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1、(10)申请公布号 CN 103103276 A (43)申请公布日 2013.05.15 CN 103103276 A *CN103103276A* (21)申请号 201310036852.1 (22)申请日 2013.01.31 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 山东出入境检验检疫局检验检疫技 术中心 地址 266002 山东省青岛市市南区瞿塘峡路 70 号 (72)发明人 孙涛 邓明俊 肖西志 王群 郑小龙 凌宗帅 (54) 发明名称 焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法 (57) 摘要 本。
2、发明公开了一种焦磷酸测序技术检测贾第 鞭毛虫的方法， 属于食源性寄生虫的检测技术领 域， 首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase， tim) 设计特异性引物及 焦磷酸测序引物 ； 再提取待测样品的脱氧核糖核 酸 (DNA)， 然后分别以 tim 基因的特异性引物进 行聚合酶链式反应 (PCR) 扩增 ； 用琼脂糖凝胶电 泳对扩增产物进行检测， 若引物扩增片段长度为 165bp， 则制备焦磷酸测序单链模板， 再进行焦磷 酸测序反应， 最后根据 PCR 扩增结果和焦磷酸测 序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发 明适用于对贾第鞭毛虫进行快速检测确。
3、证， 可广 泛应用于环境中的水质监控、 人体粪便中卵囊检 测及进出口贸易中该类原虫的确证。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103103276 A CN 103103276 A *CN103103276A* 1/2 页 2 1. 一种焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法， 其特征在于， 首先依据贾第鞭毛虫磷 酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase， tim)设计特异性引物及焦磷。
4、酸测序引物 ； 再 提取待测样品的脱氧核糖核酸 (DNA)， 然后分别以 tim 基因的特异性引物进行聚合酶链式 反应 (PCR) 扩增 ； 用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测， 若引物扩增片段长度为 165bp， 则制备焦磷酸测序单链模板， 再进行焦磷酸测序反应， 最后根据 PCR 扩增结果和焦磷酸测 序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫 ； 所述的设计贾第鞭毛虫的特异性引物及焦磷酸 测序引物是根据该虫的磷酸丙糖异构酶基因序列， 选取保守序列， 通过Assay Design SW软 件设计特异性引物序列， 以扩增出特异性单一条带， 再根据扩增区域中包含的特异核苷酸 序列 ( 目标序列 ) 设。
5、计焦磷酸测序引物以确证是否为贾第鞭毛虫 ； 贾第鞭毛虫 PCR 及测序 引物为 ： tim 基因上游引物 5 -AATGTGTACCTAGAGGGGAACG-3 ， 5 进行生物素标记 tim 基因下游引物 5 -CTTTTCCAGGGCACGCTTA-3 ， tim 基因测序引物 5 -TCCAGGGCACGCTTA-3 ； 贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶的目标序列 ： GCCTTCTTGG CGCTTTGCTCGTCGGTCTCC ； 扩增片 段长度为 165bp。 2. 根据权利要求 1 所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法， 其特征在于， 所述 的提取待测样品的 DNA 是利用人源贾第虫。
6、包囊的粪便经 100 目系统网过滤， 滤液用酚 - 氯 仿法抽提而得 ； 或用商业化的 DNA 提取试剂盒提取。 3. 根据权利要求 1 所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法， 其特征在于， 所述 的以贾第鞭毛虫 tim 引物进行 PCR 扩增 ： 其中， 上下游引物扩增是将提取的待测样品 DNA 进行 PCR 扩增， 扩增溶液中加入 2PCR buffer(10 倍聚合酶链式 Mix 反应液 )12.5L， 10pmol/L 上游引物和下游引物各 0.5L， DEPC 水补足体积至 25L， PCR 循环条件为 ： 94预变性 5min 后， 进入 94变性 30s， 46退火 30s，。
