《精品硫酸软骨素A和C和制备精品硫酸软骨素A和C的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《精品硫酸软骨素A和C和制备精品硫酸软骨素A和C的方法.pdf（21页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104140472A43申请公布日20141112CN104140472A21申请号201410190564622申请日20140507201310164925520130508CNC08B37/0820060171申请人清华大学地址100084北京市海淀区清华大学72发明人邢新会吴敬君张翀74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人贾静环闫桑田54发明名称精品硫酸软骨素A和C和制备精品硫酸软骨素A和C的方法57摘要本发明涉及一种精品硫酸软骨素A和C和制备精品硫酸软骨素A和C的方法。其中制备精品硫酸软骨素A和C的方法包括向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液。
2、中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。66本国优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表5页附图2页10申请公布号CN104140472ACN104140472A1/1页21一种精制的精品硫酸软骨素A和C，其中，硫酸皮肤素成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为5质量以下、优选为3质量以下、进一步优选为1质量以下、优选为08质量以下、优选为05质量以下、优选为03质量以下、优选为01质量以下、优选为005质量以下。2根据权利要求1。
3、所述的精品硫酸软骨素A和C，其中，硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为90质量以上、优选为93质量以上、优选为95质量以上、优选为97质量以上、优选为98质量以上、优选为99质量以上、进一步优选为995质量以上、优选为997质量以上、优选为999质量以上。3一种制备精品硫酸软骨素A和C的方法，其包括向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。4根据权利要求3所述的方法，其还包括通过分离方法分离除去混合物中的经酶分解后得到的低分子量的硫酸皮肤素。5根据权利要求4所述的方法，其。
4、中所述低分子量的硫酸皮肤素为分子量在2000道尔顿以下的经降解的硫酸皮肤素。6根据权利要求3所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶B是与MBP融合的硫酸软骨素酶B，即MBPCHONBSEQIDNO1。7根据权利要求3所述的方法，其中包括进一步除去硫酸软骨素酶B，其中，通过将加入了硫酸软骨素酶B的溶液加热至70以上，优选加热至80以上以停止硫酸软骨素酶B与所述硫酸皮肤素成分的反应，然后通过离心分离从所述溶液中除去加热后的硫酸软骨素酶B。8根据权利要求4所述的方法，其中，所述分离方法为醇沉淀分离。9根据权利要求4所述的方法，其中，所述分离方法为超滤膜分离。10根据权利要求8所述的方法，其中，所述醇沉淀。
5、分离是一级乙醇沉淀分离。11根据权利要求3所述的方法，其中，硫酸软骨素酶B与硫酸皮肤素的反应在2040的条件下，优选在2535的条件下进行，以及在PH为659的条件下，优选PH为785的条件下进行。12根据权利要求3所述的方法，所述硫酸软骨素酶B和所述硫酸软骨素混合物的比例为100IU10000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物，优选为500IU5000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物，更优选为1000IU5000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物。13根据权利要求3所述的方法，其中，所述含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊、驴、鸡等的软骨；来自鲟鱼、鲨鱼、鱿。
