宏基因组提取方法.pdf

本发明公开了宏基因组提取方法，所述方法利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA。所述方法利用宿主DNA中的重复序列Alu序列及其两端保守序列作为模板，设计单向或者双向探针，其中每条探针的5’端以生物素修饰，使用包被有链霉亲和素的磁珠捕获与探针杂交的宿主DNA，以达到减弱宏基因组中宿主DNA背景、提高测序数据有效率的目的。

权利要求书一种宏基因组提取方法，其特征在于利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响。
根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针与所述宿主基因组DNA样品杂交后与所述磁珠偶联。
根据权利要求2所述的宏基因组提取方法，其特征在于包括步骤：
1）将标记有生物素的所述探针与提取的所述宿主宏基因组DNA样品进行杂交；
2）用包被有链霉亲和素的所述磁珠捕获探针与所述宿主DNA的复合体，并用磁力架分离磁珠‑探针‑目标DNA复合物；
3）将去除所述磁珠‑探针‑目标DNA复合物的杂交液以及杂交后的磁珠清洗液进行纯化回收DNA。
根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针与所述磁珠偶联后与所述宿主基因组的杂交。
根据权利要求4所述的宏基因组提取方法，其特征在于包括步骤：
1）利用包被有链霉亲和素的所述磁珠与标记生物素的所述探针偶联；
2）将偶联好的复合物与所述宿主宏基因组DNA样品杂交；
3）去除磁珠‑探针‑目标DNA复合物，对杂交液和杂交清洗液进行纯化回收DNA。
根据权利要求1~5的任一项所述的宏基因组提取方法，其特征在于在偶联温度下使用多种正反向探针。
根据权利要求3或5所述的宏基因组提取方法，其特征在于杂交完成之后，对所述磁珠‑探针‑DNA复合物进行加热或者氢氧化钠法变性，回收偶联有探针的磁珠。
根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针选自序列表中的序列SEQ ID NO：1至序列SEQ ID NO：139。
根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述宿主宏基因组DNA样品取自人呼吸道、口腔、消化道、皮肤或生殖道。

说明书宏基因组提取方法
技术领域
本发明涉及提取宏基因组的方法，具体地涉及降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的方法。
背景技术
宏基因组是出现在某一环境样品中的所有遗传物质，包括许多个体物种的基因组。宏基因组学是指直接从环境样品中获得遗传物质，对宏基因组进行研究的科学。随着高通量DNA测序和生物信息学的发展，宏基因组学的应用价值不断提升。通过分析宏基因组文库，可发现某环境中微生物的群体特征及相互作用规律，探讨微生物与环境的相互影响。对微生物群体DNA的测序，可筛选具有特定功能的基因，获得特殊功能的蛋白。
人呼吸道每天接触到大量的病毒和细菌等微生物，对呼吸道宏基因组的研究能有效地了解各微生物群体的特征，从而帮助临床诊断和治疗。在呼吸道宏基因组中，相对于宿主人的基因组含量，病原体基因组含量一般比较小。因此，在呼吸道宏基因组测序中，为达到病原体基因组足够的序列覆盖度，消除宿主基因组的影响是非常重要的。
人呼吸道样品中总DNA的质量是宏基因组测序成功与否的关键。对传染病样品，处理DNA污染的方法需要花费比较多的时间，或者收集样品时需要特殊的处理方法。一般提取DNA时，需要利用去垢剂SDS或者溶菌酶、蛋白酶K等裂解细胞，然后利用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀DNA。在提取宏基因组DNA时，由于细胞类型的多样性以及存在宿主DNA的干扰，所以需要更有效的纯化方法用于DNA的提取。
人Alu重复序列属于短散在序列（short interspersed elements，SINEs）家族。每个Alu序列的长度约280bp，具有可变的多聚A（poly‑A）尾巴。Alu重复序列超过一百万条，约占人基因组的10%，已经被用于人类某些遗传疾病的分析。Alu重复序列是不同的，可被分为几个亚家族，是极好的标志物，可被用于检测人类基因组。Alu作为特异的探针，使用PCR技术，可以定量人基因组DNA。在人类基因组中，许多新的Alu序列被发现，并且大部分序列在其他灵长类基因组中不存在，因此依据特异Alu重复序列的分析可作为人类DNA鉴定和定量的有利方法。
