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本发明总体涉及FSH制剂的稳定领域，具体地涉及液体FSH制剂的稳定领域。通过加入包含药用碱金属阳离子，在优选的实施方案中通过加入药用盐，即钠盐或钾盐来实现所述稳定。

权利要求书包含药用碱金属阳离子的盐用于稳定液体FSH制剂的用途，其中所述盐选自由药用Na+盐和K+盐或其组合组成的组。
根据权利要求1的用途，其中所述盐是Na+盐。
根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述盐是NaCl或Na2SO4。
根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述盐是氯化钠。
根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述盐是NaCl和Na2SO4的组合。
根据权利要求1‑5中任一项的用途，其中以20‑500mM的量，或30‑300mM的量或50‑200mM的量包含所述盐。
根据权利要求1‑6中任一项的用途，其中所述FSH制剂是rFSH制剂。
根据权利要求1‑7中任一项的用途，其中所述制剂还包含防腐剂。
根据权利要求8的用途，其中所述制剂包含苄醇、苯酚和/或间甲酚。
根据权利要求1‑9中任一项的用途，其中所述制剂是可注射制剂。
用于稳定液体FSH制剂的方法，其中所述方法包括将包含药用碱金属阳离子的盐加入所述制剂中的步骤，其中所述盐选自由药用Na+盐和K+盐或其组合组成的组。
根据权利要求11的方法，其中所述盐如上述权利要求2‑6所定义。
根据权利要求11和/或12的方法，其中所述待稳定的FSH是rFSH。
根据权利要求11‑13中任一项的方法，其中所述制剂还包含防腐剂。
根据权利要求14的方法，其中所述防腐剂选自由苄醇、苯酚和间甲酚组成的组。

说明书稳定FSH
发明领域
本发明总体涉及稳定FSH制剂的领域，具体地涉及稳定液体FSH制剂的领域。通过加入盐，在优选的实施方案中，通过加入具有药用盐的碱金属阳离子的盐，即Na‑盐或K‑盐或其组合来实现稳定。
背景
促性腺激素是这样的激素家族，其基本上主要涉及雌性和雄性中的生育周期。促性腺激素可以来自尿液，用于研究和治疗目的，然而一些促性腺激素也可以重组产生。
具体地，促性腺激素可以用于治疗不育。
本文涉及并且都属于相同糖蛋白家族的四种主要的促性腺激素是促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(hCG)。所有这些促性腺激素由α和β亚基组成；α亚基是所有促性腺激素共有的，即对于所有上述四种促性腺激素是相同，而β亚基则在每一种中是不同的。
如上提及，促性腺激素是一组异源二聚糖蛋白激素，其调节雄性和雌性中的性腺功能。它们包括促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺激素(TSH)和(人)绒毛膜促性腺激素(hCG)
FSH天然由垂体前叶分泌并且功能是支持卵泡发育和排卵。FSH包括92个氨基酸α亚基(也是其他糖蛋白激素例如LH和hCG共有的)，和FSH独有的111个氨基酸的β亚基，其赋予激素生物学特异性(Pierce和Parsons，1981，Glycoprotein hormones：structure and function(糖蛋白激素：结构和功能)，Ann Rev Biochem.，50：465‑495)。每个亚基通过加入复合碳水化合物残基来翻译后修饰。两个亚基携带用于N‑连接聚糖连接的两个位点，α亚基在氨基酸52和78处而β亚基在氨基酸残基7和24处(Rathnam和Saxena，(1975)Primary amino acid sequence of follicle‑stimulatinghormone from human pituitary glands.I.alpha subunit(来自人垂体的促卵泡激素的一级氨基酸序列.I.α亚基)，J Biol Chem(生物化学杂志).250(17)：6735‑6746；Saxena和Rathnam，(1976)Amino acid sequence of the betasubunit of follicle‑stimulating hormone from human pituitary glands(来自人垂体的促卵泡激素的β亚基的氨基酸序列)，J Biol Chem(生物化学杂志).251(4)：993‑1005))。因此FSH被糖基化至约30质量％(Dias和Van Roey，(2001)Structural biology of human follitropin and its receptor(人促滤泡素及其受体的结构生物学).Arch Med Res.32(6)：510‑519；Fox等(2001)Three‑dimensional structure of human follicle‑stiumulating hormone(人促卵泡激素的三维结构).Mol Endocrinol.15(3)，379‑89).