7、 72延伸 30s， 共循环 50 次 ； 然后 72再延伸 10min。 4. 根据权利要求 1 所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法， 其特征在于， 所述 的 PCR 扩增产物电泳检测 ： 取 2g 琼脂糖， 于 100mL 电泳缓冲液中加热， 充分溶化， 加入溴化 乙锭贮存液至终浓度为 0.5g/mL， 制胶， 在电泳槽中加入电泳缓冲液， 使液面刚刚没过凝 胶 ； 将 3L 6LPCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混合， 点样 ； 9V/cm 恒压电泳， 直至 溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ； 紫外检测仪下观察电泳结果并记录。 5. 根据权利要求 1 所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫。
8、的方法， 其特征在于， 所述 的制备焦磷酸测序单链模板 ： 使用50l标记有生物素的PCR产物与200g链霉亲和素包 被的磁珠， 在室温 25下孵育 20 分钟， 用 vacuum prep tool 将与磁珠结合后的 PCR 产物 吸起， 然后在 70乙醇中清洗 5s ； denatureation buffer( 变性缓冲液 ) 洗 5s ； 最后移到 washing buffer( 冲洗缓冲液 ) 中清洗 10s ； 然后将 vaccum prep tool 放入含有测序引物 的板中， 摇动， 释放磁珠。将样品放入 80烘箱 2 分钟， 再冷却到室温。 6. 根据权利要求 1 所述的焦磷。
9、酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法， 其特征在于， 所述 的焦磷酸测序反应 ： 测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测， 加样使用 600 毫巴 /8 毫秒 的加样压力和时间， 每轮反应时间 65 秒， 引物链随着不同 dNTP 的加入而延伸， 随着核酸的 结合， CCD 摄像机检测到发出的光信号， 读出 DNA 序列。 权 利 要 求 书 CN 103103276 A 2 2/2 页 3 7. 根据权利要求 1 所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法， 其特征在于， 所述 的关于根据 PCR 扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫 ： PCR 反应 为阳性的， 进行焦磷酸测序分析。
10、， 测序片段与 tim 基因目标片段完全相同的， 确定为贾第鞭 毛虫 ； PCR 反应为阳性的， 测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非贾第鞭毛虫 ； PCR 反应为阴性的判定为非贾第鞭毛虫。 权 利 要 求 书 CN 103103276 A 3 1/6 页 4 焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法 技术领域 ： 0001 本发明属于食源性寄生虫的检测技术领域， 涉及一种采用焦磷酸测序 (Pyrosequencing) 技术检测贾第鞭毛虫的方法。 背景技术 ： 0002 贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia) 是一种具有 2 个细胞核的多鞭毛寄生原虫， 可寄 生于人体和多种脊椎动物。
11、肠道内， 继而引起以腹泻为主的贾第虫病 (Giardiasis)， 为人体 肠道感染的常见寄生虫之一， 在世界范围内普遍存在。 由于其在供水系统中存活时间较长， 对氯等消毒剂的耐受性高， 存在污染的水对供水安全造成极大威胁。 研究表明 ： 贾第虫的致 病剂量为 10 100 个活孢囊。人体感染贾第虫后， 主要症状是腹痛、 腹泻、 腹胀、 呕吐、 发热 和厌食等， 典型病人表现为以腹泻为主的吸收不良综合征， 腹泻呈水样粪便， 量大、 恶息、 无 脓血。儿童患者可由于腹泻， 引起贫血等营养不良， 导致生长滞缓。若不及时治疗， 多发展 为慢性， 表现为周期性稀便， 反复发作， 大便甚臭， 病程可长达。