链霉亲和素包被的磁珠，目前已经广泛应用于生物素化核酸、抗体或其他生物素化配体及靶分子分离和处理。直径为2.8 μm的超顺磁珠，具有共价连接到表面并另外用BSA封闭的单层重组链霉亲和素。由于具有单层的链霉亲和素，绝大多数生物素结合位点在空间上不仅可以结合游离生物素，而且还可以结合生物素化的配体。它们显示出快速液相反应动力学特性，并且形状确定的特异性表面便于进行高效捕获、分离和下游操作。
实时荧光定量PCR（Real‑time polymerase chain reaction，简称Real‑time PCR，也被称为quantitative Real‑time polymerase chain reaction，简称Q‑PCR），是基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）的分子生物学技术，该技术可以对目标片段进行扩增的同时对目标DNA分子进行定量分析。实时荧光定量PCR使用特异的探针序列或者引物，随着扩增过程中DNA模板量的增加，释放出的荧光强度也在增加，因此实时荧光定量PCR可以利用较少的样品，动态检测初始目标DNA的含量。
发明内容
本发明目的在于提供一种提取人类宏基因组的方法，该方法利用探针杂交消减法，能够有效降低宿主宏基因组中宿主DNA背景干扰。
本发明第一方面，提供了一种宏基因组提取方法，其特征在于利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响。
根据本发明的实施方式，所述探针与所述宿主基因组DNA样品杂交后与所述磁珠偶联。
根据本发明的实施方式，提供了一种宏基因组提取方法，包括步骤：
1）将标记有生物素的所述探针与提取的所述宿主宏基因组DNA样品进行杂交；
2）用包被有链霉亲和素的所述磁珠捕获探针与所述宿主DNA的复合体，并用磁力架分离磁珠‑探针‑目标DNA复合物；
3）将去除所述磁珠‑探针‑目标DNA复合物的杂交液以及杂交后的磁珠清洗液进行纯化回收DNA。
根据本发明的实施方式，所述探针与所述磁珠偶联后与所述宿主基因组的杂交。
根据本发明的另一个实施方式，提供了一种宏基因组提取方法，包括步骤：
1）利用包被有链霉亲和素的所述磁珠与标记生物素的所述探针偶联；
2）将偶联好的复合物与所述宿主宏基因组DNA样品杂交；
3）去除磁珠‑探针‑目标DNA复合物，对杂交液和杂交清洗液进行纯化回收DNA。
根据本发明的实施方式，所述的宏基因组提取方法中，在偶联温度下使用多种正反向探针。使用多种正反向探针，可扩大探针与宿主DNA杂交时结合的范围，同时可以充分饱和磁珠上的链霉亲和素位点，提高磁珠的利用效率。
根据本发明的实施方式，所述的宏基因组提取方法中，在杂交完成之后，对所述磁珠‑探针‑DNA复合物进行加热或者氢氧化钠法变性，回收偶联有探针的磁珠。回收回收偶联有探针的磁珠，可降低实验成本。
根据本发明的实施方式，针对人基因组Alu重复序列家族设计探针，通过这些探针杂交消减，达到减少人体DNA在样品中比例的目的。其中探针以多种Alu重复序列家族以及其两端的保守序列为模板，双向设计探针，探针长度在40~70nt之间，且5’端修饰有生物素。探针序列可选自序列表SEQ ID NO：1~139的人Alu序列。利用人特异的Alu序列，消除呼吸道样品中宿主人基因组的影响，对高通量宏基因组测序有非常显著的帮助。
本发明第四方面提供了呼吸道样品处理方法，针对不同取样方法、样品物理性质，采用稀释液化、离心收集等方法，最大效率富集样品中的细胞。
该方法不仅适用于用于人呼吸道宏基因组学研究，也适用于人体其他部位例如口腔、消化道、皮肤、生殖道宏基因组学研究，可以有效降低人DNA的高背景干扰，从而有效富集微生物DNA，减少宿主DNA背景引起的测序数据浪费，提高有效数据的产出量，更深入的挖掘宏基因组中微生物信息。
附图说明
图1为支气管及肺泡灌洗液与气道分泌物总DNA凝胶电泳图。
图2为质粒标准品绘制的qPCR标准曲线。
图3为实施例1中混合样品原液、杂交液回收液以及磁珠清洗液中质粒qPCR绝对定量扩增曲线。3组曲线簇自左至右分别代表模拟混合DNA原样，杂交液BW，清洗液W，横线表示阈值线。
具体实施方式
实验例支气管肺泡灌洗液（BAL）、气道分泌物以及全血总DNA提取
一、支气管肺泡灌洗