从更年期后人尿液中纯化的FSH已经在不育治疗中使用了许多年；同时在自然生殖中促进排卵并且提供卵母细胞用于辅助生殖技术。FSH的两种重组形式，Gonal‑F(Merck Serono)和Puregon(Schering‑Plough)在90年代中期是可获得的。这些都在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达(Howles，C.M.(1996)，genetic engineering of human FSH(Gonal‑F))(人FSH(Gonal‑F)的遗传改造)，Hum Reprod(人类生殖).Update，2：172‑191)。CG通常用于不育治疗，因为该化合物具有LH活性。
人FSH和hCG都是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体。在两种激素中α亚基是相同的。β亚基赋予两种激素之间的差异。FSH的成熟β亚基由111个氨基酸组成，而hCG的成熟β亚基由145个氨基酸组成，另外，FSH和hCGβ亚基的一级氨基酸序列在整个β链都是不同的。FSH和hCG两者的β链都包含6个二硫键，然而由于它们不同的氨基酸序列，它们确实在它们的更高级结构上不同，导致了带电、极性和疏水区域的不同折叠和分布(Fox等(2001).Three dimensionalstructure of humanfollicle‑stimulating hormone(人促卵泡激素的三维结构).MolEndocrinol.15(3)，379‑89)
尽管FSH和hCG的β亚基都是糖基化的，FSH的β亚基仅包含N‑糖基化(N‑7和N‑24)，而hCG的β亚基包含N‑和O‑糖基化(N‑13，N‑30，O‑121，O‑127，O‑132和O‑138)。在hCG的β亚基中的额外糖基化使得其比FSH的β亚基更疏水。β亚基提供受体相互作用的特异性。
CHO细胞通常用于制备药物重组蛋白。结构分析已经鉴定唾液酸仅通过α2，3‑连接相连。许多人糖蛋白包含唾液酸残基的α2，3‑和α2，6‑连接的混合物。因此，使用CHO系统表达的重组蛋白在其末端唾液酸连接的类型上与它们的天然对应物不同。
不育
在本发明的语境中，“不育”应该被限定为怀孕和生育后代的能力减少或没有。能够怀孕但是重复流产的妇女也被认为是不育的。不育在专用名词上也被定义为无避孕的规律性交一年怀孕失败。不育是由很多原因造成的。研究已经显示半数多一点的不育病例是由女性疾病导致的。剩余的由精液疾病以及不可解释的因素所导致。
目前存在治疗不育的一些可能性。
那些可能性是定时的性交，使用辅助生殖技术(ARTs)，子宫内膜异位、纤维瘤和女性性功能障碍(FSD)的医药处理，以及外科手术来校正异常。
在辅助生殖技术中，使用刺激排卵的药物。在LH和hCG之后，FSH是用于该用途的那些化合物之一。
对于施用，这些化合物的液体制剂是适合的。不幸的是，在过去已经显示，加入液体制剂的防腐剂，具体地，苄醇(BA)、苯酚和间甲酚对于蛋白施加去稳定的作用(Maa，Y.F.和Chung，C.H.1996，Aggregation ofrecombinant human growth hormone induced by phenolic compounds(由酚类化合物诱导的重组人生长激素的聚集).Int.J.Pharm.140：155‑168；Lam，X.M.，Patapoff，T.W.，和Nguyen，T.H.1997，The effect of benzyl alcohol onrecombinant human interferon‑gamma(苄醇对于重组人γ‑干扰素的作用).Pharm.Res.14：725‑729；Hoffmann，J.A.和Lu，J.2002，FSH and FSH variantformulations comprising benzyl alcohol as a preservative(包含苄醇作为防腐剂的FSH和FSH变体).EP0974359B1，1‑50)。
因此重要的是提供稳定的制剂，尤其鉴于待施用的FSH的剂量应该减少解离或聚集形式副作用如免疫原性反应的风险(如果非天然FSH存在的话)。然而由防腐剂导致的不稳定事件减少了在液体制剂中的活性促性腺激素，即FSH的实际水平。
因此，本发明的目的是提供稳定的FSH制剂，尤其是液体制剂，以及稳定它们的方法。
发明概述
本发明涉及使用用于稳定液体FSH制剂的包含药用碱金属阳离子的盐以稳定液体FSH制剂。待稳定的液体制剂可以是含有或不含防腐剂的制剂。
优选下述实施方案：
1.包含药用碱金属阳离子的盐用于稳定液体FSH制剂的用途，其中所述盐选自由药用Na+盐和K+盐或其组合组成的组。
2.根据项目1的用途，其中所述盐是Na+盐。
3.根据项目1或2任一项的用途，其中所述盐是NaCl或Na2SO4。
