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1、(10)申请公布号 CN 102978202 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102978202 A *CN102978202A* (21)申请号 201210383179.4 (22)申请日 2012.10.10 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院北京畜牧兽医研究 所 地址 100094 北京市海淀区圆明园西路 2 号 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 申请人 扬州大学 (72)发明人 李奎 宋成义 吴晗 鞠辉明 白立景 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54。
2、) 发明名称 一种肌肉特异表达猪 IGF1 基因的过表达载 体 (57) 摘要 本发明为一种猪骨骼肌中特异过表达猪内 源 IGF1(C1 ： Ea) 基因的安全型表达载体。该载 体 包 含 猪 内 源 性 序 列 sk-actinPromoter/ IGF1(C1:Ea)/sk-actin3 UTR/SV40 增强子串 联组成的表达盒。本发明的表达载体在细胞水平 上验证了骨骼肌特异 sk-actin 启动子在成肌 细胞中能高效表达， 在具有成肌分化潜能的 PEF 细胞中仅低水平表达而在其他类型细胞中不表 达。 本发明中构建的载体制备转基因小鼠， 通过定 量 PCR 和 WesternBlot 。
3、检测出转基因小鼠骨骼肌 中 IGF1 基因的 mRNA 和蛋白表达水平分别为野生 型小鼠的 15 倍和 3.5 倍， 并且仅在骨骼肌中高效 表达。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 9 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 9 页 附图 6 页 1/1 页 2 1. 一种猪内源性骨骼肌特异 sk-actin 启动子驱动 IGF1 基因的表达盒， 是由依次 串联的 sk-actin 启动子、 猪 IGF1 基因、 sk-actin 3 UTR 和 SV40 增强子组成 ； 其序 。
4、列如 SEQ ID No.1 所示。 2. 一种骨骼肌特异过表达猪 IGF1 基因安全型表达载体， 其特征在于含有权利要求 1 所述的猪内源性骨骼肌特异 sk-actin 启动子驱动表达盒 ； 该表达载体的序列如 SEQ ID No.2 所示。 3. 根据权利要求 2 所述的载体， 其特征在于 ： 是将权利要求 1 所述猪内源性骨骼肌特 异 sk-actin 启动子驱动表达盒通过 EcoRV 酶切位点克隆到转座子载体 pT2-HB 中而获 得。 权 利 要 求 书 CN 102978202 A 2 1/8 页 3 一种肌肉特异表达猪 IGF1 基因的过表达载体 技术领域 0001 本发明涉及一。
5、种安全型骨骼肌特异表达猪类胰岛素生长因子 1(insulin-like growth factor1,IGF1) 基因的过表达载体。 背景技术 0002 在研究基因功能及转基因动物生产过程中， 人们常常借助真核表达载体来实现， 例如 pcDNA3.0 系列载体。传统方法往往通过分子生物学手段将目的基因片段连接到病毒 启动子 （如 CMV 启动子） 或异源性强启动子下游， 以指导外源基因表达。该方法在基因表达 及功能的研究中有着极其广泛的应用， 但诸多研究暴露了该手段不足的一面 ： 异源性基因 序列导入宿主常引起基因组序列的紊乱， 内源性基因表达异常， 甚至改变宿主固有的特征 表型 ； 也常常引。
6、起人们对转基因伦理问题的争论。 此外， 病毒启动子序列或指导质粒DNA复 制等原核拢余序列的引入， 易引起转基因安全问题， 须经长期的生物安全评价才能投入实 际应用， 既费时又耗费财力。同时， 普遍性过表达外源基因常引起机体生长等的异常。因 此， 在利用转基因技术进行动物遗传改造时， 同一物种的内源基因序列， 以及组织表达的特 异性是保证转基因动物安全性的基础。 发明内容 0003 本发明提供了一种猪内源性骨骼肌特异 sk-actin 启动子驱动的表达框架， 以 及含有该表达框架的猪骨骼肌特异过表达猪 IGF1 基因安全型表达载体。 0004 本发明所述的猪内源性骨骼肌特异sk-actin启动。
