共表达两个独立的抗关节炎分子TNFRFC和CTLA4FASL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用.pdf

本发明公开了共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用,将Furin裂解位点和FMDV2A自剪切肽联合运用，使得两个抗关节炎融合蛋白TNFR-Fc和CTLA4-FasL在同一重组腺相关病毒（AAV2）载体上于体外和体内均获得了独立共表达，并发挥各自的生物活性。实验证明，含有本发明重组腺相关病毒载体的重组子介导表达的TNFR-Fc和CTLA4-FasL蛋白具有与母本蛋白相同的生物活性,含有TNFR-Fc和CTLA4-FasL双融合分子的重组腺病毒载体比表达单分子的重组腺病毒载体能更有效地抑制关节炎的发展，表明其可在制备预防和治疗关节炎（特别是类风湿性关节炎）药物中应用。

权利要求书一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体，是自上游至下游依次携带有TNFR‑Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL基因的重组腺相关病毒载体。
根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：用于构建上述重组腺相关病毒载体的出发载体为pAAV2‑neo、pAAV2neo‑EF1α、pAAV2neo‑HRE或pSDAVneo‑CAG等AAV2型载体，优选为pAAV2‑neo，所述TNFR‑Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL基因位于载体pAAV2‑neo中CMV启动子和BGH polyA尾两端的反向末端重复序列(ITR)之间。
根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。
一种构建权利要求3所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：
1）合成编码人p75TNFR胞外区（NCBI Genebank No.NM_001066.2）的基因，在合成的人p75TNFR胞外区基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Kpn I识别位点、Kozak序列、起始密码ATG、TNFR的原始信号肽、人p75TNFR胞外区基因、限制性内切酶Asc I和Pac I识别位点、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，在引入Asc I和Pac I识别位点时为了下游基因的正确编码，在Asc I识别位点后加了一个额外的碱基A、在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的人p75TNFR胞外区基因命名为(KpnI)Kozak‑ATG‑s ignal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA（EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中；
2）合成编码IgG1Fc（NCBI GenBank:AJ294730.1）的基因，在合成的IgG1Fc基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Asc I识别位点、IgG1Fc基因、6×His标签和限制性内切酶Pac I识别位点，并在Asc I识别位点后加一个额外的碱基A，在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的IgG1Fc基因命名为(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中；
3）用限制性内切酶Kpn I和EcoR I将步骤1）合成的人p75TNFR胞外区基因(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA（EcoRI）从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Kpn I和EcoR I双酶切的载体pAAV2‑neo中，得到携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR，然后用限制性内切酶Asc I和Pac I将步骤2）合成的IgG1Fc基因(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Asc I和Pac I双酶切的携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR中，得到携带有TNFR‑Fc融合基因的重组载体，命名为TRFC，在载体TRFC中，TNFR‑Fc融合基因可命名为(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR‑(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)‑TGA（EcoRI)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列；
4）合成5’端连接有Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列和2A自剪切肽编码序列的CTLA4‑FasL融合基因，在合成的CTLA4‑FasL融合基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶PacI识别位点、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列、人抑瘤素M信号肽编码序列、人CTLA4胞外区基因、人FasL胞外区基因、Flag标签编码序列、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，将此合成的CTLA4‑FasL融合基因命名为(PacI)Furin‑2A‑M
signal‑CTLA4‑FasL‑Flag‑TGA(EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列4所示，将该融合基因用限制性内切酶Pac I和EcoR I酶切后，将其连接入经同样酶双酶切的TRFC载体中，得到自上游至下游依次携带有TNFR‑Fc融合基因、Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL融合基因的重组腺相关病毒载体，命名为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，在载体TFCF中，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，CTLA4‑FasL融合基因的下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列。
一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒，其获得方法是将权利要求1‑3任一项所述重组腺相关病毒载体转染包装细胞，用Geneticin（G418）进行2轮加压筛选，浓度均为800μg/mL，获得的抗性生长克隆用于包装重组腺相关病毒，扩大培养筛选细胞株，用辅助病毒HSV1‑rc/ΔUL2（感染复数=0.1）感染筛选细胞株，得到共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒。
根据权利要求5所述的重组腺相关病毒，其特征在于：所述包装细胞可为293T细胞、BHK21细胞或CHO细胞，优选为BHK21细胞。
根据权利要求5或6所述的重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒载体转染包装细胞采用Engreen公司的Entranster‑H纳米高分子聚合物转染试剂。
权利要求1‑3任一项所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体在制备预防和/或治疗关节炎药物中的应用。
权利要求5‑7任一项所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒在制备预防和/或治疗关节炎药物中的应用。