12、数年。 0003 据美国资料分析显示， 1990 2000 年， 由于地表水受原虫污染， 导致生活饮用水 污染而引起的感染暴发事件呈上升趋势 ； 加拿大 66 家水厂水源水样本中有 81的水样检 出了原虫 ； 日本某饮用水净水厂原水中， 贾第虫包囊的检出率为 12/13。就我国的情况看， 在珠江的西江珠海段监测显示， 水中贾第虫包囊量为0152个/100L， 在广州市2003年主 要供水河段水源水原虫监测中， 阳性率为 46， 枯水期更高达 80。因此， 深入加强对贾第 鞭毛虫的检测确证研究刻不容缓。 0004 目前， 用于贾第鞭毛虫的检测及确证方法主要有密度检测、 聚合酶链反应、 荧光杂 交。
13、等方法。 但应用密度检测时， 其回收率偏低， 同时显微镜检分析多依赖于人员的经验和专 业背景知识， 主观性较大 ； 应用 PCR 技术检测确证时， 如果引物特异性不强， 可能出现检测 假阳性 ； 利用荧光杂交方法时由于 DNA 量较少， 方法又不够灵敏。 0005 焦磷酸测序技术是近年发展起来的新技术， 它是目前唯一得到定量序列结果的检 测技术， 具有极高的准确性， 且重现性极佳， 是一种通用型技术平台， 功能多样， 应用领域广 泛， 具有高通量、 低成本的特点， 聚合酶链式反应产物即可直接用于测序， 不需进行产物纯 化等二次处理， 操作极为简便， 所需样品量小， 符合出入境检验检疫的要求， 。
14、鉴于贾第鞭毛 虫等原虫危害的严重性， 加强环境中的的监控， 提高检测效率和确证的准确度， 对有效控制 贾第鞭毛虫的传播在现阶段具有重要的实际意义。 发明内容 ： 0006 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术在确证贾第鞭毛虫上存在的缺点， 提供一种贾第鞭毛虫的焦磷酸测序技术检测确证方法， 以克服现有检测技术的不足， 为人 体感染者及环境中的水质监控提供一种快速、 简便、 高效、 实用的确证贾第鞭毛虫的检测方 法。 0007 为解决上述技术问题， 本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术， 通过测序引物 说 明 书 CN 103103276 A 4 2/6 页 5 和聚合酶链式反应扩增单链脱氧核糖。
15、核酸模板杂交， 与脱氧核糖核酸聚合酶、 腺嘌呤核苷 三磷酸 (ATP) 硫酸化酶、 荧光素酶、 三磷酸腺苷双磷酸酶和底物 (APS)、 荧光素孵育， 逐一加 入四种三磷酸碱基脱氧核苷酸 (dNTPs) ： 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 dATP、 三磷酸胸腺嘧啶 脱氧核苷酸 dTTP、 三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 dCTP、 三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 dGTP， 如与模 板配对， 此三磷酸碱基脱氧核苷酸与引物的术端形成共价键， 释放焦磷酸基团 (PPi) ； 腺嘌 呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情况下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷 酸， 腺嘌呤核苷三磷酸驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧。
16、光素转化， 氧化荧光素发出与 腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可见光信号 ； 光信号由电荷耦合器件 (CCD) 收集并由软件转 化为峰 ； 每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比， 腺嘌呤核苷三磷酸和未掺 入的三磷酸碱基脱氧核苷酸由三磷酸腺苷双磷酸酶降解， 淬灭光信号， 并再生反应体系， 利 用光信号转化得到的峰图， 对样品中的贾第鞭毛虫进行准确的检测。 0008 本发明的实现， 首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶 (triose phosphate isomerase， tim) 设计特异性引物及焦磷酸测序引物 ； 再提取待测样品的脱氧核糖核酸 (DNA)， 然后分别以 tim 基因的特异性。