6、鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼等的软骨；以及来自贝类、海参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜的基本含硫酸软骨素A和C的混合物，优选所述硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊等的软骨。14根据权利要求3所述的方法，其中，所述硫酸软骨素混合物溶液的浓度为1G/L500G/L，优选为1G/L100G/L。权利要求书CN104140472A1/12页3精品硫酸软骨素A和C和制备精品硫酸软骨素A和C的方法发明领域0001本文涉及精品硫酸软骨素A和C，以及制备精品硫酸软骨素A和C的方法。背景技术0002硫酸软骨素CHONDROITINSULFATE,以下简称为“CS”广泛存在于各种动物组织中，尤其在软骨和结缔组织中含量丰富。由于不同生物。
7、或者相同生物的不同组织所含CS的种类和量均不同，CS通常是一种混合物，主要由硫酸软骨素ACHONDROITINSULFATEA，以下简称为“CSA”、硫酸软骨素CCHONDROITINSULFATEC，以下简称为“CSC”、软骨素CHONDROITIN和硫酸皮肤素CHONDROITINSULFATEB，DERMATANSULFATE，以下简称为“DS”构成，上述这些均为二糖单元构成的线性高分子，平均分子量均为25000道尔顿左右，其各自的二糖结构单元如图1所示。0003如上所述，硫酸软骨素CS是多种多糖组成的混合物，因此其结构与活性是复杂多样的。作为一类重要的生物大分子，CS具有广泛的生物活性。
8、，作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。大量研究表明，CS具有降血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等活性，临床中已用于防治关节炎、肾炎、神经痛和偏头痛等参见张天民，凌沛学，糖胺聚糖研究新进展J食品与药品,2008,10915；VOLPINQUALITYOFDIFFERENTCHONDROITINSULFATEPREPARATIONSINRELATIONTOTHEIRTHERAPEUTICACTIVITYJJPHARMPHARMACOL,2009,6112711280；UEBELHARTD,KNOLSR,DEBRUINED等人，TREATMENTOFKNEEOSTEOARTHRI。
9、TISWITHORALCHONDROITINSULFATEJADVPHARMACOL,2006,53475488；KAHANA,UEBELHARTD,DEVATHAIREF等人，LONGTERMEFFECTSOFCHONDROITINS4AND6SULFATEONKNEEOSTEOARTHRITISTHESTUDYONOSTEOARTHRITISPROGRESSIONPREVENTION,ATWOYEAR,RANDOMIZED,DOUBLEBLIND,PLACEBOCONTROLLEDTRIALJARTHRITISRHEUM,2009,60524533正确；CHRISTINAMALAVAKI，。
10、SHUJIMIZUMOTO等人，RECENTADVANCESINTHESTRUCTURALSTUDYOFFUNCTIONALCHONDROITINSULFATEANDDERMATANSULFATEINHEALTHANDDISEASECONNECTIVETISSUERESEARCH,49133139,2008。000400054种硫酸软骨素多糖的二糖结构单元0006随着CS全球市场需求量的增大，其产量逐年增加，如2008年我国出口CS达3121说明书CN104140472A2/12页4吨，出口额为186亿美元参见吴慧芳，2009硫酸软骨素360产业论坛青岛20092027。中国是全球硫酸软骨素产。
11、量最大的国家，占全球产量80以上，20062009年的年平均产量为3300吨，年复合平均增长率为24参见乔海利，2010硫酸软骨素360产业论坛青岛，2010。0007目前广泛应用的硫酸软骨素是其中的硫酸软骨素A和CCSA和CSC组分，而对于其中的硫酸皮肤素组分的应用很少，其实际应用价值还处于实验室研究阶段参见CHRISTINAMALAVAKI，SHUJIMIZUMOTO等人，RECENTADVANCESINTHESTRUCTURALSTUDYOFFUNCTIONALCHONDROITINSULFATEANDDERMATANSULFATEINHEALTHANDDISEASECONNECTIVE。
12、TISSUERESEARCH,49133139,2008。0008硫酸皮肤素可以代替肝素或者硫酸乙酰肝素与基质蛋白质相互作用，基质蛋白质比如有纤连蛋白参见WALKER,A和GALLAGHER,JT1996STRUCTURALDOMAINSOFHEPARANSULPHATEFORSPECIFICRECOGNITIONOFTHECTERMINALHEPARINBINDINGDOMAINOFHUMANPLASMAFIBRONECTINHEPIIBIOCHEMJ,317,817871、细胞膜接受器和血小板因子4参见CELLA,G,BOERRI,G,SAGGIORATO,G,PAOLINI,R,LUZZ。