7、子驱动IGF1基因的表达盒， 是由依次串联的 sk-actin 启动子 （sk-actin Promoter） 、 猪 IGF1（C1 ： Ea）基因、 sk-actin 3 UTR 和 SV40 增强子组成 ； 该表达盒序列如 SEQ ID No.1 所示。 0005 本发明所述骨骼肌特异过表达猪 IGF1 基因安全型表达载体， 含有上述的猪内源 性骨骼肌特异 sk-actin 启动子驱动表达盒， 是通过 EcoRV 酶切位点克隆到转座子载体 pT2-HB 中而获得 ； 该表达载体的序列如 SEQ ID No.2 所示。 0006 本发明中所述猪内源性骨骼肌特异 sk-actin 启动子驱动。
8、 IGF1 基因的表达 盒是由依次串联的 sk-actin 启动子、 猪 IGF1（C1 ： Ea）基因、 sk-actin 3 UTR 和 SV40增强子组成 ； 所述猪内源sk-actin启动子为克隆测序的2602个核苷酸序列 ； 所述 sk-actin 3 UTR 为克隆测序的 751 个核苷酸序列 ； 所述猪 IGF1（C1 ： Ea） 基因 CDS 全长 为 393 个核苷酸序列， 具有 GENBANK 号为 NM 214256.1 的自 5端第 13 405 位核苷酸序 列 ; 所述 SV40 增强子为 242 个核苷酸序列， 从 pGL3-control 载体自 +1 第 220。
9、1-2442 位核 苷酸序列克隆获得。 0007 所述表达载体安全性体现在载体表达调控元件及目的基因均克隆自猪内源序列， 以及转座子载体序列为脊椎动物所特有， 表达载体的核苷酸序列见序列表。 0008 本发明中的骨骼肌特异过表达猪 IGF1(C1 ： Ea) 基因的安全型表达载体， 在细胞水 平上验证了骨骼肌特异 sk-actin 启动子在成肌细胞中能高效表达， 在具有成肌分化潜 说 明 书 CN 102978202 A 3 2/8 页 4 能的 PEF 细胞中仅低水平表达而在其他类型细胞中不表达 ； 本发明中构建的载体制备转基 因小鼠， 通过定量 PCR 和 Western Blot 检测出。
10、转基因小鼠骨骼肌中 IGF1 基因的 mRNA 和蛋 白表达水平分别为野生型小鼠的15倍和3.5倍， 并且仅在骨骼肌中高效表达， 为制备安全、 骨骼肌特异表达目的基因的转基因猪模型提供了平台。 附图说明 0009 图 1 ： PCR 扩增 sk-actin Promoter 产物电泳图 ； 0010 图 2 ： PCR 扩增 sk-actin 3 UTR 产物电泳图 ； 0011 图 3 ： PCR 扩增猪 IGF1(C1 ： Ea)cDNA 产物电泳图 ； 0012 图 4 ： PCR 扩增 SV40Enhancer 产物电泳图 ； 0013 图 5 ： 表达载体元件连接示意图 ； 0014。
11、 图 6 ： pT2/-actin-IGF1 质粒酶切产物电泳图 ； 0015 图 7 ： pT2/-actin-IGF1 质粒图谱 ； 0016 图 8 ： pT2/-actin- IGF1骨架驱动报告基因 GFP 在各组细胞中表达 ； 0017 图 9 ： pIGF1 转基因鼠 PCR 检测外源基因 ； 0018 图 10 ： pIGF1 转基因鼠 SOUTHERN BLOT 检测外源基因 ； 0019 图 11 ： 荧光定量检测 IGF1 基因在转基因小鼠组织器官中的表达 ； 0020 图 12 ： Western Blot 检测 IGF1 基因在转基因小鼠组织器官中的表达 ； 0021。
12、 图 13 ： Western Blot 检测 IGF1 基因在转基因小鼠骨骼肌中的表达。 具体实施方式 0022 下述实施例中提到的实验方法， 如无特别说明均为常规方法。 0023 实施例 I、 骨骼肌特异表达猪 IGF1 载体的构建 0024 1、 特异表达载体基本构件的获得 0025 （1） 猪 sk-actin Promoter 特异片段的制备 0026 以长白猪基因组 DNA 为模板， 按表 1 中列举的扩增 sk-actin Promoter 的引 物扩增骨骼肌特异 sk-actin 启动子片段。反应体系为 50l， 5L 10Buffer、 4L 2.5mM dNTP、 1L 2。