17、引物进行聚合酶链式反应 (PCR) 扩增 ； 用琼脂糖凝胶 电泳对扩增产物进行检测， 若引物扩增片段长度为 165bp， 则制备焦磷酸测序单链模板， 再 进行焦磷酸测序反应， 最后根据 PCR 扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾 第鞭毛虫。 0009 本发明所述的设计贾第鞭毛虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的磷 酸丙糖异构酶基因序列， 选取保守序列， 通过 Assay Design SW 软件设计特异性引物序列， 以扩增出特异性单一条带， 再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列 ( 目标序列 ) 设计焦 磷酸测序引物以确证是否为贾第鞭毛虫 ； 贾第鞭毛虫 PCR 及测序引物为。
18、 ： 0010 tim 基因上游引物 5 -AATGTGTACCTAGAGGGGAACG-3 ， 5 进行生物素标记 0011 tim 基因下游引物 5 -CTTTTCCAGGGCACGCTTA-3 ， 0012 tim 基因测序引物 5 -TCCAGGGCACGCTTA-3 。 0013 贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶的目标序列 ： GCCTTCTTGG CGCTTTGCTCGTCGGTCTCC ； 扩 增片段长度为 165bp。 0014 本发明所述的提取待测样品的DNA是利用人源贾第虫包囊的粪便经100目系统网 过滤， 滤液用酚 - 氯仿法抽提而得 ； 亦可用商业化的 DNA 提取试剂盒提取。。
19、 0015 本发明所述的以贾第鞭毛虫tim引物进行PCR扩增 ： 其中， 上下游引物扩增是将提 取的待测样品 DNA 进行 PCR 扩增， 扩增溶液中加入 2PCR buffer(10 倍聚合酶链式 Mix 反 应液 )12.5L， 10pmol/L 上游引物和下游引物各 0.5L， DEPC 水补足体积至 25L， PCR 循环条件为 ： 94预变性 5min 后， 进入 94变性 30s， 46退火 30s， 72延伸 30s， 共循环 50 次 ； 然后 72再延伸 10min。 0016 本发明所述的PCR扩增产物电泳检测 ： 取2g琼脂糖， 于100mL电泳缓冲液中加热， 充分溶化，。
20、 加入溴化乙锭贮存液至终浓度为 0.5g/mL， 制胶， 在电泳槽中加入电泳缓冲液， 使液面刚刚没过凝胶 ； 将3L6L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合， 点样 ； 9V/ cm 恒压电泳， 直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ； 紫外检测仪下观察电泳结果并记录。 0017 本发明所述的制备焦磷酸测序单链模板 ： 使用 50l 标记有生物素的 PCR 产物与 200g 链霉亲和素包被的磁珠， 在室温 25下孵育 20 分钟， 用 vacuum prep tool 将与磁 说 明 书 CN 103103276 A 5 3/6 页 6 珠结合后的 PCR 产物吸起， 然后在 70乙醇中清洗 5。
21、s ； denatureation buffer( 变性缓冲 液 ) 洗 5s ； 最后移到 washingbuffer( 冲洗缓冲液 ) 中清洗 10s ； 然后将 vaccum prep tool 放入含有测序引物的板中， 摇动， 释放磁珠。将样品放入 80烘箱 2 分钟， 再冷却到室温。 0018 本发明所述的焦磷酸测序反应 ： 测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测， 加样 使用 600 毫巴 /8 毫秒的加样压力和时间， 每轮反应时间 65 秒， 引物链随着不同 dNTP 的加 入而延伸， 随着核酸的结合， CCD 摄像机检测到发出的光信号， 读出 DNA 序列。 0019 本发明所述。