13、ATO,G和TERRIBILE,VI1992INTERACTIONBETWEENHISTIDINERICHGLYCOPROTEINANDPLATELETFACTOR4WITHDERMATANSULPHATEANDLOWMOLECULARWEIGHTDERMATANSULPHATEANGIOLOGY,43,5962，硫酸皮肤素在呼吸道合胞病毒RSV感染中起到重要作用参见HALLAK,LK,COLLINS,PL,KNUDSON,W和PEEPLES,ME2000IDURONICACIDCONTAININGGLYCOSAMINOGLYCANSONTARGETCELLSAREREQUIREDFOREFF。
14、ICIENTRESPIRATORYSYNCYTIALVIRUSINFECTIONVIROLOGY,271,264275。DS通过提供一个催化模板提供抑制因子以及蛋白酶结合的位点而使通过肝素辅因子2HCII抑制凝血酶的速率提高大约1000倍参见LIAW,PCY,BECKER,DL,STAFFORD,AR,FREDENBURGH,JC和WEITZ,JI2001MOLECULARBASISFORTHESUSCEPTIBILITYOFFIBRINBOUNDTHROMBINTOINACTIVATIONBYHEPARINCOFACTORIIINTHEPRESENCEOFDERMATANSULPHATEBU。
15、TNOTHEPARINJBIOLCHEM,276,2095920965。0009结合HCII的DS片段包括六糖和八糖，而且IDOA的C2和GALNAC的C4硫酸化会得到最高的亲和能力参见MAIMONE,MM和TOLLEFSEN,DM1990STRUCTUREOFDERMATANSULPHATEHEXASACCHARIDESTHATBINDSTOHEPARINCOFACTORIIWITHHIGHAFFINITYJBIOLCHEM,265,1826318271。除此之外，DS在纤维组织母细胞生长因子2FGF2的信号转导中起到潜在的作用。PENC等人证明在伤口修复中从PGS释放出来的DS同样可以激活。
16、FGF2的信号转导参见PENC,SF,POMAHAC,B,WINKLER,T,DORSCHNER,RA,ERIKSSON,E,HERNDON,M和GALLO,RL1998DERMATANSULPHATERELEASEDAFTERINJURYISAPOTENTPROMOTEROFFIBROBLASTGROWTHFACTOR2FUNCTIONJBIOLCHEM,273,2811628121。DS还可以结合并激活肝实质细胞生长因子HGF/SF参见LYON,M,DEAKIN,JA,RAHMOUNE,H,FERNIG,DG,NAKAMURA,T和GALLAGHER,JT1998HEPATOCYTEGRO。
17、WTHFACTOR/SCATTERFACTORBINDSWITHHIGHAFFINITYTODERMATANSULFATEJBIOLCHEM,273,271278。0010根据上述内容可以看出，如果硫酸软骨素A和C中混入硫酸皮肤素，则由于硫酸皮肤素复杂的作用可能会引起很多副反应，因此有必要对作为原料的硫酸软骨素混合物进行说明书CN104140472A3/12页5精制，以从硫酸软骨素组合物中除去硫酸皮肤素，得到含硫酸软骨素A和C的精制产品。此外，由于硫酸软骨素中的软骨素的含量非常少，因此通常认为需要从原料硫酸软骨素混合物中除去的主要的杂质为硫酸皮肤素。发明内容0011目前已有的硫酸软骨素的纯化方。
18、法有酶法、有机溶剂沉淀法、盐沉淀、超滤、和离子色谱法等多种方法。MARTINBMATHEWS使用蛋白水解酶去除牛来源的硫酸软骨素钠中的痕量杂质，得到分子量为5000道尔顿的硫酸软骨素钠MARTINBMATHEWSTHEMOLECULARWEIGHTOFSODIUMCHONDROITINSULFATEBYLIGHTSCATTERINGJARCHIVESOFBIOCHEMISTRYANDBIOPHYSICS,1956,61367377。NICOLAVOLPI使用乙醇沉淀的纯化方法，向硫酸软骨素溶液中加入少量乙醇，在低温下静置后离心，取上清液重复以上步骤，最后得到高纯度的硫酸软骨素NICOLAVOL。
19、PIPURIFICATIONOFHEPARIN,DERMATANSULFATEANDCHONDROITINSULFATEFROMMIXTURESBYSEQUENTIALPRECIPITATIONWITHVARIOUSORGANICSOLVENTSJJORNALOFCHROMATOGRAPHYB,1996,6852734。KAZUAKIKAKEHI等人使用5MG/ML的氯化十六烷基吡啶纯化硫酸软骨素，当溶液中硫酸钠的浓度增加到01MOL/L时，硫酸软骨素的沉淀量达到最大KAZUAKIKAKEHI，YUKOMAEYA，YASUYOSHIMIKI，YASUOODA，SHOZOHAYASEUSEOFA。