根据权利要求8或9所述应用，其特征为，所述关节炎为类风湿性关节炎。

说明书共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体，特别是涉及一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与其在制备预防和治疗关节炎（特别是类风湿性关节炎）药物中的应用。 
背景技术
类风湿性关节炎（RA）是一种主要累及关节的慢性自身免疫病，其特征为炎性细胞浸润和滑膜增生，导致关节软骨和骨破坏。RA发病机制复杂，许多因素参与其中，包括关键的促炎细胞因子TNFα和T淋巴细胞，二者被认为在RA进程中发挥重要作用。生物治疗尤其是TNF抑制剂已经在RA临床治疗中取得了巨大成功，包括p75TNFR‑Fc融合蛋白，然而，仍然有相当一部分病人对此种治疗无效，因此迫切需要其它辅助或协同治疗方法。此外，鉴于RA发病机制的复杂性，联合阻断不同致病因素已成为很有吸引力的治疗策略，尤其是以T淋巴细胞为靶联合TNFα抑制。一些动物研究提示，联合阻断T淋巴细胞和TNFα，很可能比单独阻断TNFα能更有效地治疗RA。因此，TNFα抑制剂TNFR‑Fc和T淋巴细胞抑制剂CTLA4‑FasL的联合应用具有一定发展前景。 
T淋巴细胞在类风湿性关节炎（RA）发病的起始和进展过程中都发挥关键作用，在RA患者的关节腔和滑膜中均可观察到大量浸润的T淋巴细胞，因此清除T淋巴细胞成为RA治疗的一种有效策略。CTLA4‑FasL融合分子将CTLA4胞外区和FasL胞外区融合在一起，一方面通过CTLA4功能域阻断T淋巴细胞激活的共刺激信号，另一方面通过FasL功能域诱导活化T淋巴细胞凋亡，从而通过共刺激阻断和凋亡诱导发挥对T淋巴细胞的双重抑制作用。在前期研究中，首先证明腺相关病毒 
(Adeno‑associated virus，AAV)介导的CTLA4‑FasL基因转移能够有效抑制大鼠佐剂诱导性关节炎（AIA，一种T淋巴细胞依赖的RA动物模型），并明显减少关节中T淋巴细胞浸润，进一步研究表明CTLA4‑FasL比单独FasL分子能更有效地阻止关节炎的发展。 
以往的抗TNFα和抗T淋巴细胞联合治疗研究，应用的都是抗TNFα抗体和抗CD3或CD4抗体。鉴于高循环水平治疗蛋白在人体内产生的副作用，使用抗体或者蛋白进行联合治疗并不利于今后的临床应用，例如，使用etanercept（抗TNFα蛋白）和anakinra（抗IL‑1抗体）会增加严重感染的风险。此外，包括TNFα抗体在内的重组蛋白体内半衰期比较短，需要反复注射，费用昂贵。因此使用双抗体或蛋白联 合治疗RA并不是理想的策略。 
内部核糖体进入位点(internal ibosome entry site，IRES)是小RNA病毒类中5’端非翻译区中的一段序列，其二级结构和三级结构构成了蛋白质翻译过程中核糖体的登陆平台，40s核糖体亚单位可以不依赖5’端帽子结构而在内部结合到mRNA上，从而直接对其后的结构基因进行翻译。IRES的这一特点可应用于构建同时表达两个基因的双顺反子真核表达载体。IRES是一个传统的介导双基因表达原件，但是由于其存在一些缺陷严重影响了其在多顺反子载体构建中的应用，主要有：（1）转录起始效率较低，通常造成下游基因明显低表达，IRES介导的上、下游基因表达量不平衡，通常下游基因的表达量仅是上游的20％‑50％；(2)IRES自身结构较大，其应用常受到载体容量的限制。 
Furin裂解位点和2A自剪切序列作为一种新的技术方法，已被用于在单一开放阅读框中平衡共表达抗体重链和轻链。2A自剪切序列是由24个氨基酸组成的多肽，在最后两个氨基酸处完成自剪切，可介导上游基因和下游基因表达比例均衡，此外，2A序列肽不会引发体内特异的免疫反应。由于2A自剪切发生在2A肽C末端两个氨基酸残基之间，使得上游蛋白携带23个残留的2A肽段氨基酸，后者可能会影响上游蛋白的活性。为了消除残留的2A肽段可能产生的副影响，Furin裂解位点（RAKR）被引入到2A序列的上游，以去除残留的2A氨基酸。Furin是一种广泛存在于所有脊椎动物细胞的跨膜酶，可有效加工前体蛋白，它在许多细胞事件中发挥催化作用，并在许多疾病和感染中发挥作用。 
成功的基因治疗需要安全高效、稳定、持久表达的转基因载体。非病毒载体具有安全性高、容量大和易制备等优点，可能具有较好的应用前景，但其基因转染效率尚有待提高。尽管有多种病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等能导致外源基因高效转染与表达，然而其表现出的肝脏毒性、致炎性、免疫原性和潜在的致瘤性引起国内外学者对其安全性的深切担忧。腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科依赖病毒属，是一种对人和动物不致病的单链脱氧核糖核酸病毒。将腺相关病毒自身的编码基因去除，仅保留基因组两末端的反向末端重复序列(ITR)，使其能装载治疗基因及表达元件而产生重组腺相关病毒(rAAV)。腺相关病毒可感染多种组织细胞，能稳定、持久地表达外源基因。腺相关病毒载体理化性质稳定，是目前基因治疗所使用的各种载体中最具优势和前途的载体之一。传统制备重组腺相关病毒是采用腺病毒辅助的转染方法，然而腺病毒污染的问题是其应用的障碍。寻找新的、更安全的制备方法可以使腺相关病毒载体进一步推广应用。 
局部基因治疗是一种具有吸引力的全身蛋白递送的替代方法。在病毒基因递送载体中，AAV似乎是最有希望用于临床治疗的一类载体，而AAV2在动物研究中被应用的最多。AAV2（腺相关病毒2型）可介导目的基因在体内长期表达，而且尚未发 现由它直接引起的副作用，此外，关节中大多数细胞包括滑膜细胞和软骨细胞等均可被AAV2转导，而且AAV2似乎更倾向于转导炎性细胞，这些特点使得AAV2成为基因治疗RA的一个理想工具。AAV2介导的关节内基因转移已被证实是一种在关节局部高水平表达治疗蛋白从而阻止蛋白全身分布及副作用的有效策略。 
发明内容
本发明的目的是提供一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL，且表达量平衡的重组腺相关病毒载体。 
本发明所提供的共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体，是自上游至下游依次携带有TNFR‑Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL基因的重组腺相关病毒载体。 
用于构建上述重组腺相关病毒载体的出发载体为pAAV2‑neo、pAAV2neo‑EF1α、pAAV2neo‑HRE或pSDAVneo‑CAG等AAV2型载体，优选为pAAV2‑neo，所述TNFR‑Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL基因位于载体pAAV2‑neo中CMV启动子和BGH polyA尾两端的反向末端重复序列(ITR)之间。 
所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。 
本发明的另一个目的是提供一种构建上述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体的方法，可包括以下步骤： 
1）合成编码人p75TNFR胞外区（NCBI Genebank No.NM_001066.2）的基因，在合成的人p75TNFR胞外区基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Kpn I识别位点、Kozak序列、起始密码ATG、TNFR的原始信号肽、人p75TNFR胞外区基因、限制性内切酶Asc I和Pac I识别位点、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoRI识别位点，在引入Asc I和Pac I识别位点时为了下游基因的正确编码，在Asc I识别位点后加了一个额外的碱基A、在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的人p75TNFR胞外区基因命名为 
(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA（EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中； 
