限及选自约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的上限。在某些方面中，在一个位置经缀合的个别重链片段的量具有选自约1%、2%、5%、10%、15%、20%或25%的下限及选自约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或50%的上限。在某些方面中，在二个位置经缀合的个别重链片段的量具有选自约0%、1%、2%、3%、4%、5%、10%或15%的下限及选自约2%、3%、4%、5%、10%、15%或20%的上限。
在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数具有选自约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95或2的下限及选自约1.6、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95、2.0、2.05、2.1、2.15、2.2、2.25、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5或5的上限。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约1.5至约2.5。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约1.6至约2.4。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约1.7至约2.3。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约1.8至约2.2。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是选自约1.5、约1.55、约1.6、约1.65、约1.7、约1.75、约1.8、约1.85、约1.9、约1.95、约2.0、约2.05、约2.1、约2.15、约2.2、约2.25、约2.3、约2.4或约2.5的量。在某些方面中，该量是约1.7。在某些方面中，该量是约1.8。在某些方面中，该量是约1.9。在某些方面中，该量是约2。在某些方面中，该量是约2.1。在某些方面中，该量是约2.2。在某些方面中，该量是约2.3。
在本发明的某些方面中，每抗体的缀合数小于2，其中该抗体群中至少50%仅具有每抗体单一缀合。这些样品是有利的，因为它们允许额外的缀合反应，靶向剩余的CLκ位点。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约0.5至约1.5。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约0.6至约1.4。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约0.7至约1.3。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约0.8至约1.2。在某些方面中，在本发明的样品或组合物中每抗体的缀合数是约0.9至约1.1。
本发明的好处之一在于依照试剂及反应条件而定(特别是离去基团酯及接头:抗体的摩尔比)，MAC的组合物及样品可产生为具有相对于限定数量的抗体的限定数量的效应物部分。此特别可用于平衡该效应物部分及抗体的相对反应性及治疗窗。而且在某些情况中，增加每抗体的肽的数量超过一定阀值可能不会导致增加的靶结合或治疗效应。因此，能够控制与每抗体缀合的肽的数量是有用的，而且藉此可引导缀合的位置以最小化Fc或结合位点的干扰。因此在某些情况中，允许减少缀合，优选地仅与单一K188‑CLκ缀合的本发明的方面可具有好处。
在某些方面中，MAC的样品可为药物组合物。
IGFR抗体
在一些实施方案中，至少一个Ang2结合肽通过在抗IGF1R抗体上的赖氨酸残基的侧链缀合。在一些实施方案中，至少一个Ang2结合肽与CL结构域共价连接。在一些实施方案中，至少一个Ang2结合肽与抗IGF1R抗体上的F(ab)区共价连接。在一些实施方案中，至少一个Ang2结合肽与抗IGF1R抗体的轻链恒定区共价连接。在一些实施方案中，抗IGF1R抗体通过接头与Ang2结合肽共价连接。在一些实施方案中，Ang2结合肽不与抗IGF1R抗体的C'端或N'端融合。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体是选自那些于WO02053596(US7,037,498)及WO2005016967(US7,371,378)中所描述者(各案的内容并入本文)。在一些实施方案中，MAC包含重链恒定结构域，该重链恒定结构域含有SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，MAC包含重链可变结构域，该重链可变结构域选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1的残基1至122和SEQ ID NO:3的残基1至122。在一些实施方案中，MAC包含重链可变结构域，该重链可变结构域含有SEQ ID NO:3的残基1至122。
在一些实施方案中，MAC的重链包含VHCDR1区，该VHCDR1区包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:1的残基26至35和SEQ ID NO:3的残基26至35的序列。在一些实施方案中，MAC包含VHCDR1区，该VHCDR1区含有SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，MAC的重链包含VHCDR2区，该VHCDR2区包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:3的残基50至64和SEQ ID NO:5的残基50至64的序列。在一些实施方案中，MAC包含VHCDR2区，该VHCDR2区含有SEQ ID NO:8。
在一些实施方案中，MAC的重链包含VHCDR3区，该VHCDR3区包含选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:1的残基99至114和SEQ ID NO:3的残基99至114的序列。在一些实施方案中，MAC包含VHCDR3区，该VHCDR3区含有SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，MAC的重链包含VHFR1区，该VHFR1区包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:1的残基1至25、SEQ ID NO:3的残基1至25、和SEQ ID NO:11的序列。在一些实施方案中，MAC包含VHFR1区，该VHFR1区含有SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中，MAC的重链包含VHFR2区，该VHFR2区包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1的残基36至49和SEQ ID NO:3的残基36至49的序列。在一些实施方案中，MAC包含VHFR2区，该VHFR2区含有SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，MAC的重链包含VHFR3区，该VHFR3区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:1的残基65至98和SEQ ID NO:3的残基65至98的序列。在一些实施方案中，MAC包含VHFR3区，该VHFR3区含有SEQ ID NO:13。
在一些实施方案中，MAC的重链包含VHFR4区，该VHFR4区包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1的残基115至122和SEQ ID NO:3的残基115至122的序列。在一些实施方案中，MAC包含VHFR4区，该VHFR4区含有SEQ ID NO:14。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3区分别包含SEQ ID NO:3的残基26至35、SEQ ID NO:3的残基50至64及SEQ ID NO:3的残基99至114。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体的VHFR1、VHFR2、VHFR3及VHFR4区分别包含SEQ ID NO:3的残基1至25、SEQ ID NO:3的残基36至49、SEQ ID NO:3的残基65至98、及SEQ ID NO:3的残基115至122。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体包含选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的重链。在一些实施方案中，抗IGF1R抗体包含重链，该重链含有SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，MAC包含轻链恒定结构域，该轻链恒定结构域含有SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，MAC包含轻链恒定结构域，该轻链恒定结构域含有SEQ ID NO:45、46或47。
在一些实施方案中，MAC包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域是选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:2的残基1至108和SEQ ID NO:4的残基1至108。在一些实施方案中，MAC包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域含有SEQ ID NO:4的残基1至108。
在一些实施方案中，MAC的轻链包含VLCDR1区(轻链可变区互补决定区1)，该VLCDR1区包含选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:2的残基24至34和SEQ ID NO:4的残基24至34的序列。在一些实施方案中，MAC包含VLCDR1区，该VLCDR1区含有SEQ ID NO:17。
在一些实施方案中，MAC的轻链包含VLCDR2区，该VLCDR2区包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2的残基48至54和SEQ ID NO:4的残基48至54的序列。在一些实施方案中，MAC包含VLCDR2区，该VLCDR2区含有SEQ ID NO:18。
在一些实施方案中，MAC的轻链包含VLCDR3区，该VLCDR3区包含选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2的残基89至97和SEQ ID NO:4的残基89至97的序列。在一些实施方案中，MAC包含VLCDR3区，该VLCDR3区含有SEQ ID NO:19。
在一些实施方案中，MAC的轻链包含VLFR1区，该VLFR1区包含选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:2的残基1至23和SEQ ID NO:4的残基1至23的序列。在一些实施方案中，MAC包含VLFR1区，该VLFR1区含有SEQ ID NO:21。
在一些实施方案中，MAC的轻链包含VLFR2区，该VLFR2区包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:2的残基35至47和SEQ ID NO:4的残基35至47的序列。在一些实施方案中，MAC包含VLFR2区，该VLFR2区含有SEQ ID NO:22。
在一些实施方案中，MAC的轻链包含VLFR3区，该VLFR3区包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:2的残基55至88和SEQ ID NO:4的残基55至88的序列。在一些实施方案中，MAC包含VLFR3区，该VLFR3区含有SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，MAC的轻链包含VLFR4区，该VLFR4区包含选自SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:2的残基98至108和SEQ ID NO:6的残基98至108的序列。在一些实施方案中，MAC包含VLFR4区，该VLFR4区含有SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3区分别包含SEQ ID NO:4的残基24至34、SEQ ID NO:4的残基48至54及SEQ ID NO:4的残基89至96。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体的VLFR1、VLFR2、VLFR3及VLFR4区分别包含SEQ ID NO:4的残基1至24、SEQ ID NO:4的残基35至47、SEQ ID NO:4的残基55至88、及SEQ ID NO:4的残基97至108。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体包含选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的轻链。在一些实施方案中，抗IGF1R抗体包含轻链，该轻链含有SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体包含重链及轻链，该重链含有SEQ ID NO:1且该轻链含有SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体包含重链及轻链，该重链含有SEQ ID NO:3且该轻链含有SEQ ID NO:4。
抗体2.12.1已在WO02053596中被描述。产生对IGF1R具特异性的单克隆抗体的杂交瘤2.12.1于2000年12月12日以保藏号PTA‑2792被保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(20110‑2209维吉尼亚州马纳萨斯市大学道10801号)。
在一些实施方案中，抗IGF1R抗体包含CLκ区中的基序K188H189x190，其中x是G、A、V、I、L、S、T、C、M、N、Q、D、E、F、Y、W、H、R或K(根据Kabat编号)。在一些方面中，抗IGF1R抗体是选自WO2009032145(US2009092614)或WO2005005635(US7,579,157)中的一种，二案的内容皆纳入本文。在一些实施方案中，本发明的MAC包含与至少一个Ang2结合肽缀合的抗IGF1R抗体或其抗原结合部分，该缀合的方式不会废除该抗体的IGF1R结合亲和力。
在一些方面中，抗体靶向和效应物部分在相同途径内的不同靶。在一些方面中，抗体靶向和效应物部分不同的靶。
在一些方面中，用来缀合的抗体可能用于肿瘤学的领域中。适当的抗体包括：利妥昔单抗(Rituximab)(RituxanTM)，一种嵌合型、IgG1κ、抗CD20抗体，用于治疗癌及特别是非霍奇金氏淋巴瘤还有类风湿性关节炎；西妥昔单抗(Cetuximab)(ErbituxTM)，一种嵌合型、IgG1κ、抗EGF受体抗体，用于治疗癌，特别是结肠癌、头颈癌。
在一些方面中，用来缀合的抗体可能用于自体免疫及其它免疫疾病的领域中。适当的抗体包括：英利昔单抗(Infliximab)(RemicadeTM)，一种嵌合型、IgG1κ、抗TNFα抗体，用于治疗类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、克隆氏(Crohn’s)症、牛皮癣、干癣性关节炎及关节粘连性脊椎炎；阿达木单抗(Adalimumab)(HumiraTM)，一种人IgG1κ、抗TNFα抗体，用于治疗类风湿性关节炎、克隆氏症、牛皮癣、干癣性关节炎、幼年型自发性关节炎及关节粘连性脊椎炎；那他珠单抗(Natalizumab)(TysabriTM)，一种人源化IgG4κ、抗α4整合素抗体，用于治疗多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、幼年型自发性关节炎、干癣性关节炎、关节粘连性脊椎炎、克隆氏症；奥马珠单抗(Omalizumab)(XolairTM)，一种人源化IgG1κ、抗IgE抗体，用于治疗过敏性气喘；兰尼单抗(Ranibizumab)(LucentisTM)，一种人源化IgG1κ、抗VEGF抗体，用于治疗湿性AMD；及帕利珠单抗(Palivizumab)(SynagisTM)，一种人源化IgG1κ、抗RSV抗体，用于治疗感染性疾病，包括呼吸道合胞病毒。
在一些方面中，本发明的化合物及组合物可被用于治疗上述提及的病症。
效应物部分
效应物部分可为治疗剂、蛋白质、肽、核酸、适体、小分子、蛋白质激动剂、蛋白质拮抗剂、代谢调节剂、激素、毒素、生长因子或其它调节性蛋白质，或可为诊断剂诸如可被轻易地检测或可视化的酶，诸如辣根过氧化物酶。
在一些方面中，效应物部分可为蛋白质或肽，且可通过肽连接残基与接头连接。该蛋白质或肽可包含氨基端加帽基团R1及羧基端加帽基团R2中的一或二者。R1可为CH3、C(O)CH3、C(O)CH3、C(O)CH2CH3、C(O)CH2CH2CH3、C(O)CH(CH3)CH3、C(O)CH2CH2CH2CH3、C(O)CH(CH3)CH2CH3、C(O)C6H5、C(O)CH2CH2(CH2CH2O)1‑5Me、二氯苯甲酰基(DCB)、二氟苯甲酰基(DFB)、吡啶基羧酸酯(PyC)或酰氨基‑2‑PEG、氨基保护基团、脂质脂肪酸基团或碳水化合物。R2可为OH、NH2、NH(CH3)、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、NHCH(CH3)CH3、NHCH2CH2CH2CH3、NHCH(CH3)CH2CH3、NHC6H5、NHCH2CH2OCH3、NHOCH3、NHOCH2CH3、羧基保护基团、脂质脂肪酸基团或碳水化合物。
蛋白质或肽连接残基可为K、K(SH)、赖氨酸同系物、Dap、Dab、Orn、R、C、含硫醇残基、S、T、Y、D、E、N或Q。蛋白质或肽可通过N端氨基酸的氨基端与接头连接。蛋白质或肽可通过C端氨基酸的羧基端与接头连接。额外的氨基酸残基可被添加至N或C端以作为连接残基，不论通过氨基酸的侧链或氨基或羧基端连接。
Ang2结合肽
效应物部分可为Ang2结合肽。在一些实施方案中，Ang2结合肽可包含选自那些于WO2008056346(US2008166364)(彼等的内容是纳入本发明)中所描述的序列。在一些实施方案中，Ang2结合肽包含下列序列：
Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8X9D10K11T12L13Y14D15Q16F17M18L19Q20Q21G22(SEQ ID NO:26)
其中SEQ ID NO:26的X9是酰基赖氨酸(AcK)或亮氨酸(以下称为Ang2‑X9)且
其中该Ang2结合肽的X9、K11、L13、Q16、M18、或L19是由Ang2连接残基所取代，该Ang2连接残基包含与该接头共价连接的亲核性侧链，该连接残基选自K、Y、S、T、H、赖氨酸的同系物诸如K(SH)、同型半胱氨酸、同型丝氨酸、Dap和Dab。在一些实施方案中，Ang2连接残基可选自K、K(SH)、Y、S、T、H、Dap和Dab。在一些实施方案中，Ang2连接残基是K。Ang2连接残基可为K11。在一些实施方案中，Ang2连接残基可为K(SH)。Ang2连接残基可为K(SH)11。
在一些实施方案中，Ang2结合肽包含下列序列：
Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8(AcK)9D10K11T12L13Y14D15Q16F17M18L19Q20Q21G22(SEQ ID NO:27)
其中Ang2‑K11是Ang2连接残基。
在一些实施方案中，Ang2结合肽包含下列序列：
Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8L9D10K11T12L13Y14D15Q16F17M18L19Q20Q21G22(SEQ ID NO:28)
其中Ang2‑K11是Ang2连接残基。
在一些实施方案中，Ang2结合肽包含下列序列：
SEQ ID NO:29Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8K9D10(AcK)11T12L13Y14D15Q16F17M18L19Q20Q21G22
其中Ang2‑K9是Ang2连接残基。
在一些实施方案中，Ang2结合肽包含下列序列：
SEQ ID NO:30Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8L9D10(AcK)11T12L13Y14D15K16F17M18L19Q20Q21G22
其中Ang2‑K16是Ang2连接残基。
在一些实施方案中，Ang2结合肽包含下列序列：
SEQ ID NO:31Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8L9D10(AcK)11T12L13Y14D15Q16F17K18L19Q20Q21G22
其中Ang2‑K18是Ang2连接残基。
在一些实施方案中，Ang2结合肽包含下列序列：
SEQ ID NO:32Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8L9D10(AcK)11T12L13Y14D15Q16F17M18K19Q20Q21G22
其中Ang2‑K19是Ang2连接残基。
在一些实施方案中，Ang2结合肽另包含N端加帽基团R1，其中R1是CH3、C(O)CH3、C(O)CH3、C(O)CH2CH3、C(O)CH2CH2CH3、C(O)CH(CH3)CH3、C(O)CH2CH2CH2CH3、C(O)CH(CH3)CH2CH3、C(O)C6H5、C(O)CH2CH2(CH2CH2O)1‑5Me、二氯苯甲酰基(DCB)、二氟苯甲酰基(DFB)、吡啶基羧酸酯(PyC)或酰氨基‑2‑PEG、氨基保护基团、脂质脂肪酸基团或碳水化合物。
在一些实施方案中，Ang2结合肽另包含C端加帽基团R2，其中R2是OH、NH2、NH(CH3)、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、NHCH(CH3)CH3、NHCH2CH2CH2CH3、NHCH(CH3)CH2CH3、NHC6H5、NHCH2CH2OCH3、NHOCH3、NHOCH2CH3、羧基保护基团、脂质脂肪酸基团或碳水化合物。
在一些实施方案中，R1可为C(O)CH3。在一些实施方案中，R2可为NH2。
Ang2结合肽加上N端及C端加帽基团可包含下式：[C(O)CH3]‑[SEQ ID NO:27]‑[NH2]：
[C(O)CH3]‑Q1(AcK)2Y3Q4P5L6D7E8(AcK)9D10K11T12L13Y14D15Q16F17M18L19Q20Q21G22‑[NH2]，其中Ang2‑K11是Ang2连接残基。
本发明所描述的Ang2肽可如所述与多种类型的抗体缀合，特别是用于治疗增生性疾病(诸如癌或血管生成增加)的抗体，且亦可与催化性抗体诸如h38C2缀合以形成MAC。
接头
本发明的效应物部分(诸如小分子、适体、核酸、蛋白质或肽(例如Ang2结合肽))可通过接头与抗体或其抗原结合部分(例如抗IGF1R抗体)共价连接。该接头可通过肽连接残基的侧链的氨基与该肽共价连接。此可为赖氨酸残基。在一些实施方案中，该连接残基是携带硫醇的残基，诸如Cys或K(SH)且该接头是通过该连接残基的末端硫醇基团与该肽共价连接。
该接头可为直链或分支(以允许每缀合加成与超过一个效应物部分缀合)，及可任选地包括一或多个碳环或杂环基团。接头长度可被视为在该效应物部分与抗体之间的直链原子的数量，有环状基团诸如芳香环等等以沿着该环的最短路径计算。在一些实施方案中，该接头具有5至15个原子的直链片段，在其它实施方案中15至30个原子，在仍其它实施方案中30至50个原子，在仍其它实施方案中50至100个原子，及在仍其它实施方案中100至200个原子。在一些实施方案中，该接头的长度具有选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190的下限及选自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200的上限的范围。
其它接头考虑包括对形成的化合物的物理或药物动力学性质的影响，诸如溶解性、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(较稳定或较不稳定及较多或较少的预定降解)、刚性、柔性、免疫原性、抗体结合调节、被纳入微团或脂质体中的能力等等。
接头可为肽基接头。在一些实施方案中，该肽基接头可为3至20个氨基酸长，诸如单一氨基酸残基的重复(例如聚甘氨酸)或氨基酸残基的组合以得到给予该效应物部分的有利表达或药物动力学的肽接头。与活化基团的存在最为兼容的肽基接头可能缺乏赖氨酸及组氨酸残基。SEQ ID NO:59是示范性肽基接头。
或者，接头可为非肽基接头。这种类型的接头的典型范例将为那些以各种长度的直链或支链烃或聚乙二醇为基础的接头。这些接头可能并入其它基团以影响溶解性、刚性、等电点，诸如芳香或非芳香环、卤素、酮、醛、酯、磺酰基、磷酸基等。
在本发明的某些方面中，接头可包含式：‑X‑Y‑Z‑；其中X是与效应物部分连接的基团(例如通过肽连接残基)，Y是间隔物区，且Z是与抗体(例如抗IGF1R抗体)上的赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链连接的基团。在某些方面中，当未与抗体连接时该接头可为式XYZ*，其中Z*是离去基团，以使当与抗体缀合时，该离去基团Z*与抗体的缀合位点反应以形成缀合的接头XYZ。
X可被选择以使得与效应物部分的连接得以采用特定定向共价连接策略(例如通过肽连接残基)。在某些方面中，X可选自COOH、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、磺酸、磺酰基卤化物、醛、酮、环氧化物、碳酸酯、芳基化试剂、亚氨酸酯、胺基团或马来酰亚胺基团。举例来说，当该肽连接残基包含亲核基团时，X可为亲电子基团，且反之亦然。举例来说，若该肽连接残基侧链包含氨基，诸如K、H、鸟氨酸、Dap或Dab，X可为COOH或其它类似的反应性亲电子剂，例如异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、磺酸、磺酰基卤化物、醛、酮、环氧化物、碳酸酯、芳基化试剂或亚氨酸酯。若该肽连接残基是D或E，X可包含亲核基团，诸如氨基。这些策略中的任一允许在该X基团与该肽连接残基之间通过酰胺键形成策略形成共价键接。举例来说，当X是COOH时，其可能被活化成为五氟苯基酯。在此情况中，与肽连接肽上的氨基反应导致酰胺键形成，而该五氟苯酚是离去基团(其可被称为X*)。

箭头表示与该肽连接残基连接的点，平行线代表与该接头的Y基团连接的点。

当该肽连接基团是C、C的同系物或其它含硫醇基的残基(诸如K(SH))时，X可包含马来酰亚胺基团，此允许硫醇‑马来酰亚胺添加反应策略得以共价连接X基团与肽连接残基。在某些方面中，X可为马来酰亚胺：

其中箭头表示与肽连接残基连接的点，平行线代表与接头的Y基团连接。为了命名的简单起见，本发明所描述的利用马来酰亚胺基团建构的接头被称为含马来酰亚胺接头，其可以MAL表示，即使在建构该接头之后，该马来酰亚胺基团通常被转换成琥珀酰亚胺环。

