杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白 技术领域 本发明属于害虫生物防治技术领域， 具体涉及一种杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆 菌新菌株及其杀虫蛋白， 即苏云金芽孢杆菌新菌株 B-Y7-1 及其杀虫蛋白。
背景技术 蛴螬是鞘翅目金龟甲总科幼虫的通称， 为害各种农作物、 果树、 林木和牧草等植 物， 是地下害虫中种类最多、 分布最广和为害最重的一大类群， 也是国内外公认的难防治的 土栖性害虫。据调查统计， 植物地下部分受害的 86％是由蛴螬危害造成的。每年全国蛴螬 发生面积约 1 亿亩， 严重年份曾达 3 亿 2 千万亩， 产量损失达 20％～ 40％， 全国尤以黄淮流 域受害最为严重。我国已经记载的蛴螬种类有 100 余种， 其中常见的有 30 余种， 其中以华 北大黑鳃金龟 (Holotrichia oblita Faldermann)、 暗黑鳃金龟 (Holotrichia parallela Motschulsky)、 铜绿丽金龟 (Anomala corpulenta Motschlsky) 等发生普遍而严重。在蛴 螬的防治上化学农药发挥了一定的作用， 但化学农药易造成严重的环境污染和生态平衡的 破坏， 同时化学农药在食物中的残留和累积， 不仅危害人体健康， 而且不利于社会的可持续 发展。而生物防治具有不污染环境、 对人畜安全和害虫不易产生抗性等优点， 因此， 开发新 的生物防治技术是当前害虫综合治理亟待解决的问题。
苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， 简称 Bt) 是一种分布极其广泛的革 兰氏阳性细菌， 它在形成芽孢的同时， 能产生对多种昆虫、 螨类和原生动物等具有特异活 性的蛋白性质的伴孢晶体， 由于其杀虫晶体蛋白 (Insecticidal crystal proteins， 简称 ICPs) 对目标害虫高效专一， 对非靶标生物安全和对环境无污染。因此， Bt 已广泛用于防治 农林、 仓贮和卫生等方面的害虫， 是目前国内外产量最大、 应用范围最广的微生物杀虫剂， 其杀虫晶体蛋白也是目前应用最为广泛和最有潜力的一类抗虫蛋白。 20 世纪 80 年代以前， 有关 Bt 的研究和应用大多集中在对鳞翅目害虫的防治上， 自 Ohba 等 (1992) 筛选获得了一 株对多种金龟子幼虫具有特异杀虫活性的 Bt 新菌株 Buibui 后， 近年来对金龟子类幼虫具 有活性的 Bt 菌株的研究和开发引起了人们的关注。目前国际上已相继分离了一些杀金龟 子类害虫的 Bt 菌株， 如冯书亮等 (2000) 分离了对黄褐丽金龟 (Anomala exoleta) 和铜绿 丽金龟等具有杀虫活性的 Bt 分离株 HBF-1， Yu 等 (2006) 分离了对暗黑鳃金龟具有活性的 菌株 Btl85。 但目前成功防治蛴螬类害虫的 Bt 菌株及其产品数量还相对较少， 因此， 筛选分 离出具有更高效杀虫效果的苏云金芽孢杆菌， 发掘新型、 高效和广谱的杀虫蛋白， 对于蛴螬 类地下害虫的防治具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白， 即苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1， 及其杀虫晶体蛋白， 以弥补现有技术的不足。
本发明的一个方面涉及苏云金芽孢杆菌新菌株 Bacillus thuringiensisB-Y7-1， 其于 2011 年 7 月 26 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC No.M2011267。本发明筛选的菌株， 用于制备防治蛴螬类害虫的活菌制剂。
本发明的另一个方面涉及一种从新菌株中分离的杀虫晶体蛋白， 其蛋白的氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 1。
本发明的杀虫蛋白用于制备防治蛴螬类害虫的制剂。
本发明的菌株分离自山东省烟台地区土壤， 对蛴螬类害虫具有特异性杀虫活性， 其杀虫晶体蛋白与国内外报道的不同， 作用对象也不相同， 对我国主要地下害虫华北大黑 鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的防治效果。 附图说明