2）合成编码IgG1Fc（NCBI GenBank:AJ294730.1）的基因，在合成的IgG1Fc基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Asc I识别位点、IgG1Fc基因、6×His标签和限制性内切酶Pac I识别位点，并在Asc I识别位点后加一个额外的碱基A，在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的IgG1Fc基因命名为(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中； 
3）用限制性内切酶Kpn I和EcoR I将步骤1）合成的人p75TNFR胞外区基因 (KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA（EcoRI）从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Kpn I和EcoR I双酶切的载体pAAV2‑neo中，得到携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR，然后用限制性内切酶Asc I和Pac I将步骤2）合成的IgG1Fc基因(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Asc I和Pac I双酶切的携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR中，得到携带有TNFR‑Fc融合基因的重组载体，命名为TRFC，在载体TRFC中，TNFR‑Fc融合基因可命名为(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR‑(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)‑TGA（EcoRI)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列； 
4）合成5’端连接有Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列和2A自剪切肽编码序列的CTLA4‑FasL融合基因，在合成的CTLA4‑FasL融合基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶PacI识别位点、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列、人抑瘤素M信号肽编码序列、人CTLA4胞外区基因、人FasL胞外区基因、Flag标签编码序列、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，将此合成的CTLA4‑FasL融合基因命名为(PacI)Furin‑2A‑M 
signal‑CTLA4‑FasL‑Flag‑TGA(EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列4所示，将该融合基因用限制性内切酶Pac I和EcoR I酶切后，将其连接入经同样酶双酶切的TRFC载体中，得到自上游至下游依次携带有TNFR‑Fc融合基因、Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL融合基因的重组腺相关病毒载体，命名为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，在载体TFCF中，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，CTLA4‑FasL融合基因的下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列。 
本发明还提供了一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒，其获得方法是将前述重组腺相关病毒载体转染包装细胞，用Geneticin（G418）进行2轮加压筛选，浓度均为800μg/mL，获得的抗性生长克隆用于包装重组腺相关病毒，扩大培养筛选细胞株，用辅助病毒HSV1‑rc/ΔUL2（感染复数=0.1）感染筛选细胞株，得到共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒。 
所述包装细胞可为293T细胞、BHK21细胞或CHO细胞，优选为BHK21细胞。 
所述重组腺相关病毒载体转染包装细胞采用Engreen公司的Entranster‑H纳米高分子聚合物转染试剂。 
所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体在制备预防和治疗关节炎（特别是类风湿性关节炎）药物中的应用也属于本发明内容。 
所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒在制备预防和/或治疗关节炎药物中的应用也属于本发明内容。 
所述关节炎为类风湿性关节炎。 
采用以上方案，本发明提供了一个AAV2基因转移系统，即在单一AAV2载体上同时独立表达抗TNF蛋白（TNFR‑Fc）和抗T细胞蛋白（CTLA4‑FasL）。本发明将Furin裂解位点和FMDV2A自剪切肽联合运用，使得两个抗关节炎融合蛋白TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL在同一重组腺相关病毒（AAV2）载体上于体外和体内均获得了独立共表达，并发挥各自的生物活性。实验证明，2A介导的分离上游和下游蛋白的裂解通路和Furin催化的去除2A残留肽的裂解活性于体外和体内均发挥了相应作用，并且二者的裂解是完全的，含有本发明重组腺相关病毒载体的重组子介导表达的TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL蛋白具有与母本蛋白相同的生物活性；体内动物组织学观察结果表明，含有TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL双融合分子的重组腺病毒载体比表达单分子的重组腺病毒载体能更有效地抑制关节炎的发展。本发明的有益效果是： 
(l)在构建本发明所用载体时去掉了腺相关病毒本身的基因，避免了病毒带来的免疫反应等副作用。制备（包装）过程中所涉及的质粒等均为药理学可接受材料，安全无毒。此外，腺相关病毒是一种安全的病毒，大多数人曾受到过其感染，但从未发现它能引起任何疾病。因此，本发明具有较高的生物安全性。 
(2)转染细胞采用的EntransterTM系列转染试剂由纳米高分子聚合物组成，分子内含有许多氨基，在生理PH下会发生质子化，这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷，使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。转染复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA转移进入细胞，形成内含体(endosome)，DNA从内含体释放，进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。通过纳米技术生产出的转染试剂在纳米尺度表现出结合保护DNA能力强、毒性低的独特性能。 
(3)本发明能够感染多种类型的细胞以及分化和不分化细胞，可以应用于体外的培养细胞，也可以用于整体实验动物或者患者，应用范围广，感染效率高。 
(4)独立表达的TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL联合应用较单个蛋白能发挥更好的抗关节炎效果。 
(5)本发明给药途径可以直接注射给药，可使治疗基因在体内获得长期、稳定的表达。 
(6)本发明载体的制备方法所需设备要求不高，腺相关病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和用药过程中与很多传统药物条件相似，适合推广应用。 
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 
附图说明
图1为共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体TFCF构建方法的示意图 
图2为不同重组质粒（TRFC、CTFA、TFCF）的转染子预期生物合成TNFR‑Fc和/或CTLA4‑FasL融合蛋白的示意图 