在某些方面中，连接残基是K(SH)且X基团是马来酰亚胺。
在某些方面中，X可包含五氟苯基酯活化的羧基官能基，其可与肽上的赖氨酸侧链形成酰胺。

在某些方面中，X可包含硫醇基，这允许在肽连接残基与X基团之间形成二硫键。
在一些实施方案中，Y是生物学相容的连接链，包括任何选自C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br和I的原子，且可包含一或多种氨基酸、聚合物或嵌段共聚物。可选择Y以提供2至100个原子的接头的整体长度。可选择Y以使接头的整体长度介于5至30个原子。可选择Y以使接头的整体长度是15至25个原子。可选择Y以使接头的整体长度介于约17至约19个原子。
在某些方面中，Y可为氨基聚乙二醇酸，诸如：

其中n=0‑10，在某些方面中1‑10，在某些方面中1‑5，及在某些方面中1。
在某些方面中，Y可为聚乙二醇二酸，诸如：

其中n=0‑10，在某些方面中1‑10，在某些方面中1‑5，在某些方面中1，及在某些方面中2。
在本发明的某些方面中，接头的Y部分包含下式：

在某些方面中，Y可为氨基烷酸，诸如：

其中n=0‑20，在某些方面中1‑10，在某些方面中1‑5，在某些方面中1，及在某些方面中2。
在某些方面中，Y可为烷二酸，诸如：

其中n=0‑20，在某些方面中1‑10，在某些方面中1‑5，在某些方面中1，及在某些方面中2。
在某些方面中，Y可为聚甘氨酸，诸如：

其中n=0‑10，在某些方面中1‑10，在某些方面中1‑5，在某些方面中1，及在某些方面中2。
在某些方面中，Y、X‑Y、Y‑Z及X‑Y‑Z可选自：

其中m、n及j各自独立地是0至30。在某些方面中n=1‑10，在某些方面中n=1‑5。在某些方面中，n数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可为1。N可为2。N可为3。N可为4。N可为5。N可为6。在某些方面中m=1‑10，在某些方面中m=1‑5。在某些方面中，m数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且m数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。M可为1。M可为2。M可为3。M可为4。M可为5。M可为6。在某些方面中j=1‑10，在某些方面中j=1‑5。在某些方面中，j数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且j数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。J可为1。J可为2。J可为3。J可为4。J可为5。J可为6。在某些方面中，Y的整体长度不超过200个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过150个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过100个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过50个原子。在某些方面中，Y的整体链长度的范围以原子数而言具有选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60的下限及选自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100的上限。在某些方面中，XYZ接头可能与上述的Y基团相同。在某些方面中，波状线与X基团连接。在某些方面中，平行线与X基团连接。在某些方面中，波状线与Z基团连接。在某些方面中，平行线与Z基团连接。在某些方面中，波状线与K188‑CLκ的侧链连接。在某些方面中，平行线与K188‑CLκ的侧链连接。在某些方面中，波状线与效应物部分连接。在某些方面中，平行线与效应物部分连接。
在某些方面中，Y、Y‑Z和/或X‑Y可为马来酰亚胺PEG酸，诸如：

其中n=1‑12，在某些方面中1‑10，在某些方面中1‑5，在某些方面中1，及在某些方面中2。
在某些方面中，Y、Y‑Z和/或X‑Y可为马来酰亚胺PEG酸，诸如：

其中n数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可为1。N可为2。N可为3。N可为4。N可为5。N可为6。在某些方面中，Y、Y‑Z和/或X‑Y包含下式：

可选择Z*以使得与该抗体上的赖氨酸侧链连接得以采用特定定向共价连接策略。举例来说，Z可为COOH或另一类似的反应性亲电子剂以利用多种可能的酰胺键形成策略之一与表面赖氨酸侧链的ε‑氨基反应。
在某些方面中，Z*可被用于形成活性酯。活性酯与胺连接，因此可与抗体的赖氨酸侧链的ε‑氨基缀合。该能使活性酯形成的Z羧基官能基将存在于Y基团的末端。该活性酯的醇基或酚基官能基在缀合反应期间作为离去基团Z*，得以通过产生酰胺而与该抗体上的赖氨酸侧链连接。
在一些实施方案中，该Z*基团包含下式的结构：

其中R’是脂肪族或芳香族基团。
在一些实施方案中，Z*基团为下式：

其中R’=单独或经组合的F、Cl、Br或I中的任一者、硝基、氰基或三氟甲基，且可以1至5个的量存在。在一些实施方案中，R1可为卤素，且可存在4或5个卤素原子。在一些实施方案中，可能有4个R1原子。在一些实施方案中，可能有5个R1原子。在一些实施方案中，Z*可为四氟苯基。在一些实施方案中，Z*可包含下式：
五氟苯基
其中平行线代表与接头的Y部分连接的点。
在一些方面中，Z*基团为下式：

其中R’=单独或经组合的F、Cl、Br或I中的任一者、硝基、氰基或三氟甲基，且h=1、2、3、4或5。在一些实施方案中，R1可为卤素。在一些实施方案中，R1是F或Cl，且h=4或5。在一些实施方案中，R1是F或Cl，且h=5。在一些实施方案中，R1是F，且h=2、3、4或5。在一些实施方案中，R1是F，且h=3、4或5。在一些实施方案中，R1是F，且h=4或5。
在一些实施方案中，R1是F，且h=5。在某些方面中，Z*可选自：

以此类活性酯而言，离去基团是Z*且该Z基团本身是与Y基团连接的羰基。当与抗体反应时，该Z*基团形成酰胺，如下所示：

在一些实施方案中，Z是

在一些实施方案中，Z*基团包含方酸酯诸如

其中R=脂肪族基团或取代的芳香族基团，且可选自：

在一些实施方案中，Z基团包含马来酰亚胺基团：

在某些方面中，X*YZ*接头包含结构如下的马来酰亚胺‑PEG‑PFP酯：

其中n=1‑12。在某些方面中，n=1‑5。在某些方面中，n=2。在某些方面中，n=1。
在某些方面中，MAC包含下式的XYZ接头：

其中n=1‑12。在某些方面中，n=1‑5。在某些方面中，n=1‑3。在某些方面中，n=2。在某些方面中，n=1。
在某些方面中，X*YZ*接头包含选自下列的结构：

其中m、n及j各自独立地是0‑30，R1是F且h=2、3、4或5。在某些方面中n=1‑10，在某些方面中n=1‑5。在某些方面中，n数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可为1。N可为2。N可为3。N可为4。N可为5。N可为6。在某些方面中m=1‑10，在某些方面中m=1‑5。在某些方面中，m数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且m数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。M可为1。M可为2。M可为3。M可为4。M可为5。M可为6。在某些方面中j=1‑10，在某些方面中j=1‑5。在某些方面中，j数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且j数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。J可为1。J可为2。J可为3。J可为4。J可为5。J可为6。在某些方面中，Y的整体长度不超过200个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过150个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过100个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过50个原子。在某些方面中，Y的整体链长度的范围以原子数而言具有选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60的下限及选自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100的上限。
在某些方面中，MAC包含下式的XYZ接头：

在某些方面中，X*YZ*接头包含下式的PEG‑双‑五氟苯基酯：

其中n=1‑12。在某些方面中，n=1‑10。在某些方面中，n=1‑5。在某些方面中，n=2。在某些方面中，n=1。
在某些方面中，MAC包含下式的XYZ接头：

在某些方面中，MAC包含下式的XYZ接头：

在一些实施方案中，与XYZ*接头相连的肽包含下式：

在一些实施方案中，与XYZ*接头相连的肽包含下式：

在某些方面中，MAC包含下式的化合物：

其中Ang2‑K是Ang2结合肽的赖氨酸或经修饰的赖氨酸残基，且Ab‑K‑Ab'是抗IGF1R抗体上的赖氨酸残基。
在某些方面中，MAC包含下式的化合物：

其中Ang2‑K是Ang2结合肽的赖氨酸或经修饰的赖氨酸残基，且Ab‑K‑Ab'是抗IGF1R抗体上的赖氨酸残基。
在某些方面中，该MAC包含下式：

其中Ab‑K‑Ab'是抗体2.12.1.fx的K188。
在某些方面中，MAC包含下式：

其中Ab‑K‑Ab'是抗体2.12.1.fx的K188。
在某些方面中，MAC包含与每抗体(其可为抗IGF1R抗体)缀合的2个肽(其可为Ang2结合肽)。在某些方面中，一个肽是与抗体或其抗原结合片段(其可为抗体2.12.1.fx)的2个K188残基中的各个缀合。
在某些方面中，该MAC包含选自下列的式：

其中K188‑CLκ是与该K188‑CLκ的侧链的共价连接，效应物部分‑LR是与该效应物部分的共价连接，且m、n及j各自独立地是0‑30。在某些方面中n=1‑10，在某些方面中n=1‑5。在某些方面中，n数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可为1。N可为2。N可为3。N可为4。N可为5。N可为6。在某些方面中m=1‑10，在某些方面中m=1‑5。在某些方面中，m数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且m数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。M可为1。M可为2。M可为3。M可为4。M可为5。M可为6。在某些方面中j=1至10，在某些方面中j=1至5。在某些方面中，j数值的范围的下限选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且j数值的范围的上限选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。J可为1。J可为2。J可为3。J可为4。J可为5。J可为6。在某些方面中，Y的整体长度不超过200个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过150个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过100个原子。在某些方面中，Y的整体长度不超过50个原子。在某些方面中，Y的整体链长度的范围以原子数而言具有选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60的下限及选自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100的上限。
缀合方法
在某些方面中，本发明提供制备多功能抗体缀合物(MAC)的方法，该MAC包含抗体或其抗原结合位点，该抗体通过与CLκ‑K188(根据Kabat编号)的侧链连接的接头与至少一种效应物部分共价缀合，该方法包含：将该效应物部分共价连接至末端为下式的离去基团Z*的接头：

其中R1是单独或经组合的F、Cl、Br或I中的任一者、硝基、氰基或三氟甲基，且可能以1‑5个的量存在，及使如此形成的效应物部分‑接头‑离去基团复合物与该抗体以约3.5:1至约4.5:1的效应物部分:抗体摩尔比反应。在某些方面中，该摩尔比是约3.7:1至约4.3:1。
在一些方面中，该Z*基团为下式：

其中R1=单独或经组合的F、Cl、Br或I中的任一者、硝基、氰基或三氟甲基，且h=1、2、3、4或5。在一些实施方案中，R1可为卤素。在一些实施方案中，R1是F或Cl，且h=4或5。在一些实施方案中，R1是F或Cl，且h=5。在一些实施方案中，R1是F，且h=2、3、4或5。在一些实施方案中，R1是F，且h=3、4或5。在一些实施方案中，R1是F，且h=4或5。在一些实施方案中，R1是F，且h=5。在某些方面中，Z*可选自：

R1可以3‑5个的量存在。可能有3个R1基团。R1可以4‑5个的量存在。可能有4个R1基团。可能有5个R1基团。R1可能是氟。R1可能是氯。R1可能是溴。该离去基团可包含下式：

在某些方面中，本发明提供制备MAC的方法，其中该MAC包含与至少一种效应物部分共价连接的抗体(或其片段)，该效应物部分与额外靶(诸如肽、小分子、适体、核酸分子或蛋白质)结合，其中该效应物部分包含具有PFP离去基团的接头，该PFP离去基团能与该抗体的表面赖氨酸残基的ε‑氨基反应。在某些方面中，本发明提供用于缀合效应物部分(诸如肽)与包含κ轻链恒定区的抗体的方法，该κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的残基62至103，该方法包含使该效应物部分与包含下式的离去基团的接头缀合：

其中R1是单独或经组合的F、Cl、Br或I中的任一者、硝基、氰基、三氟甲基，且可以1至5个的量存在，使该离去基团与SEQ ID NO:15的K80侧链反应，以提供具有与该轻链恒定区缀合的效应物部分的抗体。
该抗体可包含基本上与SEQ ID NO:15的残基74至106同源的轻链恒定区。该抗体可包含基本上与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的残基62至103同源的轻链恒定区。在某些方面中，该抗体可包含基本上与SEQ ID NO:15的残基74至90同源的轻链区。在某些方面中，该效应物部分与SEQ ID NO:15的K80缀合。在某些方面中，该效应物部分与K82缀合。在某些形式中，Ang2结合肽与抗IGF1R抗体的CLκ‑K188(根据Kabat编号)缀合。
在某些方面中，该方法包含使抗体或其抗原结合部分与效应物部分组合，其中该效应物部分与包含PFP离去基团的接头共价连接。
在某些方面中，本发明提供用于缀合效应物部分与蛋白质的方法，其中该效应物部分与末端为下式的离去基团Z*的接头连接：