图1： 本发明的苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1 杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 图，
其中泳道 1 为蛋白分子量标准， 泳道 2 为 B-Y7-1。 具体实施方式
实施例 1 苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1 的分离和生物学特性 ：
1.1 土样来源 土样采集于山东省各地， 选择荒草地、 林地等非耕地的土壤采样， 取地表以下 5 ～ 10em 土壤约 50g， 装袋封口， 编号并登记采集地点。
1.2 培养基
菌株分离采用 NGKG 选择性培养基 (NISSUI 公司， 日本 )， 3.975g NGKG 培养基加 135mL 蒸馏水， 灭菌 20min， 冷却到 50℃后加蛋黄液 15mL(3mL 蛋黄液 +12mL 0.85％生理盐 水 )， 倒平板。菌株培养采用 LB 培养基 ( 蛋白胨 1％， 酵母粉 0.5％， NaCl 1％， pH7.0) 或牛 肉膏蛋白胨培养基 ( 牛肉膏 0.3％， 蛋白胨 0.5％， pH7.0)， 固体培养基添加 1.3％～ 1.5％ 的琼脂。
1.3Bt 菌株的分离
将 1g 土样悬浮于 10mL 无菌水中， 剧烈震荡 20min， 然后静置 5min。将上层悬液稀 释 100 倍， 取 80μL 涂于 NGKG 选择性培养基平板上， 30℃倒置培养 72h。用接种环挑外观似 芽孢杆菌的单个菌落， 用石碳酸复红染色后， 镜检有无伴孢晶体产生。 将镜检到有伴孢晶体 的菌落划线接种于 LB 平板培养基纯化后， 获得苏云金芽孢杆菌菌株。
1.4Bt 菌株的培养和保藏
将单菌落接种于 LB 或牛肉膏蛋白胨培养基斜面上， 30℃培养 3 ～ 4d 后， 置于 4℃ 冰箱， 可短期保存三个月至半年。或将培养 3 ～ 4d 后产生的芽孢经无菌操作制成孢子悬浮 液， 取 100μL 加入灭菌的沙土管中， 充分混匀后置真空干燥器内干燥， 管口用石蜡密封， 放 于盛有氯化钙干燥剂的容器中， 可长期保存。使用时， 从原始保藏菌种转接， 接种于 LB 或牛 肉膏蛋白胨培养基斜面上进行活化。
1.5Bt 菌株 B-Y7-1 的生物学特性
Bt 菌株 B-Y7-1 分离自山东省烟台地区， 在 LB 或牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈圆 形、 蜡质状、 边缘不光滑， 在 15 ～ 40℃之间均能生长， 最适生长温度为 27 ～ 32℃。营养体 呈杆状， 大小为 3.2 ～ 5.2μm×1.2 ～ 2.0μm， 单生或成链状， 革兰氏染色阳性， 对甲基红正 反应， 乙酰甲基甲醇 (V-P 反应 ) 正反应， 在葡萄糖、 果糖、 麦芽糖和可溶性淀粉中产酸。形
成的芽胞囊呈长卵圆形， 较营养体略膨大 ； 芽胞囊破裂后释放出游离的芽孢和伴孢晶体， 芽 孢呈卵圆形， 大小为 2.0μm×0.8μm， 伴孢晶体近方形， 大小不等， 伴孢晶体蛋白分子量为 130kDa。
实施例 2Bt 菌株 B-Y7-1 菌液的制备和生物活性测定
2.1 样品制备
挑取菌株 B-Y7-1 单菌落， 接种于 5mL 的 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 振荡培 养 16 ～ 17h， 取 1mL 培养液接种于 100mL 的 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 振荡培养约 72h， 显微镜下检查， 待芽孢和晶体分离后， 10000r/min 离心 10min 弃去上清液， 用无菌水悬 浮收集的菌体， 制成菌液制剂备用。
2.2 生物活性测定