图3为Furin裂解位点和2A自剪切肽联合序列在单一开放阅读框中调解TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白体外表达方式的ELISA检测结果 
图4为Furin裂解位点和2A自剪切肽联合序列在单一开放阅读框中调解TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL蛋白体外表达方式Western blot检测结果 
图5为在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的TNFR‑Fc对TNFα的体外中和活性检测结果 
图6为在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的CTLA4‑FasL对B7配体和Fas受体的结合活性检测结果 
图7为实施例4的检测鉴定结果；其中：A幅显示重组AAV病毒rAAV.TFCF中目的基因的PCR检测结果,B幅显示在注射rAAV.TFCF病毒的炎性关节中TFCF重组子的mRNA表达水平检测结果,C幅显示TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白体内表达水平的Western blot检测结果 
图8为包装有重组质粒TFCF的重组AAV病毒rAAV.TFCF抑制大鼠关节炎的组织学观察结果 
具体实施方式
本发明提供了一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体，是自上游至下游依次携带有TNFR‑Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL基因的重组腺相关病毒载体。 
用于构建上述重组腺相关病毒载体的出发载体为pAAV2‑neo、pAAV2neo‑EF1α、pAAV2neo‑HRE或pSDAVneo‑CAG等AAV2型载体，优选为pAAV2‑neo，所述TNFR‑Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL基因位于载体pAAV2‑neo中CMV启动子和BGH polyA尾两端的反向末端重复序列(ITR)之间。 
具体来讲，所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体可简称为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。 
本发明还提供了一种构建上述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体的方法，可包括以下步骤： 
1）合成编码人p75TNFR胞外区（NCBI Genebank No.NM_001066.2）的基因，在合成的人p75TNFR胞外区基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Kpn I识别位点、Kozak序列、起始密码ATG、TNFR的原始信号肽、人p75TNFR胞外区基因、限制性内切酶Asc I和Pac I识别位点、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，在引入Asc I和Pac I识别位点时为了下游基因的正确编码，在Asc I识别位点后加了一个额外的碱基A、在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的人p75TNFR胞外区基因命名为 
(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA（EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中； 
2）合成编码IgG1Fc（NCBI GenBank:AJ294730.1）的基因，在合成的IgG1Fc基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Asc I识别位点、IgG1Fc基因、6×His标签和限制性内切酶Pac I识别位点，并在Asc I识别位点后加一个额外的碱基A，在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的IgG1Fc基因命名为(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中； 
3）用限制性内切酶Kpn I和EcoR I将步骤1）合成的人p75TNFR胞外区基因(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA（EcoRI）从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Kpn I和EcoR I双酶切的载体pAAV2‑neo中，得到携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR，然后用限制性内切酶Asc I和Pac I将步骤2）合成的IgG1Fc基因(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Asc I和Pac I双酶切的携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR中，得到携带有TNFR‑Fc融合基因的重组载体，命名为TRFC，在载体TRFC中，TNFR‑Fc融合基因可命名为(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR‑(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)‑TGA（EcoRI)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列； 
4）合成5’端连接有Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列和2A自剪切肽编码序列的CTLA4‑FasL融合基因，在合成的CTLA4‑FasL融合基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶PacI识别位点、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列、人抑瘤素M信号肽编码序列、人CTLA4胞外区基因、人FasL胞外区基因、Flag标签编码序列、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，将此合成的CTLA4‑FasL融合基因命名为(PacI)Furin‑2A‑M 
signal‑CTLA4‑FasL‑Flag‑TGA(EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列4所示，将该融合基因用限制性内切酶Pac I和EcoR I酶切后，将其连接入经同样酶双酶切的TRFC载体中，得到自上游至下游依次携带有TNFR‑Fc融合基因、Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL融合基因的重组腺相关病毒载体，命名为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，在载体TFCF中，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，CTLA4‑FasL融合基因的下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列。 
本发明还提供了一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒，其获得方法是将上述重组腺相关病毒载体转染包装细胞，用Geneticin（G418）进行2轮加压筛选，浓度均为800μg/mL，获得的抗性生长克隆用于包装重组腺相关病毒，扩大培养筛选细胞株，用辅助病毒HSV1‑rc/ΔUL2（感染复数=0.1）感染筛选细胞株，得到共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒。 
在上述重组腺相关病毒的获得方法中，所述包装细胞可为293T细胞、BHK21细胞或CHO细胞等，优选为BHK21细胞。 
所述重组腺相关病毒载体转染包装细胞采用Engreen公司的Entranster‑H纳米高分子聚合物转染试剂。 