其中R’=单独或经组合的F、Cl、Br或I中的任一者、硝基、氰基、三氟甲基，且可以1至5个的量存在，该蛋白质包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的残基62至103，其中包含K80以使该效应物部分与该K80残基的ε‑氨基缀合，该方法包含使该效应物部分及相连的接头与该蛋白质以约3.7:1至约4.3:1的效应物部分:蛋白质摩尔比反应。
在某些方面中，该效应物部分、接头及离去基团可如本发明所述。在某些方面中，该蛋白质可包含抗体轻链恒定区。在某些方面中，该蛋白质可包含SEQ ID NO:15且该缀合部位是K80。
在某些方面中，效应物部分:抗体的摩尔比(例如ABP:抗IGF1R抗体)是介于约2.5至约4.6:1。在本发明的某些方面中，该摩尔比是约3.7:1至约4.3:1。在本发明的某些方面中，效应物部分:抗体的摩尔比是约4:1。在某些方面中，该摩尔比是介于约2:1至约7:1。在某些方面中，该摩尔比是介于约3:1至约6:1。在某些方面中，该摩尔比是介于约3:1至约7:1。在某些方面中，该摩尔比是介于约3:1至约5:1。
在希望每抗体具有少于1.5个缀合的本发明的方面中(诸如其中需要单一效应物部分时)，该摩尔比可介于约1:1至约6:1，其中缓冲液包含浓度至少为0.02M的HEPES。该HEPES的浓度可介于约0.1M至约1M。该HEPES的浓度可介于约0.1M至约0.5M。在希望每抗体具有少于1.5个缀合的本发明的方面中(诸如其中需要单一效应物部分时)，该摩尔比可介于约1:1至约3:1。
在某些方面中，该优选的摩尔比是一范围，该范围具有选自约1、约1.2、约1.4、约1.5、约1.6、约1.8、约2、约2.2、约2.4、约2.5、约2.6、约2.8、约3、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5、约5.2、约5.4、约5.5、约5.6、约5.8、约6、约6.2、约6.4、约6.5、约6.6、约6.8、约7、约7.3、约7.5、约7.7、约8、约8.5、约9、约9.5或约10比1的下限，及选自约1.5、约1.6、约1.8、约2、约2.2、约2.4、约2.5、约2.6、约2.8、约3、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5、约5.2、约5.4、约5.5、约5.6、约5.8、约6、约6.2、约6.4、约6.5、约6.6、约6.8、约7、约7.3、约7.5、约7.7、约8、约8.5、约9、约9.5、约10或约15比1的上限。
在某些方面中，本发明另包含使效应物部分与蛋白质一起缀合至少约30分钟。在某些方面中，该持续时间是至少约60分钟。在某些方面中，该持续时间是至少约2小时。在某些方面中，本发明另包含使效应物部分与抗体在约4℃至约40℃缀合。在某些方面中，本发明另包含使该效应物部分与抗体在约10℃至约30℃缀合。在某些方面中，本发明另包含使该效应物部分与抗体在约15℃至约30℃缀合。在某些方面中，该反应于约18℃至约25℃进行。在某些方面中，该反应于约22℃进行。在某些方面中，该反应于约室温中进行。
在某些方面中，缀合反应发生在约pH6.5至约pH8.0之间。在某些方面中，该缀合反应发生在约pH6.75至约pH8.0之间。在某些方面中，该缀合反应发生在约pH7.7。在某些方面中，该缀合反应发生在约pH7。在某些方面中，该缀合反应发生在约pH7.2。在某些方面中，该缀合反应发生在约pH7.5。在某些方面中，该缀合反应发生在pH数值范围之间，该范围的下限是选自5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，该范围的上限是选自6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.5或9。
在某些方面中，该pH可为低于6.5；此特别适用于需要每抗体少于约1.5个缀合的应用中。在某些方面中，该pH是约5.5至约6.5。
在某些方面中，盐浓度可低于约0.2M。该盐可为卤化盐(F、Cl、Br、I)且可包含金属诸如Li、Na、K、Be、Mg、Ca。该盐可为NaCl。该盐可为KCl。可使用上述的盐约0.1M的浓度以限制每抗体缀合的速率和/或数量。该盐浓度可介于约0至约0.1M。该盐浓度可介于约0至约0.5M。该盐浓度可介于约0至约0.3M。
在某些方面中，本发明的方法包含配制抗体或其抗原结合部分于约pH5.5的配制缓冲液中。该配制缓冲液可为乙酸钠及海藻糖缓冲液。此缓冲液具有不包含任何伯胺的好处，因此有利于pH的调整。该抗体可以约15至约25毫克/毫升的量存在。在某些方面中，该抗体可以20毫克/毫升的量存在。
该配制缓冲液的pH可被调整至约pH7.2至约pH8.0；在一些实施方案中，该配制缓冲液可被调整至pH7.7。该配制缓冲液的pH可利用磷酸盐缓冲液调整。该磷酸盐缓冲液可为介于约40mM至约80mM的浓度。该磷酸盐缓冲液可为介于约10mM至约200mM的浓度。
在某些方面中，该抗体在效应物部分/接头与离去基团Z*缀合反应期间的浓度可为一范围，其中该范围的下限选自约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约30或约40毫克/毫升，及该范围的上限选自约7、约8、约9、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200、约500毫克/毫升。
效应物部分(诸如肽或ABP)可被重建为至少约2毫克/毫升的浓度。该效应物部分可在使用前于经稀释的丙二醇中被重建为约5至约20毫克/毫升的浓度，且在一些实施方案中可为10毫克/毫升的浓度。
缀合反应可通过以4摩尔效应物部分比1摩尔抗体的摩尔比组合该抗体或其抗原结合部分与该效应物部分来进行，并于约18oC至约25oC孵育约2至约24小时。在一些实施方案中，抗体与效应物部分之间的缀合反应是于室温中进行2小时。在一些实施方案中，该缀合反应是至少约2小时。在一些实施方案中，该缀合反应是至少约30分钟。
该反应可被猝灭及调整至约pH5.0至约pH6.0。在一些实施方案中，该经猝灭的反应可被调整至pH5.5。此可利用例如约pH4.0的琥珀酸盐及甘氨酸缓冲液达成。此缓冲液具有优于其它较常见缓冲液诸如TRIS或其它氨基酸缓冲液的好处。琥珀酸盐有助于防止渗滤时的聚集及沉淀(会对该缀合分子施加应力)，甘氨酸含有额外的伯胺(特别是在MAC‑1及MAC‑2的例中)。
该反应可经浓缩，且未反应的效应物部分(例如肽或ABP)、相关物质(诸如其中该接头通过与水溶剂的反应被水解的肽)及其它该反应混合物的未反应成分(诸如PFP)可通过渗滤移除，例如使用50kDa的膜或尺寸排阻层析至琥珀酸盐、甘氨酸、氯化钠及海藻糖缓冲液pH5.5，30毫克/毫升。
在某些方面中，该方法可包含缀合效应物部分与CLκ‑K188(根据Kabat编号)。在某些方面中，本发明包含使肽与抗体或其抗原结合部分的轻链λ结构域缀合，其包含以CLκ区的对应部分取代CLλ区的一部分，使该肽与包含如本发明所定义的离去基团Z*的接头连接，及使该肽‑接头‑离去基团复合物与该抗体反应，其中该取代至该抗体中的CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基62至103。在某些方面中，该CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基62至106。在某些方面中，该CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基1至103。在某些方面中，该CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基1至106。
在某些方面中，本发明包含使肽与小鼠抗体或其抗原结合部分的轻链接构域缀合，其包含以人CLκ区的对应部分取代小鼠CL区的一部分，使该肽与包含如本发明所定义的离去基团Z*的接头连接，及使该肽‑接头‑离去基团复合物与该抗体反应，其中该取代至该抗体中的人CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基62至103。在某些方面中，该人CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基62至106。在某些方面中，该人CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基1至103。在某些方面中，该人CLκ区包含SEQ ID NO:15、45、46或47的至少残基1至106。本发明的该些方面可为有利，因为小鼠CLκ区不包含K188(在小鼠CLκ中的对应序列是RHN；见SEQ ID NO:49的残基79至81)。
本发明的药物组合物
本发明提供包含MAC及药用可接受的载体的药物组合物。本发明所使用的“药用可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散媒质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收迟延剂、及生理上可互容的类似者。药用可接受的载体的实例包括一或多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及彼等的组合和，且可包括等渗剂，例如在该组合物中的糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药用可接受的材料诸如微量的辅助材料(诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂)，其能增加该抗体或抗体部分的储存时间或有效性。
本发明的组合物可为各种形式。这些形式包括例如液体、半固体及固体剂型，诸如液体溶液(例如注射用及输注用溶液)、分散液、悬浮液、锭剂、丸剂、粉剂、脂质体及栓剂。该优选的形式依所需的施用模式及治疗应用而定。典型优选的组合物是注射或输注溶液的形式，诸如类似那些用于人的通常以抗体进行被动性免疫接种所使用的组合物。该优选的施用模式是非经肠施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在优选的实施方案中，该抗体是通过静脉内输注或注射施用。在另一优选的实施方案中，该抗体是通过肌肉内或皮下注射施用。
该药物组合物可能另包含其它成分，诸如抗肿瘤剂或显影剂。本发明的另一方面提供包含本发明的MAC的试剂盒及包含所述抗体的药物组合物。试剂盒除了该MAC或药物组合物外，还可包括诊断剂或治疗剂。试剂盒亦可包括诊断或治疗方法中的使用说明。在一些实施方案中，该试剂盒包括抗体或其药物组合物及诊断剂。在其它实施方案中，该试剂盒包括抗体或其药物组合物及一或多种治疗剂，诸如额外的抗肿瘤剂(antineoplastic agent,anti‑tumor agent)或化学治疗剂。
本发明的这些药剂及化合物可与药用可接受的载体(诸如盐水、林格(Ringer)氏液、葡萄糖溶液等)组合。特定给药配方亦即剂量、时间及重复性将依特定个体及该个体的医学病史而定。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下对接受者不具毒性，可能包括例如缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇、苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3‑戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属复合物(例如锌‑蛋白质复合物)；和/或非离子性表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有本发明的化合物的脂质体是以本领域已知的方法制备，诸如美国专利第4,485,045及4,544,545号中所述者。循环时间延长的脂质体揭露于美国专利第5,013,556号。特别有用的脂质体可利用逆相蒸发方法以包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG‑衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG‑PE)的脂质组合物产生。脂质体被挤压通过限定孔径大小的滤网以产生具有所需直径的脂质体。
该活性成分亦可被包囊化于通过例如凝聚技术或通过界面聚合化所制备的微胶囊中例如分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚‑(异丁烯酸甲酯)微胶囊中、于胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳状液、纳米颗粒及纳米胶囊)或于粗乳状液中。这些技术揭示于Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Mack Publishing(2000)。
可以制备持续释放性制剂。持续释放制剂的适当实例包括含有该抗体的固相疏水性聚合物的半透性基质，该基质是有形状的物品的形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2‑羟乙基‑甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L‑谷氨酸及7乙基‑L‑谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯‑乙酸乙烯酯、可降解的乳酸‑乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸‑乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)所组成的注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯及聚‑D‑(‑)‑3‑羟丁酸。
欲用于体内施用的制剂必须为无菌。此可轻易地通过例如无菌过滤膜的过滤达成。本发明的治疗性化合物通常被置放于具有无菌接口的容器中，例如具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
适当的乳液可利用自商业途径获得的脂质乳液制备，诸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。活性成分可被溶解于预先混合的乳液组合物中，或者可被溶解于油中(例如大豆油、红花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)再与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合以形成乳液。将了解的是可添加其它成分例如甘油或葡萄糖以调整该乳液的张力。适当的乳液通常将含有最高20%例如介于5%至20%的油。该脂肪乳液可包含介于0.1至1.0微米特别是0.1至0.5微米的脂肪液滴，且具有介于5.5至8.0的pH。
该乳液组合物可为那些通过混合本发明的化合物与IntralipidTM或其成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制备的组合物。
用于吸入或喷入的组合物包括在药用可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液及悬浮液和粉末。该液体或固体组合物可能包含如前述的适当的药用可接受的赋形剂。在一些实施方案中，该组合物是以经口或经鼻呼吸途径施用以提供局部或全身性效应。在药用可接受的优选无菌溶剂中的组合物可通过使用气体进行气雾化。经气雾化的溶液可从喷雾装置直接吸入，或该雾化装置可与面罩、帷幕或间歇性正压呼吸器连接。溶液、悬浮液或粉末组合物可自装置优选地经口或经鼻施用，该装置以适当方式递送制剂。
本发明的化合物及组合物可与已建立的用于相关适应症的治疗一起使用。实例包括用于血管生成疾病特别尤其是癌的5‑氟尿嘧啶、伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxilaplatin)、西妥昔单抗(cetuximab)、舒尼替尼(sunitinib)及利妥昔单抗(rituximab)。其它实例包括雷珠单抗(ranibizumab)、英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)及帕利珠单抗(palivizumab)。
本发明的治疗性方法
本发明亦提供治疗性方法。治疗性方法包含施用本发明的化合物或组合物至有需要的对象。
本发明提供本发明的化合物或本发明的药物组合物于抑制或减少血管生成的方法的用途或用于治疗或预防与血管生成病状有关的疾病或症状的用途。本发明提供抑制或减少血管生成或治疗或预防与血管生成紊乱有关的疾病或症状的方法，该方法包含施用治疗有效剂量的本发明的化合物及组合物至病患。本发明亦提供递送或施用本发明的化合物及组合物的方法及使用本发明的化合物及组合物的治疗方法。本发明亦提供治疗癌的方法，该方法包含施用治疗有效量的根据本发明的化合物或药物组合物至对象。本发明所使用的血管生成介导的病症是一种异常血管生成活性所造成的病症或一种其中调节血管生成活性的化合物具有治疗用途的病症。可利用本发明的化合物及组合物治疗和/或诊断的疾病和病症包括癌、关节炎、高血压、肾疾病、牛皮癣、与眼疾病、感染或手术介入有关的眼睛的血管生成、黄斑变性、糖尿病视网膜病等等。
更特别地，如本文所用，当与本发明有关时，“癌”的实例包括肺癌(NSCLC及SCLC)、头或颈癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肛门区域的癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、输尿管癌、肾盂癌、甲状腺癌、膀胱癌、脑癌、肾细胞癌、中枢神经系统(CNS)的癌、CNS的肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、脊轴肿瘤、口咽癌、下咽癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、尿道癌、淋巴瘤、或一或多种前述癌的组合。又更特别地，当于此处与本发明有关的使用时，“癌”的实例包括选自下列的癌：肺癌(NSCLC及SCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肛门区域的癌或一或多种前述癌的组合。
在其它实施方案中，本发明的药物组合物涉及非癌性过度增生性疾病诸如但不限于年龄相关性黄斑变性、血管成形术后的再狭窄及牛皮癣。在另一实施方案中，本发明涉及用于治疗哺乳动物的药物组合物，该哺乳动物需要活化IGF1R和/或Ang2，其中该药物组合物包含治疗有效量的本发明的活化抗体及药用可接受的载体。本发明的药物组合物可被用于治疗骨质疏松症、脆弱性(frailty)或其中该哺乳动物分泌太少活性生长激素或无法对生长激素反应的病状。
本文所使用的药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是指足以影响任一或多种有益或所需结果的量。就预防性用途而言，有益或所需结果包括消除或减少疾病的风险、减轻疾病的严重性或延迟疾病的开始，包括该疾病的生化学、组织学和/或行为学的症状、在该疾病发展期间所表现的其并发症及中间病理学表型。就治疗性用途而言，有益或所需结果包括诸如减少肿瘤大小、减少扩散、减少肿瘤的血管、减少一或多种癌或其它与增加血管生成有关的疾病的症状、降低治疗该疾病所需的其它药物的剂量、提高其它药物的效应和/或延缓病患的疾病进程的临床结果。有效剂量可分一或多次施用。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景下所了解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能与或不与另一药物、化合物或药物组合物组合达到。因此，“有效剂量”可在施用一或多种治疗剂的情况中被考虑，且若与一或多种其它治疗剂组合时可能或达成所学的结果时，可被考虑给予有效量单一治疗剂。
“个体”或“对象”是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物亦包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长动物及马。
有利地，治疗性施用本发明的化合物导致减少血管生成和/或在癌的例子中稳定或减少的肿瘤体积。优选地，肿瘤体积相较于施用本发明的MAC前至少减少约10%或约15%。优选地，肿瘤体积相较于施用该MAC之前至少减少约20%。又优选地，肿瘤体积相较于施用该MAC之前至少减少30%。有利地，肿瘤体积相较于施用该MAC之前至少减少40%。更有利地，肿瘤体积相较于施用该MAC之前至少减少50%。非常有利地，肿瘤体积相较于施用该MAC之前至少减少60%。最佳地，肿瘤体积相较于施用该MAC之前至少减少70%。
根据本发明的方法施用本发明的化合物可为连续性或间歇性，取决于例如接受者的生理状况、给药的目的是治疗性或预防性、及本领域技术人员所知的其它因素。本发明的化合物的施用可为基本上连续一段预定的时间，或可为一系列的间隔剂量。
抗体
“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，各四聚体是由二对相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻链”(约25kDa)及一条“重链”(约50kDa至70kDa)。各链的氨基端部分包括约100至110个或更多氨基酸的可变区，该可变区主要负责识别抗原。各链的羧基端部分定义主要负责效应物功能的恒定区。人轻链被分成κ及λ轻链。重链被分成α、δ、ε、γ及μ，且分别定义抗体的同种型为IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。在轻链及重链内，可变区及恒定区是由约12或更多个氨基酸的"J"区连接，重链亦包括约10多个氨基酸的"D"区。各轻链/重链对的可变区形成该抗体结合位点使得完整的免疫球蛋白具有2个结合位点。
免疫球蛋白链展现相同的一般性结构，其中相对保守的框架区(FR)是由3个亦称为互补决定区或CDR的高变区连接。来自各对的2条链的CDR通过框架区对齐，使其能与特定表位结合。从N端至C端，轻链及重链皆包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。氨基酸的分配至各结构域是根据Kabat(Kabat)的Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987及1991))的定义。
在特定抗体中组成CDR的氨基酸残基的身份可利用本领域广为周知的方法进行测定。举例来说，抗体CDR可被鉴定为最早由Kabat等人定义的高变区(Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C.)。CDR的位置亦可能被鉴定为最早由Chothia等人所描述的结构性环结构(Chothia et al.,1989,Nature 342：877‑883)。其它识别CDR的方法包括“AbM定义”，该法为Kabat法及Chothia法的折衷，是源自利用Oxford Molecular AbM抗体模型软件(现为)，或如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262：732‑745所述根据观察到的抗原接触的CDR的“接触定义”。在此处称为CDR的“构象定义”的另一方法中，CDR的位置可能被鉴别为对抗原结合造成焓贡献的残基(Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156‑1166)。虽然其它CDR边界定义可能不严格遵守上述方法之一，但将与至少部分的Kabat CDR重叠，不过它们可能根据预测或实验结果(特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合)被缩短或延长。本文所使用的CDR可能指由本领域已知的任何方法(包括多种方法的组合)所定义的CDR。本文所使用的方法可利用根据这些方法中任一者所定义的CDR。以任何包含超过一种CDR的给定实施方案而言，该CDR(或该抗体的其它残基)可根据Kabat、Chothia、延长、AbM、接触和/或构象定义中任一种进行定义。
此处所使用的某些残基已被给予其Kabat编号，因此K188‑CLκ是指根据Kabat编号的κ轻链的残基188，从该κ轻链的开头计算。当能了解的是，该残基的编号可能根据所采用的特定编号方式而改变。
“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过酶或化学切割完整抗体来产生。抗原结合部分包括尤其是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双价单链抗体、单链噬菌体抗体、双价抗体及包含至少一部分的免疫球蛋白的多肽(该部分的免疫球蛋白足以赋予该多肽特异性抗原结合)。Fab片段是由VL、VH、CL及CH I结构域组成的单价片段；F(ab')2片段是包含二个由绞链区的二硫键连接的Fab片段的双价片段；Fd片段是由VH及CH1结构域组成；Fv片段是由抗体单臂的VL及VH结构域组成；及dAb片段是由VH结构域或VL结构域组成(例如人、骆驼(camelid)或鲨鱼)。
通常，提及抗体被视为亦提及其抗原结合部分，特别是其包含CLκ的至少K188的抗原结合部分。
单链抗体(scFv)是其中VL及VH区是经配对以通过合成性接头形成单价分子的抗体，该合成性接头使它们得以被产生成为单一蛋白质链。双价抗体是双价、双特异性的抗体，其中VH及VL结构域是表达于单一多肽链上，但使用过短以防止该同一链上的两个结构域配对的接头，藉此强迫所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。一或多个CDR可被共价或非共价地并入分子中以使其成为免疫粘附素。免疫粘附素可纳入CDR以作为较大多肽链的部分，可共价连接该CDR至另一多肽链，或可非共价地并入该CDR。该等CDR使免疫粘附素得以与目标特定抗原特异性结合。
抗体可能具有一或多个结合位点。若有一个以上的结合位点，所述结合位点可能彼此相同或可能不同。举例来说，天然存在的免疫球蛋白具有2个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，然而“双特异性”或“双功能性”抗体具有2个不同的结合位点。
“分离的抗体”是(1)不与天然相关的成份相关的抗体，包括其它在其天然状态下伴随其的天然相关的抗体，(2)不含其它来自该相同物种的蛋白质的抗体，(3)由天然不表达该抗体的细胞表达的抗体，或由来自不同物种的细胞表达的抗体，或(4)不天然存的抗体。
术语“人抗体”包括所有具有一或多种衍生自人免疫球蛋白序列的可变区及恒定区的抗体。在本发明的某些实施方案中，抗IGF1R抗体的所有可变及恒定结构域衍生自人免疫球蛋白序列(全人抗体)。人源化抗体是衍生自非人物种的抗体，其中在该重链及轻链的骨架及恒定结构域中的某些氨基酸是经突变以避免或消除于人的免疫反应。或者，人源化抗体可通过融合来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域进行产生。
术语“嵌合抗体”是指包含来一种抗体的一或多个区域及来自一或多种其它抗体的一或多个区域的抗体。
术语“表位”包括任何能与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的蛋白质决定簇。表位决定簇通常是由分子的化学活性表面基团组成，诸如氨基酸或糖侧链，且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。当解离常数是<1uM，优选地<100nM且更优选地<10nM时，抗体被称为与抗原特异性结合。
术语多功能抗体缀合物或MAC是指本发明所定义的与至少一个效应物部分共价缀合的抗体或其抗原结合部分，该效应物部分与靶结合。该效应物部分可为肽、小分子、蛋白质、核酸分子、毒素、适体、或抗原结合抗体或其片段。提到与肽的缀合及在本说明书各处所提及的类似者通常适用于与蛋白质及(抗原结合)抗体或其片段的缀合。效应物部分与抗体(或其片段)之间的连接可为共价键接。在效应物部分是蛋白质或肽的某些实施方案中，该效应物部分可与抗体链之一的N或C端融合。应当了解所谓的融合是指效应物部分与抗体通过其各自的肽主链之间的肽键融合。在某些方面中，效应物部分与抗体通过接头共价缀合，且不通过连接该2个肽主链的肽键融合。
在一些实施方案中，本发明的MAC包含人源化抗IGF1R抗体。本发明的MAC可包含全人抗IGF1R抗体，通过导入人免疫球蛋白基因至鼠以使该鼠产生全人抗体。本发明亦提供全人抗IGF1R抗体。预期全人抗IGF1R抗体可最小化小鼠或小鼠衍生性单克隆抗体(Mab)所固有的免疫原性及过敏反应，因此增加施用的抗体的疗效及安全性。全人抗体的使用可被预期在慢性及复发性人疾病诸如发炎及癌的治疗上提供实质好处，其可能需要重复的抗体施用。在另一实施方案中，本发明提供包含抗IGF1R抗体的MAC，该抗IGF1R抗体不与补体结合。
产生用于本发明的抗IGF1R抗体的方法于WO02053596及WO2005016967中描述，二者皆以引用方式被并入本文。
在一些实施方案中，经突变的抗IGF1R抗体的VH或VL区相较于在突变前的该抗IGF1R抗体具有不超过10个氨基酸改变。在一些实施方案中，经突变的抗IGF1R抗体的VH或VL区中具有不超过5个氨基酸改变。其中可能具有不超过3个氨基酸改变。在其它实施方案中，在恒定结构域中具有不超过15个氨基酸改变。在恒定结构域中可能具有不超过10个氨基酸改变。在恒定结构域中可能具有不超过5个氨基酸改变。
此外，可产生融合抗体，其中两个(或多个)单链抗体是彼此相连。若想在单一多肽链上产生双价或多价抗体或想产生双特异性抗体，这是有用的。
一种类型的衍生化抗体是通过交联2个或多个抗体产生(相同类型或不同类型以产生例如双特异性抗体的抗体)。适当的交联剂包括该些具有2个由适当间隔物分开的不同反应基团的异双官能交联剂(例如m‑马来酰亚胺苯甲酰基‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能交联剂(例如二琥珀酰亚氨基辛二酸酯)。
另一类型的衍生化抗体是标记的抗体。可用于衍生本发明的抗体或抗体部分的检测剂包括荧光化合物，包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5‑二甲胺‑1‑萘磺酰基氯化物、藻红素、镧、磷光体等等。抗体亦可使用可用于检测的酶标记，诸如辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等等。当抗体是利用可检测的酶标记时，其通过添加额外试剂进行检测，其中该酶使用该额外试剂以产生可被分辨的反应产物。举例来说，当辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢及二氨基联苯胺产生可被检测的有色反应产物。抗体亦可利用生物素标记，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合进行检测。抗体可利用磁性物质标记，诸如钆。抗体亦可利用预先测定的多肽表位标记，该多肽表位是由二级报告物(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别。在一些实施方案中，标记是通过各种长度的间隔物臂连接以减少潜在的空间位阻。
抗体亦可利用化学基团衍生化，诸如聚乙二醇(PEG)、甲基、乙基、或糖基。这些基团可被用于增进该抗体的生物特性，例如增加血清半衰期或增加组织结合。
催化抗体
在本发明的某些方面中，MAC包含催化抗体，或其抗原结合部分。在某些方面中，抗体可为醛缩酶抗体。
专利US2006205670的内容通过引用并入本文，特别是段落[0153]至[0233]，其中描述抗体、其有用的片段及其变体及修饰、结合位点及CDR、抗体制备、表达、人源化、氨基酸修饰、糖基化、ADCC、CDC、增加抗体的血清半衰期、表达载体、哺乳动物宿主系统、及折叠和其它抗体技术的元素。
本发明所使用的“结合位点”(亦称为抗体结合位点)是指与适当抗原的决定簇(或结构类似蛋白质)结合(或可结合)的免疫球蛋白或Ig结构域的区域。该术语通常包括CDR及邻近的与抗原结合有关的框架残基。
本发明所使用的“醛缩酶抗体”是指包含当未被阻碍时(例如通过缀合)，该结合位点部分催化在脂肪族酮供体与醛受体之间的醛醇加成反应的抗体。醛缩酶抗体能通过以包括下式的1,3二酮半抗原的免疫原免疫接种免疫反应性动物来产生：