以无菌水做对照， 将 5mL 菌液与 10g 饲料 ( 细土豆丝 ) 以及 90g 灭菌土混合均匀， 放入直径为 12cm 和高度为 9cm 的塑料盒中， 每盒接入 3 日龄的蛴螬 5 头， 每个处理 6 盒 ( 共 30 头虫 )， 重复 3 次， 置于室温下饲养， 分别于 7d 和 14d 检查死虫和活虫数， 计算校正死亡 率。结果表明， Bt 菌株 B-Y7-1 对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫均具有较高的杀虫活 性， 在浓度为 6.7μg/g( 蛋白量与土的质量比 ) 时， 对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫 14d 的杀虫效果分别达到 86.7％和 76.7％。
实施例 3Bt 菌株 B-Y7-1 伴孢晶体蛋白的生物活性
3.1 蛋白样品的制备
挑菌株 B-Y7-1 单菌落， 接种于 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 培养约 3 ～ 4d， 待芽孢和晶体分离后， 提纯伴孢晶体蛋白， 测得的序列为 SEQ ID NO ： 1。蛋白碱解后用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度， 蛋白样品保存于 -20℃， 供生物活性测定用。
3.2 伴孢晶体蛋白的生物活性
将纯化的伴孢晶体蛋白分别稀释成不同的浓度， 分别将 5mL 不同浓度的蛋白溶液 与 10g 饲料 ( 细土豆丝 ) 以及 90g 灭菌土混合均匀， 放入直径为 12cm 和高度为 9cm 的塑料 盒中， 每盒接入 3 日龄的蛴螬 5 头， 每个处理 6 盒 ( 共 30 头虫 )， 重复 3 次， 置于室温下饲 养， 分别于 7d 和 14d 检查死虫和活虫数， 计算致死中浓度 (LC50)。活性测定的结果见表 1。
表 1 伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟的生物活性测定
结果表明， 本发明的伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的 杀虫效果， 对华北大黑鳃金龟 14d 的 LC50 为 5.7μg/g， 对暗黑鳃金龟 14d 的 LC50 为 2.0μg/ g。因此， 本发明筛选出的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白具有明显的杀虫效果， 具有 广阔的应用前景。
背景技术 蛴螬是鞘翅目金龟甲总科幼虫的通称， 为害各种农作物、 果树、 林木和牧草等植 物， 是地下害虫中种类最多、 分布最广和为害最重的一大类群， 也是国内外公认的难防治的 土栖性害虫。据调查统计， 植物地下部分受害的 86％是由蛴螬危害造成的。每年全国蛴螬 发生面积约 1 亿亩， 严重年份曾达 3 亿 2 千万亩， 产量损失达 20％～ 40％， 全国尤以黄淮流 域受害最为严重。我国已经记载的蛴螬种类有 100 余种， 其中常见的有 30 余种， 其中以华 北大黑鳃金龟 (Holotrichia oblita Faldermann)、 暗黑鳃金龟 (Holotrichia parallela Motschulsky)、 铜绿丽金龟 (Anomala corpulenta Motschlsky) 等发生普遍而严重。在蛴 螬的防治上化学农药发挥了一定的作用， 但化学农药易造成严重的环境污染和生态平衡的 破坏， 同时化学农药在食物中的残留和累积， 不仅危害人体健康， 而且不利于社会的可持续 发展。而生物防治具有不污染环境、 对人畜安全和害虫不易产生抗性等优点， 因此， 开发新 的生物防治技术是当前害虫综合治理亟待解决的问题。
苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， 简称 Bt) 是一种分布极其广泛的革 兰氏阳性细菌， 它在形成芽孢的同时， 能产生对多种昆虫、 螨类和原生动物等具有特异活 性的蛋白性质的伴孢晶体， 由于其杀虫晶体蛋白 (Insecticidal crystal proteins， 简称 ICPs) 对目标害虫高效专一， 对非靶标生物安全和对环境无污染。因此， Bt 已广泛用于防治 农林、 仓贮和卫生等方面的害虫， 是目前国内外产量最大、 应用范围最广的微生物杀虫剂， 其杀虫晶体蛋白也是目前应用最为广泛和最有潜力的一类抗虫蛋白。 