20、BINARYMIXTUREOFQUANTERNARYAMMONIUMSALTSINFLUOROMETRICDETERMINIATIONOFGLYCOSAMINOGLYCANSJANALYTICALBIOCHEMISTRY,1997,2525661。BLIGNOT等人采用管形的三氧化铝膜纯化硫酸软骨素，滤膜的孔径分别为100、50、20NM，溶液的透过速率分别为每平方米90、60、43L/H，硫酸软骨素的截留率均为100，肽类的截留率分别为20、45、45，盐类的截留率分别为50、65、70BLIGNOT,VLAHOGUE,PBOURSEAUENZYMATICEXTRACTIONOFCHONDR。
21、OITINSULFATEFROMSKATECARTILAGEANDCONCENTRATIONDESALTINGBYULTRAFITRATIONJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,2003,103281284。熊双丽等人使用DEAE52和DEAESEPHAROSEFF离子交换层析纯化硫酸软骨素粗品，实验结果表明DEAESEPHAROSEFF更适合于分离纯化此类多糖，因为后者不仅带有离子交换功能还具有分子筛效应熊双丽，金征宇，不同分子量硫酸软骨素的制备和抗氧化活性探讨J中成药，2006，28913431346。0012上述硫酸软骨素的精制方法都很粗放，纯化效果不佳，并且上述方法的操作较。
22、为麻烦，成本较高，比较费时，需要昂贵的仪器，而且回收的硫酸软骨素是多种成分的混合物，收率和纯度低。0013此外，由于硫酸皮肤素DS和硫酸软骨素A和C的结构很类似，通过蛋白水解酶法、有机溶剂沉淀法、盐沉淀、超滤、和离子色谱法等方法得到的硫酸软骨素A和C的收率和纯度一般较低，产品中含有的多糖种类较多，不够单一。目前尚没有方法可以有效和有针对性地除去硫酸软骨素混合物中与硫酸软骨素A和C结构类似的硫酸皮肤素等杂质。0014因此，鉴于上述问题，本申请的发明人进行了深入地研究，提出了如下的方案解决了上述问题。0015本文的一个方面提供一种精品硫酸软骨素A和C。具体来说00161一种精制的精品硫酸软骨素A和。
23、C，其中，硫酸皮肤素成分在所述精品硫酸软说明书CN104140472A4/12页6骨素A和C的总量中所占的比例为5质量以下、优选为3质量以下、进一步优选为1质量以下、优选为08质量以下、优选为05质量以下、优选为03质量以下、优选为01质量以下、优选为005质量以下。00172根据1所述的精品硫酸软骨素A和C，其中，硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为90质量以上、优选为93质量以上、优选为95质量以上、优选为97质量以上、优选为98质量以上、优选为99质量以上、进一步优选为995质量以上、优选为997质量以上、优选为999质量以上。0018本文的另一个方面涉及一。
24、种硫酸软骨素A和C的精制方法制备精品硫酸软骨素A和C的方法，具体来说00193一种制备精品硫酸软骨素A和C的方法，其包括0020向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。00214根据3所述的方法，其还包括0022通过分离方法分离除去混合物中的经酶分解后得到的低分子量的硫酸皮肤素。00235根据4所述的方法，其中所述低分子量的硫酸皮肤素为分子量在2000道尔顿以下的经降解的硫酸皮肤素。00246根据3所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶B是与MBP融合的硫酸软骨素酶B，即MBPCHONBSEQIDNO1。
25、。00257根据3所述的方法，其中包括进一步除去硫酸软骨素酶B，其中，通过将加入了硫酸软骨素酶B的溶液加热至70以上，优选加热至80以上以停止硫酸软骨素酶B与所述硫酸皮肤素成分的反应，然后通过离心分离从所述溶液中除去加热后的硫酸软骨素酶B。00268根据4所述的方法，其中，所述分离方法为醇沉淀分离。00279根据4所述的方法，其中，所述分离方法为超滤膜分离。002810根据8所述的方法，其中，所述醇沉淀分离是一级乙醇沉淀分离。002911根据3所述的方法，其中，硫酸软骨素酶B与硫酸皮肤素的反应在2040的条件下，优选在2535的条件下进行，以及在PH为659的条件下，优选PH为785的条件下进。