该1,3二酮半抗原是与载体蛋白偶联，且该抗体在其结合位点另具有含有反应性ε‑氨基的赖氨酸。醛缩酶抗体的其它特征为其催化活性受到1,3‑二酮半抗原的抑制，通过在该1,3‑二酮半抗原与该催化抗体的赖氨酸的ε‑氨基之间形成复合物。
如某些实施方案中所讨论的，可用于制备本发明的MAC、组合物及样品的某些抗体可包含在该抗体结合位点中的反应性侧链。反应性侧链可为天然存在，或可通过突变被置于抗体中。该抗体结合位点的反应性残基可与该抗体相关，诸如该残基是由存在于最先被识别为制备该抗体的淋巴样细胞中的核酸所编码。或者，该氨基酸残基可通过故意突变DNA以编码该特定残基产生。该反应性残基可为非天然残基，通过例如使用如本文所述的独特密码子、tRNA及氨基酰基‑tRNA的生物合成并入产生。在另一方法中，该氨基酸残基或其反应性功能基团(例如亲核性氨基或巯基)可与该抗体结合位点中的氨基酸残基连接。因此，本发明所使用的“通过抗体的结合位点中的氨基酸残基”发生的与抗体的共价键接可指与抗体结合位点的氨基酸残基直接键接，或通过与抗体连接部位的氨基酸残基的侧链连接的化学基团键接。在一些实施方案中，该氨基酸是半胱氨酸，且该侧链的反应性基团是巯基。在其它实施方案中，该氨基酸残基是赖氨酸，且该侧链的反应性基团是ε‑氨基。在一些实施方案中，该氨基酸是根据Kabat编号的位于重链上的K93。在一些实施方案中，该氨基酸是根据SEQ ID NO:52及54的编号的HC h38C2上的K99。
催化抗体是具有包含一或多个反应性氨基酸侧链的适当结合位点的抗体来源。此类抗体包括醛缩酶抗体、β内酰胺酶抗体、酯酶抗体及酰胺酶抗体。
一个实施方案包含醛缩酶抗体，诸如小鼠单克隆抗体mAb33F12及mAb38C2(其VL及VH包含SEQ ID NO:56及57)，以及适当的嵌合及人源化版本的此类抗体(例如h38C2IgG1：SEQ ID NO:51及52和h38C2‑IgG2：SEQ ID NO:53及54)。小鼠mAb38C2(及h38C2)具有靠近但在HCDR3以外的反应性赖氨酸且是新类型的催化抗体的原型，该新类型的催化抗体是通过反应性免疫及机械性模拟天然醛缩酶来产生。其它可被使用的醛缩酶催化抗体包括由下列杂交瘤产生的抗体：杂交瘤85A2(具有ATCC登录号PTA‑1015)、杂交瘤85C7(具有ATCC登录号PTA‑1014)、杂交瘤92F9(具有ATCC登录号PTA‑1017)、杂交瘤93F3(具有ATCC登录号PTA‑823)、杂交瘤84G3(具有ATCC登录号PTA‑824)、杂交瘤84G11(具有ATCC登录号PTA‑1018)、杂交瘤84H9(具有ATCC登录号PTA‑1019)、杂交瘤85H6(具有ATCC登录号PTA‑825)、杂交瘤90G8(具有ATCC登录号PTA‑1016)。通过反应性赖氨酸，这些抗体利用天然醛缩酶的烯胺机制催化醛醇及逆向醛醇反应。
本发明的化合物亦可能通过连接靶向剂与反应性半胱氨酸形成，诸如那些于硫酯酶及酯酶催化抗体的结合位点中所发现的。含反应性氨基酸的抗体可通过本领域广为周知的方法制备，包括使抗体结合位点残基突变以编码反应性氨基酸，或以包含反应基团的接头化学衍生抗体结合位点中的氨基酸侧链。
抗体可为人源化抗体。当本发明的化合物是与抗体的结合位点共价连接且所述抗体是经人源化时，很重要的是所述抗体经人源化以保留对W基团的高度连接亲和力。各种形式的人源化小鼠醛缩酶抗体皆被考虑。一种实施方案使用人源化醛缩酶催化抗体h38c2IgG1或具有人恒定结构域Cκ及Cγ11的h38c2Fab。C人种系Vk基因DPK‑9及人Jk基因JK4被用来作为人源化m38c2的κ轻链可变结构域的框架，且人种系基因DP‑47及人JH基因JH4被用来作为人源化m38c2的重链可变结构域的框架。图18A说明在m38c2、h38c2及人种系中的可变轻链与重链之间的序列比对。h38c2可利用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定结构域，包括其任意的同种异型。另一实施方案使用嵌合抗体，其包含h38c2的可变结构域(VL及VH)(SEQ ID NO:55及56)和包含K188‑CLκ的来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的恒定结构域。该抗体可为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、VH、VL、双价抗体或微型抗体，其包含来自h38c2的VH及VL结构域。该抗体可为包含来自h38c2的VL及VH结构域和选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定结构域的抗体。该抗体可为h38C2IgG1(SEQ ID NOS：51及52)。该抗体可为h38C2IgG2(SEQ ID NOS：53及54)。该抗体可为包含来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区的人源化版本的小鼠醛缩酶抗体。在另一实施方案中，该抗体是嵌合抗体，其包含来自小鼠醛缩酶抗体的VL及VH区(例如SEQ ID NO:57及58)和来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区。在其它实施方案中，该抗体是全人版本的小鼠醛缩酶抗体，其包含来自天然或自然人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的多肽序列。
各种形式的人源化醛缩酶抗体片段亦被考虑。一种实施方案使用h38c2F(ab')2。h38c2F(ab')2可通过蛋白水解消化h38c2IgG1产生。另一实施方案使用h38c2scFv，该h38c2scFv包含任选地通过介入接头(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:59)连接的来自h38c2的VL及VH结构域。可产生人抗体以作为人源化抗体的替代品。举例来说，现在有可能产生能够在免疫(或以酶催化性抗体为例的反应性免疫)时产生整套人抗体而没有内源性免疫球蛋白产生的转基因动物(例如小鼠)。
本发明所使用的“药物动力学”是指施用的化合物在不同时间的血清浓度。药效学是指施用的化合物在靶及非靶组织中在不同时间下的浓度，及对该靶组织(例如疗效)及非靶组织(例如毒性)的影响。在例如药物动力学或药效学上的改进可针对特定靶向剂或生物剂设计，诸如通过使用不稳定键接或通过修饰任何接头的化学特性(例如改变可溶性、电荷等等)。术语“Koff”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。术语“Kd”是指特定抗体‑抗原相互作用的解离常数。
在一些实施方案中，MAC的抗IGF1R抗体部分对IGF1R的选择性至少高出其对胰岛素受体的选择性的50倍。在一些实施方案中，MAC的抗IGF1R抗体部分的选择性高于其对胰岛素受体的选择性的100倍。在一些实施方案中，MAC的抗IGF1R抗体部分不展现对IGF1R以外的任何其它蛋白质任何可评估的特定结合。
在本发明的某些方面中，该MAC以高亲和力与IGF1R结合。在一些实施方案中，该MAC以1×10‑8M或更低的Kd与IGF1R结合。在一些实施方案中，该MAC以1×10‑9M或更低的Kd与IGF1R结合。在一些实施方案中，该MAC以5×10‑1M或更低的Kd与IGF1R结合。在一些实施方案中，该MAC以1×10‑1M或更低的Kd与IGF1R结合。
在本发明的某些方面中，MAC具有自IGF1R解离的低解离速率。在一实施方案中，MAC具有1×104s‑1或更低的Koff。在一些实施方案中，该Koff是5×10‑5s‑1或更低。
在某些方面中，本发明提供药用可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物及本发明的化合物、样品、组合物及药物组合物的前药。
催化性抗体接头
某些适合用于连接靶向剂与催化性抗体的结合位点的接头(催化性抗体接头：CA接头)揭示于US2009098130，其内容通过引用并入本文。术语“靶向剂”是用于本文以区别术语“效应物部分”，但很明显的是，与CA接头或MAC接头的末端连接的分子种类可互相交换。特别是，在US2009098130中涉及该(CA)接头的通式、特定(CA)接头结构、(CA)接头的合成、及不同组件P、Q及W的组合(其中分别被分类为X、Y及Z基团)的特定及一般性描述的方面包括于本文中。
CA接头可为CA线性或分支接头，且可任选地包括一或多个碳环或杂环基团。CA接头长度可被视为直链原子的数量，有环状基团诸如芳香环等以沿着该环的最短路径计算。在一些实施方案中，该CA接头具有5至15个原子的直链片段，在其它实施方案中15至30个原子，在仍其它实施方案中30至50个原子，在仍其它实施方案中50至100个原子，及在仍其它实施方案中100至200个原子。其它CA接头考虑包括对形成的化合物的物理或药物动力学性质的影响，诸如溶解性、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(较稳定或较不稳定及较多或较少的预定降解)、刚性、柔性、免疫原性、调节抗体结合、被并入微团或脂质体中的能力等等。
在某些方面中，CA接头可与TA连接残基的侧链共价连接。该接头可包含式P‑Q‑W；其中P是生物相容性连接链，其包括任何选自C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br或I的原子且可包含聚合物或嵌段共聚物，当该接头是线性时，P与该连接残基共价连接(通过适当的侧链、氨基端或羧基端)；Q是可任选地存在的识别基团，其包含至少一环状结构；且W是连接基团，其包含与抗体的结合位点中的氨基酸侧链的共价连接。
当存在时，Q可具有任选取代的结构：

其中a、b、c、d及e独立地是碳或氮；f是碳、氮、氧或硫；Q在任2个足够价数的环位置独立地与P及W连接；且a、b、c、d、e或f中不超过4个同时为氮且优选地在环结构中的a、b、c、d及e各自为碳。在某些方面中，Q可为苯基。虽然不希望被任何理论束缚，应当能相信该Q基团可帮助放置(positioning)该反应基团至适当的抗体结合位点以使该W基团可与反应性氨基酸侧链反应。
CA接头可经设计以使其包含能够与大分子(诸如抗体、蛋白质或其片段)共价或非共价地形成键的反应基团。该反应基团是经选择以用于特定结合位点中的反应残基。举例来说，用于由醛缩酶抗体修饰的化学基团可为酮、二酮、β内酰胺、活性酯卤酮、内酯、酐、马来酰亚胺、α‑卤乙酰胺、环己基二酮、环氧化物、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫环氧化物、经掩蔽或保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤酮、醛等等。
在一些实施方案中，W在与抗体的结合位点中的残基的侧链缀合之前包括一或多个C=O基团，所述C=O基团是经排列以形成氮杂环丁酮、二酮、酰基β内酰胺、活性酯、卤酮、环己基二酮基、醛、马来酰亚胺、经活化的烯、经活化的炔、或一般而言包含易受亲核或亲电子取代的离去基团的分子。其它基团可包括内酯、酐、α‑卤乙酰胺、亚胺、酰肼或环氧化物。可与抗体的结合位点中的反应性亲核基团(例如赖氨酸或半胱氨酸侧链)共价结合的示范性接头亲电子反应基团包括酰基β‑内酰胺，简单二酮，琥珀酰亚胺活性酯，马来酰亚胺，含接头的卤乙酰胺，卤酮，环己基二酮，醛，脒，胍，亚胺，烯胺，磷酸酯，膦酸酯，环氧化物，氮丙啶，硫环氧化物，经掩蔽或保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、磺酸酯等等，经掩蔽的C=O基团诸如亚胺、缩酮、缩醛，以及任何其它已知的亲电子基。在某些实施方案中，该反应基包括一或多个C=O基团，所述C=O基团是经排列以形成酰基β‑内酰胺、简单二酮、琥珀酰亚胺活性酯、马来酰亚胺、含接头的卤乙酰胺、卤酮、环己基二酮或醛。W可为取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳基、取代的芳烷基、取代的杂环基、或取代的杂环烷基，其中至少一个取代基是1,3‑二酮基团、酰基β‑内酰胺、活性酯、α‑卤酮、醛、马来酰亚胺、内酯、酐、α‑卤乙酰胺、胺、酰肼或环氧化物。在某些方面中，W基与大分子支架共价连接，该大分子支架可提供本发明的肽增加的半衰期。在某些方面中，该W基若存在则与抗体的结合位点共价连接。
在某些方面中，W在缀合之前(例如与抗体的结合位点)具有下列结构：

其中q=0‑5。q可为1或2。q可为1。在其它方面中，q可为2。
在某些方面中，在与抗体结合位点缀合后，W具有下列结构：

其中q=0‑5且抗体‑N‑是与抗体的结合位点中的侧链的共价键接。q可为1或2。q可为1。在其它方面中，q可为2。
P可为包含三个组分的基团：Pp‑Ps‑Py，其中Pp是特别适合与靶向剂结合的基团，Ps是P基团的间隔物区，且Py是适合与该W基团结合的基团。在某些方面中，Py是选自酰胺键、烯胺键、或胍盐键。可选择Py以提供邻近(在二个原子以内)该Q基团的氢分子。虽然不希望被理论束缚，当能相信该H原子可帮助Q基团通过H‑键相互作用识别疏水口袋，特别是对于催化抗体(诸如h38C2)的结合槽的疏水口袋。因此例如酰胺键可具有方向性以使NH基团直接与Q基结合，使该NH基团的H用于氢键接。或者，酰胺的C=O基团可与Q基团结合，其中NH基团的H邻近该Q基团约2个原子，但仍可被用于H键接。在一些实施方案中，Py不存在。在一些实施方案中，Py基团具有下式：

在某些方面中，选择Ps以使Ps不提供任何过度反应的基团。Ps可被选择以提供2至15个原子的P基团的整体长度。Ps可被选择以使P基团的整体长度介于2至10个原子。Xs可被选择以使P基团的整体长度是4至8个原子。Ps可被选择以使P基团的整体长度是5个原子。Ps可被选择以使P基团的整体长度是6个原子。在某些方面中，Ps可包含下列式之一：

其中n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，且m存在或不存在；n可为1、2、3、4、5、或6；n可为1、2、3、或4；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4。
在某些方面中，Ps包含下列式之一：

理想地选择Pp以使可以对靶分子诸如肽、蛋白质、小分子、核酸或适体的连接残基(TA连接残基)采取特定定向共价连接策略。举例来说，当TA连接残基包含亲核基团时，Pp可为亲电子基团，且反之亦然。举例来说，若该TA连接残基侧链包含氨基，诸如K、H、Y、鸟氨酸、Dap、或Dab，Xp可为COOH，或其它类似的反应性亲电子剂。若该TA连接残基是D或E，Pp可包含亲核基团，诸如氨基。这些策略中的任一种允许在Pp基团与TA连接残基之间通过酰胺键形成策略形成共价键。当TA连接基团是氨基时，Pp可包含下式：

P可为任选地存在的生物相容性聚合物或嵌段共聚物。P可具有下列结构：

其中p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44、或45；w、r、及s各自独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；且Rb每次出现时独立地是氢、取代或未取代的C1‑10烷基、取代或未取代的C3‑7环烷基‑C0‑6烷基、或取代或未取代的芳基‑C0‑6烷基。
当TA连接残基是C、C的同系物或其它含硫醇基的残基时，Pp可包含马来酰亚胺基团(或类似者)，此允许硫醇‑马来酰亚胺加成反应策略得以共价连接该Pp基团与该TA连接残基。在某些方面中，Pp亦可包含硫醇基，此允许在该TA连接残基与Pp基团之间形成二硫键。在某些方面中，Pp可为马来酰亚胺：

其中箭头表示与靶分子连接的点，平行线代表与接头的Q基团连接。当与靶分子连接的点包含半胱氨酸残基或其它带硫醇侧链时，缀合的机制可如下图：

在一些方面中，Pp基团包含取代的马来酰亚胺：

在一些方面中，P是

其中选择v及w以使P的主链长度是6至12个原子。
在一些方面中，TA接头为下式：

其中n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可为1、2、3、4、5、或6；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4。M可不存在。M可存在。
在一些方面中，TA接头为下式：

其中n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可为1、2、3、4、5、或6；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4。M可不存在。M可存在。
在一些方面中，CA接头的P部分可被用来作为Y、X‑Y、Y‑Z及X‑Y‑Z(用于本发明的MAC的接头的部分)。
肽及蛋白质
酰基赖氨酸，或
Kac(又名AcK)是指：            K(SH)是指：

二氨基丁酸(Dab)                二氨基丙酸(Dap)

同型半胱氨酸        同型丝氨酸        鸟氨酸

一般来说，与本文所描述的细胞培养、组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质及核酸化学和杂交有关所使用的命名法及技术是本领域所广为周知且经常使用的。本发明的方法及技术通常根据本领域所广为周知的常规方法进行，除非另外说明否则如同本说明书各处引述及讨论的各种一般性及更具体的参考文献所述。本发明所使用的20种常规的氨基酸及其缩写遵照习惯用法。“多肽”、“肽”及“蛋白质”可交换使用，以指氨基酸残基的聚合物。本发明所使用的这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一或多种氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。这些术语亦适用于天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸可呈L或D形式，只要保持了该肽的结合及其它所需特征。多肽可为单体或多体。
除非另外以“D”前缀(例如D‑Ala或N‑Me‑D‑Ile)或小写字母形式表示(例如a、i、l(Ala、Ile、Leu的D型式))，否则在本说明书及随附的权利要求中所描述的肽中的氨基酸及氨酰基残基的α‑碳的立体化学是天然或“L”构型。
所有肽序列是根据普遍接受的惯例书写，其中α‑N端氨基酸残基在左侧且α‑C端氨基酸在右侧。本发明所使用的术语“N端”是指肽中的氨基酸的游离α‑氨基基团，且术语“C端”是指肽中的氨基酸的游离α‑羧酸端。在N端具有封端基团的肽是指在该N端氨基酸残基的α‑氨基氮上带有基团的肽。在N端具有封端基团的氨基酸是指在该α‑氨基氮上带有基团的氨基酸。
本发明所使用的“卤”、“卤素”或“卤化物”是指F、Cl、Br或I。
本发明所使用的“生物学活性”是指化合物、组合物或其它混合物的体内活性，或在体内施用化合物、组合物或其它混合物时导致的生理反应。因此生物学活性包含该化合物、组合物及混合物的治疗效应、诊断效应及医药活性。术语“生物学活性的”或“功能性”是指展现至少一种活性的多肽，该活性是AA靶向剂特征性的或类似AA靶向剂的活性。
本发明所使用的术语“生物相容性”是指具有生物学惰性或不与细胞内及细胞外生物分子起反应且不具毒性的某物。
术语“取代的烷基”是指其中一或多个与碳或氢的键被与非氢及非碳原子的键取代的烷基，非氢及非碳原子诸如但不限于在卤化物中的卤素原子诸如F、Cl、Br、及I；在诸如羟基、烷氧基、芳氧基及酯基的基团中的氧原子；在诸如硫醇基、烷基及芳基硫化物基团、砜基、磺酰基及亚砜基的基团中的硫原子；在诸如胺、酰胺、烷胺、二烷胺、芳胺、烷芳胺、二芳胺、N‑氧化物、酰亚胺及烯胺的基团中的氮原子；在诸如三烷基硅烷基、二烷基芳基硅烷基、烷基二芳基硅烷基及三芳基硅烷基的基团中的硅原子；及其它在各种其它基团中的杂原子。取代的烷基亦包括其中一或多个与碳或氢原子的键被与杂原子的键取代的基团，该杂原子诸如在羰基、羧基、及酯基中的氧；在诸如亚胺、肟、腙、及腈的基团中的氮。取代的烷基包括其中一或多个与碳或氢原子的键被一或多个与氟原子的键取代的烷基。取代的烷基的一个实例是三氟甲基及其它包含三氟甲基的烷基。其它烷基包括那些其中一或多个与碳或氢原子的键被与氧原子的键取代的烷基，以使该取代的烷基包含羟基、烷氧基、芳氧基或杂环氧基。其它烷基还包括具有胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、(烷基)(芳基)胺、二芳基胺、杂环基胺、(烷基)(杂环基)胺、(芳基)(杂环基)胺、或二杂环基氨基团的烷基。
术语“未取代的烷基”是指如上述定义的二价未取代的烷基。因此亚甲基、乙烯及丙烯各自为未取代的烯的实例。术语“取代的烷基”是指如上述定义的二价的取代的烷基。取代或未取代的低级伸烷基具有自1至约6个碳。
术语“未取代的环烷基”是指环状烷基诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、及如上述经直链及支链烷基取代的所述环。该术语亦包括多环烷基诸如但不限于金刚烷基、降冰片基及双环[2.2.2]辛基等、及如上述经直链及支链烷基取代的所述环。因此，该术语将包括甲基环己基。该术语不包括含有杂原子的环状烷基。未取代的环烷基可与母体化合物中的一或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子键接。在一些实施方案中，未取代的环烷基具有自3至20个碳原子。在其它实施方案中，所述未取代的烷基具有自3至8个碳原子，在其它实施方案中，所述基团具有自3至7个碳原子。
术语“取代的环烷基”具有和取代的烷基相对于未取代的烷基的意义相同的相对于未取代的环烷基的意义。因此，该术语包括但不限于氧环己基、氯环己基、羟环戊基及氯甲基环己基。
附图说明
图1A：抗体2.12.1及2.12.1.fx的重链的氨基酸序列的比对，其中显示可变区的共有序列。图1B：抗体2.12.1及2.12.1.fx的轻链的氨基酸序列的比对，其中显示可变区的共有序列。CDR以画底线表示，恒定区以斜体表示。抗体2.12.1及2.12.1.fx的序列揭示于WO2005016967及WO2005016967。
图2：MAC的完整分子量质谱分析显示多个肽与抗IGF1R抗体2.12.1.fx连接。图2A：抗IGF1R抗体2.12.1.fx的质谱分析数据。图2B至2D：MAC‑2的质谱分析数据，其显示3个单独批次的重复试验。
图3：2.12.1.fx(IGF1R)及3批MAC‑2(MAC)的质谱分析，其中二硫键被还原。图3A：2.12.1.fx(IGF1R)轻链的质谱分析数据。图3B：2.12.1.fx(IGF1R)重链的质谱分析数据。图3C：MAC‑2轻链(批号1)的质谱分析数据。图3D：MAC‑2重链(批号1)的质谱分析数据。图3E：MAC‑2轻链(批号2)的质谱分析数据。图3F：MAC‑2重链(批号2)的质谱分析数据。图3G：MAC‑2轻链(批号3)的质谱分析数据。图3H：MAC‑2重链(批号3)的质谱分析数据。
图4A：抗体2.12.1.fx的轻链的氨基酸序列，其中胰凝乳酶切割位点以黑点标示。包含Lys残基(可能缀合的位点)的胰凝乳酶切割片段以自N端的编号标示。该轻链的Y15片段以下划线标示。图4B：抗体2.12.1.fx的重链的氨基酸序列，其中胰凝乳酶切割位点以黑点标示。包含Lys残基(可能缀合的位点)的胰凝乳酶切割片段以自N端的编号标示。
图5A：经缀合的含赖氨酸的肽：轻链Y15的质谱分析数据，其显示未缀合的抗IGF1R抗体2.12.1.fx(IGF1r)与MAC‑2(MAC)的质谱分析数据，另显示Y15片段的图式。图5B：未经缀合的轻链Y15片段的质谱分析数据，其显示未经缀合的抗IGF1R抗体2.12.1.fx(IGF1r)与MAC‑2(MAC)的质谱分析数据，另显示Y15片段的图示。
图6A：2.12.1.fx的胰蛋白酶切割片段的选择离子LCMS层析数据。图6B：当该胰蛋白酶切割片段的Lys188用MAC‑2的ABP修饰后的选择离子LCMS层析数据。
图7A：2.12.1.fx的胰蛋白酶切割片段的选择离子LCMS层析数据。图7B：当该胰蛋白酶切割肽的Lys190用MAC‑2的ABP修饰后的选择离子LCMS层析数据。
图8：完整MAC‑2的质谱图。
图9A：用于MAC‑2的经还原的重链的质谱图。图9B：用于MAC‑2的经还原的轻链的质谱图。
图10：Ang1‑4的结合ELISA。MAC与Ang家族成员(Ang1‑4)结合的代表图。
图11：Ang2竞争性ELISA。MAC与Ang2竞争与Tie2受体的结合的代表图。
图12：IGF1R竞争性ELISA。MAC与IGF1竞争与IGF1R的结合的代表图。
图13：MAC抑制在3T3‑hIGF1R细胞上的IGF1诱导的IGF1R自体磷酸化。
图14A：Colo205结肠腺癌异种移植在经载体、Ang2‑h38c2、IGF1R抗体(2.12.1.fx)或MAC‑2治疗后(腹腔注射，一周一次)的肿瘤体积。数据是以0至28天的n=10/组的平均值及SE表示(在28天后所有组别的n=10)。*：P<0.05，IGF1R抗体(2.12.1.fx)10mg/kg相较于MAC‑210mg/kg；**：P<0.01，Ang2‑h38C2相较于MAC‑2；二向ANOVA分析，Bonferroni事后检验。图14B：从切除及冷冻的肿瘤所制备的溶解物中的相对IGF1R表达量。
图15A：Colo205结肠腺癌异种移植在经载体或MAC‑2每周IP治疗后(腹腔注射一周一次，0.3至10mg/kg)的肿瘤体积。数据是以n=10/组的平均值及SE表示。***：P<0.001，PBS相较于MAC‑2(所有剂量)；二向ANOVA分析，Bonferroni事后检验。图15B：第28天的终末肿瘤重量。图15C：Colo205结肠腺癌异种移植在经载体或MAC‑2治疗后(IP，一周一次)的肿瘤微血管密度。图15D：从经切除及冷冻的肿瘤所制备的溶解物中的相对Ang2表达量。图15E：从经切除及冷冻的肿瘤所制备的溶解物中的相对IGF1R表达量。
图16A：Colo205结肠腺癌异种移植在经载体、Ang2‑h38c2(10mg/kg)、IGF1R抗体(2.12.1.fx)(10mg/kg)或MAC‑2(1、3或10mg/kg)一周一次腹腔注射治疗后的肿瘤体积。图16B：Colo205结肠腺癌异种移植在经载体、IGF1R抗体(2.13.2)(10mg/kg)或MAC‑2(10mg/kg)一周一次腹腔注射治疗后的肿瘤体积。图16C：Colo205结肠腺癌异种移植在经载体、Ang2‑h38c2(10mg/kg)、IGF1R抗体(2.12.1.fx及2.13.2)(10mg/kg)、MAC‑2(1、3或10mg/kg)、或Ang2‑h38c2(10mg/kg)与2.12.1.fx或2.13.2(10mg/kg)的组合一周一次腹腔注射治疗后的肿瘤体积。所有数据是以n=10/组的平均值及SE表示。
图17：MDA‑MB‑435黑色素瘤在经载体或MAC‑2每周治疗后(IP，一周一次)的肿瘤体积。**：P<0.05，PBS相较于MAC‑2，20mg/kg；***：P<0.01PBS相较于Ang2‑h38c2，10mg/kg或MAC‑2，3mg/kg；二向ANOVA分析，Bonferroni事后检验。数据是以n=10/组的平均值及SE表示。
图18A：m38c2、h38c2及人种系的可变结构域的氨基酸序列比对。框架区(FR)及互补决定区(CDR)是根据Kabat(Kabat)等人的定义。星号标示在m38c2与h38c2之间或在h38c2与该人种系序列之间的不同。图18B：小鼠轻链κ恒定区(mCLκ)、人轻链κ恒定区(hCLκ)及人轻链λ恒定区(hCLλ)的氨基酸序列比对。在mCLκ与hCLκ之间和hCLκ与hCLλ之间的不同以星号显示，保守性取代则以十字表示。
为了使本发明更易于了解，提出下列实施例。这些实施例是仅为了说明的目的，不应被视为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1合成本发明所使用的肽