20 世纪 80 年代以前， 有关 Bt 的研究和应用大多集中在对鳞翅目害虫的防治上， 自 Ohba 等 (1992) 筛选获得了一 株对多种金龟子幼虫具有特异杀虫活性的 Bt 新菌株 Buibui 后， 近年来对金龟子类幼虫具 有活性的 Bt 菌株的研究和开发引起了人们的关注。目前国际上已相继分离了一些杀金龟 子类害虫的 Bt 菌株， 如冯书亮等 (2000) 分离了对黄褐丽金龟 (Anomala exoleta) 和铜绿 丽金龟等具有杀虫活性的 Bt 分离株 HBF-1， Yu 等 (2006) 分离了对暗黑鳃金龟具有活性的 菌株 Btl85。 但目前成功防治蛴螬类害虫的 Bt 菌株及其产品数量还相对较少， 因此， 筛选分 离出具有更高效杀虫效果的苏云金芽孢杆菌， 发掘新型、 高效和广谱的杀虫蛋白， 对于蛴螬 类地下害虫的防治具有重要意义。
苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， 简称 Bt) 是一种分布极其广泛的革 兰氏阳性细菌， 它在形成芽孢的同时， 能产生对多种昆虫、 螨类和原生动物等具有特异活 性的蛋白性质的伴孢晶体， 由于其杀虫晶体蛋白 (Insecticidal crystal proteins， 简称 ICPs) 对目标害虫高效专一， 对非靶标生物安全和对环境无污染。因此， Bt 已广泛用于防治 农林、 仓贮和卫生等方面的害虫， 是目前国内外产量最大、 应用范围最广的微生物杀虫剂， 其杀虫晶体蛋白也是目前应用最为广泛和最有潜力的一类抗虫蛋白。 20 世纪 80 年代以前， 有关 Bt 的研究和应用大多集中在对鳞翅目害虫的防治上， 自 Ohba 等 (1992) 筛选获得了一 株对多种金龟子幼虫具有特异杀虫活性的 Bt 新菌株 Buibui 后， 近年来对金龟子类幼虫具 有活性的 Bt 菌株的研究和开发引起了人们的关注。目前国际上已相继分离了一些杀金龟 子类害虫的 Bt 菌株， 如冯书亮等 (2000) 分离了对黄褐丽金龟 (Anomala exoleta) 和铜绿 丽金龟等具有杀虫活性的 Bt 分离株 HBF-1， Yu 等 (2006) 分离了对暗黑鳃金龟具有活性的 菌株 Btl85。 但目前成功防治蛴螬类害虫的 Bt 菌株及其产品数量还相对较少， 因此， 筛选分 离出具有更高效杀虫效果的苏云金芽孢杆菌， 发掘新型、 高效和广谱的杀虫蛋白， 对于蛴螬 类地下害虫的防治具有重要意义。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白， 即苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1， 及其杀虫晶体蛋白， 以弥补现有技术的不足。
本发明的一个方面涉及苏云金芽孢杆菌新菌株 Bacillus thuringiensisB-Y7-1， 其于 2011 年 7 月 26 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC No.M2011267。本发明筛选的菌株， 用于制备防治蛴螬类害虫的活菌制剂。
本发明的另一个方面涉及一种从新菌株中分离的杀虫晶体蛋白， 其蛋白的氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 1。
本发明的杀虫蛋白用于制备防治蛴螬类害虫的制剂。
本发明的菌株分离自山东省烟台地区土壤， 对蛴螬类害虫具有特异性杀虫活性， 其杀虫晶体蛋白与国内外报道的不同， 作用对象也不相同， 对我国主要地下害虫华北大黑 鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的防治效果。 附图说明
图1： 本发明的苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1 杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 图，
其中泳道 1 为蛋白分子量标准， 泳道 2 为 B-Y7-1。 具体实施方式
实施例 1 苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1 的分离和生物学特性 ：
1.1 土样来源 土样采集于山东省各地， 选择荒草地、 林地等非耕地的土壤采样， 取地表以下 5 ～ 10em 土壤约 50g， 装袋封口， 编号并登记采集地点。