13、0M 引物 sk-actin Promoter F、 1L 20M 引物 sk-actin Promoter R（引物序列见表 1） 、 0.5L5 U/L 高保真 LA Tag 聚合酶， 2l 长白猪基因组 DNA模板， 加超纯水至50L （高保真酶购自TaKaRa Code ： DR002A） 。 PCR扩增程序 ： 9510s， 60 3min， 循环 35 次。PCR 扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 （如图 1 所示） 。 0027 PCR 产物用 QIAGEN 琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化 （操作步骤见试剂盒说明） ， 将纯化 产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector （。
14、TaKaRa Code ： D102A） ,按要求步骤操作转化DH5 感受态大肠杆菌 （购自北京全式金公司， 货号 CD201） ； 菌液涂琼脂糖凝胶板， 于 37培养箱 中培养过夜 ； 挑单菌落接种于液体 LB 培养基中培养， 部分菌液送公司测序 （invitrogen 北 京分公司） 。测序结果表明含有 sk-actin Promoter 的重组载体， 提取质粒备用。 0028 （2） 猪 sk-actin 3 UTR 特异片段的制备 0029 以长白猪基因组 DNA 为模板， 按表 1 中列举的扩增 sk-actin 3 UTR 的引物扩 增骨骼肌特异sk-actin 3 UTR片段。 。
15、反应体系为50l， 5L 10Buffer、 8L 2.5mM 说 明 书 CN 102978202 A 4 3/8 页 5 dNTP、 1L 20M 引物 sk-actin 3 UTR F、 1L 20M 引物 sk-actin 3 UTR R( 序 列见表 1)、 0.5L5U/L 高保真 LA Tag 聚合酶， 2l 长白猪基因组 DNA 模板， 加超纯水至 50L（高保真酶购自 TaKaRaCode ： DR002A） 。PCR 扩增程序 ： 95 10s， 60 1min， 循环 35 次。PCR 扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 （如图 2 所示） 。 0030 PCR 产物用。
16、 QIAGEN 琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化 （操作步骤见试剂盒说明） ， 将纯化 产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector （TaKaRa Code ： D102A） ,按要求步骤操作转化DH5 感受态大肠杆菌 （购自北京全式金公司， 货号 CD201） ； 菌液涂琼脂糖凝胶板， 于 37培养箱 中培养过夜 ； 挑单菌落接种于液体 LB 培养基中培养， 部分菌液送公司测序 （invitrogen 北 京分公司） 。测序结果表明含有 sk-actin 3 UTR 的重组载体， 提取质粒备用。 0031 （3） 猪 IGF1(C1 ： Ea)cDNA 的克隆 0032 以长白猪肝脏组织cD。
17、NA为模板， 按表1中列举的扩增IGF1(C1 ： Ea)的引物扩增 类 Ea 特异剪接体形式的 IGF1CDS 片段 （GENBANK 登录号为 NM 214256.1 的自 5端第 13 405位核苷酸序列） 。 反应体系为50l， 5L 10Buffer、 4L 2.5mM dNTP、 1L 20M引 物 IGF1(C1 ： Ea)F、 1L 20M 引物 IGF1(C1 ： Ea)R （引物序列见表 1） 、 0.5L5U/L 高保真 LA Tag 聚合酶， 2l 长白猪肝脏组织 cDNA 模板， 加超纯水至 50L（高保真酶购自 TaKaRa Code ： DR002A） 。PCR 。