Rink酰胺树脂
利用Fmoc化学的固相肽合成(SPPS)的步骤：(i)以20%的哌啶/DMF移除Fmoc，(ii)氨基酸偶联；相对于树脂胺装载的HBTU:氨基酸:HOBt:NMM的比是5:5:5:20。使用的溶剂是NMP，(iii)重复步骤用于各氨基酸偶联。X=不耐酸的侧链保护基团。
完成受到完全保护、与树脂结合的肽的组装：
(i)以20%的哌啶/DMF移除Fmoc，(ii)乙酰化：乙酸酐/NMM/NMP。
完成N‑乙酰化、受保护、与树脂结合的肽的组装。
方案1：利用Fmoc化学固相合成肽链(以典型Ang2结合肽(ABP)SEQ ID NO:27为例)
实施例2：从树脂切割如实施例1中所制备的肽

1.完成N‑乙酰化、受保护、与树脂结合的肽的组装
2.TFA/水/苯酚/三异丙基硅烷(90:4:4:2)
方案2：从树脂切割ABP(SEQ ID NO:27)
实施例3合成ABP‑硫醇‑接头化合物

1.Ang2结合肽
2.S‑三苯甲基‑巯基丙酸/HBTU/NMM(相对于Ang2肽为5:5:10的比例)
3.受三苯甲基保护的硫醇Ang2肽中间体
4.TFA/DCM/TIPS(比例5:93:2)
5.带硫醇Ang2修饰肽
方案3：ABP‑1‑ti(3.3)(SEQ ID NO:27的K11被连接残基K(SH)取代)的合成
合成了具有不同系链点(tether point)的Ang‑2结合肽(ABP)的类似物(见实施例1及2)。首先合成及纯化游离的硫醇ABP中间体，接着添加马来酰亚胺‑PEG2‑PFP接头，然后进行终纯化步骤以获得纯的、PFP活化的ABP。肽链的组装及切割如方案1及2所示进行以产生纯的ABP。
ABP(284mg，0.1mmol)通过搅拌溶解于二甲基甲酰胺(0.5ml)。S‑三苯甲基‑巯基丙酸(MPA，62mg，约0.125mmol)、HBTU(48mg，0.125mmol)及N‑甲基吗啉(0.025ml，0.25mmol)被分开搅拌于DMF中(0.5ml)5分钟直到溶解。该ABP溶液及活化的MPA溶液被混合在一起2小时。该反应的进程由LCMS监测。2小时后，缓慢添加该溶液至冰冷的乙醚(40ml)以沉淀ABP‑S‑三苯甲基‑MPA产物。过滤收集白色的沉淀物然后干燥。接着使固体残余物溶解于三氟乙酸的二氯甲烷(1:10，10ml)溶液中，并添加0.050ml的三异丙基硅烷(TIPS)搅拌1小时。该溶液在减压下蒸发至淡黄油状，接着通过添加冰冷乙醚以沉淀粗硫醇肽。离心收集产物并于真空中干燥。将残余物溶解于50%水性乙腈，然后冷冻干燥以产生粗硫醇肽(HPLC分析约具80%的纯度)。该粗硫醇肽经半制备HPLC纯化产生145mg的SEQ ID NO:27。
合成SEQ ID NO:27‑K(SH)11‑MAL‑2PEG‑PFP

方案4：合成SEQ ID NO:27‑K(SH)11‑MAL‑2PEG‑PFP
实施例4产生Ang‑2结合肽硫醇中间体(ABP‑ti)
肽链组装是以0.1毫摩尔的规模进行。使用的树脂是Fmoc‑Rink‑PL树脂(150mg，0.67mmol/g取代)。标准Fmoc化学方法被用来合成该肽。以20%的哌啶/DMF移除Fmoc共3×5分钟，所有树脂清洗步骤使用DMF。为了并入氨基酸，每个残基采用单一偶联步骤，使用HBTU/HOBt/NMM活化2小时。连接残基(K(SH))作为Fmoc‑Lys(Nε‑巯基丙酸酯‑S‑Trt)‑OH被并入。在链组装时，N端Fmoc基团被移除且肽基树脂通过乙酰化加帽。终树脂以DCM清洗并于真空中过夜干燥。所获得的终树脂的重量如下：SEQ ID NO:29‑K(SH)9：627mg、SEQ ID NO:30‑K(SH)16：573mg、SEQ ID NO:31‑K(SH)18：642mg、及SEQ ID NO:32‑K(SH)19：641mg。
酸解移除保护基及从树脂切除肽是利用TFA/水/二硫苏糖醇/三异丙基硅烷的混合液(比例90:4:4:2，5ml)进行2小时。自树脂过滤出溶液，树脂利用另外5ml的纯TFA清洗。合并的滤液被蒸发成为浆状，然后添加冰冷的乙醚以沉淀白色粉末。离心收集粉末，接着将其溶解于50%水性乙腈(20ml)，冷冻及冻干过夜。
结果：
SEQ ID NO:29‑K(SH)9

获得的粗产物SEQ ID NO:29‑K(SH)9的量是252mg。HPLC分析粗产物SEQ ID NO:29‑K(SH)9显示明显主峰；5‑95%B/30min，C18，Rt=18.3min。进一步LCMS分析粗产物SEQ ID NO:29‑K(SH)9显示该主峰是所需的产物；观察到[M+H]+=2930，+2=1465，+3=977。
SEQ ID NO:30‑K(SH)16

获得的粗产物SEQ ID NO:30‑K(SH)16的量是229mg。HPLC分析粗产物SEQ ID NO:30‑K(SH)16显示明显主峰；5‑95%B/30min，C18，Rt=22.0min。进一步LCMS分析粗产物SEQ ID NO:30‑K(SH)16显示该主峰是所需的产物；观察到[M+H]+=2915，+2=1458，+3=972。
SEQ ID NO:31‑K(SH)18

获得的粗产物SEQ ID NO:31‑K(SH)18的量是252mg。HPLC分析粗产物SEQ ID NO:31‑K(SH)18显示明显主峰；5‑95%B/30min，C18，Rt=21.1min。进一步LCMS分析粗产物SEQ ID NO:31‑K(SH)18显示该主峰是所需的产物；观察到[M+H]+=2912，+2=1456，+3=971。
SEQ ID NO:32‑K(SH)19

获得的粗产物SEQ ID NO:32‑K(SH)19的量是261mg。HPLC分析粗产物SEQ ID NO:32‑K(SH)19显示明显主峰；5‑95%B/30min，C18，Rt=20.0min。进一步LCMS分析粗产物SEQ ID NO:32‑K(SH)19显示该主峰是所需的产物；观察到[M+H]+=2930，+2=1465，+3=977。
纯化：
制备型HPLC柱利用稀释水性TFA及乙腈预先平衡。将粗产物ABP‑硫醇中间体(即以K(SH)作为连接残基的ABP)溶解于DMF(3ml)，接着使其吸附至柱上，施用乙腈的稀释TFA溶液梯度洗脱。按质量(M=1465)自动收集级分。来自该柱的洗脱液由UV监测，所获得的级分由分析型RP‑HPLC分析。最纯的级分(分析型HPLC显示>95%)被合并及冷冻干燥以得到下列量：87mg的纯SEQ ID NO:29‑K(SH)9、50mg的纯SEQ ID NO:30‑K(SH)16、59mg的纯SEQ ID NO:31‑K(SH)18、及39mg的纯SEQ ID NO:32‑K(SH)19。
接头合成
考虑5种不同的活化策略以缀合ABP与本发明的抗IGF1R抗体，(实施例5至9)(利用SEQ ID NO:27‑K(SH)11显示示范性结构)：
实施例5N‑羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)(SEQ ID NO:27‑K11‑NHS)

N‑羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)(SEQ ID NO:27‑K11‑NHS)

方案5：合成SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑NHS
合成SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑NHS
使SEQ ID NO:27(5.1)与双NHS的PEGx‑接头(5.2)反应，以使NHS活化的羧基维持在终活化肽产物(5.3)上，且维持可用于后续缀合。这必须在该ABP上存在4个其它游离的羧基。这些要求排除了简单的原位活化策略，因为活化基团的位置无法被轻易地控制且有可能使多个羧基侧链被活化。
检查了在双PEG5‑NHS酯与该ABP(SEQ ID NO:27)之间的反应。使用10倍过量的在DMSO中的接头，ABP与N‑甲基吗啉(作为碱)的DMSO溶液被缓慢滴定至搅拌均匀的溶液中。在不同时间点取样品并以HPLC及LCMS检测。在约2小时后，有大量产物形成(大约80%自5.1转换形成5.3)，其轻易地与双NHS接头试剂分离。然而，即使在DMSO中，产物5.3缓慢地随时间转换成游离酸形式(其中NHS‑酯基团被转换成不活化的游离羧基)。同样地，当粗反应混合物被分馏以分离所需的产物5.3时，其亦会在纯化及后续冷冻干燥步骤期间受到水解。虽然此方法可成功地合成一些产物，但认为形成的NHS‑酯的水性不稳定性将限制在后续缀合反应中的应用。其它关于MAL‑PEG2‑NHS的检测于实施例30中说明(包含Z*基团Z13)。
实施例6马来酰亚胺(Mal)(SEQ ID NO:27‑K11‑Mal)

马来酰亚胺活化通常与游离硫醇缀合配对物(parter)一起使用。虽然在抗体2.12.1.fx上不存在游离的硫醇残基，有一些方法可用来导入游离硫醇至蛋白质中以藉此提供用于基于马来酰亚胺的缀合的键接位点。
含Mal的肽通常可利用简单的含马来酰亚胺/酸的接头相当简单地合成。数种SEQ ID NO:27‑MAL化合物如下所示合成。通常，马来酰亚胺活化肽不与缺乏内源性硫醇(源自游离半胱氨酸侧链)或用其它化学方法(例如通过Traut’s试剂)导入的硫醇的蛋白质或抗体缀合。

SEQ ID NO:27‑K11‑Mal

SEQ ID NO:27‑K11‑4PEG‑Mal‑2
实施例7氮杂环丁酮(AZD)(SEQ ID NO:27‑K11‑AZD)

SEQ ID NO:27‑AZD
AZD活化的ABP是通过连接AZD‑酸接头与溶液中的ABP来合成。
AZD活化：

方案6：合成SEQ ID NO:27‑K11‑AZD(6.3)
AZD活化的ABP非常缓慢地与赖氨酸侧链氨基反应。尝试在pH7至9的磷酸盐缓冲液中进行缀合，通过降低抗体表面赖氨酸的电荷(蛋白质表面上的赖氨酸的pKa是约9.1至11.2)，以增加其亲核性。有关抗体稳定性及AZD水解的问题排除了在pH9以上使用。在3天的反应时间内，每1摩尔的抗体添加15摩尔的AZD活化的ABP，产生低量的缀合(平均每抗体2个AZD活化的ABP)。在碱性pH下，AZD水解快速发生(在24小时后50%)导致减少量的缀合。
实施例8方形酸的酯(方酸酯)(SEQ ID NO:27‑方酸酯)

SEQ ID NO:27‑K11方酸酯‑R

7.1SEQ ID NO:27

7.2R1及R2衍生的方酸酯，在此实施例中，R1及R2皆为CH2CH3。

方案7：7.3SEQ ID NO:27‑K11‑方酸酯‑
方案7方形酸衍生物SEQ ID NO:27‑K11‑方酸酯接头‑1‑>ABP‑1‑方酸酯‑1
由方形酸制备的烷基酯已知会选择性地与硫醇在中性pH下反应，然而在较高的pH下(约8.5及8.5以上)，它们亦可与胺反应(虽然较为缓慢)。方酸酯的反应性可通过以芳基取代烷基而显著提高。本发明提供数种ABP的方酸酯衍生物，其中‘R’的特性有所不同(R选自乙基、苯基、2‑甲氧基羰基苯基、3‑氟苯基或3,5‑二氟苯基)，本发明亦提供其它其中接头位置有所不同的衍生物。乙基方酸酯与游离硫醇缀合良好，但与蛋白质及抗体上的游离胺缀合不良，除非pH在9以上。芳基方形酯在中性pH下与本发明的抗体上的游离赖氨酸缀合时显示较好的效率。
实施例9五氟苯基酯(PFP)(SEQ ID NO:27‑PFP)

本发明亦提供使用五氟苯基(PFP)酯以形成相对稳定的活化肽。该方法具有一些优于其它方法的好处，包括PFP基团可简单地从稳定活化的肽产物被导入溶液中，PFP基团本身可利用标准HPLC方法纯化，而不会有PFP酯水解。合成与具有能与抗体缀合的反应基团的接头共价连接的ABP的挑战在于ABP序列中存在四个酸性侧链(3个天冬氨酸及1个谷氨酸)。这些排除了使用肽与活化剂的简单活化策略，因为并没有已知的简单方法可确保在一个特定酸性侧链上的位点特异性活化。
为了解决这个问题，本发明提供一种合成途径，藉此途径使活化的酯基团(诸如PFP)可通过化学选择性反应(使用硫醇/马来酰亚胺化学)或通过使用双活性酯试剂与在肽上的侧链赖氨酸直接偶联，活化的酯基团与肽侧链形成酰胺但留下另一端作为活性酯。
在一些实施方案中，该策略可为双‑酸PEG，其中各酸活化为PFP酯。在含有某些碱的有机溶液中，双‑PFP接头的末端与赖氨酸的N‑ε‑氨基侧链于所需的系链位置反应形成稳定的酰胺键接，而另一端维持另一PFP基团。此策略的一个可能的问题在于形成肽二聚体的可能性，其中肽将被添加至存在于接头各端的各个PFP部分上。在某些方面中，本发明通过改变化学计量及加入分别的肽与双‑PEG‑PFP接头以克服此额外的问题。本发明所提供的一个解决方案是使溶液中含有过量的双‑Pfp接头，缓慢添加肽至溶液中，以使接头的量永远超过肽的量。通过使接头与肽的比介于约3.7:1至约4.3:1，或在一些实施方案中约4:1，所需的PFP活化的肽可被合成且无二聚体存在。SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP的合成如下方案8所示：

方案8：SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP
合成双‑dPEG5‑OPfp接头(8.2)
使双‑dPEG5‑酸(1mmol，338mg)溶解于脱水二氯甲烷(5ml)中，接着添加五氟苯酚(2mmol，368mg)与二环己基碳二酰亚胺(1mmol，208mg)。该溶液于室温中搅拌过夜。之后，过滤去除细白的二环己基脲副产物，滤液经蒸发干燥以得到淡黄色轻质油。以TLC及HPLC分析显示具有正确MS=670的纯产物。此产物用于下一步骤无须进一步纯化。该产物在‑20oC下可维持数个月的稳定。
合成SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP(8.3)
使SEQ ID NO:27(8.1)(730mg)溶解于脱水二甲基甲酰胺(8ml)中，并添加N‑甲基吗啉(0.05ml)。取一份纯bis‑dPEG5‑OPfp试剂(8.2)(0.5ml)装入玻璃小瓶(20ml)。随着剧烈搅拌，将SEQ ID NO:27/NMM溶液在2小时内以4×2ml等分添加至bis‑dPEG5‑OPfp试剂中，接着终混合物再搅拌1小时。转换成SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP产物的过程由分析型HPLC监测。当反应结束时，溶液通过半制备型HPLC在1”C8柱上过滤及直接纯化。该最纯的组分(分析型HPLC显示>95%)被合并及冷冻干燥以得到400mg(产率48%)的终ABP‑1‑5PEG‑PFP肽‑接头‑2产物。类似机制可被用于产生SEQ ID NO:27‑K(SH)11‑马来酰亚胺‑2PEG‑PFP(见方案4)。
合成马来酰亚胺‑2PEG‑PFP接头

方案9：马来酰亚胺‑dPEG2‑酸(9.1)‑>马来酰亚胺‑2PEG‑PFP(9.2)
将马来酰亚胺‑dPEG2‑酸(328mg，1mmol，Quanta Biodesign)、五氟苯酚(0.103ml，1mmol，PFP)及二环己基碳二酰亚胺(206mg，1mmol，DCC)溶解于干燥DCM(10ml)中，在室温下搅拌1小时。过滤移除形成的细白沉淀物(DCU副产物)，滤液在真空中蒸发至干燥。获得高产率的细白粉末产物(490mg，定量)。分析型HPLC显示纯度是>95%；MS显示[M+H]+=495。
合成PFP活化的ABP类似物
各种经纯化的ABP‑硫醇‑中间体(即具有K(SH)作为连接残基的ABP)的样品(30至40mg)被溶解于脱水DMF(2ml)中。添加Mal‑PEG2‑PFP(20mg)与N‑甲基吗啉(5mL)。反应在室温下搅拌进行，以HPLC监测以跟踪产物形成的时间进程。在前2小时内观察到起始肽完全转换成PFP活化的ABP产物。溶液经过滤，并由半制备型HPLC直接分离产物峰。在各例中，产物在冷冻干燥后被分离至约40%的产率。


SEQ ID NO:30‑K(SH)16‑MAL‑2PEG‑PFP:6mg

SEQ ID MO:31‑K(SH)18‑MAL‑2PEG‑PFP:9mg

SEQ ID N0:32‑K(SH)19‑MAL‑2PEG‑PFP:12mg
实施例10抗体缀合
MAC‑1及MAC‑2药物产品是通过使2.12.1.fx与Ang2结合肽缀合来制备。MAC‑1包含2.12.1.fx与SEQ ID NO:27‑K(SH)11‑MAL‑2PEG‑PFP，MAC‑2包含2.12.1.fx与SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP。计算各MAC的样品中每个2.12.1.fx分子的肽缀合数(见表1)。

表1:MAC‑l和MAC‑2的缀合谱
MAC‑1的产生

方案10：SEQ ID NO:27‑K(SH)11‑MAL‑2PEG‑PFP与抗体的赖氨酸侧链(Ab‑K‑Ab)反应：其中抗体是2.12.1.fx，MAC是MAC‑1
MAC‑2的产生