22、的关于根据 PCR 扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有 贾第鞭毛虫 ： PCR 反应为阳性的， 进行焦磷酸测序分析， 测序片段与 tim 基因目标片段完全 相同的， 确定为贾第鞭毛虫 ； PCR 反应为阳性的， 测序片段与目标片段有一个以上碱基不同 判定为非贾第鞭毛虫 ； PCR 反应为阴性的判定为非贾第鞭毛虫。 0020 本发明适用于对贾第鞭毛虫进行快速检测确证， 可广泛应用于环境中的水质监 控、 人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证 ； 与现有技术相比， 其应用焦磷酸 测序技术可以快速、 准确地进行短 DNA 序列分析， 便于构建标准化操作流程 ； 具有高通量、 低成本。
23、的特点， PCR 产物即可直接用于测序， 不需进行产物纯化等二次处理， 操作极为简便， 所需样品量小。 附图说明 ： 0021 图 1 为本发明对粪便样品中 tim 基因的扩增图谱， 其中 M ： DL2000， 1 ： 粪便样品。 0022 图 2 为本发明对粪便样品中 tim 基因焦磷酸测序结果。 具体实施方式 ： 0023 下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。 0024 实施例 1 ： 检测感染者粪便样品中是否含有贾第鞭毛虫 0025 1、 设计特异性引物序列 0026 通过 Internet 登陆美国国立生物信息技术中心 (NCBI)， 查询检索已公布的贾第 鞭毛虫 tim 。
24、的核苷酸序列， 不包含不明碱基成分序列， 对同源性较近的同年份同地点的虫 株只选取一株， 用 DNAStar7.1 软件包中的 Editseq 和 MegAlign 软件对所选样本的 tim 基 因核苷酸序列进行编辑， 逐一比对， 用 Clustal W Method( 软件 ) 默认参数对所选的 tim 核 苷酸序列进行同源性比较， 找到表征该虫的特异核苷酸序列 ( 目标检测序列 )。 0027 PCR扩增引物设计和测序引物设计均可以通过Assay Design SW软件来进行， 使用 得分较高的一组引物进行实验， 根据 DNASTAR 的同源性分析结果， 选取样本基因中较保守 的序列区域，。
25、 设计扩增引物， 以便于扩增出特异性单一条带， 为后续测序奠定基础。同时为 各个扩增区域中包含的特异核苷酸序列 ( 目标序列 ) 设计测序引物， tim 扩增片段长度为 165bp。 0028 贾第鞭毛虫 PCR 及测序引物为 ： 0029 tim 基因上游引物 5 -AATGTGTACCTAGAGGGGAACG-3 ， 5 进行生物素标记 0030 tim 基因下游引物 5 -CTTTTCCAGGGCACGCTTA-3 ， 0031 tim 基因测序引物 5 -TCCAGGGCACGCTTA-3 。 0032 2、 提取待测样品的 DNA 说 明 书 CN 103103276 A 6 4/6。
26、 页 7 0033 将含贾第虫包囊的粪便经 100 目细铜网过滤， 滤液离心 (2000r/min， 10min)， 弃上 清， 沉淀加水至 2mL 3mL ； 取另一离心管， 加入 0.85mol/L 蔗糖 5mL ； 将上述包囊液加入到 蔗糖上层， 离心(2000r/min， 5min)， 缓慢吸取蔗糖上层含包囊悬液2mL， 洗2次。 用血球计数 板计数纯化包囊数目。向上述纯化的包囊沉淀中加入 400L 裂解液 ( 含蛋白酶 K200g/ mL)， 重悬包囊， 56温育 3h， 期间混匀多次 ； 用酚 - 氯仿法分别抽提贾第虫包囊 DNA。 。 0034 3、 以贾第鞭毛虫 tim 引物进。
27、行 PCR 扩增 0035 扩增溶液中加入 2PCR buffer(10 倍聚合酶链式 Mix 反应液 )12.5L， 10pmol/ L上游引物和下游引物各0.5L， 将提取的待测样品DNA加入反应体系中， DEPC水补足体 积至 25L， PCR 循环条件为 ： 94预变性 5min 后， 进入 94变性 30s， 46退火 30s， 72 延伸 30s， 共循环 50 次 ； 然后 72再延伸 10min. 0036 4、 进行琼脂糖凝胶电泳 0037 将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 取 2g 琼脂糖， 于 100mL 电泳缓冲液中加热， 充分 溶化， 加入溴化乙锭贮存液至终浓度为。