1.2 培养基
菌株分离采用 NGKG 选择性培养基 (NISSUI 公司， 日本 )， 3.975g NGKG 培养基加 135mL 蒸馏水， 灭菌 20min， 冷却到 50℃后加蛋黄液 15mL(3mL 蛋黄液 +12mL 0.85％生理盐 水 )， 倒平板。菌株培养采用 LB 培养基 ( 蛋白胨 1％， 酵母粉 0.5％， NaCl 1％， pH7.0) 或牛 肉膏蛋白胨培养基 ( 牛肉膏 0.3％， 蛋白胨 0.5％， pH7.0)， 固体培养基添加 1.3％～ 1.5％ 的琼脂。
1.3Bt 菌株的分离
将 1g 土样悬浮于 10mL 无菌水中， 剧烈震荡 20min， 然后静置 5min。将上层悬液稀 释 100 倍， 取 80μL 涂于 NGKG 选择性培养基平板上， 30℃倒置培养 72h。用接种环挑外观似 芽孢杆菌的单个菌落， 用石碳酸复红染色后， 镜检有无伴孢晶体产生。 将镜检到有伴孢晶体 的菌落划线接种于 LB 平板培养基纯化后， 获得苏云金芽孢杆菌菌株。
1.4Bt 菌株的培养和保藏
将单菌落接种于 LB 或牛肉膏蛋白胨培养基斜面上， 30℃培养 3 ～ 4d 后， 置于 4℃ 冰箱， 可短期保存三个月至半年。或将培养 3 ～ 4d 后产生的芽孢经无菌操作制成孢子悬浮 液， 取 100μL 加入灭菌的沙土管中， 充分混匀后置真空干燥器内干燥， 管口用石蜡密封， 放 于盛有氯化钙干燥剂的容器中， 可长期保存。使用时， 从原始保藏菌种转接， 接种于 LB 或牛 肉膏蛋白胨培养基斜面上进行活化。
1.5Bt 菌株 B-Y7-1 的生物学特性
Bt 菌株 B-Y7-1 分离自山东省烟台地区， 在 LB 或牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈圆 形、 蜡质状、 边缘不光滑， 在 15 ～ 40℃之间均能生长， 最适生长温度为 27 ～ 32℃。营养体 呈杆状， 大小为 3.2 ～ 5.2μm×1.2 ～ 2.0μm， 单生或成链状， 革兰氏染色阳性， 对甲基红正 反应， 乙酰甲基甲醇 (V-P 反应 ) 正反应， 在葡萄糖、 果糖、 麦芽糖和可溶性淀粉中产酸。形
成的芽胞囊呈长卵圆形， 较营养体略膨大 ； 芽胞囊破裂后释放出游离的芽孢和伴孢晶体， 芽 孢呈卵圆形， 大小为 2.0μm×0.8μm， 伴孢晶体近方形， 大小不等， 伴孢晶体蛋白分子量为 130kDa。
实施例 2Bt 菌株 B-Y7-1 菌液的制备和生物活性测定
2.1 样品制备
挑取菌株 B-Y7-1 单菌落， 接种于 5mL 的 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 振荡培 养 16 ～ 17h， 取 1mL 培养液接种于 100mL 的 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 振荡培养约 72h， 显微镜下检查， 待芽孢和晶体分离后， 10000r/min 离心 10min 弃去上清液， 用无菌水悬 浮收集的菌体， 制成菌液制剂备用。
2.2 生物活性测定
以无菌水做对照， 将 5mL 菌液与 10g 饲料 ( 细土豆丝 ) 以及 90g 灭菌土混合均匀， 放入直径为 12cm 和高度为 9cm 的塑料盒中， 每盒接入 3 日龄的蛴螬 5 头， 每个处理 6 盒 ( 共 30 头虫 )， 重复 3 次， 置于室温下饲养， 分别于 7d 和 14d 检查死虫和活虫数， 计算校正死亡 率。结果表明， Bt 菌株 B-Y7-1 对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫均具有较高的杀虫活 性， 在浓度为 6.7μg/g( 蛋白量与土的质量比 ) 时， 对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫 14d 的杀虫效果分别达到 86.7％和 76.7％。
实施例 3Bt 菌株 B-Y7-1 伴孢晶体蛋白的生物活性
3.1 蛋白样品的制备