26、行。003012根据3所述的方法，所述硫酸软骨素酶B和所述硫酸软骨素混合物的比例为100IU10000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物，优选为500IU5000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物，更优选为1000IU5000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物。003113根据3所述的方法，其中，所述含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊、驴、鸡等的软骨；来自鲟鱼、鲨鱼、鱿鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼等的软骨；以及来自贝类、海参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜的基本含硫酸软骨素A和C的混合物，优选所述硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊等的软骨。003214根据3所述的方法，其中，所述硫酸。
27、软骨素混合物溶液的浓度为1G/L500G/L，优选为1G/L100G/L。0033本文利用硫酸软骨素酶B，通过使硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素混合物中的硫酸说明书CN104140472A5/12页7皮肤素反应，将硫酸皮肤素降解为小分子硫酸皮肤素的二糖形式，并利用分子量小的组分在乙醇中溶解度高、高分子硫酸软骨素溶解度低的特点，通过随后乙醇沉淀通常可以是一级沉淀，即一次乙醇沉淀而得到基本上不含硫酸皮肤素的硫酸软骨素A和C的混合物，或者采用超滤膜分离过滤除去硫酸皮肤素二糖而截留大分子的硫酸软骨素A及硫酸软骨素C。由此使得到的产品中硫酸软骨素的种类更为单一，纯度更高。此外由于后续获得精品硫酸软骨素A和C的。
28、步骤较为简单，降低了成本并同时达到硫酸软骨素收率提高的双重效果。附图说明0034图1为利用THERMO公司的HYPERSILSAX色谱柱30250MM，34105253030分析硫酸软骨素原料中DS含量的色谱图。方法如下在1ML、50MG/ML的待分析样品中加入05IU硫酸软骨素酶B，在30下反应24H，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在原料中存在DS。0035图2为利用THERMO公司的HYPERSILSAX色谱柱30250MM，34105253030分析对比例1中得到的硫酸软骨素产品中DS含量的色谱图。方法如下在1ML、50MG/ML的待分析。
29、样品中加入05IU硫酸软骨素酶B，在30下反应24H，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在对比例1的产品中存在DS。0036图3为利用THERMO公司的HYPERSILSAX色谱柱30250MM，34105253030分析实施例1中得到的精品硫酸软骨素中DS含量的色谱图，方法如下在1ML、50MG/ML的待分析样品中加入05IU硫酸软骨素酶B，在30下反应24H，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的弱峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在实施例1的产品中存在很少的DS。0037图4为利用THERMO公司的HYPERSILSAX色谱柱3025。
30、0MM，34105253030分析实施例2中得到的精品硫酸软骨素中DS含量的色谱图，方法如下在1ML、50MG/ML的待分析样品中加入05IU硫酸软骨素酶B，在30下反应24H，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的弱峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在实施例2的产品中存在很少的DS。具体实施方式0038以下，对本文的实施方式进行具体说明。0039如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。本文中，所涉及的数值一般指重量或重量百分比，除非特殊说明。0040在本说明书的上下文中，本文所提到的全部出版物、专利申请、专利和其它。
31、文献，若非另有说明，通过引用将其整体明确地并入本文，用于仿佛完全阐明的全部目的。0041除非另有定义，本文所使用的全部技术和科技术语具有本文所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。若有冲突，将以本说明书包括定义为准。00420043本文的一个方面提供一种精制的硫酸软骨素A和C。精品硫酸软骨素A和C通常说明书CN104140472A6/12页8以粉末状态存在。0044该硫酸软骨素A和C中的硫酸皮肤素DS成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为5质量以下，优选为3质量以下，进一步优选为1质量以下，优选为08质量以下，优选为05质量以下，最优选为03质量以下，优选为01质量以下，优选。