本发明还提供了共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体在制备预防和治疗关节炎（特别是类风湿性关节炎）药物中的应用。 
本发明还提供了共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒在制备预防和治疗关节炎（特别是类风湿性关节炎）药物中的应用。 
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。 
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。 
所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由上海英骏公司完成。 
实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。 
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。 
材料和抗体 
重组TNFα蛋白购于Peprotech公司；放射菌素D购于Sigma公司；细胞计数试剂盒购于Dojindo公司。小鼠抗TNFR抗体、羊抗CTLA4抗体、兔抗FasL抗体、羊IgG1、 兔IgG1均购于Santa Cruz公司。所有二抗包括辣根酶标记的羊抗人IgG Fc、羊抗兔IgG(H+L)、兔抗羊IgG(H+L)和FITC标记的羊抗兔IgG(H+L)、兔抗羊IgG(H+L)均购于Jackson Immunoresearch Laboratories。 
实施例1、构建共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体 
如图1所示，本发明共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的重组腺相关病毒载体的构建方法，包括以下步骤： 
1）由上海英骏公司合成编码人p75TNFR胞外区（NCBI Genebank No.NM_001066.2）的基因，在合成的人p75TNFR胞外区基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Kpn I识别位点、Kozak序列（GCCGCCACC）、起始密码ATG、TNFR的原始信号肽（63bp）、人p75TNFR胞外区基因、限制性内切酶Asc I和Pac I识别位点、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，在引入Asc I和Pac I识别位点时为了下游基因的正确编码，在Asc I识别位点后加了一个额外的碱基A、在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的人p75TNFR胞外区基因命名为(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA（EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中； 
2）由上海英骏公司合成编码IgG1Fc（NCBI GenBank:AJ294730.1）的基因，在合成的IgG1Fc基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Asc I识别位点、IgG1Fc基因、6×His标签序列和限制性内切酶Pac I识别位点，并在Asc I识别位点后加一个额外的碱基A，在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的IgG1Fc基因命名为(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因克隆入载体pGEM‑T中； 
3）用限制性内切酶Kpn I和EcoR I将步骤1）合成的人p75TNFR胞外区基因(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR(AscI‑PacI)‑TGA(EcoRI)从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Kpn I和EcoR I双酶切的载体pAAV2‑neo中，得到携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR，然后用限制性内切酶Asc I和Pac I将步骤2）合成的IgG1Fc基因(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)从载体pGEM‑T上切下，将其连接入同样经Asc I和Pac I双酶切的携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR中，得到携带有TNFR‑Fc融合基因的重组载体，命名为TRFC，在载体TRFC中，TNFR‑Fc融合基因可命名为(KpnI)Kozak‑ATG‑signal‑TNFR‑(AscI)IgG1Fc‑His(PacI)‑TGA（EcoRI)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列； 
4）由上海英骏公司合成5’端连接有Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列和2A自剪切肽编码序列的CTLA4‑FasL融合基因，在合成的CTLA4‑FasL融合基因中 自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Pac I识别位点、Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列(AGGGCCAAGAGG)、2A自剪切肽氨基酸 
(APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)编码序列 
(GCACCGGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCC)、人抑瘤素M信号肽、人CTLA4胞外区基因、人FasL胞外区基因、Flag标签编码序列、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，将此合成的CTLA4‑FasL融合基因命名为(PacI)‑Furin‑2A‑M signal‑CTLA4‑FasL‑Flag‑TGA(EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列4所示，将该融合基因用限制性内切酶Pac I和EcoR I酶切后，将其连接入经同样酶双酶切的载体TFCF中，得到自上游至下游依次携带有TNFR‑Fc融合基因、Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4‑FasL融合基因的重组腺相关病毒载体 
(pAAV2/TNFR‑Fc‑Furin‑2A‑CTLA4‑FasL)，命名为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，在载体TFCF中，TNFR‑Fc融合基因与CTLA4‑FasL融合基因的5’端携带有各自的信号肽序列，在两个融合基因之间含有Furin‑2A序列，此外，TNFR‑Fc融合基因的上游为CMV启动子，CTLA4‑FasL融合基因的下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列。 
以TFCF质粒为模板，应用CtFaP5引物（CCGGAATTCGCCGCCACCATGGGGGTACTGCTC）和CtFaP3引物（GGAAGATCTTCATTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAGTC）进行PCR扩增，扩增得到的目的基因序列为（EcoRI）Kozak‑抑瘤素M信号肽‑CTLA4胞外区‑FasL胞外区‑Flag标签‑TGA（BglII），将目的基因用限制性内切酶EcoR I和Bgl II进行双酶切后，将其连接入经同样酶双酶切的pAAV2/neo载体中，得到CTLA4‑FasL表达质粒，命名为CTFA，在载体CTFA中，CTLA4‑FasL融合基因的上游为CMV启动子，下游为BGH polyA尾，两端各有一个ITR序列。 
实施例2、Furin裂解位点和2A自剪切肽在单一开放阅读框中调解TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL蛋白的体外表达方式验证 
