说明书一种基因抑制细胞K562‑siWnt5a及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种转基因细胞的构建，尤其涉及一种基因抑制细胞K562‑siWnt5a及其制备方法。
背景技术
Wnt5a 蛋白是一种分泌型的糖蛋白，属于Wnt家族，在不同肿瘤中，Wnt5a发挥着不同的作用，如在它能促使乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤生长甚至可促使肿瘤的侵袭，而在甲状腺肿瘤、结肠直肠癌等肿瘤中Wnt5a可能发挥着抑制肿瘤的作用。Wnt5a在肿瘤发生中的作用和机理仍不清楚。
在前期的研究中，我们使白血病细胞K562细胞过表达Wnt5a基因，并研究过表达Wnt5a对K562细胞的生物学形状的影响（牛长春，司维柯，李军等。稳定过表达Wnt5a对K562细胞生物学性状的影响.第三军医大学学报. 2009;31(22):2199‑2201.）。为了更全面的研究Wnt5a对K562的影响，在本发明中我们使用逆转录病毒的方法，用siRNA干扰K562细胞中Wnt5a基因的表达，使之处于稳定低表达水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因抑制细胞K562‑siWnt5a，所述基因抑制细胞K562‑siWnt5a有利于进一步的研究Wnt5a表达降低对白血病细胞的影响及机制。
本发明的技术方案是：
一种基因抑制细胞K562‑siWnt5a细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址是中国湖北武汉武汉大学，保藏日期是2012年7月12日，保藏编号为CCTCC NO:C201291，分类命名是K562‑siWnt5a细胞。
所述基因抑制细胞包含SEQ ID NO:1所示的基因片段Wnt5a。
所述基因抑制细胞进一步包含siRNA启动子，所述siRNA启动子可以来自以pSEB‑HUS为载体的逆转录病毒。
所述基因抑制细胞进一步包含siRNA启动子为H1、U6双启动子。
制备基因抑制细胞K562‑siWnt5a细胞的方法，包含下列步骤：
1）质粒pSEB‑HUS‑Wnt5a的构建；
2）质粒pSEB‑HUS‑Wnt5a和pCL‑Ampho去内毒素大量提取；
3）pSEB‑HUS‑Wnt5a和pCL‑Ampho与脂质体2000共转染HEK293细胞；
4）感染K562细胞并筛选阳性细胞克隆；
5）鉴定阳性细胞克隆，获得所述基因抑制细胞K562‑siWnt5a。
所述步骤1）可包含将基因片段Wint5a酶切后与pSEB‑HUS载体连接。
所述步骤5）鉴定阳性克隆的方法为Real‑time PCR检测K562 mRNA表达水平及Western Blotting检测Wnt5a蛋白表达水平。
本发明使用逆转录病毒作为载体，可以把外源性的siRNA启动子(H1,U6双启动子)和Wnt5a基因目标序列片段（ SEQ ID NO:1 :5‑GTGGATAACACCTCTGTTT‑3）整合到细胞的基因组中，从而能够稳定内源性表达Wnt5a而不丢失，便于对Wnt5a的研究。其不同于使用转染的方法把siRNA瞬间转入细胞。基因抑制细胞K562‑siWnt5a细胞的构建，对于进一步研发白血病诊断和预后判断指标和Wnt5a作为基因治疗靶点的研究具有重要意义，有利于进一步的研究表达过表达Wnt5a对于白血病的作用以及机制。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为Real‑time PCR鉴定K562 mRNA表达水平结果；
图2为Western Blotting 检测Wnt5a表达水平及JNK活性的变化；
图3 为pSEB‑HUS质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明基因抑制细胞K562‑siWnt5a及制备方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
本发明以质粒pSEB‑HUS‑Wnt5a为载体包装逆转录病毒，构建基因抑制细胞K562‑siWnt5a细胞，达到了使K562细胞中Wnt5a表达水平下降的效果，并且表明Wnt5a表达水平的下降可以导致JNK活性的降低。
本发明利用Western blot的方法检测K562‑Wnt5a细胞中Wnt5a蛋白表达水平的变化，证实基因抑制细胞K562‑siWnt5a中Wnt5a蛋白表达量增高。
本发明制备的基因抑制细胞已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2012年7月12日，保藏号为CCTCC C201291，细胞名称K562‑siWnt5a。
材料和来源