方案11：SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP与抗体的赖氨酸侧链(Ab‑K‑Ab)反应：其中抗体是2.12.1.fx，MAC是MAC‑2
实施例11优化基于PFP缀合的条件
进行一系列测试以建立引导缀合的理想反应条件。在各反应缀合结束时，利用琥珀酸盐及甘氨酸缓冲液猝灭反应，降低pH值至约5.5并猝灭任何游离的肽或肽/接头。MAC‑2分析是通过测量该MAC的完整分子量(MW)进行，在通过尺寸排阻层析柱分离蛋白质与盐及赋形剂之后，利用电喷雾飞行时间质谱仪检测该MAC的完整分子量。
温度
2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液在pH7.7下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.06M磷酸钠。肽/接头(SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP)于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以4.3:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在18°C、22°C或25°C下进行2小时。结果显示于表2。

表2:4.3:1的肽;抗体在0.06M磷酸盐中的反应温度
反应pH
2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液在pH 6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75或8.0下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.06M磷酸钠。SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP(L2)于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以4.3:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行2小时。结果显示于表3。

表3:4.3:1的肽:抗体在0.06M磷酸盐中的pH
2.12.1.fx抗体利用HEPES缓冲液在pH7.0、7.5及8.0下调整至2mg.ml‑1，终浓度为0.02MHEPES。SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP于DMSO中重建为10mg.ml‑1。以5:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行过夜。结果显示于表4。缀合量在pH8.0以上下降。

表4:5:1的肽:抗体在0.O2M HEPES缓冲液申的pH
缀合反应的持续时间
2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液在pH7.7下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.06M磷酸钠。SEQ ID NO:27/5PEG‑PFP于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以4.3:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行30、60、120、180、240、300、或2400分钟(表5)。

表5:4.3:1的肤:抗体在0.06M磷酸钠中的缀合反应持续时间
肽与蛋白质的摩尔比
2.12.1.fx抗体利用HEPES缓冲液在pH7.5下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.2M HEPES。SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以1:1、2:1、3:1、4:1、及5:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体(表6)，使反应在室温下进行至少2小时，但是高浓度的HEPES缓冲液导致降低的缀合量。

表6:0.2M HEPES中肽与蛋日质1:1至5:1的摩尔比
2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液在pH7.7下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.06M磷酸钠。SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以5:1、7:1、10:1、12:1、及15:1的摩尔比添加该肽/接头至2.12.1.fx抗体(表7)，使反应在室温下进行2小时以产生具有较高缀合量的MAC。

表7:0.06M磷酸钠中肽与蛋白质的7:1至l5:1的摩尔比
为了进一步优化2.12.1.fx抗体与SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP的摩尔比，2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液在pH7.7下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.06M磷酸钠。肽/接头于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以2.5、2.8、3.1、3.4、3.7、4.0、4.3、或4.6:1的摩尔比(表8)添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行2小时。

表8:0.06M磷酸钠中肽与蛋白质2.5:1至4.6:1的摩尔比
2.12.1.fx抗体利用HEPES缓冲液在pH7.0下调整至2mg.ml‑1，终浓度为0.02M的HEPES。SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP于DMSO中重建为10mg.ml‑1。以5、6、7、8、10:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行过夜。结果显示于表9。

表9:0.2M HEPES中肽与蛋白质5:1至lO:1的摩尔比不同蛋白质浓度下2.12.1.fx的缀合谱
分析不同浓度的2.12.1.fx与SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP的缀合谱。2.12.1.fx经浓缩至>50mg/mL，利用20mM乙酸钠、200m海藻糖pH5.5稀释至所需浓度，并添加60mM磷酸钠pH7.7。SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP利用50%丙二醇重悬，以4.3:1摩尔比与该抗体混合，在室温下反应过夜。所有样品经稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，以测定该蛋白质的缀合形式的数目及定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；作为通过肽的质量差异所分开的不同信号观察到多重缀合位点。多重缀合物质的相对定量通过测量该信号强度进行。表10显示2.12.1.fx在不同的抗体浓度时与肽的缀合谱。当抗体浓度10mg/mL至50mg/mL时，缀合发生在0‑5个加成的分布，平均为1.8或更多的加成。当抗体浓度0.5至5mg/mL时，缀合发生在0‑3个加成的分布，平均为1.5或更少的加成。

表10:抗体浓度的影响
反应缓冲液选择
2.12.1.fx抗体利用碳酸钠、硼酸钠、或磷酸钠缓冲液在pH7.7下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.05M磷酸钠。SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以1、2、3、4、或5:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行2小时。低反应pH导致减少的缀合量(表11)。

表11:缓冲液和pH变化
2.12.1.fx抗体利用硼酸钠及磷酸钠缓冲液在pH7.5、7.7及8.0下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.04M。SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP是于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以4.3:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行2小时(表12)。

表12·:缓冲液和pH变化
2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液在pH7.7下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.04M、0.06M、或0.08M磷酸钠。肽/接头(SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP)于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以4.3:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行2小时。结果显示于表13。

表13:磷酸盐浓度缓冲液组分对缀合的影响
丙二醇：2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液在pH7.7下调整至18mg.ml‑1，终浓度为0.06M磷酸钠。肽/接头(SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP)于丙二醇溶液中重建为20mg.ml‑1(缀合反应中5%丙二醇)。以4.3:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，并添加额外的0%至15%丙二醇(丙二醇的最终百分比为5%、10%、15%及20%)，使反应于室温下进行2小时。结果显示于表14。

表14:丙二醇在0.06M磷酸钠中的百分比
氯化钠：2.12.1.fx抗体利用HEPES缓冲液在有或无0.14M氯化钠存在时的pH7.0下调整至2mg.ml‑1，终浓度为0.02M HEPES。SEQ ID NO:27‑K115PEG‑PFP于DMSO中重建为10mg.ml‑1。以5:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行过夜。结果显示于表15。在氯化钠存在时，缀合量降低。

表15:在0.02M HEPES中氯化钠的浓度
HEPES：2.12.1.fx抗体利用HEPES缓冲液在pH7.0下调整至2mg.ml‑1，终浓度为0.2M及0.02M HEPES。SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP于50%丙二醇中重建为10mg.ml‑1。以5:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行2小时。结果显示于表16。缀合量在0.2M HEPES缓冲液中减少。

表16;HEPES浓度
DMSO：2.12.1.fx抗体利用磷酸钠缓冲液在pH7.7下调整至15mg.ml‑1，磷酸钠终浓度为0.06M，添加DMSO至终浓度30%。SEQ ID NO:27K11‑5PEG‑PFP于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1。以4:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在室温下进行2小时。结果显示于表17。

表17:0.06M磷酸钠中的DMSO
缀合反应参数的讨论
当效应物部分(在此实施例中为肽)与抗体的摩尔比降至低于约3.5:1时，缀合量减少，如表8所示。另外，表9显示增加该摩尔比导致增加的缀合量。增加每抗体的肽数通常减少抗体(本例中为2.12.1fx)与其抗原(本例中为IGF1R受体)的结合有效性，因此肽与抗体的摩尔比经优化以最大化抗体与抗原的结合和肽与同系物的结合。
也发现改变缀合缓冲液可改变缀合模式。含胺赋形剂通常较不适合，因为它们可与PFP基团反应。缓冲液诸如碳酸盐及硼酸盐可用于缀合，但被避免，因为它们的pKa(硼酸的pKa约为9，碳酸盐具有二个pKa为约6及约11)与MAC‑1和MAC‑2的最佳缀合pH7.7相差太远(表11)。缀合量不仅取决反应的化学条件，也与时间有关。在2小时后，大部分的PFP活化的肽已经与抗体反应或PFP Z*已经水解(表5)。
PFP活化的肽/接头快速地与赖氨酸侧链氨基反应。在pH6.5至8的磷酸盐缓冲液中进行缀合以通过降低抗体表面赖氨酸的电荷(蛋白质表面上的赖氨酸的pKa是约9.1至11.2)而增加其亲核性，如表3及4所示。
MAC‑1及MAC‑2的理想缀合条件如下述：2.12.1.fx抗体利用磷酸盐缓冲液调整至pH7.7，终浓度为0.06M磷酸钠。肽/接头(SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP)于丙二醇溶液中重建为10mg.ml‑1(在反应中丙二醇的终浓度为10%)。以4.3:1的摩尔比添加肽/接头至2.12.1.fx抗体，使反应在环境室温下进行2小时。利用琥珀酸盐及甘氨酸缓冲液猝灭该反应，降低pH值至约6.0并猝灭任何游离的肽。在一些方面中，反应物可被浓缩，且肽相关物质(诸如其中该接头通过与水溶剂的反应被水解的肽)及该反应混合物的其它成分(诸如PFP)可通过渗滤移除，例如使用50kDa的膜或尺寸排阻层析至琥珀酸盐、甘氨酸、氯化钠及海藻糖缓冲液pH5.5，30毫克/毫升。
上列的缀合条件经变化以决定各方法参数的范围。参数范围根据可能发生在缀合期间的变化设定，和/或被扩张直到观察到超过10%的物质群变化。表18总结导致类似的MAC‑2缀合谱的参数。

表18:针对MAC‑2优化的方法参数
实施例12抗体上的接头位点
通常，只有包含卤素苯基酯的Z*离去基团显示一致水平的定向缀合，不过方酸酯及NHS酯在某些情况下显示一些潜在用途。
在5种被提出的接头中只有2种(PFP酯及方酸酯)能成功地制备MAC。虽然假设亲电子接头通常能使肽(诸如Ang2肽(ABP))与抗体(诸如IGF1R抗体)缀合，但是氮杂环丁酮接头无法让肽与抗体以可接受的速率缀合(该反应需要显著过量的氮杂环丁酮接头且太过缓慢)。表19列出对于用来制备MAC的各种接头的一些考虑点。

表19:通过PFP酯和万酸酯的活化万法
实施例13缀合肽在抗体上的位置
MAC‑2药物制品分子是由1至4个与2.12.1.fx抗体(α‑IGF1R‑1)连接的SEQ ID NO:27分子分布组成，使用如方案11所示的5PEG‑PFP接头。此是通过测量该MAC‑2的完整分子量(MW)来测定，在通过尺寸排阻层析柱分离蛋白质与盐及赋形剂之后，利用电喷雾飞行时间质谱仪检测该MAC‑2的完整分子量。质谱分析数据显示2.12.1.fx抗体及3批MAC‑2的完整分子量(MW)如图3所示。图2A显示在缀合前的2.12.1.fx。此为显示单一MW的同样的(uniform)分子。MAC‑2批次显示与2.12.1.fx缀合的肽的分布；观察到1‑4个缀合加成(CA)。各种形式的相对量在不同批次之间是一致的，在各批次中最常见的形式具有2个肽(SEQ ID NO:27)与单个2.12.1.fx抗体连接。
通过还原2.12.1.fx抗体中的二硫键，轻链及重链被分开观察。二硫键还原是通过以20mM的三(2‑羧基乙基)膦(TCEP)处理完整的2.12.1.fx抗体进行。形成的重链及轻链的混合物如上述分析完整分子量。图3显示的数据提供关于ABP在2.12.1.fx上的位置的证据。大部分在MAC‑2批次中的轻链(>65%)是缀合的。大部分缀合的轻链包含1CA。亦有较低量观察到2CA。几乎所有被观察的重链(>90%)未经修饰，这表示很少缀合的肽位于重链上。
肽定位被用来测定准确的缀合位置。步骤如下：利用8M盐酸胍使一份MAC‑2变性，二硫键由TCEP还原，形成的半胱氨酸硫醇基经碘乙酰胺烷化。此经处理的蛋白质样品接着利用蛋白酶胰凝乳酶消化(1:125的蛋白酶:MAC重量比)。形成的胰凝乳酶消化肽在通过C8液相层析柱分离之后，分别通过质谱分析检测。通过此项技术，MAC‑2的重链及轻链在图4中的序列所示的位置(黑点)被胰凝乳酶消化成片段。接着利用液相层析质谱分析(LC‑MS)检测各肽的MW，以测定哪一个赖氨酸是由经缀合的肽所修饰。若片段是经缀合肽连接的修饰，其MW将随之移动。
重链的片段Y1、Y6、Y9、Y10、Y20、Y25、Y26、Y29、Y32、Y33、Y34、Y37、Y40及Y43包含Lys残基。其中，在Y6、Y10、Y25、Y33及Y37检测到肽缀合。轻链的片段Y3、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15及Y16包含Lys残基。其中，在Y3、Y13及Y15检测到缀合。
被称为Y15的轻链片段(自轻链N端起第15个胰凝乳酶消化片段)根据图5所示的资料被发现缀合。在MAC中明显地检测到经修饰的Y15的MW。在未缀合的2.12.1.fx样品中，并无修饰的Y15片段的证据。在MAC与2.12.1.fx两者中皆观察到未修饰的Y15片段。此片段的强度在2.12.1.fx样品中较高，因为所有此片段完全以未缀合的形式存在。当此片段被缀合至MAC‑2中时，观察到的未修饰的Y15的量降低，即在图5中可见较小面积的波峰。
在MAC‑2中的轻链片段Y15上所观察到的SEQ ID NO:27‑5PEG缀合的量是通过测量未修饰的Y15的减少波峰面积预测。在归一化信号强度以使未缀合的2.12.1.fx显示100%之后，3个独立批次的MAC‑2分别显示17%、27%及22%的未缀合的Y15片段。
观察到的Y15于MAC样品中的强度归一化至Y15于2.12.1.fx样品中的强度。在MAC‑2中75%至85%的Y15片段经测定为修饰的。由于MAC‑2主要包含1至2个缀合加成，这表示大部分在MAC‑2中的缀合是位于轻链片段Y15的2个K残基之一(K188或K190)。片段Y15在2.12.1.fx序列中的位置如图4所示。
胰蛋白酶消化被用于区别K188及K190(胰蛋白酶对于K及R的C端具有特异性)。由于胰蛋白酶不消化缀合的K残基，因此该酶消化依照哪一个K残基被缀合而产生不同的肽长度。检查来自胰蛋白酶消化的MAC‑2的LCMS数据提供肽与K188特异性连接的证据。未观察到修饰的K190的证据。
MAC‑2如上述利用TCEP还原及盐酸胍变性。利用Tris消化缓冲液将蛋白质浓度调整至2mg/ml及pH调整至7.8。纯化的胰蛋白酶以1:125蛋白酶:MAC重量比添加，并于30℃孵育4小时。样品储存于‑20℃直到LCMS分析。片段样品利用水/乙腈+0.1%TFA移动相在C18反相柱上分离。片段的检测利用UV214nm及ESI‑TOF质谱分析进行。所有数据分析皆利用MassLynx软件进行。
胰蛋白酶消化MAC‑2时所形成的片段依肽缀合的位点而定。赖氨酸是缀合的靶残基。图2至5的数据显示肽结合的主要位点是K188或K190。下面的方案显示当在K188或K190缀合时所发生的胰蛋白酶消化反应。

两个怀疑为可能的消化片段的化学结构如下:

图6显示当K188与肽缀合时，胰蛋白酶消化肽的选择离子LCMS层析数据。图7显示当K190经缀合肽修饰时，胰蛋白酶消化片段的选择离子LCMS层析数据。这些资料指出，只有K188经缀合；此情况导致在MAC‑2中检测到显著信号，但在2.12.1.fx对照实验中并无信号存在。来自K190的修饰的结果不提供任何相较于阴性对照具有独特性的数据。
和预期不同的是，肽/接头似乎优先与2.12.1.fx的轻链的K188(SEQ ID NO:15的K80)连接。意外的好处是2.12.1.fx抗体的Fc部分不受影响。测试显示导致的MAC‑2的PK大约等于未缀合的2.12.1.fx的PK。混杂、非特异地与抗体上的多位点缀合可导致PK降低的产物。由MAC‑1及MAC‑2所示范的本发明的定向缀合提供最小化一些可由混杂、非特异性缀合造成的可能有害效应(包括降低PK)的好处。
为了建立该方法的可再现性，重复进行该实验。MAC‑2经稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，以测定该蛋白质的缀合形式的数目及定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；通过经缀合的肽/接头的质量差异所分开的不同信号观察到多重缀合位点。多重缀合物质的相对定量由测量该信号强度进行。图8显示MAC‑2的代表性图谱；用于定量的计算如表20所示。完整MAC‑2的平均缀合加成利用下式计算为2.11：SUMPRODUCT(缀合加成数(CA)，每CA百分比)。此实施例显示肽的缀合发生为0至4个肽加成的分布，最大形式是2个肽加成，且肽加成的平均数为2.11。由多人重复分析显示该缀合谱是一致且可再现。

表20:缀合加成的加权平均:2.11
肽缀合的程度在2.12.1.fx的轻链及重链上分开检测。MAC‑2利用盐酸胍及二硫苏糖醇来变性及还原二硫键。形成的游离轻链及重链利用LCMS分析以测定各自的缀合谱。图9显示各链的代表性图谱；用于定量的计算如表21所示。经还原的重链MAC‑2的平均缀合加成(平均CA)经计算为0.14，且经还原的轻链MAC‑2的平均CA经计算为0.86，使用下式计算：SUMPRODUCT(缀合加成数(CA)，每CA百分比)。这些数据显示在轻链上的缀合位置数较高；最丰富的轻链形式包含一个肽加成，且轻链包含平均0.86个肽加成。在重链上的缀合观察到显著较低的量。由多人重复分析此实验显示该缀合谱是一致的且可再现。

表21:鉴别特定缀合位置的MAC‑2的肽定位特征
MAC‑2经二硫苏糖醇还原，且半胱氨酸残基由碘乙酰胺的羧基甲基化进行烷化。使用胰凝乳酶进行蛋白水解消化。溶液中经消化的片段利用液体层析质谱(LCMS)分析。各片段在C18HPLC柱中分离，其正确质量于四级杆飞行时间(Q‑ToF)质谱仪中测量。所得到的片段质量被用于识别未经修饰的片段或经缀合肽修饰的片段。此实验通过聚焦于包含赖氨酸残基的胰凝乳酶消化片段进行评估，因为这些是肽缀合的可能位点。表22显示所有所述片段的列表。空白代表未利用该项技术检测的片段。被观察到具有肽修饰物的检测片段被认为是潜在的缀合位点。
表22的表格字段解释如下：
·片段编号：自N端的胰凝乳酶消化片段编号；联合片段(例如Y1‑2)表示缺少切割位点。
·开始/结束：自N端的片段位置的编号。
·肽质量(Da)：以道尔顿示出的片段的理论质量。
·滞留时间(对照/分析)：在LCMS片段定位实验中层析滞留/洗脱的时间。
·MS信号强度(对照/分析)：由MS观察到的观察信号的强度。
·质量误差‑ppm(对照/分析)：片段的理论与观察质量的比较；数值>10，特别是越接近零(0)显示越高的质量正确性。
·修饰物：片段的潜在共价加成；肽为Lys残基的抗体结合片段，CAM为半胱氨酸残基的羧基甲基化。
·星号表示经修饰(例如缀合)版本的个别片段。
·Pep表示经缀合的肽。
肽与Y15片段的定向缀合通过定量缀合量显示。下列分析在各个被观察到在该2.12.1.fx参照产物的肽定位实验中具有缀合的肽片段上进行。观察到的在未缀合的对照(2.12.1.fx抗体支架‑无缀合)中未修饰的肽相较于缀合的参照产物(MAC‑2)的信号强度的比例显示于表23。使用未经修饰的信号是因为可以直接比较各样品中相同的肽信号。举例来说，未缀合的肽将预期在对照与产物样品中具有相同的观察信号强度，因此导致比例为一(1)。缀合将导致产物样品中未修饰肽的观察量减少，其将以超过一(1)的比例表示。表23中的数据进一步被归一化以校正对照与产物之间的样品及实验差异。表23显示轻链肽Y15相较于其它各种缀合肽以显著较高的量缀合。这表示缀合以定向方式发生且不随机分布在K残基之间。




表23:肽与轻链上的Yl5片段的定向缀合
实施例13Ang1‑4结合ELISA
高结合性半孔板经重组人Ang1、人Ang2、小鼠Ang3或人Ang4(所有试剂来自R&D Systems，250μg/ml)的50ul PBS溶液包被，并于4℃孵育过夜。孔板以清洗缓冲液清洗3次(0.1%Tween20，PBS，pH7.4)，以Superblock150μl/孔于室温中封闭1小时。用清洗缓冲液清洗孔板3次。在清洗后，准备给药溶液(dosing solution)(范围：0.005至50,000ng/ml)，并将其添加至孔板及孵育1小时，以允许该化合物与该孔板上包被的Ang家族成员结合。各种血管生成素的阳性对照包括拮抗各家族成员的单克隆或多克隆抗体(由R&D Systems供应)。清洗孔板3次，添加50μl的HRP缀合的抗人IgG(0.8μg/mL)(或用于阳性对照的物质)，于室温中孵育1小时。清洗孔板3次，添加50μl(25μl TMB+25μl H2O2)底物溶液，孵育1至5分钟。加入25μl的2M H2SO4以停止显色。测量检测波长450nm及校正波长540nm的吸收值(OD450nm)。
实施例14Ang2反向竞争试验
在Ang2反向竞争ELISA中，使用人Tie2‑Fc、血管生成素‑2蛋白、生物素化抗人Ang2抗体、链霉抗生物素蛋白HRP(R&D Systems、及来自皮尔斯(Pierce)公司的TMB底物。高结合性半孔板经Tie2‑Fc(50ng/孔)的50μlPBS溶液包被，并于4℃孵育过夜。孔板以清洗缓冲液清洗3次(0.1%Tween20，PBS，pH7.4)，以Superblock150μl/孔于室温中封闭1小时。清洗孔板3次。在清洗后，添加50μl的含Ang2结合肽化合物(50nM，5x连续稀释)与50ng/ml(0.83nM)的Ang2的Superblock溶液，在室温中孵育1小时。清洗孔板3次，添加50μl的含1μg/mL的生物素化抗Ang2检测抗体的Superblock溶液，于室温中孵育2小时。清洗孔板3次，添加50μl的链霉抗生物素蛋白HRP(1:200稀释于Superblock中)，于室温中孵育20分钟。清洗孔板3次，添加50μl(25μl TMB+25μl H2O2)底物溶液，孵育20至30分钟。加入25μl的2M H2SO4以停止显色。测量检测波长450nm及校正波长540nm的吸收值(OD450nm)。利用Prism4软件中的非线性S形剂量响应曲线拟合功能计算IC50的值(50%抑制Ang2与Tie2的结合)。
在某些实施例中，Ang2‑h38C2‑IgG1被用来作为对照。Ang2‑h38C2的产生及结构在专利WO2008056346中有详细说明(为化合物43)，该专利的内容并入本文，特别参照有关化合物43的产生的方面。简言之，该结构如下：