挑菌株 B-Y7-1 单菌落， 接种于 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 培养约 3 ～ 4d， 待芽孢和晶体分离后， 提纯伴孢晶体蛋白， 测得的序列为 SEQ ID NO ： 1。蛋白碱解后用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度， 蛋白样品保存于 -20℃， 供生物活性测定用。
3.2 伴孢晶体蛋白的生物活性
将纯化的伴孢晶体蛋白分别稀释成不同的浓度， 分别将 5mL 不同浓度的蛋白溶液 与 10g 饲料 ( 细土豆丝 ) 以及 90g 灭菌土混合均匀， 放入直径为 12cm 和高度为 9cm 的塑料 盒中， 每盒接入 3 日龄的蛴螬 5 头， 每个处理 6 盒 ( 共 30 头虫 )， 重复 3 次， 置于室温下饲 养， 分别于 7d 和 14d 检查死虫和活虫数， 计算致死中浓度 (LC50)。活性测定的结果见表 1。
表 1 伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟的生物活性测定
结果表明， 本发明的伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的 杀虫效果， 对华北大黑鳃金龟 14d 的 LC50 为 5.7μg/g， 对暗黑鳃金龟 14d 的 LC50 为 2.0μg/ g。因此， 本发明筛选出的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白具有明显的杀虫效果， 具有 广阔的应用前景。
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本发明的另一个方面涉及一种从新菌株中分离的杀虫晶体蛋白， 其蛋白的氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 1。
本发明的杀虫蛋白用于制备防治蛴螬类害虫的制剂。
本发明的菌株分离自山东省烟台地区土壤， 对蛴螬类害虫具有特异性杀虫活性， 其杀虫晶体蛋白与国内外报道的不同， 作用对象也不相同， 对我国主要地下害虫华北大黑 鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的防治效果。 附图说明
图1： 本发明的苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1 杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 图，
其中泳道 1 为蛋白分子量标准， 泳道 2 为 B-Y7-1。 具体实施方式
实施例 1 苏云金芽孢杆菌菌株 B-Y7-1 的分离和生物学特性 ：
1.1 土样来源 土样采集于山东省各地， 选择荒草地、 林地等非耕地的土壤采样， 取地表以下 5 ～ 10em 土壤约 50g， 装袋封口， 编号并登记采集地点。
1.2 培养基
菌株分离采用 NGKG 选择性培养基 (NISSUI 公司， 日本 )， 3.975g NGKG 培养基加 135mL 蒸馏水， 灭菌 20min， 冷却到 50℃后加蛋黄液 15mL(3mL 蛋黄液 +12mL 0.85％生理盐 水 )， 倒平板。菌株培养采用 LB 培养基 ( 蛋白胨 1％， 酵母粉 0.5％， NaCl 1％， pH7.0) 或牛 肉膏蛋白胨培养基 ( 牛肉膏 0.3％， 蛋白胨 0.5％， pH7.0)， 固体培养基添加 1.3％～ 1.5％ 的琼脂。
1.3Bt 菌株的分离
将 1g 土样悬浮于 10mL 无菌水中， 剧烈震荡 20min， 然后静置 5min。将上层悬液稀 释 100 倍， 取 80μL 涂于 NGKG 选择性培养基平板上， 30℃倒置培养 72h。用接种环挑外观似 芽孢杆菌的单个菌落， 用石碳酸复红染色后， 镜检有无伴孢晶体产生。 将镜检到有伴孢晶体 的菌落划线接种于 LB 平板培养基纯化后， 获得苏云金芽孢杆菌菌株。
1.4Bt 菌株的培养和保藏
将单菌落接种于 LB 或牛肉膏蛋白胨培养基斜面上， 30℃培养 3 ～ 4d 后， 置于 4℃ 冰箱， 可短期保存三个月至半年。或将培养 3 ～ 4d 后产生的芽孢经无菌操作制成孢子悬浮 液， 取 100μL 加入灭菌的沙土管中， 充分混匀后置真空干燥器内干燥， 管口用石蜡密封， 放 于盛有氯化钙干燥剂的容器中， 可长期保存。使用时， 从原始保藏菌种转接， 接种于 LB 或牛 肉膏蛋白胨培养基斜面上进行活化。