对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶（B4或B5）或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气管肺段进行灌洗。首先在要灌洗的肺段经活检孔通过细硅胶管注入2%利多卡因1~2ml，做灌洗肺段局部麻醉；然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处，再经活检孔通过硅胶管快速注入37℃灭菌生理盐水。每次25~50ml，总量100~250ml，一般不超过300ml；立即用50~100mmHg负压吸引回收灌洗液，通常回收率为40%~60%；将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液，并记录总量；装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中（减少细胞粘附），置于含有冰块的保温瓶中。
二、气道分泌物吸引
选择合适的吸痰管，吸痰管的外径不应超过气管导管内径1/2；检查吸痰装置是否完好，吸引负压应不超过‑50mmHg；清洁口腔之后进行纯氧膨肺，气道灌洗。阻断吸痰管负压，将吸痰管插入气管导管作，吸痰后吸净口咽部分泌物。，达到气管导管末端时上提0.5cm开放负压，旋转上提；吸痰动作轻柔、迅速，每次吸痰时间不超过15秒；严格无菌操作。
三、仪器与试剂准备
ABI 7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，Life Technologies公司）。
Qubit® 2.0荧光定量仪（Invitrogen，Life Technologies公司）。
蛋白酶K：将100 mg蛋白酶K溶于5 mL双蒸水，配制成20 mg/ml的溶液，‑20℃保存。
1L PBS缓冲液（pH7.4）：
磷酸二氢钾(KH2PO4)（购自北京化工厂），0.27g
磷酸氢二钠(Na2HPO4)（购自西陇化工），1.42g
氯化钠(NaCl)（购自西陇化工），8g
氯化钾(KCl)（购自北京化工厂），0.2g
加去离子水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，高温高压灭菌后室温保存。
DNA提取试剂盒：QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，货号51306）。
四、提取步骤
1、取灌洗液收集1~5ml，13000rpm离心浓缩10分钟，弃上清，加入等体积PBS稀释，辅助溶解分散，对于粘稠的气道分泌物，需要先用2~3倍体积PBS进行稀释，轻柔混匀进行匀质化；
2、准备若干1.5ml离心管，每管加入50μl蛋白酶K于管中；
3、每管加入500μl稀释分散后的呼吸道分泌物样品，不足500μl用PBS补足；
4、每管加入500μl buffer AL（QIAamp DNA Mini Kit），轻柔混匀15秒后置于56℃水浴锅中，孵育10分钟；
5、取出后，快速离心，将管壁与管盖上的液滴收集回管内，加入500μl无水乙醇，涡旋混匀15秒，快速离心后，将管内全部混合物转移至离心柱中（可分两次进行），8000rpm离心1分钟，转移离心柱至新离心管中；
6、加入500μl buffer AW1，8000rpm离心1分钟，弃掉管内液体；
7、加入500μl buffer AW2，14000rpm离心3分钟，弃掉管内液体后，空甩1分钟；
8、转移离心柱至1.5ml新离心管中，加入30μl双蒸水，室温放置2分钟后，8000rpm离心一分钟。
提取出的总DNA，经过琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1，M：DL2000，条带由大到小为2000bp，100bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道1和泳道2为气道分泌物提取获得的DNA，浓度分别为72ng/μl，15ng/μl；泳道3和泳道4为支气管肺泡灌洗液提取获得的DNA，浓度均为21ng/μl。从图1可看出：基因组DNA条带完整。
图2为质粒标准品绘制的qPCR标准曲线。标准品采用BAP质粒（2.6 kbp）5倍梯度稀释成5个浓度梯度的样品，由标准品浓度以及Ct值绘制标准曲线，用于定量分析样品中质粒含量。图中横坐标Log CO表示模板浓度，纵坐标Ct表示样品的Ct值，每个方形点表示标准样品。由此进行模拟实验中杂交前后样品中质粒的定量。
灌洗液与全血参照上述步骤进行总DNA提取。
实施例杂交消减降低宏基因组DNA中宿主DNA背景