28、0.5g/mL， 制胶。 在电泳槽中加入电泳缓冲液， 使液 面刚刚没过凝胶 ； 将 3L 6L PCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混合， 点样 ； 9V/cm 恒压电泳， 直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ； 紫外检测仪下观察电泳结果， 待检贾第虫样 品能够扩增出特异性条带， 扩增条带为 165bp， 电泳结果见图 1。 0038 5、 制备焦磷酸测序单链模板 0039 使用 50l 标记有生物素的 PCR 产物与 200g 链霉亲和素包被的磁珠， 在室温 25下孵育20分钟， 用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起， 然后在70乙 醇中清洗 5s ； denatur。
29、eation buffer 洗 5s ； 最后移到 washing buffer 中清洗 10s ； vaccum prep tool 放入含有 tim 基因测序引物的板中， 摇动， 释放磁珠。将样品放入 80烘箱 2 分 钟， 再冷却到室温。 0040 6、 焦磷酸测序 0041 在焦磷酸测序仪 (PYROMARK ID) 上进行反应， 室温条件下， 加样使用 600 毫巴 /8 毫秒的加样压力和时间， 每轮反应时间 65 秒， 引物链随着不同 dNTP 的加入而延伸 ； 随着核 酸的结合， CCD 摄像机检测到发出的光信号， tim 基因焦磷酸测序结果见图 2， 读取的序列为 GCCTTC。
30、TTGG CGCTTTGCTC GTCGGTCTCC。 0042 7、 结果判定 0043 粪便样品的 tim 基因扩增片段长度为 165bp， 与预期一致 ； 经过焦磷酸测序， 测定 的 tim 序列与贾第鞭毛虫目标序列一致， 为 ： GCCTTCTTGG CGCTTTGCTC GTCGGTCTCC， 因此判 定样品中含有贾第鞭毛虫。 0044 实施例 2 ： 检测某水域中是否含有贾第鞭毛虫 0045 1、 设计特异性引物序列 0046 同实施例 1。 0047 2、 提取待测样品的 DNA ： 0048 采集一定体积水样 ( 水源水 10L， 滤后水 50L)， 经 1m 孔径滤膜过滤后，。
31、 依次用 PBS+0.1 Tween80、 乙醇、 超纯水清洗容器， 滤膜用 40mL 丙酮溶解， 在 3000r/min 下离心去 上清液后， 再次加入 40mL 丙酮溶液并离心去上清液， 得到相应沉淀。 0049 向浓缩得到的沉淀中加入 6mL 的 PBS+0.1 Tween80， 用振荡器振荡 2min， 混合均 说 明 书 CN 103103276 A 7 5/6 页 8 匀后将溶液均匀分至 4 个 15mL 离心管中， 向每个离心管中加入 3mL 离心介质 Percoll- 蔗 糖， 于 20、 3000r/min 下离心 10min， 此时溶液分成 3 层， 取出中间层放入新的离心。
32、管中。 采用DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver3.0)， 按照说 明书进行中间层 DNA 的提取。 0050 3、 以贸第鞭毛虫 tim 引物进行 PCR 扩增 0051 同实施例 1。 0052 4、 进行琼脂糖凝胶电泳 ： 0053 将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 取 2g 琼脂糖， 于 100mL 电泳缓冲液中加热， 充分 溶化， 加入溴化乙锭贮存液至终浓度为 0.5g/mL， 制胶， 在电泳槽中加入电泳缓冲液， 使液 面刚刚没过凝胶 ； 将 3L 6L PCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混合， 点样。
33、 ； 9V/cm 恒压电泳， 直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ； 紫外检测仪下观察电泳结果。 0054 待检样品 PCR 扩增未扩增出特异性条带， 因此判定某水域中的样品中不含有贾第 鞭毛虫。 0055 实施例 3 ： 检测不同原虫样品中是否含有贾第鞭毛虫基因 0056 1、 设计特异性引物序列 0057 同实施例 1。 0058 2、 提取待测样品的 DNA 0059 2.1 贾第虫虫株来源 0060 用于本实验的贾第鞭毛虫株购自澳大利亚 BTF 公司。2.2 对照 DNA 样本 0061 日本血吸虫 (Schistosoma japonicum)、 刚地弓形虫 (Toxoplasma go。