1.5Bt 菌株 B-Y7-1 的生物学特性
Bt 菌株 B-Y7-1 分离自山东省烟台地区， 在 LB 或牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈圆 形、 蜡质状、 边缘不光滑， 在 15 ～ 40℃之间均能生长， 最适生长温度为 27 ～ 32℃。营养体 呈杆状， 大小为 3.2 ～ 5.2μm×1.2 ～ 2.0μm， 单生或成链状， 革兰氏染色阳性， 对甲基红正 反应， 乙酰甲基甲醇 (V-P 反应 ) 正反应， 在葡萄糖、 果糖、 麦芽糖和可溶性淀粉中产酸。形
成的芽胞囊呈长卵圆形， 较营养体略膨大 ； 芽胞囊破裂后释放出游离的芽孢和伴孢晶体， 芽 孢呈卵圆形， 大小为 2.0μm×0.8μm， 伴孢晶体近方形， 大小不等， 伴孢晶体蛋白分子量为 130kDa。
实施例 2Bt 菌株 B-Y7-1 菌液的制备和生物活性测定
2.1 样品制备
挑取菌株 B-Y7-1 单菌落， 接种于 5mL 的 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 振荡培 养 16 ～ 17h， 取 1mL 培养液接种于 100mL 的 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 振荡培养约 72h， 显微镜下检查， 待芽孢和晶体分离后， 10000r/min 离心 10min 弃去上清液， 用无菌水悬 浮收集的菌体， 制成菌液制剂备用。
2.2 生物活性测定
以无菌水做对照， 将 5mL 菌液与 10g 饲料 ( 细土豆丝 ) 以及 90g 灭菌土混合均匀， 放入直径为 12cm 和高度为 9cm 的塑料盒中， 每盒接入 3 日龄的蛴螬 5 头， 每个处理 6 盒 ( 共 30 头虫 )， 重复 3 次， 置于室温下饲养， 分别于 7d 和 14d 检查死虫和活虫数， 计算校正死亡 率。结果表明， Bt 菌株 B-Y7-1 对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫均具有较高的杀虫活 性， 在浓度为 6.7μg/g( 蛋白量与土的质量比 ) 时， 对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫 14d 的杀虫效果分别达到 86.7％和 76.7％。
实施例 3Bt 菌株 B-Y7-1 伴孢晶体蛋白的生物活性
3.1 蛋白样品的制备
挑菌株 B-Y7-1 单菌落， 接种于 LB 液体培养基中， 30℃ 200r/min 培养约 3 ～ 4d， 待芽孢和晶体分离后， 提纯伴孢晶体蛋白， 测得的序列为 SEQ ID NO ： 1。蛋白碱解后用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度， 蛋白样品保存于 -20℃， 供生物活性测定用。
3.2 伴孢晶体蛋白的生物活性
将纯化的伴孢晶体蛋白分别稀释成不同的浓度， 分别将 5mL 不同浓度的蛋白溶液 与 10g 饲料 ( 细土豆丝 ) 以及 90g 灭菌土混合均匀， 放入直径为 12cm 和高度为 9cm 的塑料 盒中， 每盒接入 3 日龄的蛴螬 5 头， 每个处理 6 盒 ( 共 30 头虫 )， 重复 3 次， 置于室温下饲 养， 分别于 7d 和 14d 检查死虫和活虫数， 计算致死中浓度 (LC50)。活性测定的结果见表 1。
表 1 伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟的生物活性测定
结果表明， 本发明的伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的 杀虫效果， 对华北大黑鳃金龟 14d 的 LC50 为 5.7μg/g， 对暗黑鳃金龟 14d 的 LC50 为 2.0μg/ g。因此， 本发明筛选出的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白具有明显的杀虫效果， 具有 广阔的应用前景。
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