4.根据项目1或2任一项的用途，其中所述盐是Na2SO4。
5.根据项目1或2任一项的用途，其中所述盐是NaCl和Na2SO4的组合。
6.根据项目1‑5中任一项的用途，其中以20‑500mM的量，或30‑300mM的量或50‑200mM的量包含所述盐。
7.根据项目1‑6中任一项的用途，其中所述FSH制剂是rFSH制剂。
8.根据项目1‑7中任一项的用途，其中所述制剂还包含防腐剂。
9.根据项目8的用途，其中所述制剂包含苄醇、苯酚和/或间甲酚。
10.根据项目1‑9中任一项的用途，其中所述制剂是可注射制剂。
11.用于稳定液体FSH制剂的方法，其中所述方法包括将包含药用碱金属阳离子的盐加入所述制剂中的步骤，其中所述盐选自由Na+盐和K+盐或其组合组成的组。
12.根据项目11的方法，其中所述盐如上述2‑6定义。
13.根据项目11和/或12的方法，其中所述待稳定的FSH是rFSH。
14.根据项目11‑13中任一项的方法，其中所述制剂还包含防腐剂。
15.根据项目14所述的方法，其中所述防腐剂选自由苄醇、苯酚和间甲酚组成的组。
16.根据项目1‑10中任一项的用途，其中所述液体制剂是重构的液体制剂，其获自冻干的制剂。
17.项目11‑15中任一项的方法，其中所述加入盐的步骤在冻干步骤之前进行。
18.项目17的方法，其中重构步骤在所述冻干步骤之后进行。
19.项目17和/或项目18的方法，其中所述盐包含在冻干制剂中或其中所述盐包含在重构液体中。
提供有稳定盐的制剂因此是以冻干状态贮存的备选实施方案。冻干以本领域技术人员通常所知的方式进行。接着可以贮存冻干制剂直到最终用于患者。在施用前，接着将冻干制剂与任一种已知的重构介质，例如无菌水重构。盐包含在冻干制剂中或包含在重构液体中。
20.上述项目中任一项的用途或方法，其中所述液体制剂是单次用制剂或多剂量制剂，优选地用于注射。
在优选的实施方案中，盐包含在液体中，所述液体制剂本身不是冻干的而是在贮存中作为液体保存。
具体地，在优选的实施方案中，本发明涉及液体FSH制剂的稳定，其中所述碱金属阳离子选自由Na+和K+组成的组。特别优选的，所述盐是NaCl或Na2SO4。
如上所述，液体FSH制剂适合用于治疗不育。在该方面，清楚的是，液体FSH制剂可以是不稳定的；对于包括用于单次使用的那些在内的所有液体FSH制剂，这是真实的。如果液体FSH制剂包括防腐剂(例如这对于所有多剂量制剂是必须的)，那么不稳定性甚至可能是更显著的。该防腐剂可以是每一种用于保存FSH制剂的防腐剂，因此，防腐剂可以是由FDA批准的用于FSH制剂的防腐剂，具体地，例如批准用于肠胃外FSH制剂的FDA批准的防腐剂，如例如苄醇，苯酚和/或间甲酚；然而防腐剂绝不限于那些实例。FSH的稳定性例如被苄醇、苯酚和/或间甲酚减少。
因此，本发明要求保护和描述的包含药用阳离子的盐用于稳定单次用FSH制剂。
此外，本发明要求保护和描述的包含药用阳离子的盐，用于稳定多剂量的FSH制剂；所述制剂不需要包含防腐剂但是也可以包含防腐剂。
加入本发明要求保护的包含药用阳离子的盐，即Na+和K+盐，稳定液体FSH制剂。在特别优选的实施方案中，所述盐是药用盐。在单次用或多剂量制剂中尤其在较长的贮存时间内实现稳定，并且在又一个可能的实施方案中，作为防腐剂(如苄醇、苯酚和/或间甲酚)的去稳定作用的反措施可以是有利的。
可以根据本发明使用的盐，在优选的实施方案中，包括NaCl或Na2SO4。
优选地以20‑500mM的量包含盐，甚至更优选地以30‑300mM的量包含盐；在特别优选的实施方案中，以50‑200mM的量包含盐。
加入的盐的最大量被限于溶液摩尔渗透压浓度。为了使注射后的疼痛最小，溶液应该优选是等渗的或至少不是高渗的。由于在溶液中所有赋形剂都对摩尔渗透压浓度有贡献，所以可以加入溶液的盐的最大量依赖于其它存在的成分的量。
优选以导致350mosmol/kg的最大摩尔渗透压浓度的量包含盐，甚至更优选的以导致320mosmol/kg的最大摩尔渗透压浓度的量包含盐；在特别优选的实施方案中，以导致300mosmol/kg的最大摩尔渗透压浓度的量包含盐。
摩尔渗透压浓度理论
摩尔渗透压浓度是一种实用手段，其给出对存在于溶液中的各种溶质对溶液渗透压的贡献的全面测量。摩尔渗透压浓度可以根据Ph.Eur.2.2.35，第7版，增刊2011(7，2)，Osmolality(摩尔渗透压浓度)，01/2008：20235进行测量。
在本发明的语境中，“盐”是通过用金属或带正电的原子团完全或部分取代氢而从酸衍生的化学化合物。
“具有(或包含)药用盐的阳离子的盐”的定义指所有那些与根据FDA无活性成分列表批准用于肌内或皮下递送的阳离子形成的盐；该组的碱金属阳离子是钠(Na+)和钾(K+)。
发明人已经令人惊奇地发现两个非常特异性的阳离子特别适合于稳定FSH制剂。