18、扩增程序 ： 95 10s， 60 1min， 循环 35 次。PCR 扩增产物用 1.5% 琼脂 糖凝胶电泳检测 （如图 3 所示） 。 0033 PCR 产物用 QIAGEN 琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化 （操作步骤见试剂盒说明） ， 将纯化 产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector （TaKaRa Code ： D102A） ,按要求步骤操作转化DH5 感受态大肠杆菌 （购自北京全式金公司， 货号 CD201） ； 菌液涂琼脂糖凝胶板， 于 37培养箱 中培养过夜 ； 挑单菌落接种于液体 LB 培养基中培养， 部分菌液送公司测序 （invitrogen 北 京分公司） 。测序结果表。
19、明含有 IGF1(C1 ： Ea) 的重组载体， 提取质粒备用。 0034 （4） SV40Enhancer 特异片段的制备 0035 以 pGL3-control 载体 （Promega Code ： E1741） 为模板， 按表 1 中列举的扩增 SV40 Enhancer的引物扩增特异的真核表达增强子片段 （pGL3-control载体自+1第22012442 位核苷酸序列） 。反应体系为 50l， 5L 10Buffer、 4L 2.5mM dNTP、 1L 20M 引 物 SV40 EnhancerF、 1L 20M 引物 SV40 Enhancer R（引物序列见表 1） 、 0.。
20、5L5 U/L 高保真 LA Tag 聚合酶， 20ng pGL3-control 载体为模板， 加超纯水至 50L（高保真酶购 自 TaKaRa Code ： DR002A） 。PCR 扩增程序 ： 95 10s， 60 30s， 循环 35 次。PCR 扩增产物用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 （如图 4 所示） 。 0036 PCR 产物用 QIAGEN 琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化 （操作步骤见试剂盒说明） ， 将纯化 产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector （TaKaRa Code ： D102A） ,按要求步骤操作转化DH5 感受态大肠杆菌 （购自北京全式金公司， 货号 C。
21、D201） ； 菌液涂琼脂糖凝胶板， 于 37培养箱 中培养过夜 ； 挑单菌落接种于液体 LB 培养基中培养， 部分菌液送公司测序 （invitrogen 北 京分公司） 。测序结果表明含有 SV40Enhancer 的重组载体， 提取质粒备用。 0037 2、 pT2/-actin-IGF1 特异表达载体的构建 0038 （1） 非转座子表达载体 pA-actin-IGF1 的构建 0039 以 pGL3-control vector（Promega Code ： E1741） 为骨架载体， 用 KpnI/MluI 双酶 切将 sk-actin Promoter 从克隆 T 载体上切下， 连。
22、入骨架载体 KpnI/MluI 酶切位点处， 说 明 书 CN 102978202 A 5 4/8 页 6 构建成pGL3-1中间载体 ； 再用NcoI/HpaI双酶切将sk-actin 3 UTR/SV40 enhancer片 段从克隆 T 载体上切下， 连接入中间载体 pGL3-1 的 NcoI/HpaI 酶切位点处， 构建成 pGL3-2 中间载体 ； 然后用 EcoRI/NcoI 双酶切将 IGF1 从克隆 T 载体切下， 连入中间载体 pGL3-2 的 EcoRI/NcoI 酶切位点处， 构建成 pA-actin-IGF1 表达载体。 （连接酶购自 Promega Code ： M1。
23、804） 0040 （2） pT2/-actin-IGF1 表达载体的构建 0041 用 内 切 酶 EcoRV 将 包 含 sk-actin Promoter/IGF1(C1:Ea)/sk-actin 3 UTR/SV40 enhancer 串 联 组 成 的 的 表 达 盒 （图 5） ( 命 名 为 -actin-IGF1) 从 pA-actin-IGF1 表达载体上切出， 用 0042 QIAGEN 琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化 （操作步骤见公司试剂盒） ； -actin-IGF1 表 达盒的序列如 SEQ ID No.1 所示， 0043 同时用 EcoRV 酶切两侧含正反向转座元件的转。