其中接头与抗体的结合位点的K99(根据Kabat编号的K93)的ε‑氨基共价连接，且抗体是h38C2‑IgG1(SEQ ID NO:51及52)(WO2008/056346的SEQ ID NO:189及SEQ ID NO:190)。
实施例15IGF1R竞争试验
在IGF1R竞争ELISA中，使用重组人IGF1R(R&D Systems)、生物素化IGF1(GroPep Ltd.)、链霉抗生物素蛋白‑聚‑HRP20(SDT)、Superblock、及TMB底物(Pierce)。高结合性半孔板经IGF1R(62.5ng/孔)的50ul PBS溶液包被，并于4℃孵育过夜。孔板以清洗缓冲液清洗3次(0.1%Tween20，PBS，pH7.4)，以Superblock150μl/孔于室温中封闭1小时。用清洗缓冲液清洗孔板3次。在清洗后，添加50μl的含IGF1R结合化合物(1μM，5x连续稀释)与100ng/mL(13.3nM)的生物素化IGF1的Superblock溶液，在室温中孵育1小时。清洗孔板3次，添加50μl的链霉抗生物素蛋白‑聚‑HRP20(1:5000稀释于Superblock中)，于室温中孵育20分钟。清洗孔板3次，添加50μl(25μl TMB+25μl H2O2)底物溶液，孵育5至10分钟。加入25μl的2M H2SO4以停止显色。测量检测波长450nm及校正波长540nm的吸收值(OD450nm)。利用Prism4软件中的非线性S形剂量响应曲线拟合功能计算IC50的值(50%抑制IGF1与IGF1R的结合)。
实施例16IGF1诱导IGF1R自体磷酸化抑制试验
在IGF1R自体磷酸化抑制试验中，使用表达人IGF1R的工程化小鼠3T3细胞，且该磷酸化是由细胞信号技术(Cell Signaling Technologies)公司的磷酰基‑IGFI受体β(Tyr1131)夹心式ELISA试剂盒#7302测定。表达人IGF1R的完整细胞被接种(5.0×104细胞/孔)于96孔组织培养处理圆底板，允许其于50μL的生长培养基中附着过夜(37℃，5%CO2，生长培养基是由含10%FBS、2mM L‑谷氨酰胺、青霉素‑链霉素及500μg/mL的遗传霉素(Geneticin)的DMEM组成)。16小时后，吸取移除生长培养基，每孔添加50μL的含有IGF1R结合化合物(1mM，8x连续稀释)与100ng/mL(13.3nM)重组人IGF1的新的生长培养基，在室温中孵育10分钟。板通过吸掉液体再添加每孔100μL的冰冷PBS进行清洗。立刻吸掉所述冰冷PBS，接着添加60μL的裂解缓冲液(从裂解缓冲液开始，所有下列试剂皆为Cell Signaling Technologies所制造供应的商用试剂盒的一部分，该试剂盒经设计以定量IGF1R的酪氨酸1131的磷酸化)至各孔，于室温中摇晃孵育10分钟。该孔板接着在4℃离心5分钟。上清液(每孔50μL)接着被移除并添加至预先包被磷酰基‑IGF1受体β(Tyr1131)兔抗体且含有每孔50μL的样品稀释剂的96孔板。该孔板于4℃轻微摇晃孵育过夜16小时。在孵育之后，该孔板以清洗缓冲液清洗4次，在每孔中添加100μL的人IGF1受体检测抗体(小鼠来源)于37℃反应1小时。以清洗缓冲液清洗该孔板4次，在每孔中添加100μL的连接HRP的小鼠IgG二抗于37℃反应30分钟。清洗该孔板4次，在各孔中添加100μL的TMB底物并孵育30分钟。加入50μl的2M H2SO4以停止显色。测量检测波长450nm及校正波长540nm的吸收值(OD450nm)。不论有无IGF1处理的内部对照组皆证实该磷酸化事件的特异性及测定该跨膜信号转导的抑制%。利用Prism4软件中的非线性S形剂量响应曲线拟合功能计算EC50的值(达到一半最大信号的浓度)。
实施例17IGF1R下调试验
在IGF1R下调中，使用人结肠腺癌Colo205细胞，IGF1R于细胞表面的表达是由流式细胞分析测定。接种5×104细胞/孔于生长培养基(RPMI，10%胎牛血清，谷氨酰胺)的组织培养96孔板于37oC下以化合物滴定处理3小时。用PBS润洗细胞，利用CellStripper使细胞脱离，并转移至新鲜的96孔板。用含有2.5%胎牛血清的PBS清洗细胞3次。细胞与经藻红素缀合的小鼠抗人IGFIR单克隆抗体(R&D FAB391P，10μl/5×10‑5cells)于暗室中孵育1小时。接着用含有2.5%胎牛血清的PBS清洗细胞3次。细胞表面上的IGF1R存在是通过使用FACSArray的流式细胞分析测定，利用FloJo软件分析数据。受体数量通过拟合数据至利用QuantiBRITE PE珠(BD340495)产生的标准曲线计算。该资数据被报告为测试化合物比上阴性对照hIgG2的下调百分比。
结果及讨论
MAC‑2与人Ang2特异性结合的能力显示于图10。MAC‑2及Ang2‑h38c2能与人Ang2结合，但无法与人Ang1、人Ang4或小鼠Ang3结合，这显示对Ang2而非其它血管生成素家族成员的高度特异性。
MAC‑1及MAC‑2能与Ang2结合以防止Ang2与Tie2结合，如Ang2竞争试验中所示(图11及表24)。令人意外的是，相较于Ang2‑h38c2，MAC‑1及MAC‑2二者皆显示竞争结合Ang2的能力增加。在证实该缀合MAC结合并抑制Ang2与Tie2的结合后，其与IGF1竞争与IGF1R结合的能力利用IGF1R竞争试验测定(图12)。MAC‑1及MAC‑2和母体抗IGF1R抗体(2.12.1.fx)一样有效地与IGF1竞争与IGF1R的结合。MAC‑1及MAC‑2显示低纳摩尔范围的IC50的值。相对地，在某些其它抗IGF1R抗体的测试中，观察到与肽的缀合干扰抗体与IGF1R相互作用的能力(数据未显示)。
为了证实在该竞争试验中观察到的IGF抑制转换成抑制IGF诱导的信号转导事件，使用基于细胞的功能测试来测定在IGF刺激后IGF1R自体磷酸化的抑制(图13及表24)。MAC‑1及MAC‑2具有和母体抗IGF1R抗体(2.12.2.fx)类似的活性；因此，与有限Ang2肽缀合似乎并不改变该MAC固有的结合及抑制作用。
除了抑制IGF1R的自体磷酸化之外，抗IGF1R抗体亦造成IGF1R的内化作用及降解，导致受体下调。此行为在处理的2小时内观察到，并维持24小时。因此测试该MAC下调在人结肠癌细胞系Colo205上的IGF1R量的能力。细胞于培养基中以MAC化合物滴定处理3小时。收集细胞，利用流式细胞分析测定IGF1R的表面表达。测定IGF1R下调相较于阴性对照hIgG2的百分比(表24)。MAC‑1及MAC‑2具有和母体IGF1R抗体(2.12.1.fx)类似的IGF1R下调活性。

表24:MAC‑I及MAC‑2结合和调节IGF1R和Ang2的能力
所显示的是，每抗体缀合2个肽对于IGF1R自体磷酸化及下调的效应是最佳的，每抗体缀合超过或少于2个肽皆减弱该MAC达成这些功能的能力。
为了评估每抗体的肽的数目对于2.12.1.fx调节IGF1R活性的能力的影响，制备2种MAC‑1样品，其中反应条件经设定以提供减少的缀合(MAC‑1低)或增加的缀合(MAC‑1高)(表25)。分析所述样品下调及磷酸化IGF1R的能力(表25)。MAC‑1高相较于MAC‑1低在有效调节IGF1R途径的能力上有显著差异。相较于每抗体缀合约2个或少于2个肽，每抗体缀合超过约2个肽限制该MAC抑制IGF1R自体磷酸化及诱导IGF1R下调的二种功能活性。因此，为了有效地以一种双功能实体同时调节二种不同的生物途径，每抗体缀合约2个肽可能是理想的(依肽及靶的药物动力学特性而定)。

表25:MAC‑l高及MAC‑l低的分析
实施例18体内药物动力学
实验方法
经验证的直接结合酶联免疫吸附测定(ELISA)方法被用于测量小鼠及猴血清中的血清MAC量。简言之，在样品中的MAC与被动吸附在微量盘上的IGF1R或Ang2结合，使用辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG与显色底物以产生与血清样品中的MAC‑2的浓度成比例的信号。在小鼠血清中MAC‑2的定量上限及下限为26.0及1000ng/ml，食蟹猴(cynomolgus monkey)的上限及下限为52.0及2000ng/ml。Ang2及IGF1R反向ELISA
高结合性半孔板经IGF1R(62.5ng/孔)或Ang2(6.25ng/ml)的50ul PBS溶液包被，并于4℃孵育过夜。孔板以清洗缓冲液清洗3次(0.1%Tween20，PBS，pH7.4)，以Superblock150μl/孔于室温中封闭1小时。用清洗缓冲液清洗孔板3次。在清洗后，准备给药溶液标准物(范围：3.91至500ng/ml)，将血清样品添加至孔板及孵育1小时，以允许MAC复合物与该孔板上包被的Ang2或IGF1R结合。清洗孔板3次，添加50μl的HRP缀合的山羊抗人IgG(0.8μg/mL)，于室温中孵育1小时。清洗孔板3次，添加50μl(25μlTMB+25μl H2O2)底物溶液，孵育1至5分钟。加入25μl的2M H2SO4以停止显色。测量检测波长450nm及校正波长540nm的吸收值(OD450nm)。MAC复合物的血清浓度利用标准曲线计算。由ELISA测定的MAC复合物浓度被作成时间函数的图。利用WinNonlin version4.1(Pharsight Corporation)进行进一步的数据分析，以测定MAC复合物的β半衰期(T1/2)及曲线下面积(AUC)。
小鼠
PK试验利用开始给药时体重大约20至22克的Swiss Webster公鼠(CFW,Charles River,Hollister,CA)进行。MAC化合物经静脉内施用。在下列时间点中的每个时间点向4只小鼠采集血液样品：0.08、0.5、1、3、5、7及24小时。采集样品前，在所有血液试管中加入蛋白酶抑制剂混合物。使血液在冰上凝血30分钟，接着于4°C以12000rpm离心5至10分钟以收集血清，并立刻储存于‑80°C直到通过ELISA分析。给药溶液被用于建立由Ang2或IGF1R反向ELISA进行血清样品分析的标准曲线。各血清样品的等分利用Ang2或IGF1R反向ELISA分析。
猴
MAC‑2的药物动力学特性经测定。2只雄性食蟹猴(长尾猕猴(Macaca fascicularis))被用于本试验；MAC‑2是以10 mg/kg的剂量经静脉注射(推注)施用。所有动物在第一天给药后5分钟、15分钟、1小时、4小时及8小时观察，之后每天二次观察任何对治疗的反应。在第1、2、3、4、5、7及14天测量并记录体重。用于毒理动力学分析的血液样品在指定的时间点收集，分离血清并储存于‑80°C。
在实验期间并未观察到可能与MAC‑2治疗有关的不良临床症状。体重纪录令人满意。在各时间点(0.08至504小时)自每只动物的股静脉收集大约1.0 mL的血液样品至空白凝血管。血液样品收集后静置于室温下1小时，接着在4°C下以3000 rpm离心10分钟。形成的血清样品在分析前被储存于大约‑80°C。
结果
探索性非GLP药物动力学(PK)试验是于Swiss Webster雄性鼠及雄性食蟹猴进行(表26及27)。分析MAC的Ang2及IGF1R结合活性。在小鼠中，MAC‑1及MAC‑2显示与母体抗IGF1R抗体类似的驻留时间，β相半衰期为383小时至397小时。MAC‑1及MAC‑2 Ang2结合能力证明与Ang2‑h38c2类似的驻留时间，在小鼠单一剂量IV试验中具有105至120小时的β相半衰期。在食蟹猴中，MAC‑2显示比母体抗IGF1R抗体稍微较短的驻留时间，β相半衰期为100.4小时。MAC‑2 Ang2结合能力显示与Ang2‑h38c2类似的驻留时间，β相半衰期为97.8小时。

表26:小鼠中以10mg/mk经IV施用MAC的单一剂量PK

表27:食蟹猴中以10mg/mk经IV施用MAC的单一剂量PK
实施例19体内药理学
实验方法
MAC‑2的抗肿瘤活性于Colo205(人结肠腺癌)或MDA‑MB‑435(黑色素瘤)异种移植模型中评估。Colo205或MDA‑MB‑435细胞利用10%FBS RPMI培养基培养，3×106细胞于0.1ml Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中被皮下注射至5至7周龄nu/nu雌性鼠的右上侧腹，使其建立200至400mm3的体积后才开始治疗。一旦肿瘤建立后，小鼠被随机分配至具有相同肿瘤体积的治疗组(n=9至10/组)，MAC‑2治疗通过腹膜内(IP)注射施用一周一次。在组合试验中，额外的抗癌剂通过IP注射伴随MAC‑2治疗每周一起施用。在治疗期间，肿瘤体积每周利用光标卡尺测量一次或二次，体重每周测量一次。在一些试验中，当载体治疗对照组的肿瘤体积达到2000mm3时，所有小鼠皆以CO2窒息法安乐死，接着切除肿瘤、秤重及处理以供进一步组织学和/或免疫化学评估。在假性存活试验中，当各治疗组的平均肿瘤体积超过2000mm3时，小鼠以CO2窒息法安乐死，接着切除肿瘤及秤重。
结果
在Colo205(人结肠腺癌)异种移植模型中进行的实验如图14A及15A所示。每周施用Ang2‑h38c2或抗IGF1R抗体(2.12.1.fx)抑制Colo205肿瘤生长。每周施用Ang2‑h38c2与抗IGF1R抗体的组合显示在抑制Colo205肿瘤生长上的加成好处。每周单独施用MAC‑2显示与该组合类似的好处(图14A)。在不同的试验中，MAC‑2剂量依赖性地抑制Colo205肿瘤生长及终肿瘤重量(图15A、B)。
在第28天，化合物治疗小鼠被处死，切除肿瘤并进行快速冷冻。为了评估MAC‑2的抗血管生成效应，在经载体(PBS)或MAC‑2(剂量反应介于0.3mg/kg‑10mg/kg)治疗的Colo205结肠腺癌异种移植肿瘤的冷冻切片上以免疫组织化学评估肿瘤微血管密度。肿瘤以抗CD31的小鼠特异性单克隆抗体染色，在每个肿瘤的3个切片中的5个区域定量免疫反应性(图15C)。MAC‑2(10mg/kg，一周一次)相较于载体治疗组显著减少肿瘤微血管密度约42%，证实MAC‑2治疗的抗血管生成活性。
为了探讨MAC‑2在体内是否同时以Ang2及IGF1R为靶，在二个经载体、Ang2‑h38c2、IGF1R抗体(2.12.1.fx)或MAC‑2(剂量反应介于0.3mg/kg至10mg/kg)治疗的独立Colo205异种移植肿瘤中评估MAC‑2对Ang2及IGF1R表达量的影响。自冷冻切除的肿瘤制备裂解物，以ELISA定量Ang2及IGF1R免疫反应性。相较于载体治疗组，MAC‑2治疗以剂量依赖方式(1、3及10mg/kg)显著减少Ang2及IGF1R免疫反应性(图14B、15D及15E)。MAC‑2对IGF1R量的影响类似在IGF1R拮抗抗体(2.12.1.fx)所观察到的结果(图14B)。此外，磷酸化IGF1R的量在经MAC‑2治疗的动物的肿瘤中减少(数据未显示)。在这些肿瘤的固定切片上的免疫荧光亦证实IGF1R及pIGF1R的减少(数据未显示)。这些数据显示MAC‑2治疗在Colo205异种移植模型中影响Ang2及IGF1R二种途径。
在3个单独的试验中，MAC‑2治疗相较于载体(PBS)、Ang2‑h38c2及IGF1R抗体(2.12.1.fx及2.13.2)导致持续肿瘤抑制(图16A、16B、16C)。抗IGF1R抗体2.13.1在WO02/053596中被称为SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47，含有较少的各信号序列。MAC‑2的肿瘤抑制与Ang2‑h38c2及2.12.1.fx的组合类似，且高于Ang2‑h38c2及2.13.2的组合(图16C)。MAC‑2治疗不影响体重增加(数据未显示)，小鼠在整个试验期间呈现良好健康状况。允许各组动物的肿瘤生长至2000mm3以作为假性存活试验。Ang2‑h38c2及抗IGF1R抗体两个治疗组必须在第48天停止；然而，MAC‑2治疗肿瘤(3至10mpk)到第94天该试验结束时仍在2000mm3以下。
MAC‑2的抗肿瘤疗效亦在MDA‑MB‑435黑色素瘤异种移植模型中评估。每周施用MAC‑2(3及20mg/kg IP)导致MDA‑MB‑435模型中的肿瘤生长显著减少40%(第67天)(图17)。因此，MAC‑2在二个不同的人异种移植肿瘤模型中显示显著抗肿瘤疗效。
实施例20各种抗体的肽缀合谱
分析多种不同抗体与肽的缀合谱，分别使用SEQ ID NO:27及5PEG作为示范性肽及接头。所有测试抗体皆为具清楚定义及表征的抗原相互作用的人或全人源化IgG抗体。hAbλ测试包含CLλ，然而2.12.1.fx、mAbκTest1、h28C2‑IgG1(SEQ ID NO:51及52)和h38C2‑IgG2(SEQ ID NO:53及54)各包含CLκ。各抗体经缓冲液交换为20mM HEPES，pH7.0，浓缩成5mg/mL至20mg/mL。SEQ ID NO:27/K11‑5PEG‑PFP利用50%丙二醇重悬，以4.3:1摩尔比与所述相关抗体混合，在室温下反应至少2小时。所有样品稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，测定蛋白质的缀合形式的数目并定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；作为通过结合肽的质量差异所分开的不同信号观察多重肽缀合位点。多重肽缀合物质的相对定量是由测量该信号强度进行。表28显示各种抗体的肽缀合谱。
对包含CLκ的抗体而言，肽缀合发生在介于0至4个肽加成的分布，最大形式为2至3个肽加成。相对地，对包含CLλ的抗体(hAbλTest)而言，肽的缀合发生在介于0至4个肽加成的分布，最大形式为1至2个肽加成。
肽缀合的程度在轻链及重链上分开检测。各样品利用盐酸胍及二硫苏糖醇进行变性及还原二硫键。形成的游离轻链及重链利用LCMS分析以测定各自的缀合谱。在各种抗体的轻链及重链上的肽缀合谱显示于表28。在2.12.1.fx和hAbκTest1上的数据显示缀合位置在轻链上较多；含量最多的轻链形式包含1个肽加成。在重链上的缀合观察到显著较低的量。在h38C2‑IgG1及h38C2‑IgG2上，轻链及重链上所观察到的缀合量类似，稍微偏向轻链上的缀合。在含CLλ的抗体(hAbλTest)上，大部分的缀合发生在重链上，在轻链上观察到低量的缀合。

表28:各种抗体的缀合谱
抗体2.12.1.fx、hAbλTest及hAbκTest1各自在缀合之后检测，以测定缀合加成对于抗体支架保留其受体结合能力的影响(相较于天然mAb)(表29)。结果显示肽与测试抗体的定向缀合似乎不改变该抗体的结合。

表29:抗体在缀合前后与天然抗原的结合实施例21IgG2‑κ的代表性抗体的肽缀合谱
分析具有39聚体肽的IgG2κ抗体(hABκTest2)的缀合谱。该抗体被浓缩成8mg/mL，并经缓冲液交换至40mM HEPES pH8.0。肽利用100%DMSO重悬，以5.0:1摩尔比与该抗体混合，在室温下反应过夜。所有样品稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，以测定蛋白质的缀合形式的数目及定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；作为通过结合肽的质量差异所分开的不同信号观察多重肽缀合位点。多重肽缀合物质的相对定量由测量该信号强度进行。表30显示具有39聚体肽的hAbκTest2肽缀合谱。肽缀合发生在介于0至4个肽加成的分布，平均为2.03个肽加成，且与CLκ‑K188上的定向缀合一致。