盐可以因此与下述药用阳离子形成：钾(一元、二元或三元)，或钠(一元、二元或三元)。优选地，所述盐是钠盐。
特别优选的是NaCl和Na2SO4。
可以根据本发明稳定的促性腺激素是FSH，即促卵泡激素，其任选与其他活性成分组合。
FSH是来源与尿或血浆的FSH或重组FSH(rFSH)。在优选的实施方案中，所述FSH是尿FSH或rFSH；特别优选的是rFSH。
如上提及，现在可以重组产生FSH。因此，本文提及的FSH一般总是包括尿液来源的促性腺激素以及重组促性腺激素。因此，本文提及的FSH还包括rFSH。
在本发明的优选实施方案中，所述制剂是液体rFSH制剂，最优选是可注射的，其通过Na2SO4或NaCl稳定。
在本发明的优选实施方案中，所述制剂是液体rFSH制剂，最优选是可注射的，其通过Na2SO4或NaCl稳定。
在备选实施方案中，所有实施方案的rFSH是长效的FSH。可以如本领域技术人员公知(例如，通过修饰FSH分子或通过修饰所述制剂)获得长效FSH制剂。
因此，此处的FSH涵盖所有可能的尿液来源的或重组形式的上述FSH以及FSH形式所有可能的组合。还包含用于单次用的制剂以及一种或多种用于多剂量用途的其他制剂(相同或不同促性腺激素的)。
一种可能的产品可以是包含FSH(任选地具有CG、LH、LH活性等)的制剂，都在不同的瓶中。LH活性(如果存在)可以来自LH或CG。LH可以被等效剂量的CG代替并且反之亦然；在该语境中，“等效剂量”可以基于Pharmacopeia Van Hell Bioassay(Van Hell，H等，Acta Endocrin.47，409‑418，1964)中的1IU的CG等价于5‑7IU的LH来进行计算。
优选的组合是(r)FSH、(r)LH和(r)hCG的组合，都在不同的瓶中。
在不同瓶中的可能的组合也包括：尿液(u)FSH和uhCG或uFSH和uLH；其他的(rhCG或rLH或rFSH)和(uhCG或uLH或rhCG或rLH)，及其所有可能的排列。
另外优选的组合是(r)FSH和(r)hCG的组合，其分别在不同的瓶中。
另外优选的组合是(r)FSH和(r)LH的组合，其分别在不同的瓶中。
本发明的FSH制剂是液体制剂。
优选地，所述制剂是可注射的。制剂可以作为这样的产品供应，所述产品具有一种、两种或多种包含FSH或FSH/hCG的药物组合物，其用于单独或在一起施用。如果单独施用，施用可以是顺序进行的。所述产品可以以任何适合的包装供应。例如，产品可以包含许多预先填充的注射器，其各自包含FSH(FSH组合物)，或另外还包含hCG(hCG组合物)，例如，其中所述注射器可以以泡罩包装或其他方式包装以维持无菌。产品可以任选地包含使用FSH制剂的说明书。根据另一个方面，本发明的FSH制剂作为多剂量制剂提供。然而，本发明也明确地涉及用于单次使用的制剂。本发明还涉及作为试剂盒的一部分的制剂的稳定。所述试剂盒将包含至少一个包含一个或多个日剂量的FSH的容器；或例如两个容器(例如，小瓶)，其各自包含不同的促性腺激素；以及例如另外的说明书(例如，用于施用的)和例如用于注射的其他工具。在优选的实施方案中，使用用于多次注射的注射笔，其中FSH溶液被填充在各个药筒中。
在优选的实施方案中，以35‑850IU/ml，优选地50‑800IU/ml，甚至更优选地100‑600IU/ml包含FSH。
用于例如600IU/ml rFSH的特别优选的制剂具有下述组成：
600IU/ml rFSH
0.001‑0.05，优选为0.005mg/ml聚山梨醇酯20
0.1‑10，优选为1.0mg/ml L‑甲硫氨酸
0.5‑50，优选为5.0mg/ml苯酚
1‑100，优选为14mg/ml硫酸二钠(即0.1M)
0.1‑10，优选为1mM磷酸钠缓冲液，(pH6‑8，优选为pH6.5)。
所述溶液摩尔渗透压浓度优选为300mosmol/kg
(pH指整个溶液的pH。)
可注射贮存(depot)形式可以通过在可生物降解聚合物中形成FSH(和其它药剂，如果存在的话)的微囊基质来进行制备。基于聚合物的贮存形式/持续释放系统可以(取决于它们的化学性质)例如是微颗粒或纳米颗粒、水凝胶、胶束、乳状液或植入物。取决于FSH与聚合物的比率和使用的特定聚合物的性质，可以控制FSH释放的速率。可生物降解的聚合物的实例包括聚交酯/聚乙交酯共聚物系统、聚乙烯吡咯烷酮、聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(乙二醇)、聚氨基酸、多糖例如透明质酸钠(NaHA)或其其他的盐、明胶、脱乙酰壳多糖等。可以对所有提及的聚合物进行衍生化或修饰从而使蛋白药物递送或其稳定性最优化。贮存可注射制剂也可以通过将FSH包埋在液体系统，或聚合物脂质混合物如胶束、脂质体或微乳(其与体组织可相容)中来进行制备。