32、为005质量以下。在本文中，对于硫酸皮肤素成分含量的下限没有具体限定，可以是所采用的检测方法的极限值，例如可以是0001质量或以上。0045此外，就本文的精品硫酸软骨素A和C而言，硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为90质量以上，优选为93质量以上，优选为95质量以上，优选为97质量以上，优选为98质量以上，优选为99质量以上，进一步优选为995质量以上，优选为997质量以上，优选为999质量以上。0046在本文中通过色谱方法来检测硫酸软骨素混合物中硫酸皮肤素的含量。在本文的检测方法中，利用硫酸软骨素酶B与待测样品中的硫酸皮肤素反应并将其降解为二糖形式，并通过色谱。
33、方法来检测降解形成的二糖从而判断待测样品中是否含有硫酸皮肤素。所述色谱方法是能够用于检测二糖含量的色谱方法，通过其检测样品中含有的硫酸皮肤素经降解后得到的二糖的量，并通过该量来表征样品中硫酸皮肤素的量。具体的检测方法的实例可以参见实施例部分描述的色谱测定方法。0047利用色谱方法测定可以获得在色谱谱图中代表二糖的特征峰的峰面积的数值，通过该数值的大小来反应硫酸皮肤素的相对量，并通过与硫酸皮肤素含量已知的标准样品的二糖特征峰的峰面积来比对、计算出待分析样品中硫酸皮肤素的量。具体的计算方法可以参见实施例部分描述的计算方法。0048在本文中，涉及对硫酸软骨素A和C的含量进行检测的方法。可以直接检测硫。
34、酸软骨素A和C的含量利用硫酸软骨素酶ABC在一定条件下，将硫酸软骨素酶解成硫酸软骨素A和C对应的二糖，然后通过离子交换色谱分析二糖的含量，换算成硫酸软骨素的含量。具体方法见中国药典2010版第二部984985页。0049或者测定硫酸软骨素A、C和DS的总含量，参见欧洲药典70版采用滴定法测定，通过与标准品比对确定硫酸软骨素含量。具体方法见EUROPEANPHARMACOPOEIA7016811683。0050在本文中针对经过通常的纯化步骤，除去了其它杂质的硫酸软骨素的粗产品，由于通常仅含有硫酸软骨素A和C，以及难以除去的杂质硫酸皮肤素，因此硫酸软骨素A和C的含量也可以通过从100质量中减去检测。
35、到的样品中硫酸皮肤素的量的方法来确定。00510052本文的另一个方面涉及一种制备精品硫酸软骨素A和C的方法，其包括0053向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。0054含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物0055本文的含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物是指含有硫酸软骨素A和C的原料，因此只要是主要含硫酸软骨素A和C的原料即可，通常硫酸软骨素A和C的含量占原料的比例在20质量以上，在30质量以上，在40质量以上，在50质量以上，在60质量以上，在70质量以上，在80质量以上，在90质量以。
36、上或者更高。在本文中的说明书CN104140472A7/12页9含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物是指未经本文所述的方法进行处理的含有硫酸皮肤素等杂质的混合物。当然该硫酸软骨素混合物也可以是经过了通常的纯化步骤除去了其它多种杂质但尚未除去硫酸皮肤素等杂质的含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物。例如可以从安徽科宝生物工程有限公司、四川广元申达实业有限公司购买含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物。0056或者本文所涉及的硫酸软骨素混合物也可以是从动物中直接提取得到，并通过本文中引用的文献记载的方法进行初步纯化。目前提取硫酸软骨素混合物的原料种类也逐渐增多。所用原料不仅有猪、牛、羊、驴。
37、、鸡等软骨，也有鲟鱼、鲨鱼、鱿鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼软骨，还有贝类、海参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜等。0057硫酸软骨素混合物的来源有陆地动物和海洋动物两大类。陆地动物主要是牛、猪、和禽；海洋动物包括软骨鱼的软骨、海参和贝类等。陆地动物的硫酸软骨素混合物中，硫酸软骨素A是主要组成组分，而海洋动物则以硫酸软骨素C为主。USPNF2003年第一增补版颁布的CS硫酸软骨素标准中对其来源作了认定健康的、适合人类食用的牛、猪和禽的软骨，而对海洋动物来源未予认定。0058来自动物的硫酸软骨素混合物可以是来自猪、牛、羊、驴、鸡等的软骨的提取物；来自鲟鱼、鲨鱼、鱿鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼等的软骨的提取物；以及来自贝类、海。