本发明利用Alu序列在人DNA中出现频率高的特点，针对Alu家族序列以及两端保守区域设计探针，5’端用生物素标记，并将不同序列的多种探针配合使用，通过联袂亲和素包被的磁珠，将杂交复合DNA捕获出来，从而减少宿主DNA在宏基因组中的背景干扰。
所需试剂及母液配制：
20×SSPE：称取210.6g NaCl（购自西陇化工），27.6g NaH2PO4.H2O（购自北京化工厂），5.845g EDTA（购自西陇化工），去离子水溶解，调整pH至7.7，定容至1L，过滤除菌分装，4℃保存。
100×Denhardt’s regent溶液：称取2g聚蔗糖（Ficoll，400型，购自Sigma），2g聚乙烯吡咯烷酮（PVP‑40，购自Sigma，P‑3004），2g BSA（购自索宝来生物科技），加水至总体积为100ml。过滤除菌，分装成小份，‑20℃贮存。
20×SSC：称取88.2g柠檬酸钠（购自西陇化工），175.3g NaCl，加900ml水溶解，用NaOH（购自北京化工厂）调节pH至7.0，去离子水定容至1L，过滤除菌。     10%SDS溶液：取10gSDS（购自北京全新拓达科技），去离子水溶解，定容至100ml。
1M Tris‑HCl；称取72.66gTris‑base（购自北京全新拓达科技），加入500ml去离子水，用HCl（购自北京化工厂）调节pH至7.5，定容至600ml。
50mM EDTA溶液：称取1.86gEDTA溶于100ml去离子水。
4M NaCl 溶液：称取23.376gNaOH溶于100ml去离子水。
以上母液均用过滤法除菌。
杂交液：50ml 2× B&W buffer：取0.5ml 1M Tris‑HCl (pH 7.5)，1ml 50mM EDTA，25ml 4M NaCl，加水至50ml。
50ml 2×杂交液HYB buffer：取25ml 20×SSPE溶液，5ml 100×Denhardt’s溶液，10ml 50mM EDTA，1ml 10% SDS，加水至50ml。
50ml磁珠清洗液wash buffer：取2.5ml 20×SSC，0.5ml 10%SDS，加水至50ml
探针变性磁珠回收液（0.15M NaOH）：称取0.6gNaOH，溶于100ml去离子水中，分装保存。
实施例1 对模拟混合样品进行探针杂交消减（先杂交后偶联）
1、模拟混合DNA取20 μl（按人全血DNA与2815bp质粒按照纳克量9∶1混合，总量约100ng/μl）于200μl管中，置于PCR仪中95℃预热5分钟，65℃ 5分钟；取 27μl 2×杂交液HYB置于PCR仪中65℃预热5分钟；
2、取序列号为SEQ ID NO：1~70的探针各0.1μl，约70pmol，65℃预热2分钟；
3、混合上述体系共54μl，65℃，杂交1小时；
4、取磁珠M‑280（invitrogen）30μl，用2×B&W buffer清洗2次，弃上清，用54μl 2×B&W重悬；
5、将杂交体系（54μl）加入磁珠中，混匀，室温下（20℃~25℃）孵育15分钟，期间轻弹管壁，混匀；
6、磁珠结合过程结束之后，将1.5ml离心管置于磁力架上，室温放置1~2分钟，待磁珠吸附到管壁之后，吸取上清保留，标记为BW；
7、用100μl wash buffer，轻轻吹打清洗磁珠，然后置于磁力架上静止，上清吸出保留标记为W，再重复2次；
8、用100μl wash buffer，轻轻吹打清洗磁珠，然后置于磁力架上静止，上清吸出保留标记为W，再重复2次；将回收回来的杂交液BW与wash buffer清洗之后的回收液W用Qiagen PCR纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit，QIAGEN，货号28106）柱回收DNA，50μL洗脱DNA。磁珠可按如下的方法保存：20μl 0.15M NaOH溶液重悬磁珠，室温下孵育10分钟，置于磁力架上1~2分钟后去除上清，加30μl 1×B&W buffer溶液，4℃保存磁珠。磁珠用50μL 1×SSC溶液清洗之后，加入50μL 1×SSC重悬磁珠，95℃孵育5分钟，置于磁力架上静置1~2分钟后，移除上清，加入30μL 1×B&W溶液保存。
实施例2 对呼吸道灌洗液样品总DNA进行探针杂交消减（先杂交后偶联）
除了在实施例1步骤1中，选用人呼吸道灌洗液样品DNA、取2×杂交液HYB 32μl、步骤2中取序列号为SEQ ID NO：1~4的探针各3μl（约120pmol）、步骤4中用64μl 2×B&W重悬以外，以与实施例1中相同的方法和条件进行先杂交后偶联探针杂交消减。