可以例如通过经由细菌过滤器过滤的方式，或通过掺入无菌固体组合物(其可以在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中)形式的杀菌剂对可注射制剂进行灭菌。可注射的制剂可以在如上所述的任何适合的容器，例如小瓶、预先填充的注射器、注射药筒等中供应。
可以根据本领域的常规实践来调整药物组合物中的各种成分的pH和精确浓度。见GOODMAN和GILMAN的THE PHARMACOLOGICALBASIS FOR THERAPEUTICES(治疗剂的药理学基础)，第7版。在优选的实施方案中，本发明的组合物可以作为肠胃外施用的组合物进行供应。本领域中已知用于制备肠胃外制剂的一般方法并且在REMINGTON；THESCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(雷明顿：药物科学和实践)，见上文，在780‑820页中描述。肠胃外组合物可以在液体制剂中或作为固体供应，所述固体可以在施用前与无菌可注射的介质混合。在尤其优选的实施方案中，以易于施用和剂量均一性的剂量单位形式供应肠胃外组合物。
本发明的FSH可以通过常规方式从尿液中获得或可以重组制备。对于可能的生产方法，还参考例如WO2009/127826。
hCG可以通过本领域任何已知的方式获得。当用于本文时hCG包括人来源的hCG和重组hCG。人来源的hCG可以通过本领域任何已知的方法从任何适合的来源(例如尿液和胎盘)纯化。表达和纯化重组hCG的方法是本领域公知的。
LH可以通过本领域任何已知的方式获得。当用于本文时，LH包括人来源的LH和重组LH。人来源的LH可以通过本领域任何已知的方法从任何适合的来源(例如，尿液)中纯化。表达和纯化重组LH的方法是本领域已知的。
药物组合物可以用于治疗不育，例如用于例如辅助生殖技术(ARTs)，诱导排卵(OI)或子宫内授精(IUI)。药物组合物可以例如用于其中使用已知FSH制剂的医疗适应症。本发明还提供本文描述的稳定的FSH制剂(根据本发明的方面)用于治疗不育的用途，或在制备用于治疗不育的药物中的用途。可以将药物组合物配制为已知的组合物，其用于任何途径的药物施用，例如口腔、直肠、肠胃外、透皮(例如贴片技术)、静脉内、肌肉内、皮下、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(粉末、膏剂或滴剂)或作为颊含或鼻喷雾剂。典型的组合物包含药用载体，如水溶液、非毒性赋形剂，包括盐和防腐剂，缓冲剂等，特别如在Remington′s Pharmaceutical Sciences fifteenthedition(雷明顿药物科学第15版)(Matt出版公司，1975)，在1405‑1412页和第1461‑87页，和national formulary(国家处方集)XIV，第14版(AmericanPharmaceutical Association(美国药物协会)，1975)中所述。
合适的水性和非水性药物载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。
所述组合物还可以包含添加剂如但不限于防腐剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂和分散剂。可以包含抗细菌剂和抗真菌剂以防止微生物生长并且包括例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。此外，包含张性剂(tonicity agent)也是理想的。
在一些情形中，为了实现延长作用，需要延缓对来自皮下或肌内注射的FSH(和其他活性成分，如果存在的话)的吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的晶体或无定形物质的液体混悬液来实现。那么例如FSH的吸收速率取决于其解离的速率，这又可以取决于晶体大小和晶体形式。备选地，肠胃外施用的FSH组合形式的延缓吸收通过将FSH组合溶解或悬浮在油性赋形剂中来实现。
根据本发明，发明人努力研究某些化合物对液体促性腺激素制剂的稳定性的作用；在此，研究了某些化合物的稳定以及去稳定作用。
术语″稳定性″可以指化学稳定性，包括在氨基酸序列中的共价修饰，但是在蛋白稳定性的语境下，其还指物理稳定性，包括蛋白折叠状态(即天然状态)的变化，不包括共价键裂解。
在本发明中，术语“稳定性”指促性腺激素，尤其是本发明的FSH的制剂的物理稳定性。蛋白制剂的物理不稳定性可能由蛋白分子聚集形成高级聚集体，通过异二聚体解离成单体，或通过任何其他构象变化(其减少包含在本发明中的FSH蛋白的至少一种生物学活性)来导致。