如图2所示，分别利用TNFR和CTLA4特异的天然信号肽，在TFCF转染子的培养上清中预期可获得TNFR‑Fc融合蛋白和CTLA4‑FasL融合蛋白的分泌性表达。为在同一个开放阅读框中获得TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白的独立共表达，Furin裂解位点和2A自剪切肽被引入到两个分子之间，由于2A自剪切发生在2A肽C末端最后两个氨基酸之间，上游的TNFR‑Fc融合蛋白的C端将携带有额外的23个来自2A肽的氨基酸。为了去除残留的2A肽可能引起的副作用，在2A序列和Fc片段之间引入Furin裂解序列，从而使Fc端残留的氨基酸仅为RA。因此在2A和Furin裂解序列的共同调解下，在单一TFCF载体中可以独立表达TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL两个融合蛋白，在TNFR‑Fc融合蛋白的C端携带有两个额外的氨基酸残基RA，在CTLA4‑FasL 融合蛋白的N端携带有一个额外的氨基酸残基P，没有造成过多的2A肽序列残留。用下述方法进行TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白体外表达方式的检测及验证： 
一、ELISA法检测Furin裂解位点和2A自剪切肽在单一开放阅读框中调解TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL蛋白的体外表达方式 
1、转染293T细胞 
在准备转染前1天，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基（Hyclone)在6孔板上培养293T细胞（购自ATCC），每孔接种量为5×105，置于37℃、CO2培养箱中培养。使用DNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化重组质粒TFCF、TRFC、CTFA或PGFP(阴性对照，载体pAAV2‑neo多克隆位点中EcoR I和Bgl II酶切位点之间插入有GFP基因的重组表达载体)，用Engreen公司的Entranster‑H转染试剂将上述重组质粒分别转染6孔板培养的293T细胞，具体转染方法为:质粒DNA（1μg）加入到50μl OPTI‑MEM无血清培养液中，充分混匀；将1μl EntransferTM‑H转染试剂加入到50μlOPTI‑MEM无血清培养液中，充分混匀，室温静置5分钟后加入到上述质粒溶液中，充分混匀室温静置15分钟，将含有10％FBS的完全培养基加入到转染复合物中，轻柔混匀；去除培养孔中原有培养基，加入转染培养液。转染4小时后，去除转染液，用不含血清的新鲜DMEM培养液继续培养48小时，收集转染细胞培养上清液。 
2、ELISA法检测在无血清培养液中靶蛋白TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的表达方式 
用ELISA法检测转染TFCF、TRFC（阳性对照）、CTFA或PGFP(阴性对照)质粒的细胞培养上清液中TNFR‑Fc的表达情况，具体方法为：重组人TNFα蛋白以0.05M的碳酸盐包被液（pH9.6）稀释为终浓度2μg/mL，包被于96孔板，100μl/孔，4℃过夜，设3个复孔；以3％BSA/PBS溶液封闭，37℃封闭2小时；分别加入转染不同质粒的细胞培养上清，以PBS为空白对照，100μl/孔，37℃孵育2小时；以PBS洗涤后，加入2μg/mL抗TNFR抗体，37℃孵育1h，然后加入0.4μg/mL辣根酶标记的羊抗小鼠二抗，37℃孵育50min（或者此步骤以直接加入0.25μg/mL辣根酶标记的抗IgG Fc抗体代替，37℃孵育50min），最后以TMB底物液显色，检测450nm吸光度值。每项操作步骤之间均以PBS洗板3次。结果参见图3之A幅所示，TFCF和TRFC样品均为明显阳性，表明在TFCF质粒中位于上游的TNFR‑Fc融合分子获得了良好表达。 
用ELISA方法检测转染TFCF、TRFC、CTFA(阳性对照)或PGFP(阴性对照)质粒的细胞培养上清液中CTLA4‑FasL的表达情况，具体方法为：96孔板分别以抗CTLA4抗体（或抗FasL抗体）包被(5μg/mL)，4℃过夜，设3个复孔；以3％BSA/PBS溶液封闭，37℃封闭2小时；分别加入转染不同质粒的细胞培养上清，以PBS为空白对照，100μl/孔，37℃孵育2小时；洗涤后分别以抗FasL抗体或（抗CTLA4抗体）(2μg/mL)孵育，随后加入相应的辣根酶标记的羊抗兔或（兔抗羊）二抗 (0.4μg/mL)，37℃孵育50分钟，最后以TMB底物液显色，检测450nm吸光度值。每项操作步骤之间均以PBS洗板3次。结果如图3之B幅所示，用抗CTLA4抗体包板，用FasL抗体进行检测，结果TFCF和CTFA样品呈现明显阳性；在平行实验中，用抗FasL抗体包被，用CTLA4抗体进行检测，获得了相似的阳性实验结果，表明在TFCF质粒中位于下游的CTLA4‑FasL融合分子获得了良好表达。 
以上检测结果表明，Furin裂解位点和2A自剪切肽联合序列（furin‑2A）可有效介导TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL在同一开放阅读框中共表达。 
此外，用ELISA检测TFCF转染细胞培养上清中排除TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL做为共同体表达的可能性，以初步确定TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL是否在Furin和2A的调解下获得了独立表达，具体方法为：96孔板以抗CTLA4抗体(5μg/mL)包被，4℃过夜，设3个复孔；以3％BSA/PBS溶液封闭，37℃封闭2小时；分别加入转染不同质粒的细胞培养上清，以PBS作为空白对照，随后加入酶标抗IgG Fc抗体(0.25μg/mL)，37℃孵育50分钟，最后以TMB底物液显色，检测450nm吸光度值。每项操作步骤之间均以PBS洗板3次。如果Furin和2A没有实现有效切割或切割不完全，TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL将作为一个共同体获得表达，抗CTLA4抗体结合抗IgGFc抗体检测的结果应该为阳性。结果如图3之C幅所示，TFCF转染上清与其它实验组一样均为明显阴性，说明TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白应该被独立表达而非作为一个共同体表达。 
二、Western blot检测Furin裂解位点和2A自剪切肽在单一开放阅读框中调解TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL蛋白的体外表达方式 
1、转染293T细胞 
将重组质粒TFCF、TRFC、CTFA或PGFP(阴性对照，载体pAAV2‑neo多克隆位点中EcoR I和Bgl II酶切位点之间插入有GFP基因的重组表达载体)分别转染293T细胞（购自ATCC），转染方法与检测一相同。转染4小时后，去除转染液，用不含血清的新鲜DMEM培养液继续培养48小时，收集转染细胞培养上清液。 
2、用Western blot检测在无血清培养液中靶蛋白TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的表达方式 
为进一步明确在Furin‑2A双裂解序列的调解下，上游TNFR‑Fc和下游CTLA4‑FasL融合蛋白是否像预期那样获得独立表达，用Western blot检测在无血清培养液中靶蛋白TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL的表达方式，具体方法如下： 
1）检测TNFR‑Fc靶蛋白：对转染细胞培养上清液进行8％（非还原）或10％（还原）SDS‑PAGE蛋白电泳，转尼龙膜，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2小时。对于TNFR‑Fc靶蛋白的检测，转印膜以辣根酶标记的抗IgG Fc抗体进行孵育，洗涤后用ECL底物液显色并曝光于X光片。所有的抗体均以含有5％脱脂奶粉的TBST溶 液稀释。结果如图4之A所示，在非还原条件下（左图），于TFCF转染细胞培养上清液中检测到一条明显的分子量在130‑140kDa条带，与TNFR‑Fc二聚体分子的蛋白分子量一致，在下面有一条较弱的65‑70kDa条带为TNFR‑Fc单体分子，以上两条条带均与母本对照TRFC转染液中检测到的蛋白条带大小一致；在还原条件下（右图），130‑140kDa大分子量条带消失（原因是二聚体分子解离成单体），仅有65‑70kDa条带；在CTFA和PGFP转染细胞培养上清液中则均未检测到反应条带。 