24、座子载体 pT2-HB（由 Hackett 教授 （Unibersity of Minnesota,USA） 惠赠， Zongbin Cui,Aron M.Geurts,Geyi Liu,Christopher D.Kaufman,Perry B.Hackett.StructureFunction Analysis of the Inverted Terminal Repeats of theSleeping Beauty Transposon.Journal of Molecular Biology,318(5):1221-1235. 该载体在 Hackett 教授的实验室网站 http:/。
25、 www.cbs.umn.edu/labs/perry/plasmids/plasmid.html 有详细的图谱及序列信息） ， 将 -actin-IGF1 表达盒 ( 含有 IGF1(C1 ： Ea) 的纯化产物与酶切后的载体 pT2-HB 连接构建 成pT2/-actin-IGF1表达载体。 pT2/-actin-IGF1质粒酶切鉴定结果如图6所示， pT2/ -actin-IGF1 质粒图谱如图 7 所示。 0044 表 1 ： 本发明中用于扩增载体构件的引物 0045 说 明 书 CN 102978202 A 6 5/8 页 7 0046 实施例 II、 本发明的含骨骼肌特异 sk-a。
26、ctin 启动子驱动 GFP 的细胞水平表达 检验 0047 1、 冻存细胞的复苏与培养 0048 pEGFP-N1 质粒 ( 购自 Clontech 货号为 PT3027-5)、 pT2/-actin-GFP 质粒用 QIAGEN 纯化试剂盒胶回收， 产物终浓度调整为 500ng/ul 用于细胞转染。 0049 从液氮中取出装有猪胎儿成纤维细胞 PEF（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 细胞工程实验室自行分离培养） 、 小鼠 C2C12 细胞和猪 PK15 细胞 （购自中国科学院细胞库） 的冻存小管， 立即投入 37-40的温水中快速晃动， 直至冻存液完全融解 ； 在 1-2min 内完成 。
27、复温 ； 将细胞悬液移入无菌的离心管， 加入5mL培养液， 轻轻吹匀 ； 将细胞悬液800-1000rpm 离心 5min， 弃上清 ； 向含有细胞沉淀的离心管加入 1mL 完全培养基， 轻轻吹匀， 将细胞悬液 转入细胞培养瓶， 加入适量的完全培养基进行培养。 0050 2、 细胞转染与筛选 0051 将猪胎儿成纤维细胞 PEF、 小鼠成肌细胞 C2C12 细胞系和猪肾细胞 PK15 细胞系 分别分成三组 （转染空白 pT2-HB 质粒对照组、 转染 pEGFP-N1 质粒阳性对照组、 转染 pT2/ -actin-GFP 质粒组） ， 每组 2 个重复。 0052 转染前 24h， 向每孔含。
28、 10% 胎牛血清 （购自 GIBCO 公司， 货号 ： 21640-079）的 500LDMEM 高糖培养基 （购自 GIBCO 公司， 货号 ： 12100-046） 的 24 孔板中按 0.5-2105个 细胞 / 孔分别接种三种细胞系， 使细胞在转染前达到约 90% 的汇合 ； 用 50L 的无血清、 无 抗生素的培养基分别稀释 0.8g 待转染 DNA， 并温和的混匀 ； 使用前将脂质体温和摇匀， 将 说 明 书 CN 102978202 A 7 6/8 页 8 2LlipefectaminTM-2000 加入 50L 的无血清、 无抗生素的 DMEM 培养基并轻轻混匀， 于室 温孵。
29、育 5min ； 5min 后， 分别将 50L 的各组 DNA 稀释液加入 50L 的脂质体稀释液， 轻轻混 匀并于室温放置 20min ； 将 100L 的 DNA 脂质体混合物加入到准备好的孔内， 轻轻来回晃 动培养板， 将其置于 37、 饱和湿度、 5%CO2的培养箱中培养， 于 4h 后用完全培养基代替转 染培养基， 完全培养 24-36h 后于 495nm 波长下观察绿色荧光的瞬时表达强度。 0053 3、 转染细胞绿色荧光表达强度鉴定 0054 以广谱表达的 CMV 启动子的报告基因表达载体 pEGFP-N1 为阳性对照组， pT2-HB 质粒为空白对照组， pT2/-actin。