“稳定的”溶液或制剂是这样的溶液或制剂，其中蛋白在其中的聚集、解离、构象改变、生物学活性的损失等的程度可接受地被控制，并且不会随时间不可接受地增加。稳定性可以通过本领域公知的方法评估，所述方法包括测量样品的光散射，透明度和/或着色的视觉观察、吸光度或光密度、分子大小确定(例如，通过大小排阻色谱法或场流分级法)、体外或体内生物学活性和/或通过差示扫描量热法(DSC)。其他评估稳定性的方法是本领域公知的，并且也可以根据本发明使用。
已知一些防腐剂对促性腺激素制剂具有显著的去稳定作用并且令人惊奇地发现，盐，具体地包含在此显示为适于稳定液体FSH制剂的药用碱金属阳离子(具体地Na+或K+)的盐，如NaCl或Na2SO4还适合用于抵消需要被包含在用于医疗用途的液体多剂量FSH制剂中的防腐剂如苄醇、苯酚和间甲酚的去稳定作用。本发明要求保护的盐对液体FSH制剂具有稳定作用，其以有利的和令人惊奇的方式，比已知稳定剂，如例如蔗糖的稳定作用甚至更显著。与已知稳定剂如蔗糖相比提高的稳定作用是特别令人惊奇的。此外，相当出人意料地，本发明的盐可以显示关于FSH制剂的稳定作用，而对于非常相似的hCG没有显示稳定作用。同样令人惊奇的是，观察到的稳定作用并没有遵守所谓的Hofmeister系列(也见以下)，而是实际上与它相反。
还从现有技术中已知在药物FSH制剂中存在FSH的降解并且这通过第一组本发明的实施例证实。
FSH将作为时间的函数和温度的函数地降解。具体地，在室温以上的温度，二级结构、三级结构和四级结构被改变。
看上去，在加热后发生的三级FSH结构和二级FSH结构的构象解折叠是两‑状态转变(当蛋白聚集受限时)。这种解折叠可以独立于亚基解离(四级结构变化)。
此外，关于本发明清楚的是，包含防腐剂如苄醇或苯酚的FSH(其中所述防腐剂是需要的，例如在液体FSH制剂中作为抗微生物剂)明显地以不利方式影响FSH多剂量制剂的稳定性。在此，FSH的长效稳定性被降低，FSH的变性温度降低，并且与不包含防腐剂的FSH制剂相比，已经变性的形式具有更低水平的二级结构。
本发明还首次证明：包含用于稳定液体FSH制剂的药用碱金属阳离子(即Na和K)的盐，对于液体FSH制剂的稳定性具有明显的作用。可以证明的是，在包含这些盐的液体FSH制剂中的FSH的二级结构在加热到76.5℃后不会显著改变。在存在例如Na2SO4时，变性形式是相对地构成的，这使变性更加可逆，并且因此显著增加蛋白的动力学稳定性。这由目前显示的实时稳定数据支持，所述数据显示对FSH的异二聚体结构的显著的稳定作用。
结果清楚地表明本发明要求保护的盐，例如硫酸钠和氯化钠，可以限制FSH分子解离的倾向并且因此显著增加贮存稳定性。
本发明还涉及用于稳定液体FSH制剂的方法，其中所述方法包括将上述盐加入所述制剂中的步骤。
通过另外进行的实时数据来证实所有的研究。
附图简述
图1：显示在不同温度对于rFSH的作为波长(nm)函数的CD(圆二色谱，见下)信号(mdegree)。观察到在24.0℃→45.9℃光谱之间没有显著的差异，但是观察到在超过50℃CD‑信号的温度‑依赖性增加。将rFSH蛋白(0.93mg/ml)溶解在3.57mM包含0.0036mg/ml聚山梨醇酯20的pH6.3的磷酸盐缓冲液中。在24.0℃(粗实迹线)，50.3℃(虚迹线)，54.7℃(点迹线)，59.0℃(虚‑点迹线)，63.4℃(星)，67.8℃(菱形)和76.5℃(实迹线)扫描。
图2：显示在不同温度对于包含Na2SO4的rFSH的作为波长(nm)函数的CD信号(mdegree)。观察到在24.0℃→45.9℃光谱之间没有显著的差异。将rFSH蛋白溶解在3.57mM包含0.0036mg/ml聚山梨醇酯20和8.6mg/ml的硫酸钠(Na2SO4)的pH6.3磷酸盐缓冲液中。在24.0℃(粗实迹线)，50.3℃(虚迹线)，54.7℃(点迹线)，59.0℃(虚‑点迹线)和76.5℃(实迹线)扫描。
图3：显示在不同温度对于包含苄醇的rFSH的作为波长(nm)函数的CD信号(mdegree)。观察到在24.0℃→45.9℃光谱之间没有显著的差异。将rFSH蛋白(0.93mg/ml)溶解在3.57mM包含0.0036mg/ml聚山梨醇酯20和0.17mg/ml苄醇的pH6.3磷酸盐缓冲液中。在24.0℃(粗实迹线)，45.9℃(圆圈)，50.3℃(虚迹线)，54.7℃(点迹线)，59.0℃(虚‑点迹线)，63.4℃(星)，67.8℃(菱形)和76.5℃(实迹线)扫描。
图4：随后对hCG和rFSH进行DSC扫描。对于在0.005mg/ml聚山梨醇酯20，0.5mg/ml L‑甲硫氨酸，1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的5mg/mlhCG和在0.005mg/ml聚山梨醇酯20，0.5mg/ml L‑甲硫氨酸，0.24M NaCl，1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的2.4mg/ml rFSH的DSC数据。扫描速率2.0℃/min。第一次rFSH扫描(实迹线)，第二次rFSH扫描(虚‑点迹线)，第一次hCG扫描(虚迹线)和第二次hCG扫描(点迹线)。在第一次扫描之后，在第二次扫描之前，将样品冷却到20℃。