2）检测CTLA4‑FasL靶蛋白：对转染细胞培养上清液进行10％（还原）SDS‑PAGE蛋白电泳，转尼龙膜，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2小时。对于CTLA4‑FasL靶蛋白的检测，转印膜以抗CTLA4抗体或抗FasL一抗进行孵育，洗涤后以酶标二抗兔抗羊或羊抗兔进行孵育，条带用ECL底物液显色并曝光于X光片。所有的抗体均以含有5％脱脂奶粉的TBST溶液稀释。结果如图4之B所示，用抗FasL抗体（左图）或抗CTLA4抗体（右图）于还原条件下，在TFCF和CTFA转染上清中均检测到分子量为43‑45kDa大小的条带，与CTLA4‑FasL蛋白分子量一致，而在TRFC和PGFP转染上清中则未检测到反应条带。 
此外，如果Furin和2A并没有发挥有效的切割作用，在还原条件下将会检测一条额外的110‑120kDa大小条带（TNFR‑Fc+Furin‑2A+CTLA4‑FasL）。实际上不论应用抗IgG Fc抗体、抗FasL抗体还是抗CTLA4抗体均未检测到这样的条带，表明Furin裂解位点和2A自剪切肽均发挥了有效并完全的切割作用，在Furin裂解位点和2A自剪切肽联合序列（Furin‑2A）的调解下，TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白获得了独立表达。 
实施例3、在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白的生物活性分析 
一、在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的TNFR‑Fc对TNFα的体外中和活性检测 
1、转染293T细胞 
将重组质粒TFCF、TRFC、CTFA或PGFP(阴性对照，载体pAAV2‑neo多克隆位点中EcoR I和Bgl II酶切位点之间插入有GFP基因的重组表达载体)分别转染293T细胞（购自ATCC），转染方法与实施例2中的检测一相同。转染4小时后，去除转染液，用不含血清的新鲜DMEM培养液继续培养48小时，收集转染细胞培养上清液。 
2、在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的TNFR‑Fc对TNFα的体外中和活性检测 
使用对TNFα杀伤敏感的L929细胞，进行体外TNFα抑制分析，以确定TFCF质粒表达的TNFR‑Fc蛋白对TNFα的中和活性，并以表达TNFR‑Fc母本蛋白的TRFC质粒为阳性对照，以表达CTLA4‑FasL母本蛋白的CTFA和PGFP质粒为阴性对照。具体检测方法 为：将L929细胞（对TNFα细胞毒性敏感），接种于96孔细胞培养板，2×104细胞/孔，以100μl含10％胎牛血清的DMEM培养液培养24小时。向100μl分别转染了TFCF、TRFC、CTFA和PGFP质粒的293T细胞培养上清中加入不同浓度重组人TNFα蛋白(0.0625、0.25、1、4ng/mL)，每个浓度设4个复孔。与之平行的，将TNFα浓度固定为1ng/mL，与不同体积(12.5、25、50、100μl)的293T转染细胞上清预孵育，以DMEM培养液将体积补足为100μl。将TNFα与细胞培养上清于37℃预孵育1小时后，加入放射菌素D(Act‑D，1μg/mL)，并将此混合溶液加入到培养板中以替换原有培养液，培养24小时，加入CCK‑8溶液(10μl/孔)，37℃孵育2小时，测吸光度450nm（A450）值，根据平均A450值以下面公式计算细胞存活率，细胞存活率(％)=[As‑Ab]/[Ac‑Ab]×100％。As表示含有细胞、CCK‑8溶液、TNFα蛋白、Act‑D和待检细胞上清的实验孔的平均A450值；Ac表示含有细胞、CCK‑8溶液、Act‑D但不加TNFα的对照孔的平均A450值；Ab表示仅含有DMEM培养液、Act‑D、CCK‑8溶液但没有细胞和TNFα的空白孔的平均A450值。 
首先使用系列稀释浓度TNFα，观察转染细胞培养上清（100μl）对TNFα细胞毒性的抑制效应，检测结果如图5之A幅所示，由于可溶性TNFR‑Fc蛋白对TNFα介导的细胞杀伤产生抑制作用，因此在每个浓度条件下，表达TNFR‑Fc蛋白的TFCF和TRFC转染上清液，与CTFA和PGFP转染上清相比，均可显著提高细胞存活率。然后，将TNFα浓度固定为1ng/mL，与不同体积的293T转染细胞培养上清预孵育，检测细胞存活率，检测结果如图5之B幅所示，可观察到TFCF和TRFC转染细胞培养上清与CTFA和PGFP转染细胞培养上清相比，将细胞存活率从20‑30％提高到70‑90％，显著抑制了TNFα对L929细胞的毒性作用，本分析体现了剂量依赖关系，即加入的TFCF和TRFC转染上清体积越多，细胞存活率越高，这是由上清中TNFR‑Fc蛋白对TNFα细胞毒性产生中和活性造成的。上述检测结果表明，在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的TNFR‑Fc融合蛋白与母本蛋白一样可做为TNFα拮抗剂发挥生物活性。 
二、在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的CTLA4‑FasL融合蛋白对B7配体和Fas受体的结合活性检测 
1、转染293T细胞及Daudi和Jurkat细胞的培养 
将重组质粒TFCF、TRFC、CTFA或PGFP(阴性对照，载体pAAV2‑neo多克隆位点中EcoR I和Bgl II酶切位点之间插入有GFP基因的重组表达载体)分别转染293T细胞（购自ATCC），转染方法与实施例2中的检测一相同。转染4小时后，去除转染液，用不含血清的新鲜DMEM培养液继续培养48小时，收集转染293T细胞培养上清液。 
用含有10％胎牛血清的RPMI‑1640培养基（Hyclone)在6孔板上培养Daudi和Jurkat细胞（购自ATCC公司），每孔接种量为5×105，置于37℃、CO2培养箱中培 养。 
2、在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的CTLA4‑FasL融合蛋白对B7配体和Fas受体的结合活性检测 
CTLA4可以结合表达B7分子的细胞，Daudi细胞表面表达B7分子而不表达Fas受体，可被用于观察CTLA4‑FasL融合蛋白对B7配体的结合活性，而Jurkat细胞表达Fas抗原，可被用于观察CTLA4‑FasL融合蛋白对Fas受体的结合活性。流式细胞术检测方法为：收集8×105个Daudi（或Jurkat）细胞于2mL离心管中，加入1.8mL转染293T细胞培养上清，在旋转仪上以20rpm速度于4℃旋转结合45分钟。收集细胞，以PBS洗涤两次，分别于冰上与10μg/mL兔抗FasL抗体（或羊抗CTLA4抗体）孵育30分钟，使用兔IgG1（或羊IgG1）做为同型对照。PBS洗涤后，以FITC标记的羊抗兔（或兔抗羊）二抗于冰上孵育细胞30分钟。洗涤后，上机检测FITC标记的阳性细胞。 
B7+Daudi细胞用293T转染细胞上清孵育，以10μg/mL兔抗FasL抗体或同型对照（兔IgG）、FITC标记羊抗兔IgG检测CTLA4‑FasL融合蛋白对B7配体的结合活性，检测结果如图6之A幅所示，TFCF转染上清被检测到较高的阳性染色率（58.89％），与母本样品（CTFA转染上清，68.14％）相似。Fas+Jurkat细胞用293T转染细胞上清孵育，以10μg/mL羊抗CTLA4抗体或同型对照（羊IgG）、FITC标记兔抗羊IgG检测CTLA4‑FasL融合蛋白对Fas受体的结合活性，检测结果如图6之B幅所示，TFCF转染上清的阳性染色率（78.25％）与母本样品（CTFA，74.85％）的基本相同。结果表明含有Furin‑2A序列的TFCF质粒表达的CTLA4‑FasL融合蛋白同母本蛋白一样，通过相应的结构域既可结合Fas受体又可结合B7配体。 
以上实验结果表明，在Furin‑2A双裂解序列的调解下独立表达的TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白很好地保留了它们各自的生物活性。 
实施例4、在Furin‑2A双裂解序列的调解下TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白在体内的独立表达 