38、参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜，优选所述硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊等的软骨参考文献张雷，刘新硫酸软骨素不同提取工艺的探讨黑龙江科技信息，200929253253。0059硫酸软骨素酶B0060在该方法中，硫酸软骨素酶B可以是通过任何方法获得的硫酸软骨素酶B。该硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品，也可以利用能够生产硫酸软骨素酶B的细菌菌体、该细菌菌体的细胞提取物、也可以是细胞提取物经提纯得到的含酶溶液、以及经纯化得到的酶。上述能够生产硫酸软骨素酶B的细菌例如有肝素黄杆菌PEDOBACTERHEPARINUS或FLAVOBACTERIUMHEPARINUM、金黄节杆菌ARTHROBACTERAURESC。
39、ENS和嗜水气单孢菌AEROMONASLIQUEFACIENS。0061例如，硫酸软骨素酶B来自肝素黄杆菌。0062硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品，例如购买自SIGMA、IBEX等公司的硫酸软骨素酶B。0063其中，来自肝素黄杆菌的硫酸软骨素酶B可以通过直接使用肝素黄杆菌菌体、菌体的细胞提取物、或细胞提取物经初步纯化后得到的含酶溶液。也可以利用该硫酸软骨素酶B分别在大肠杆菌中重组表达后得到的经基因工程操作的酶。0064在本文中，硫酸软骨素酶B可以是与MBP融合的硫酸软骨素酶，即MBPCHONB。该MBPCHONB的氨基酸残基序列如SEQIDNO1所示，其DNA序列如SEQIDNO2所示，关于。
40、MBPCHONB的详细描述可以参考申请号为2011103581347的中国专利申请。0065MBPCHONB可以是以具有该酶基因的细菌的粗培养液、该粗培养液的细胞提取物、或者是根据简单的纯化方法得到的酶粗产品、或者进一步纯化得到的酶产品形式被利用。0066在上述方法中，硫酸软骨素酶B与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物进行反应，反应过程中硫酸软骨素酶B降解硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素。本文对于该反应条件没有特别地限定，只要是硫酸软骨素酶B能够发挥活性，有效地降解硫酸皮肤素的说明书CN104140472A8/12页10反应条件即可，本领域技术人员可以根据所使用的酶和原料进行适当地选择。在一个。
41、具体的实施方式中，反应在2040的条件下，优选在2535的条件下进行，以及在PH为785，优选在30，PH75的条件下进行。0067对于上述反应进行的时间也没有具体限定，只要是能够将作为原料的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素充分降解皆可。所述充分降解是指在反应进行的过程中通过紫外可见光分光光度计检测反应体系在232235NM处的吸光度，当吸光度不再变化时，认为其中的硫酸皮肤素已经被充分降解。因此仅需要根据不同的酶量、不同的操作条件，选择适当的反应时间即可，本领域技术人员可以适当地调节。在一个具体的实施方式中，反应进行的时间根据加入的酶量和DS的含量适当调整。0068在上述方法中，本领域技术人员可。
42、以根据原料中含有的DS的量，以及计划进行的反应时间来适当地确定硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素混合物的比例，所述比例在100IU100000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物，优选为500IU5000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物，更优选为1000IU5000IU硫酸软骨素酶B/KG硫酸软骨素混合物。0069其中硫酸软骨素酶B的1IU定义为在30，PH值为75的条件下能产生1MOL4,5不饱和糖醛酸的酶量。0070此外，硫酸软骨素混合物的浓度为1G/L500G/L，优选为1G/L100G/L。在进行本文所述的方法之前，可以称量一定量的待精制的硫酸软骨素混合物，将其加入到去离子水中，配。
43、制成1G/L500G/L，优选为1G/L100G/L的浓度。0071在本文所述的方法中，由于硫酸软骨素A和C的分子量在25000道尔顿左右，而经硫酸软骨素酶B反应而降解的硫酸皮肤素是基本上以二糖形式存在的低分子经降解的硫酸皮肤素，其分子量一般在2000道尔顿以下，例如1000道尔顿以下，或约为400500道尔顿，由于分子量明显不同于硫酸软骨素A和C，因此可以容易地在后续步骤中利用分子量的差异从混合物中分离出目标产品硫酸软骨素A和C。0072在本文涉及的方法中，还包括可以添加反应终止剂使酶失活然后除去该酶。所述反应终止剂例如酸、碱等。考虑到不再向反应体系中增加其它的杂质，可以通过加热的方法使酶失。