图5：具有不同的糖或盐的hCG的DSC扫描。在0.005mg/ml聚山梨醇酯20，0.5mg/ml L‑甲硫氨酸和1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的5mg/mlhCG的DSC数据。没有加入糖或盐(粗实迹线)，0.1M Na2SO4(实迹线)，0.1M NaCl(点迹线)，0.1M NaClO4(虚迹线)和0.1M蔗糖(虚‑点迹线)。扫描速率2.0℃/min。
图6：具有不同的糖和盐的rFSH的DSC扫描。在0.005mg/ml聚山梨醇酯20，0.5mg/ml L‑甲硫氨酸和1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的2.4mg/ml rFSH的DSC数据。没有加入糖或盐(粗实迹线)，0.1M Na2SO4(实迹线)，0.1M NaCl(点迹线)，0.1M NaClO4(虚迹线)和0.1M蔗糖(虚‑点迹线)。扫描速率1.0℃/min。
本发明进一步通过下述实施例来解释，然而实施例将不被视为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1‑同步辐射圆二色光谱学(SRCD)
方法
通过使用在University ofAarhus，Denmark的同步加速器进行圆二色光谱学。使用0.1mm路径长度石英suprasil池(Hellma GmbH，Germany)，在180‑270nm的波长范围内，在1nm步长中，记录所有的CD光谱，其中停留时间为3秒/波长。对于rFSH和参比(对照剂)试验的每个实验试验记录三次相同的CD扫描。通过从平均蛋白扫描中扣除平均的相应对照剂扫描获得在本报道中呈现的rFSH的CD光谱。对于每一组CD扫描，使用约120μl溶液(对应于约112μg rFSH)。
在研究温度对rFSH CD光谱的效应过程中，加热室中的温度以5℃的时间间隔从25℃到85℃变化，并且平衡时间为5分钟。从校准文件，确定实际的实验温度(在石英suprasil池中的温度)。
CD测量由于结构不对称性发生的左圆极化光和右圆极化光吸收的差异。可以通过CD光谱在远UV区域(约180‑250nm)中研究蛋白的二级结构。一般地，更有序的结构伴随更强烈的CD信号(正或负)。然而，不同的二级结构具有不同的CD光谱，并且因为α‑螺旋具有比β‑结构更强的CD信号，所以在待确定的不同蛋白之间不能对有序结构的程度进行直接比较。
由于针对结构变化的高敏感性，当研究蛋白的物理稳定性时，CD光谱是强有力的工具。通常，通过检测CD光谱来进行所述研究，所述CD光谱作为外界因子例如温度、pH、变性剂，表面活性剂或稳定剂的浓度变化的函数。在本发明的研究中，研究作为温度的函数的rFSH的CD光谱。另外，还研究苄醇和硫酸钠(Na2SO4)对于rFSH二级结构的影响。
在该实施例和在实施例2和3中使用的促性腺激素是重组促卵泡激素(rFSH)，其是使用重组DNA技术从人PER.细胞系表达的人激素。rFSH是由两种糖基化单体：FSH、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)和促甲状腺激素(TSH)共有的92个氨基酸的α‑亚基，以及对于FSH特异的111个氨基酸的β‑亚基组成的异二聚体蛋白。包含FSH的糖蛋白激素都在非共价偶联的单体解离后失去它们的生物学活性。以前的结果已经说明rFSH的不稳定性主要基于二聚体解离(四级结构的分解和伴随的免疫结合反应的减少)。
取决于意欲的用途，目前市售的rFSH制剂以不同的浓度提供，范围从37.5IU/ml(对于Gonal‑f对应于约2.8μg/ml)到至少833IU/ml(对于Puregon对应于约83.3μg/ml)。
在研究中使用的rFSH意欲用于液体药物产品制剂，对于皮下注射是600IU rFSH/ml。由于所述产品的目的在于多剂量注射，所以添加防腐剂是必须的。
通过混合不同成分的储液产生研究的制剂。蛋白和赋形剂的研究的浓度间隔由于所用的方法而受到限制，即与赋形剂浓度比较，蛋白浓度需要被保持得相对较高。由于芳香族化合物在研究的波长区域内的UV吸收，苄醇浓度需要被保持得低。下面的表概括了三种不同的制剂，所述制剂由本发明的发明人在第一次实验设计中进行检查。
表1
该表显示了用于温度对rFSH的影响的SRCD研究的三种制剂的含量。

样品1