一、重组rAAV病毒的制备和PCR鉴定 
用Engreen公司的Entranster‑H转染试剂将重组质粒TFCF、TRFC、CTFA和PGFP(阴性对照)分别转染BHK21细胞（购自ATCC），以Geneticin（G418）进行2轮加压筛选，浓度均为800μg/mL，获得的抗性生长克隆用于包装2型AAV病毒，扩大培养筛选细胞株，以辅助病毒HSV1‑rc/ΔUL2（感染复数=0.1，购自五加和公司）感染，用“氯仿处理‑PEG/NaCl沉淀‑氯仿抽提法”对重组rAAV病毒进行初步纯化，然后用“离子交换层析法”进一步纯化，用DNA斑点杂交法检测纯化病毒的滴度，具体操作参见文献(Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide.Nat Biotechnol.2005,23(5):584‑590.)，使用系列稀释的已知基因拷贝数的相应载体质粒DNA做为标准品，结果获得了滴度达5×1012vg/mL以上的分别包 装有重组质粒TFCF、TRFC、CTFA和PGFP的4组重组2型AAV病毒，命名为rAAV.TFCF、rAAV.TRFC、rAAV.CTFA和rAAV.EGFP。为进一步确定重组rAAV病毒rAAV.TFCF中目的基因的存在，取3μl纯化病毒，加入蛋白酶K储存液，使其终浓度为0.1mg/mL，加无菌水补足至40μl，55℃水域中孵育1h，然后在水浴中煮沸10min，去除病毒外壳蛋白以释放DNA，离心收集处理的溶液，取出5μl，以其为模板，应用不同引物对PCR扩增相应的目的基因片段：TR1+TR2(扩增TNFR片段)、Fc1+Fc2(扩增Fc片段)、F2ACF1+F2ACF2(扩增Furin‑2A‑CTLA4‑FasL片段)、Total1+Total2(扩增全长TNFR‑Fc‑Furin‑2A‑CTLA4‑FasL)，引物序列如表1所示： 
表1PCP扩增引物序列 

PCR反应体系为：5μl处理的病毒溶液，dNTP(2.5mM)4μL，上游引物和下游引物(100μM)各0.5μL，10×Taq酶缓冲液5μL，Taq酶0.3μL，灭菌水补足至50μL。PCR反应条件为：95℃，4min；95℃30s，68℃30s，72℃1min或2.5min，30个循环；72℃7min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收纯化后进行测序，以明确重组rAAV病毒rAAV.TFCF中目的基因的存在。检测结果如图7之A幅所示（1：以rAAV.EGFP DNA为模板的第5泳道的阴性对照；2：TNFR片段（750bp）；3：IgG Fc片段（690bp）；4：Furin‑2A‑CTLA4‑FasL片段（1080bp）； 
5：TNFR‑Fc‑Furin‑2A‑CTLA4‑FasL片段（2570bp）），检测结果表明在重组AAV病毒rAAV.TFCF中目的基因的位置及序列均正确。 
二、在注射rAAV.TFCF病毒的炎性关节中TFCF重组子的mRNA表达水平检测 
无菌条件下充分研磨热灭活结核杆菌H37Ra菌株(购于Difco公司)，加入矿物油（购于Sigma公司）使其终浓度为5mg/mL并充分研磨混合液，于Lewis大鼠（6 周龄、雌性，购于维通利华公司）尾根部上方1‑2cm的中心部位注射上述制备液，200μl/只，制备关节炎发病动物模型。免疫第二天，于两侧踝关节分别注射50μl含5×1010病毒基因组（vg）重组rAAV病毒的生理盐水。免疫第25天处死大鼠，分离踝关节，在液氮中速冻，充分研磨后加入Trizol试剂在组织匀浆器中充分匀浆。提取总RNA，取5μg RNA用于RT‑PCR扩增。50μl扩增体系中包含：25ng模板cDNA，250nM上游引物（Total1）和下游引物（Total2），dNTP(2.5mM)4μl，10×Taq酶缓冲液5μl，Taq酶0.3μl，灭菌水补足至50μl。使用引物GAP5（5’ 
‑CGGTGTCAACGGATTTGGC‑3’）和GAP3（5’‑CCATGCCAGTGAGCTTCCC‑3’）作为内参基因GAPDH对照；RT‑PCR扩增反应条件为：95℃，4min；95℃30s，68℃30s，72℃2.5min，30个循环；72℃7min。在注射rAAV.TFCF病毒的炎性关节中TFCF重组子mRNA表达水平的RT‑PCR检测结果如图7之B幅所示，于关节注射rAAV.TFCF重组病毒后，TNFR‑Fc‑furin‑2A‑CTLA4‑FasL全长基因在注射rAAV.TFCF的踝关节中被检测到有表达，但在注射rAAV.EGFP的对照踝关节中未检测到。 
三、TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL融合蛋白体内表达水平的Western blot检测 
为排除内源性干扰，Flag标签被加在CTLA4‑FasL的末端以便于体内表达检测，相应的，在TNFR‑Fc片段的末端引入6个His标签。为检测Furin裂解位点和2A自剪切肽能否于体内炎性条件下介导TNFR‑Fc和CTLA4‑FasL蛋白在单一AAV载体上实现独立表达，使用关节裂解液通过Western blot分析，具体检测方法为：用与二中相同的方法构建关节炎发病动物模型，免疫第二天，于两侧踝关节分别注射50μl含5×1010病毒基因组（vg）重组rAAV病毒（rAAV.TFCF、rAAV.TRFC、rAAV.CTFA或rAAV.EGFP）的生理盐水，免疫第25天处死大鼠，分离踝关节，在液氮中速冻，充分研磨后向200mg研磨成粉的踝关节中加入2mL裂解液(20mM HEPES，0.5M NaCl，0.25％Triton X，蛋白酶抑制剂（0.5μg/mL Leupeptin，0.7μg/mL Pepstatin A，50μg/mL PMSF，2.2μg/mL Aprotinin）)，于4℃搅拌4小时制成匀浆液，离心收集上清，进行Western blot分析，分别以抗His抗体(Sigma公司)和抗Flag抗体(Sigma公司)检测，以β‑actin作为内参蛋白对照，条带用ECL底物液显色并曝光于X光片。所有的抗体均以含有5％脱脂奶粉的TBST溶液稀释。检测结果如图7之C幅所示，从注射rAAV.TFCF病毒的关节裂解液中检测到带有His标签条带，大小与从注射rAAV.TRFC病毒的关节裂解液的关节裂解液中检测到的条带一致；从注射rAAV.TFCF病毒的关节裂解液中检测到带有Flag标签条带，大小与从注射rAAV.CTFA病毒的关节裂解液的关节裂解液中检测到的条带一致，说明Furin裂解位点和2A自剪切肽有效介导了上游TNFR‑Fc和下游CTLA4‑FasL的表达，因为如果Furin裂解位点和2A自剪切肽只有一个发挥作用或者二者都不发挥作用，那么从rAAV.TFCF处理的关节裂解液中检测到的蛋白条带的分子量至少要比rAAV.TRFC或者rAAV.CTFA处 理样品的分子量大2.5‑3.0kDa。 
实施例5、rAAV.TFCF重组病毒抑制大鼠关节炎的组织学观察 
用与实施例4中相同的方法构建关节炎发病动物模型，免疫第二天，于两侧踝关节分别注射50μl含5×1010病毒基因组（vg）重组rAAV病毒（rAAV.TFCF、rAAV.TRFC、rAAV.CTFA或rAAV.EGFP）的生理盐水，免疫第25天处死大鼠，分离踝关节，以4％福尔马林溶液固定，10％EDTA溶液进行脱钙处理，石蜡包埋，制作5μm冰冻切片，苏木精&伊红（H＆E）染色，根据滑膜增生和炎性细胞浸润程度分别进行组织学评分（0‑3分）：0，正常；1，滑膜轻度增生；仅有少量的炎性细胞侵润到关节腔和滑膜；2，滑膜中度增生并开始入侵到关节腔；中度炎性细胞侵润；3，重度滑膜增生伴有血管翳生成，侵蚀到软骨和骨；炎性细胞广泛侵润到关节腔和滑膜。组织学评分应用Kruskal‑Wallis检验来分析，P<0.05具有统计学意义。踝关节组织学观察结果如图8所示，通过对踝关节的组织学观察，可初步检测重组rAAV.TFCF病毒对关节炎症的抑制作用，与rAAV.TRFC和rAAV.CTFA相比，rAAV.TFCF能更有效地抑制动物关节炎症，伴有最为轻微的滑膜增生和炎性浸润。rAAV‑EGFP处理组的关节组织中有大量滑膜细胞增殖造成明显的滑膜增生，其中有大量炎性细胞浸润，增生的滑膜组织侵入关节腔及和软骨和骨，造成关节腔狭窄和软骨及骨破坏。而rAAV.TRFC和rAAV.CTFA处理的组织学表现为明显减少的滑膜增生和炎性浸润；与之相比，rAAV.TFCF处理的组织学表现与正常关节的组织学表现最为接近，仅有轻微的滑膜增生和炎性细胞浸润，并保持关节结构完整，表明rAAV.TFCF能更有效地抑制动物关节炎。