44、活从而停止反应。加热的温度只要是使硫酸软骨素酶B失活并产生絮状沉淀的温度即可，例如可以加热至70以上，优选加热至80以上，加热的时间可以根据加热的温度选定，例如可以列举在80加热20分钟，从而停止硫酸软骨素酶B与所述硫酸皮肤素成分的反应，然后通过离心分离从所述溶液中除去加热后的硫酸软骨素酶B。0073进一步，在通过上述加热过程使硫酸软骨素酶B失活并产生絮状沉淀后，通过离心分离除去加热后沉淀的硫酸软骨素酶B，对于离心分离的转速和时间没有具体限定，只要可以除去沉淀的硫酸软骨素酶B即可。在本文一个具体的实施方案中，例如可以在10000RPM的转速下离心10分钟。此外，通过上述的离心步骤可以除去硫酸软。
45、骨素混合物中的其它的杂质，例如蛋白质等。0074本文所述的方法还包括通过分离方法分离除去所述含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物中的经酶分解后得到的低分子量的硫酸皮肤素硫酸皮肤素的二糖，从而得到精品硫酸软骨素A和C。0075例如，通过如上所述离心除去硫酸软骨素酶B后，得到了含有硫酸软骨素A和C的中间产品。然后通过分离方法除去所述含有硫酸软骨素A和C的中间产品中的、经酶分解说明书CN104140472A109/12页11后得到的低分子硫酸皮肤素。0076由于经过硫酸软骨素酶B降解后，硫酸皮肤素降解为二糖形式，因此其分子量与硫酸软骨素A和C不同，利用分子量不同，可以利用本领域技术人员已知的不同。
46、的分离方法来实现分离，从含有硫酸软骨素A和C的中间产品分离除去经酶分解后得到的低分子硫酸皮肤素。所述分离方法例如有利用醇溶液进行的醇沉淀分离、梯度离心、膜过滤方法等。0077所述醇沉淀是本领域普通技术人员所熟知的醇沉淀方法，由于分子量小的物质的醇溶性更好，在同样的乙醇浓度下更容易溶解而除去，因此在本文所述的方法中，可以利用醇沉淀分离方法来除去降解后的低分子的硫酸皮肤素。通常可以采用3070的乙醇溶液进行分级分离，静置一段时间后，收集沉淀。在本文实施例中通过乙醇进行醇沉淀，利用的乙醇是80重量的乙醇溶液。在本文所述的方法中，醇沉淀可以进行13次。在本文的一实施方式中，醇沉淀是利用乙醇溶液进行的一。
47、次乙醇沉淀，即进行一次乙醇沉淀。具体操作的方式例如添加80重量的乙醇溶液，在10000RPM的转速下离心10分钟，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥离心得到的沉淀物质12小时，得到经精制的硫酸软骨素A和C的产品。0078由于降解后的硫酸皮肤素的分子量低于硫酸软骨素A和C，因此在本文的方法中可以利用超滤膜截留不同分子量的物质，从而可以实现将低分子量的硫酸皮肤素二糖与硫酸软骨素A和C的分离。对于超滤膜的种类没有具体的限制，可以根据操作选择合适截留分子量的超滤膜，例如根据购买的厂商的使用说明书中标注的截留分子量来进行选择，通常可以选择截留分子量为1000道尔顿、3000道尔顿、5000道尔顿、8000道尔顿。
48、以及10000道尔顿的市售超滤膜。本文实施例中使用了超滤膜的截留分子量为1000道尔顿。利用超滤膜分离的方法例如可以是使待分离的混合物溶液切向通过超滤膜，其中分子量小于截留分子量的物质透过膜，大分子等回流到初始的待分离的混合物溶液中进入下一次膜分离，如此循环，直至效率截留分子量的小分子基本透过超滤膜，从而实现将大分子与小分子分离的目的。可以使用例如美国通用GE、美国3M、日本东丽、旭化成、海德能、新加坡凯发等公司提供的超滤膜。0079在本文的一个具体的实施方式中，使用MINIPORE公司的超滤膜PLAC1K。该超滤膜的使用条件可以参考其说明书，在该实施方式中，控制进口压力01802MPA，回流。
49、压力006008MPA，操作60分钟，切向流速大约1L/MIN，过滤体积100ML，循环次数为600次。0080通过上述本文的制备精品硫酸软骨素A和C的方法得到的质量收率可以通过精品硫酸软骨素A和C产品/原料硫酸软骨素混合物100来计算。0081利用本文所述的方法可以获得本文的精品硫酸软骨素A和C，即硫酸皮肤素成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总含量中所占的比例为5质量以下，优选为3质量以下，进一步优选为1质量以下，优选为08质量以下，优选为05质量以下，优选为03质量以下，优选为01质量以下，优选为005质量以下。0082硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总含量中所占的比例为90质量以上，优选为93质量以上，优选为95质量以上，优选为97质量以上，优选为98质量以上，优选为99质量以上，进一步优选为995质量以上，优选为997质量以上，优选为997质量以上、优选为999质量以上。0083实施例说明书CN104140472A1110/12页120084下面结合具体实施例对本文。