实施例3 对模拟混合样品进行探针杂交消减（先偶联后杂交）
1、取磁珠M‑280（invitrogen）30μl，用2×B&W buffer 清洗2次，弃上清，加入15μl 2× B&W buffer重悬磁珠；
2、向重悬的磁珠中加入序列号为SEQ ID NO：71~139的探针各0.1μl（约70pmol）以及8μl ddH2O，室温下孵育15分钟，期间轻旋混匀；置于磁力架室温放置1~2分钟，去上清；
3、模拟混合DNA取20 μl（按人全血DNA与约2.6kbp质粒按照纳克量9∶1混合，总量约100ng/μl）于200μlPCR管中，置于PCR仪95℃预热5分钟，65℃ 5分钟；取26μl 2×杂交液HYB置于PCR仪中65℃预热5分钟；
4、将混合DNA和杂交液加入磁珠中，混匀，置于PCR仪中65℃，杂交1小时，期间间隔混匀；
5、杂交结束之后步骤参照实施例1的步骤6‑8。
实施例4 对呼吸道灌洗液样品总DNA进行探针杂交消减（先偶联后杂交）
除了步骤2中加入12种序列号为SEQ ID NO：1~12的探针各1μl（120pmol）以及3μl水、步骤3中取人呼吸道灌洗液样品DNA样品20 μl外，以与实施例3中相同的方法和条件进行先偶联后杂交探针杂交消减。
检测例1 测定杂交消减前后宿主DNA的降低
利用实时荧光定量PCR进行绝对定量分析，测定杂交消减前后混合样品中质粒DNA的含量差异，以及人DNA与质粒DNA的比例差异。实时荧光定量PCR试剂采用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（Toyobo），选取质粒上特定序列设计的序列号为SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：143的引物和序列号为SEQ ID NO：144的探针，探针的5’端标记FAM荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭集团。依照THUNDERBIRD Probe qPCR Mix说明书进行Realtime‑PCR实验。通过标准样对杂交前后质粒DNA的含量进行绝对定量，每个样品3个重复样。Q‑bit荧光定量测定DNA样品的总DNA含量之后，用总量减去质粒DNA量，即为人DNA含量，测定以ng为单位，结果见表1。
图3为实施例1中混合样品原液、杂交液回收液以及磁珠清洗液中质粒qPCR绝对定量扩增曲线。3组曲线簇自左至右分别代表模拟混合DNA原样，杂交液BW，清洗液W。绿色横线表示阈值线，阈值线与扩增曲线相交处对应的循环数即为Ct值，通过Ct值可以比较计算初始DNA模板量。Ct值越小，初始模板浓度越大，结合DNA溶液体积即可计算初始模板总量。
经过实时荧光定量PCR对混合DNA原液和杂交回收液中的质粒进行绝对定量分析，合并BW和W纯化回收之后得到的质粒量。实施例1中，质粒回收效率约为初始混合DNA中质粒的91%，杂交之后人与质粒DNA量（ng）比例约为1∶1；实施例3中，质粒回收效率约为初始混合DNA中质粒的83.5%，杂交之后人与质粒DNA量（ng）比例约为0.92∶1，能够有效减少人DNA的含量，结果见表1。
表1 定量分析实施例1和3中杂交前后的质粒DNA和人DNA含量及比例。

检测例2 测定细菌DNA含量变化
针对细菌和古菌的16S rDNA的保守区域设计序列号为SEQ ID NO： 140和SEQ ID NO：141的通用引物，目的是通过染料法的实时荧光定量PCR，检测杂交前后呼吸道灌洗液总DNA中微生物的相对含量的变化。依照THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix说明书进行Realtime‑PCR（TOYOBO有限公司生命科学部，日本大阪，货号QPS‑201）实验。由于初始DNA使用量为20μl，杂交后回收洗脱用水量为40μl，故Real‑time PCR定量实验中，杂交后回收DNA用量体积为杂交前DNA用量体积的2倍，以调整二者初始总体积比例的差异。
经过Real‑time PCR定量实验，实施例2和实施例4中，杂交消减后的细菌含量分别提高约3倍和16倍，见表2。运用此方法，可以重复利用偶联有探针的磁珠对实际呼吸道灌洗液样品进行杂交消减，降低样品杂交处理的成本。细菌含量杂交前后比值见表2。
表2 定量分析实施例2和实施例4样品杂交前后细菌含量

* ddCt=杂交后样品Ct值－杂交前样品Ct值
**含量比值（杂交后细菌DNA含量：杂交前细菌DNA含量）=2‑ddCt。