菌株和质粒：大肠杆菌克隆菌株DH5α购自宝生物工程有限公司，细胞株K562、HEK293购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）,中国总代理北京中原公司，pSEB‑HUS（图谱见图3）、pCL‑Ampho（见文献：Naviaux RK, Costanzi E, Haas M, Verma IM, et al. The pCL vector system: rapid production of helper‑free, high‑titer, recombinant retroviruses. J Virol. 1996 Aug; 70(8): 5701‑5.）。
双链DNA序列：由Invitrogen公司合成。
序列1(SEQ ID NO:2)：5‑AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT‑3；
序列2(SEQ ID NO:3)：5‑AAAACAGAGGTGTTATCCACTTTT‑3。序列1与序列2混合，95℃加热5min，后放室温。
其他主要试剂：T4 DNA连接酶、限制性内切酶Sfi I购自TAKARA公司；TIANgel Midi Purification Kit购自天根生化科技有限公司；脂质体2000（Lipofectamine 2000）、灭瘟素 (Blasticidin S HCL ) 购自Invitrogen 公司；
质粒普通纯化试剂盒与去内毒素纯化试剂盒购自Omega公司；
RPMI‑1640、DMEM培养基购自Gibco公司；
Real‑time PCR检测：引物序列由Invitrogen公司合成；RNA逆转录cDNA试剂盒，real‑time PCR试剂盒，Toyoba产品，日本。
实施例1 质粒pSEB‑HUS‑Wnt5a的构建
1. DNA小片段（siRNA 靶点序列）制备单链DNA序列由Invitrogen公司合成。
序列1(SEQ ID NO :2)：5‑AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT‑3；
序列2(SEQ ID NO :3)：5‑AAAACAGAGGTGTTATCCACTTTT‑3。
序列1与序列2混合，95℃加热5分钟后放室温。
2. Wnt5a重组质粒构建
① pSEB‑HUS载体酶切及回收
将pSEB‑HUS载体（图3） 用Sfi I酶切50℃消化3小时（酶切反应体系为：16μlDNA，2μl限制性内切酶Sfi I，2μl 10×Buffer），电泳。取酶切产物做1%琼脂糖凝胶电泳，证实得到大小为7000bp左右的特异性片段。使用TIANgel Midi Purification Kit回收：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl 平衡液BL，12,000 rpm离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；紫外灯下切下含特异DNA条带的胶条，放入EP管中称重，加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴10 分钟直至胶条完全融化，将1个吸附柱放入收集管中，将全部样品移入柱内，离心l分钟，倒出流过柱子的液体，将吸附柱放回同一收集管中，加700μl的漂洗液于吸附柱内，离心1分钟，倒出流过柱子的液体，将吸附柱放回同一收集管中，重复洗涤，最后离心2分钟，将吸附柱放入1个干净的1. 5 ml离心管，加50μl三蒸水于吸附柱上的膜中心，柱子放置 1 分钟后离心1分钟，收集洗脱的DNA。
② 连接
T4 DNA连接酶16℃过夜连接（连接反应体系为：2μl T4 DNA Ligase，2μl 10 × T4 DNA Ligase Buffer，质粒酶切回收产物6μl，DNA小片段10μl，取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5α细菌200μl，冰浴，吸取5μl连接产物加入管中，转化DH5α细菌，轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800μl室温的SOC培养液(成分：2% (W/V) 胰化(蛋白)胨，0.5% (W/V) 酵母提取物，0.05% (W/V) NaCl，2.5 mM KCl 10 mM MgCl 2，20 mM 葡萄糖)混匀，37℃摇床220 rpm振荡培养1小时，取50μl菌液涂于含氨苄西林(浓度为50μg/mL)的LB培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取单个菌落接种于含氨苄西林的LB培养基扩大培养。
③ 鉴定
将重组质粒pSEB‑Wnt5a送往上海生工公司测序。测序的结果显示，插入片段为5‑AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT‑3（SEQ ID NO:2），与合成序列一致。重组质粒命名为pSEB‑HUS‑Wnt5a。
实施例2 质粒pSEB‑HUS‑Wnt5a和pCL‑Ampho去内毒素大量提取