30、-GFP 为实验组， 分别转染 (a) 成肌细胞 C2C12、 (b) 猪 胎儿成纤维细胞 PEF 和 (c) 猪肾细胞 PK15， 转染 24h 后， 荧光显微镜下观察荧光。结果发 现 ： 以 pT2-HB 质粒为空白组的三种细胞系中均无绿色荧光表达， pT2/-actin-GFP 转染 的成肌细胞 C2C12 中的荧光强度明显高于对照组 ； 而在猪胎儿成纤维细胞 PEF 中， pT2/ -actin-GFP 转染组的荧光强度则明显低于对照组 ； 在高度分化的猪肾细胞 PK15 中， pT2/ -actin-GFP 转染组完全没有荧光的表达。 （如图 8 所示） 。结果表明实验中构建的表达载。
31、 体具有较高的细胞类型特异性， 证实了本实验中克隆的启动子能够介导外源基因在体内肌 肉中特异高效的表达。 0055 实施例 III、 含猪 IGF1 表达载体制备的转基因小鼠的验证 0056 1、 表达猪 IGF1 转基因小鼠的制备 0057 将环状 pT2/-actin-IGF1 质粒与表达转座酶的质粒 pCMV-SB11 按 1 1 等摩尔 浓度混合， 利用原核显微注射法制备转基因小鼠。 0058 2、 转基因小鼠的整合检测 0059 分别利用针对sk-actin Promoter(P 1)、 sk-actin 3 UTR(P2)和pIGF1全 长 (P3) 检测引物 （见表 2） 检测转。
32、基因小鼠基因组 DNA 中相应载体元件的整合。 0060 检测 1 中获得的转基因小鼠后代中外源基因的整合情况。PCR 反应体系为 20l， 2L10Buffer、 2L 2.5mM dNTP、 1L 20M引物F、 1L 20M引物R、 0.5L5 U/L 高保真Tag聚合酶， 100ng小鼠尾组织DNA， 加超纯水至20L。 PCR扩增程序 ： 95C 5min ； 94C 30s， 6030s， 72C 1min， 循环30次， 最后72C延伸5min。 PCR扩增产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测， 筛选出分别能扩增出sk-actin Promoter、 sk-actin 3 UTR及。
33、 pIGF1 基因的鼠为转基因阳性鼠 ( 图 9)( 图中， blank ： 阴性对照， 正常鼠 DNA 为模板 ； 1-20 ： 为部分转基因鼠扩增条带， 上图可见 5、 7、 15-18 号鼠能扩增出预期条带 )。 0061 以表 2 中为检测整合载体元件及标记探针产物的引物 （合成探针引物见表 2） ， 按照试剂盒操作说明书体系加样 ； PCR 运行程序如下 ： 95 5min， 94 30S， 60 1min， 72 1min， 30 个 循 环 后 72 延 伸 5min（探 针 标 记 试 剂 盒 购 自 Roche 公 司， 货 号 ： 11175033910） 。 0062 以。
34、 PCR 产物为探针进行 southen 杂交检测， 杂交前在 95变性 5 分钟后立即冰水 中冷却备用 ； 大量抽提小鼠尾组织 DNA （动物基因组 DNA 提取试剂盒购自 Roche 公司， 货号 ： 11814770001） ， 用EcoRV酶切基因组， 于1%琼脂糖凝胶电泳分离各酶切片段， 每孔上样5ug ； 然后使 DNA 原位变性后转移到带正电荷尼龙膜上。按照试剂盒操作说明进行预杂交、 杂交 及 X- 光片曝光检测杂交信号 （购自 Roche 公司， 货号 ： 11745832910） 。检测结果 （图 10） 表 明， PCR 检测阳性鼠样， southern 杂交检测相应鼠能检。
35、测出相应条带 （图中， + ： 为含目标基 说 明 书 CN 102978202 A 8 7/8 页 9 因的质粒 DNA, 作为阳性对照 ； 1-9 号样品所代表的转基因鼠为目标基因整合小鼠 ； ： 为 野生型小鼠的基因组 DNA, 作为阴性对照） 。 0063 3、 小鼠组织总 RNA 提取及 cDNA 的制备 0064 从 2 中筛出的阳性转基因小鼠正常饲养至 16 周龄， 屠宰取各组织器官用于提取 RNA， 按照天根动物组织总 RNA 提取试剂盒 （货号 ： DP431） 操作说明， 提取各组织细胞总 RNA ； 按照 Ferment 反转录试剂盒 （货号 ： K0441） ， 将提取。