34、ndii)、 微小 隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、 溶组织内阿米巴虫(Entamoeba histolytica)DNA样 本为上海兽医研究所提供。 0062 2.3 贾第虫包囊的分离纯化及 DNA 制备 0063 将含贾第虫包囊的样品经 100 目细铜网过滤， 滤液离心 (2000r/min， 10min)， 弃上 清， 沉淀加水至 2mL 3mL ； 取另一离心管， 加入 0.85mol/L 蔗糖 5mL ； 将上述包囊液加入到 蔗糖上层， 离心(2000r/min， 5min)， 缓慢吸取蔗糖上层含包囊悬液2mL， 洗2次。 用血球计数 板计数纯化包囊数目。向。
35、上述纯化的包囊沉淀中加入 400L 裂解液 ( 含蛋白酶 K200g/ mL)， 重悬包囊， 56温育 3h， 期间混匀多次 ； 用酚 - 氯仿法分别抽提贾第虫包囊 DNA。 0064 3、 以贾第鞭毛虫 tim 引物进行 PCR 扩增 0065 扩增溶液中加入 2PCR buffer(10 倍聚合酶链式 Mix 反应液 )12.5L， 10pmol/ L 上游引物和下游引物各 0.5L， 将提取的待测样品 DNA 和对照 DNA 样本分别加入到反 应体系中， DEPC 水补足体积至 25L， PCR 循环条件为 ： 94预变性 5min 后， 进入 94变性 30s， 46退火 30s， 7。
36、2延伸 30s， 共循环 50 次 ； 然后 72再延伸 10min. 0066 4、 进行琼脂糖凝胶电泳 0067 将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 取 2g 琼脂糖， 于 100mL 电泳缓冲液中加热， 充分 溶化， 加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5g/mL， 制胶。 在电泳槽中加入电泳缓冲液， 使液 面刚刚没过凝胶 ； 将 3L 6L PCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混合， 点样 ； 9V/cm 恒压电泳， 直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ； 紫外检测仪下观察电泳结果， 待检贾第虫样 品能够扩增出特异性条带， 扩增条带为 165bp， 其他原虫 DNA 样本均未检测到条带。 说。
37、 明 书 CN 103103276 A 8 6/6 页 9 0068 5、 制备焦磷酸测序单链模板 0069 使用扩增出条带的PCR产物50l与200g链霉亲和素包被的磁珠， 在室温25 下孵育20分钟， 用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起， 然后在70乙醇中 清洗5s ； denatureation buffer洗5s ； 最后移到washing buffer中清洗10s ； vaccum prep tool 放入含有 tim 基因测序引物的板中， 摇动， 释放磁珠。将样品放入 80烘箱 2 分钟， 再 冷却到室温。 0070 6、 焦磷酸测序 0071 在焦磷。
38、酸测序仪 (PYROMARK ID) 上进行反应， 室温条件下， 加样使用 600 毫 巴 /8 毫秒的加样压力和时间， 每轮反应时间 65 秒， 引物链随着不同 dNTP 的加入而 延伸 ； 随着核酸的结合， CCD 摄像机检测到发出的光信号， 读取的序列为 GCCTTCTTGG CGCTTTGCTCGTCGGTCTCC。 0072 7、 结果判定 0073 粪便样品的 tim 基因扩增片段长度为 165bp， 与预期一致 ； 经过焦磷酸测序， 测定 的 tim 序列与贾第鞭毛虫目标序列一致， 为 ： GCCTTCTTGG CGCTTTGCTC GTCGGTCTCC， 因此判 定样品中含有贾第鞭毛虫。 说 明 书 CN 103103276 A 9 1/3 页 10 0001 序 列 表 CN 103103276 A 10 2/3 页 11 0002 0003 序 列 表 CN 103103276 A 11 3/3 页 12 序 列 表 CN 103103276 A 12 1/2 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 103103276 A 13 2/2 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 103103276 A 14 。