在24℃到77℃之间的13个不同温度，记录rFSH、样品1(见表1)的CD光谱。为了清楚，这些光谱中仅有7个显示在图1中。样品1，如从表1中可推出的，既不包含盐也不包含防腐剂。在图1中显示光谱。结果清楚地显示CD信号的强度作为温度的函数减少，说明在高温(＞50℃)的二级结构的分解。在24.0℃→45.9℃光谱之间没有检测到明显的差异，这显示在测量的时间阶段中(约20分钟)，在加热到约46℃后，蛋白的二级结构是完整的。加热后FSH的SRCD光谱显示在约193nm的异二向色点，对于样品2的光谱，这也被发现了，见图2。
样品2
记录包含Na2SO4的rFSH、样品2(见表1)的CD光谱。在24℃‑77℃的13个不同温度获得的光谱，并显示在图2中。为了清楚，这些光谱中仅有5个显示在图2中。结果显示作为温度的函数的二级结构的分解。数据揭示，在加热到约46℃后(在实验的过程中)，样品2中的rFSH的二级结构是完整的。重要的是，数据还显示在存在Na2SO4时，变性形式相对地构成。
样品3
记录包含苄醇(BA)的rFSH、样品3(表1)的CD光谱。苄醇是一种抗微生物防腐剂，其通常被选择用于FSH的液体制剂。由于与例如间甲酚相比的相对较弱的防腐能力，BA必须以高浓度(约10‑15mg/ml)使用。因为意欲在多至1个月的时期内将rFSH用于多次注射，并且因为rFSH通常在室温进行贮存，所以防腐剂是必须的。
在24℃‑77℃之间的13个不同温度获得在0.17mg/ml BA存在下的rFSH的光谱，并显示在图3中。为了清楚，这些光谱中仅8个在图3中显示。由于苄醇的非常高的UV吸收(和伴随的低CD信号)，不能增加研究的BA浓度，并因此甚至不能接近用于保存rFSH制剂的浓度。然而，观察到BA的明显的去稳定作用。CD结果显示样品3中的rFSH的二级结构在加热到42℃后是完整的，与样品1和2中的rFSH的开始变性温度相比稍低。
另外，重要的是，数据显示与不存在防腐剂的FSH相比，变性形式显著缺乏有序结构。
赋形剂对于温度诱导的结构变化的作用
在本文中用作本发明要求保护的盐的代表性实例的盐Na2SO4显示对于温度变性蛋白的结构的明显影响。这明显是一个重要的发现。因为与天然蛋白相比，变性(解折叠或部分解折叠)的蛋白更易于结合形成聚集体(Fink，A.L.，1998，Fold Des.3(1)：R9‑R23)，结果说明硫酸钠可以限制rFSH分子变性的倾向并且因此限制聚集的风险并由此显著增加贮存稳定性。另一方面，苄醇(BA)在高温诱导显著的结构分解。通过SRCD未检测到有序的二级结构。观察到的BA的作用(解折叠程度更高的结构)可以部分地解释在加入苄醇后在其它蛋白系统中发现的增加聚集(Maa，Y.和Hsu，C.C.，1996，Int.J.Pharm.140：155‑168；Zhang，Y.等，2004，J.Pharm.Sci.93(12)：3076‑3089)。
然而，加入防腐剂对于开发多剂量制剂是关键的，并且从市场上存在的rFSH产品已知，需要开发具有甚至相对更高含量的苄醇的更稳定的制剂(含10mg/ml苄醇)。
发现苄醇降低rFSH的稳定性并且促进在加热后失去有序的二级结构。然而，加入防腐剂是重要的。该研究显示，本发明要求保护的盐在加热的rFSH制剂中增加有序结构的水平。因此，这些盐非常适合在液体rFSH制剂中作为稳定剂，例如补偿苄醇或其他酚类防腐剂的效果。
实施例2‑差示扫描量热法(DSC)
在该实施例中代表性使用的FSH与在实施例1中使用的相同。一般地，蛋白的天然(生物活性)结构对于其周围环境，例如制剂的组成、容器系统、pH和温度是非常敏感的。在本发明的实施例中，已经通过液体差示扫描量热法(DSC)研究了rFSH变性温度，Tm。rFSH变性温度提供了蛋白在溶液中稳定性的指示，其中更高的Tm显示更稳定的蛋白。
蛋白的三级结构和四级结构主要通过非共价相互作用稳定。因为在解折叠过程中，许多的这些分子内相互作用被与水分子的非共价相互作用取代，所以不同结构形式(即，天然和变性的)之间的热动力学平衡是精细的。一般地，这意味着，天然蛋白的稳定性是受到限制的。许多蛋白在约70℃热解折叠。可以通过热动力学参数描述蛋白折叠或变性，所述热动力学参数可以使用DSC进行直接研究和量化。因此，DSC是研究赋形剂对蛋白稳定性作用的重要工具，并且因此是鉴定蛋白治疗剂的最优制剂的重要工具。
液体差示扫描量热法(DSC)
理论
当在液体DSC中加热蛋白样品(即，增加样品温度)时，仅获得稍稍增加的基线，但是当加热继续(即，温度持续增加)时，热由蛋白吸收导致其在研究的蛋白的特征性温度范围内热解折叠。这产生吸热峰。在蛋白的解折叠过程中，由于暴露了更疏水的链，围绕蛋白的水分子重新组织。当解折叠完成时，热吸收减少并且形成了新的基线。
样品的热容量Cp的积分给出焓的变化ΔH，其与等式(1)的解折叠过程相关。观察到的焓的变化来自吸热过程，如氢键的断裂和放热过程如在蛋白和周围介质之间的氢键的形成。热转化的中点或转化中点，Tm(通常被称为蛋白变性温度)，是当一半蛋白分子折叠，一半蛋白分子解折叠时的温度。