36、的总 RNA 反转录成 cDNA。 0065 4、 IGF1 转基因小鼠荧光定量 PCR 检测 0066 以 3 中制备的 cDNA 为模板， 分别以 IGF1 及小鼠 -actin 基因为内参 （扩增方法 如实施例 I 的步骤 1（引物见表 2） ） ， 进行荧光定量 PCR 测定 IGF1 的表达量， 上样体系按照 ABI 定量试剂说明书上样 , 反应体系为 20l， 10L 2Mixturer( 购自 TaKaRa 公司， 货 号 DRR041A)、 1L 20M 上游引物、 1L 20M 下游引物、 1L cDNA， 加超纯水至 20L。 PCR 扩增程序 ： 95 C 30s， 95。
37、 C 5s， 60 34s， 循环 40 次， 最后 72 C 延伸 5min。 0067 荧光定量检测结果如图 11 所示， 在进行 IGF1 表达水平检测时， 以野生型小鼠 （对 照组） 肝脏组织表达量为基准， 转基因小鼠骨骼肌中 IGF1 的表达量是对照组的 15 倍， 而其 他组织中 IGF1 的表达量与对照组相应组织中的表达量相当， 证实转外源 IGF1 表达盒能特 异高效地在骨骼肌中过量表达。 0068 表 2 转基因鼠筛选鉴定及定量引物 0069 0070 说 明 书 CN 102978202 A 9 8/8 页 10 0071 5、 IGF1 转基因小鼠 Western blo。
38、t 检测 0072 从 2 和 4 中筛出的阳性转基因小鼠样品中提取总蛋白 （总蛋白抽提试剂盒购自 Thermo公司， 货号 ： 78510） ， 经蛋白电泳、 转膜后， 用抗人IGF1一抗进行杂交检测 （抗人IGF1 抗体购自 Abcam 公司， 货号 ： ab106836） ， 并进行常规压片、 曝光检测杂交信号。 0073 Western blot 检测蛋白表达结果如图 12、 图 13 所示， 外源 IGF1 蛋白表达谱显示 在转基因小鼠骨骼肌中高表达， 同时在心肌中也有微量表达， 而在其他组织中无表达 ； 转基 因小鼠骨骼肌中IGF1表达与正常小鼠骨骼肌中IGF1的表达水平相比， 明。
39、显高于正常小鼠， 对灰度值量化比较， 发现转基因小鼠骨骼肌中 IGF1 蛋白表达量约为正常小鼠的 3.5 倍。证 实了转基因表达载体能在体内促进外源 IGF1 在骨骼肌中特异性地过量表达。 说 明 书 CN 102978202 A 10 1/9 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102978202 A 11 2/9 页 12 0003 序 列 表 CN 102978202 A 12 3/9 页 13 0004 序 列 表 CN 102978202 A 13 4/9 页 14 0005 序 列 表 CN 102978202 A 14 5/9 页 15 0006 序 列 表 CN 1。
40、02978202 A 15 6/9 页 16 0007 序 列 表 CN 102978202 A 16 7/9 页 17 0008 序 列 表 CN 102978202 A 17 8/9 页 18 0009 序 列 表 CN 102978202 A 18 9/9 页 19 序 列 表 CN 102978202 A 19 1/6 页 20 图 1 图 2 图 3图 4 说 明 书 附 图 CN 102978202 A 20 2/6 页 21 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102978202 A 21 3/6 页 22 图 7 说 明 书 附 图 CN 102978202 A 22 4/6 页 23 图 8 说 明 书 附 图 CN 102978202 A 23 5/6 页 24 图 9 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 102978202 A 24 6/6 页 25 图 12 图 13 说 明 书 附 图 CN 102978202 A 25 。