表30:39聚体肽和hAbκTest2的缀合谱
在单独的实验中，该39聚体肽是通过上述的MAL‑2PEG‑PFP以不同摩尔浓度与h38C2‑IgG2缀合。此外，测定与该39聚体的同源受体的结合。结果(表31)显示与在K188‑CLκ的定向缀合一致。另外，增加每抗体的肽平均数不会大幅增加与靶的整体结合。此显示在某些情况中，增加每抗体的缀合可能不会增加靶结合，这是本发明的好处之一；控制每抗体缀合的肽数目有助于达成每单位肽的最大靶结合。

表31:39聚体肽和h38C2‑lgG2的缀合谱
实施例22生物素缀合至2.12.1.fx Fab
生物素‑2.12.1.fx
分析2.12.1.fx的Fab区(SEQ ID NO:50及4)与PFP‑生物素的缀合谱。抗体Fab被浓缩至20mg/mL，经缓冲液交换至20mM乙酸钠+200mM海藻糖pH5.5，添加60mM磷酸钠pH7.7。PFP‑生物素利用100%DMSO重悬，以连续摩尔比与该抗体混合后在室温下反应过夜。所有样品稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，以测定该缀合形式的数目及定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；作为通过结合肽的质量差异所分开的不同信号观察多重肽缀合位点。多重缀合物质的相对定量是由测量该信号强度进行。表32显示不同摩尔比的2.12.1.fx Fab与PFP‑生物素的缀合谱。该缀合随着摩尔比的增加发生在介于0至2加成的分布。每抗体较低的分子数是与之前结果一致，根据所使用的摩尔比。有效地显示该方法通过改变一或多种反应参数来控制缀合量的弹性。
生物素‑PFP

表32:坐物素与2.12.1.fx Fab的缀合谱
实施例23生物素缀合至h38C2‑IgG1
生物素‑h38C2‑IgG1
抗体h38C2‑IgG1以HEPES缓冲液pH7.5调整至20mg/mL，终浓度为0.02M。生物素‑PFP经水重建为10mg/mL，以5:1的摩尔比被添加至h38C2‑IgG1，在室温下反应2小时。未反应的PFP‑生物素通过尺寸排阻层析移除，并经缓冲液交换为组氨酸、甘氨酸及蔗糖缓冲液pH6.5。该样品经稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，测定蛋白质的缀合形式的数目及定量。表33显示h38C2‑IgG1与生物素‑PFP的缀合谱。h38C2‑IgG1的缀合发生在介于0至3CA的分布，平均为1.1个缀合。在理想化反应条件后，有可能增加缀合。h38C2‑IgG1上的VH‑K99(根据Kabat编号为K93)当与催化抗体测试化合物CATC‑1反应并通过反向层析分析时，其反应性经证实为>95%。

表33:生物素与h38C2‑lgG1的缀合
实施例242.12.1.fx及K188、K190突变体的缀合谱
根据肽定位地图，在Y15片段上有二个Lys。为了区别活性缀合位点，K188及K190被分别或一起突变成R。突变是根据QuickChange定点突变形成试剂盒(Stratagene)中的说明产生。突变通过寡核苷酸引物导入并以DNA测序证实。该经突变的单克隆抗体被瞬时表达于HEK293细胞，利用A蛋白亲和柱纯化。该纯化的单克隆抗体可利用MS进行表征。SEQ ID NO:33、34及35显示2.12.1.fx IGF1r突变轻链序列。
该抗体经缓冲液交换至0.02M HEPES缓冲液pH7.5或6.5，浓度为2mg/mL。若pH为6.5，该抗体接着添加60mM磷酸钠pH7.7。SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP利用50%丙二醇重悬，以4.3:1摩尔比与该蛋白质混合，在室温下反应过夜。所有样品稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，测定该蛋白质的缀合形式的数目及定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；作为通过结合肽的质量差异所分开的不同信号观察多重肽缀合位点。多重蛋白质缀合物质的相对定量是由测量该信号强度进行。表34显示未经修饰的2.12.1.fx、2.12.1.fx‑K188R(轻链：SEQ ID NO:33)、2.12.1.fx‑K190R(轻链：SEQ ID NO:34)、及2.12.1.fx‑K188R‑K190R(轻链：SEQ ID NO:35)的缀合谱。K188R突变显示减少缀合。K190R和未经缀合的2.12.1.fx具有类似缀合。MAC‑2的缀合低于在其它测试中所观察到的，因为使用组合的HEPES/磷酸盐缓冲液。

表34:2.12.1.fx、K188及K190突变体的缀合谱
实施例252.12.1.fx突变体以阐述K188上的定向缀合机制
检查靠近K188的残基。H189侧链非常靠近K188的ε‑氨基。由于His通常与质子转移反应有关，因此H189非常有可能为K188缀合所需。为了了解H189在K188定点缀合的角色，我们用丙氨酸取代组氨酸以消除咪唑环。
制备D151A及D151A/H189A突变以研究D151于定点缀合的角色及D151及H189的组合效应。
突变是根据QuickChange定点突变形成试剂盒(Stratagene公司)中的说明产生。突变通过寡核苷酸引物导入并以DNA测序证实。该经突变的单克隆抗体被瞬时表达于HEK293细胞，利用A蛋白亲和柱纯化。该经纯化的单克隆抗体可利用MS进行表征。产生下列2.12.1.fx轻链突变体：D151A(SEQ ID NO:36)、K188A(SEQ ID NO:37)、H189A(SEQ ID NO:38)、K190A(SEQ ID NO:39)及D151A/H189A(SEQ ID NO:40)。
这些抗体各自经缓冲液交换至20mM乙酸钠、200m海藻糖pH 5.5，浓度为20mg/ml。所述蛋白质接着添加60mM磷酸钠pH 7.7。SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP利用50%丙二醇重悬，以4.3:1摩尔比与该抗体混合，在室温下反应过夜。所有样品稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，以测定该蛋白质的缀合形式的数目及定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；作为通过结合肽的质量差异所分开的不同信号观察多重肽缀合位点。多重缀合物质的相对定量是由测量该信号强度进行。
表35显示2.12.1.fx、2.12.1.fx‑D151A、2.12.1.fx‑K188A、2.12.1.fx‑H189A、2.12.1.fx‑K190A、及2.12.1.fx‑D151A/H189A突变体的缀合谱。所有突变体相较于未经修饰的2.12.1.fx抗体皆显示减少的平均缀合量，除了K190A以外，其维持定向缀合。
缀合的程度在轻链及重链上分开检测。各样品是利用盐酸胍及二硫苏糖醇进行变性及还原二硫键。形成的游离轻链及重链利用LCMS分析以测定各自的缀合谱。在2.12.1.fx及突变体的轻链及重链上的缀合谱显示于表35。所有表中列示的突变体显示相较于该未经修饰的2.12.1.fx在轻链上减少的缀合量，除了K190A以外。所述突变体的重链缀合量与未经修饰的2.12.1.fx类似。

表35:MAC‑2及K188A、D151及H189突变体的缀合谱
实施例26λ/κ取代
在hAbλTest1中的LCλ被LCκ取代以测定是否能增加轻链衍生的水平、定向和/或控制。该LCλ/LCκ结构域取代杂合构建体是利用重叠PCR产生。该LVλ及LCκ是分别利用hAbλTest及κ单克隆抗体轻链作为模板以经PCR扩增。这2种PCR产物经混合以作为模板；在重叠PCR反应中使用hAbλTest1正向引物及LCκ反向引物扩增全长hAbλTest LV/LCκDNA。该杂合抗体建构体被瞬时表达于HEK293细胞，利用A蛋白亲和柱纯化。该经纯化的抗体可利用MS进行表征。该hAbλTest LCκ杂合体与其同源受体的结合类似天然的mAb(hAbλTest)(表36)。SEQ ID NO:41、42及43是来自hAbλTest、hAbλTest‑λκ(含λJ)、及hAbλTest‑λκJ(含κJ)的轻链固定区。

表36:人/κ取代的抗体:抗原结合
实施例27hAbλTest1突变体：基序修饰
为了了解短基序“KH”是否足以在CLλ的相应区域中形成MAC，制备具有在hAbλTest中的残基CLλ188/189简单序列交换的突变体以在K187旁放进组氨酸，因此“K187S188H189”变成“K187H188S189”。突变是根据QuickChange定点突变形成试剂盒(Stratagene公司)中的说明产生。突变通过寡核苷酸引物导入并以DNA测序证实。该突变抗体建构体被瞬时表达于HEK293细胞，利用A蛋白亲和柱纯化。该经纯化的抗体可利用MS进行表征。该hAbλTest‑S188H/H189S(轻链：SEQ ID NO:44)突变体与其受体的结合和母体hAbλTest抗体一样有效(表37)。

表37:hAbλTest‑S188H/H189S
实施例28hAbλTest1突变体的缀合谱
各种抗体(hAbλTest、hAbλTest‑λκ、hAbλTest‑λκJ及hAbλTest‑S188H/H189S)经缓冲液交换至20mM乙酸钠、200m海藻糖pH5.5，浓度为20mg/ml。所述蛋白质接着添加60mM磷酸钠pH7.7。SEQ ID NO:27/K11‑5PEG‑PFP利用50%丙二醇重悬，以4.3:1摩尔比与该抗体混合，在室温下反应过夜。所有样品经稀释至2mg/ml，通过尺寸排阻层析‑质谱分析(SEC‑MS)分析完整的缀合蛋白质，以测定该蛋白质的缀合形式的数目及定量。此技术测量各种蛋白质形式的分子量；作为通过结合肽的质量差异所分开的不同信号观察多重肽缀合位点。多重肽缀合物质的相对定量由测量该信号强度进行。表38显示在2种LC交换杂合体(λκ及λκJ，前者包括λJ片段，后者包括κJ片段)中缀合的整体量增加。该缀合量随着hAbλTest对照的平均CA增加，分别自1.66增加至2.19(λκ)及2.53(λκJ)。突变体相较于天然序列具有很少效应，显示“KH”基序不足以用于MAC形成。
肽缀合的程度在轻链及重链上分开检测(表38)。各样品利用盐酸胍及二硫苏糖醇进行变性及还原二硫键。形成的游离轻链及重链利用LCMS分析以测定各自的缀合谱。在该还原分析中，天然hAbλTest的轻链仅具有5%的1CA，但是hAbλTest‑λκ及hAbλTest‑λκJ分别急剧地地跳到58%1CA及63%1CA。LC交换对于HC缀合的量的影响很小，维持相对固定(λκJ除外，其中HC缀合呈中度增加)。同样地，突变体相较于天然序列具有很少效应，显示“KH”基序不足以用于MAC形成。

表38:hAbλTest突变体的缀合谱
这些缀合形式的受体结合特性亦经评估以测定与SEQ ID NO:27/K11‑5PEG‑PFP缀合对于经缀合的抗体仍能与其受体结合的能力的影响(表39)。

表39:抗体的λ的抗体:抗原结合
实施例29利用不同离去基团产生MAC
为了探讨活性酯离去基团的活化程度和/或结构在定义该定向缀合效果时是否重要，合成一系列SEQ ID NO:27‑K11(SH)MAC‑2PEG‑PFP的选择性活化的(alternatively activated)酯类似物。缀合产物的分布是由完整缀合物的MS检测，且肽加成至轻链及重链的程度亦在还原完整缀合物及分开轻链及重链后由MS测定。
经选择性活化的酯的结构与命名如下所述。
经选择性活化的肽利用和前述实施例1至3中的相同策略及方法合成。简言之，各种经活化的基团被并入马来酰亚胺‑2PEG‑Z*接头中，其中Z*代表取代PFP的新的离去基团。为了合成上述化合物，经纯化的ABP‑硫醇肽(即具有K(SH)作为连接残基的ABP)的样品(30至40mg)被溶解于脱水DMF(2ml)中。添加MAL‑PEG2‑Z*(20mg)与N‑甲基吗啉(5mL)。反应在室温下搅拌进行，以HPLC监测以得知产物形成的时间进程。在2至6小时内观察到起始肽完全转换成与活化酯连接的ABP产物。溶液经过滤，并由半制备型HPLC直接分离产物峰。分离产物，在冷冻干燥后产率介于大约30%至50%。
所述缀合反应于标准条件下进行。简言之，2.12.1.fx抗体溶液利用磷酸钠pH7.7稀释2.12.1.fx溶液至终浓度0.06M进行制备。单独地，该肽溶液是通过溶解该肽于丙二醇至20mg/ml，接着以水稀释此溶液至10mg/ml进行制备。在缀合反应中，肽与抗体溶液以4:1摩尔比混合预定的时间。在时间进程的试验中，缀合溶液样品是在不同的时间点猝灭，通过混合缀合反应样品与40mM琥珀酸、200mM甘氨酸pH4.0的溶液(1:1,v/v)达成。缀合反应的时间进程由HPLC监测。SEQ ID NO:27被用来作为示范性肽。


表40:24小时的反应性酯‑完整缀合
表40显示在缀合反应开始后24小时完整缀合物的终产物分布。结果显示有些酯完全不反应(Z4、Z12)，其它酯反应缓慢(例如Z5)，然而有些达到PFP(Z1)的效果(例如Z3)。
缀合动力学
各种终缀合物随时间的加成速率显示于表41、42、43及44。0CA代表未经衍生化的2.12.1.fx抗体，而1、2或3CA代表在各个检测的时间期间加成1、2或3个肽至该2.12.1.fx抗体。

表41:产生O CA的不同Z*基团的缀合动力学

表42:产生lCA的不同Z*基团的缀合动力学

表43:产生2CA的不同Z*某团的缀合动力学

表44:产生3CA的小同Z*基团的缀合动力学
轻链及重链分布
各种选择性活化的酯的肽缀合程度在轻链及重链上分开检测。各样品利用盐酸胍及二硫苏糖醇进行变性及还原二硫键。形成的游离轻链及重链利用LCMS分析以测定各自的缀合谱。在2.12.1.fx及突变体的轻链及重链上的肽缀合谱显示于表45。几乎所有列于表中的经活化的肽相较于使用PFP(Z1)的化合物显示在轻链上减少的缀合量，除了2,3,6‑三氟苯基(Z3)以外，其显示类似的缀合量。衍生自N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)的经活化的酯，即N‑羟基‑5‑降冰片烯‑2,3‑二羧酸酰亚胺及2‑羟基‑异吲哚啉‑1,3‑二酮(Z8及Z9)显示较高倾向的重链衍生化。



表45:活化酯结果总结。有些数据也显示于表40‑44。
实施例30
其它选择性活化酯的实例显示于表46。检测一些PFP酯的类似物的缀合时间进程。通过减少在PFP中的氟基团的数目及位置，较少反应性活化酯形式可被合成及检测。2,3,5,6‑四氟苯基酯及2,4,6‑三氟苯基酯皆在与SEQ ID NO:27‑K11(SH)MAC‑2PEG‑PFP缀合后测试。1‑羟基‑吡咯啶‑2,5‑二酮(NHS)与SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP缀合。

在2小时缀合后，这些较不活化形式相较于PFP给予2.12.1.fx较低的整体缀合。NHS基团亦显示较低的整体缀合。包含NHS的肽及PFP的肽与2.12.1.fx缀合。分析该还原形式以了解在2小时的分布。PFP显示远较高的轻链衍生化倾向(对于LC为整体77%，对于重链仅6%)，相较于1‑羟基‑吡咯啶‑2,5‑二酮(NHS)显示对于LC的整体31%，但对于重链34%。

表46:选择性活化酯‑进一步的实例
化合物Z1至Z15代表各种不同结构类型的活性酯。考虑氟化芳香族活性酯系列，其在芳香环周围具有不同的氟原子数目及取代模式(化合物Z1、Z2、Z3、Z11、Z14及Z15)及考虑其结构如何影响其对蛋白质衍生化的反应性及倾向应当具有启发性。这些衍生物的抗体缀合的动力学可被方便地在2小时时间点比较，这时五氟苯基(Z1)反应已完成。随着环周围的氟取代的量增加，整体缀合的量增加且未反应抗体随之减少。反应速率与氟化苯酚离去基团的pKa直接相关，最酸性的酚产生较高的反应速率。缀合速率是Z1>Z14>Z3>Z15>Z2>Z11。氟取代模式的细微效应可通过比较化合物Z2、Z3及Z15了解。
活性酯的结构亦显著影响缀合反应的定向。通常，氟化芳香酯显示对轻链衍生化的明显倾向(主要如前所述的CLκ‑K188)。相反地，有些基于N‑羟基琥珀酰亚胺衍生物的酯(Z8、Z9及Z13)显示较低偏好，通常观察到较高量的重链衍生化。
实施例31
检测MAC‑1(PEG‑2‑琥珀酰亚胺‑巯丙基接头位于肽与PFP活化基团之间)与MAC‑2(直链PEG‑5接头位于肽与PFP活化基团之间)的缀合速率。表47将这些活化肽与2.12.1x比较。结果显示所述活化肽在衍生化的速率及程度上非常类似，虽然其具有稍微不同的接头结构。

表47:MAC‑1和MAC‑2之间的缀合比较
实施例32接头长度的影响
检测具有不同长度的接头对于终缀合物分布谱的影响。利用不同PEG长度的接头连接肽与PFP基团以合成化合物。加成0、1、2、3及4个肽至2.12.1.fx的结果显示于表48。整体而言，改变PEG接头的长度通常很少影响所获得的缀合物的分布。

表48:接头长度的影晌
实施例33：替代性肽序列的缀合
为了证实本发明对于其它肽序列的适用性，缀合SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:61(测试‑肽‑1，及测试‑肽‑2)。在先前针对与SEQ ID NO:27‑K11‑5PEG‑PFP的反应优化的条件下，使SEQ ID NO:60及61与5‑PEG‑PFP然后与2.12.1.fx抗体缀合。缀合谱及LC/HC缀合的分析结果显示于表49。SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:61二者皆显示与轻链定向缀合。进一步分析LC/HC分布时，观察到具有和MAC‑2类似的谱，即约70%LC衍生化及少于10%的HC衍生化。

表49:SEQ ID NO60及SEQ ID NO:61的缀合谱

实施例34：
肽定位实验于一系列蛋白质/缀合物组合上进行，目的是为了确认导致在抗体轻链上的K188的定向缀合的重要参数。表50列出进行的肽定位实验的结果。每种试验参数使用先前描述的肽定位方法。“***”表示高量的与K188‑CLκ的定向缀合。“**”表示较低程度，“*”表示仍有观察到定向缀合，但可能显示差异，诸如较缓慢的反应条件，较少的整体缀合，或平均仅一个轻链，因此可能比较适合特殊状况，诸如产生具有每抗体0.5至1.5个肽(举例来说)的MAC。“‑”表示这些反应条件似乎不利于在K188‑CLκ的定向缀合。
由于K188‑CLκ被观察到是在MAC‑2中的定向缀合的位置，研究替代性参数的肽定位试验以此位置为焦点。各种参数的详细肽定位数据并未包括，但是在其它K残基的显著缀合量并未被观察到，且对于其它MAC的观察与在K188‑CLκ的定向缀合一致。
2.12.1.fx的K188R及K188A突变导致丧失在此位点的定向缀合；显示此特定残基的必要作用。K190R及K190A突变不阻碍甚至可能增进K188的定向缀合。对于所检测的其它试验参数而言，至少一部分的轻链恒定区亚型被观察到对于定向缀合具有显著影响；至少一部分的轻链亚型κ经测定为必要的。与λ轻链亚型缀合(使用示范性包含λ的抗体hAbλTest1)并不显示定向缀合。当hAbλTest1的LCλ突变成LCκ，恢复在K188的定向缀合。

A表50:在K188CLκ的定向缀合的总结
本发明因此已经参考上述的代表性实施方案进行广泛地揭示及说明。本领域技术人员当能了解，可对本发明进行各种修饰而不背离其精神及范围。所有公开数据、专利申请及授权专利是以引用方式纳入本文，如同各个单独的公开资料、专利申请或授权专利特别地且个别地明示以引用方式整体纳入。在通过引用方式纳入的文本中所包含的定义若与本公开中的定义有所冲突则将被排除。
应当能了解的是本发明的某些特征为了清楚说明的目的而在分开的实施方案的上下文中描述，亦有可能在单一实施方案中组合提供。相反地，本发明的各种特征为了简便起见而在单一实施方案的上下文中描述者，亦有可能分开或在任何适当的亚组合中提供。
特别考虑的是关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制可能适用于本发明的任何其它实施方案。另外，本发明的任何组合物可能被用于本发明的任何方法，且本发明的任何方法可被用于产生或利用本发明的任何组合物。特别是，在权利要求中所描述的本发明的任何方面，其单独或与一或多个额外的权利要求和/或该说明书的方面组合，被了解是可与在其它权利要求和/或说明书和/或序列表和/或附图处所示的本发明的其它方面组合。
只要在此处说明的具体实例不属于发明的范围内，可明确地放弃该具体实例。
在权利要求中使用术语“或”是用来代表“和/或”，除非明确地指出仅代表选择或该选择具有互相排除性，不过本公开支持仅代表选择及“和/或”的定义。在本说明书所使用的“a”或“an”可代表一或多，除非另外清楚地说明。如在本发明的权利要求中所使用者，当与“包含”这个术语一起使用时，术语“a”或“an”可能代表一或超过一。本发明所使用的“另一”可代表至少第二个或更多。除非此处另外进行定义，关于本发明所使用的科学性及技术性术语应具有本领域的一般技术人员所通常了解的意义。另外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数意义且复数术语应包括单数意义。术语“包含/含有”及术语“具有/包括”当参照本发明用于本文时是用来表明所述的特征、整数、步骤或成分的存在，但不排除一或多种其它特征、整数、步骤、成分或其组的存在或加入。
序列表