按照Omega质粒DNA提取试剂盒操作（E.Z.N.A. Fastfilter Endo‑free Plasmid maxi Kit）：从抗性平板上挑取质粒转化菌落，接种于4ml含氨苄西林的LB培养基中37℃恒温培养，8小时后接种到含有氨苄西林的100mlLB培养基中37℃恒温扩大培养12‑16小时。沉淀菌体，4500g，离心10 分钟，弃上清，尽量吸干，用10ml预冷的溶液I将上述细菌沉淀重悬，剧烈振荡，加入溶液II 10ml轻轻颠倒混匀5次，使其澄清，加入Buffer N3，温和上下颠倒混匀后倒入针筒过滤器中，收集裂解液上清，加入0.1倍体积ETR溶液，静置，4000g离心5分钟，将上清移置另一试管中，加入1/2体积的无水乙醇，颠倒5次放置5分钟，将HiBind大量结合柱套入50ml试管中，把过滤液倒入结合柱中，4000g离心5分钟，弃去收集管中的滤液，在结合柱中加入10ml HB Buffer，4000g离心5分钟，弃去收集管中的滤液，在结合柱中加入15ml DNA Wash Buffer，4000g离心5分钟，弃去收集管中的滤液，重复使用15ml DNA Wash Buffer洗涤柱子，待柱子干燥后加入2ml预热的ddH2O，室温放置2分钟，5000g离心5分钟，收集洗脱下的DNA溶液，‑20℃保存。
实施例3 pSEB‑HUS‑Wnt5a和pCL‑Ampho与脂质体2000共转染HEK293细胞
HEK293细胞使用含10%小牛血清的完全DMEM 培养液，置37 ℃、5% CO2 细胞培养箱中（50ml细胞培养瓶），饱和湿度下培养，当细胞处于对数生长期且细胞浓度为30‑40%时准备转染；准备转染的试剂，包括250μl DMEM (无血清)、5μl pCL‑Ampho(约0.5‑1.0μg DNA)、10μl pSEB‑HUS‑Wnt5a (约1.0‑2.0μg DNA)、15μl Lipofectamine 2000 ( Invitrogen)，混匀，放置15‑20分钟；仔细使用无血清的DMEM冲洗细胞三次，加入2.5ml无血清的DMEM，小心加入转染混合物；加入后3‑5小时后，把培养基吸出，加入4ml完整DMEM培养液；在36小时、60小时、84小时和108小时收集含有逆转录病毒的上清。‑80°C保存病毒。
实施例4 感染K562细胞并筛选阳性克隆
使用以上所得上清液置换培养处于对数生长期的K562细胞的培养液（添加海美溴铵最终浓度为12µg/ml），反复感染4次后，换为含有10%小牛血清的RPMI‑1640完全培养基，培养24小时后加入灭瘟素（最终浓度为40µg/ml），培养6天后更换为含有10%小牛血清的RPMI‑1640完全培养基，未感染逆转录病毒的细胞已全部死亡，得到阳性的抗性细胞克隆。阳性克隆细胞命名为K562‑siWnt5a细胞。
实施例5 提取K562细胞mRNA以及Real‑time鉴定基因Wnt5a的表达
空载体pSEB‑HUS包含无基因靶点的siRNA表达序列，经去内毒素大抽、与质粒pCL‑Ampho共转染HEK293细胞得到逆转录病毒并感染K562细胞得到抗灭瘟素的阳性细胞克隆（K562‑si对照组细胞）。
提取K562‑siWnt5a细胞、K562‑si对照组细胞mRNA：将细胞悬液收集至离心管中，1000～1500 r/min离心5 min，弃去上清；将获得的细胞置于EP管中，加入1 ml 的TriPure 试剂，反复吹打细胞或使用匀浆器将细胞裂解，室温下孵育5分钟；加入1.2 ml氯仿，小心盖好管盖，用力剧烈振荡15 s ，室温下孵育2～15 min， 4 ℃下 12000 g，离心15 min。将得到的无色水相转移到一个新的EP管中。加入0.5 ml异丙醇混匀，盖好管盖，颠倒数次将其充分混匀，室温下孵育5～10 min，4 ℃下12000 g，离心15 min，弃去上清，加入1 ml 75％乙醇，通过旋转作用洗涤乙醇中的RNA颗粒；DEPC处理过无RNA酶的无菌水重悬RNA样品。使用Toyoba逆转录试剂盒逆转录RNA为cDNA，反应体系(Toyoba, Japan)：无RNA酶的无菌纯水，10.5 μl；Oligo(DT)20 (10pmol/μl)，1.0 μl；总RNA，1.0 μl；5×RT buffer，4.0 μl；dNTP (10mmol/L)，2.0 μl；RANase 抑制剂，0.5 μl；ReverTra Ace (100u/μl)，1.0 μl。逆转录反应条件：30 ℃，10 min；48 ℃，120 min；99 ℃，5 min；4 ℃，5 min。
Real‑time PCR检测Wnt5a mRNA的表达。引物：Wnt5a：(SEQ ID NO :4) 5’‑CTTCGCCCAGGTTGTAATTGAAGC‑3’，(SEQ ID NO:5) 5’‑CTGCCA AAAACAGAGGTGTTATCC‑3’； GAPDH：(SEQ ID NO:6) 5’‑GAAGGTG AAGGTCGGAGTC‑3’， (SEQ ID NO:7) 5’‑GAAGATGGTGATGGGATTTC ‑3’。反应体系(Toyoba, Japan)：双蒸水，6.2μl；SYBR，12.5μl；plus‑solution, 2.5μl； 上游引物，1μl；下游引物，1μl； cDNA, 2μl。
PCR条件为：95℃预变性2分钟，然后95℃变性10秒、58℃退火、延伸45秒，共40个循环；每个循环结束时进行荧光检测。GAPDH作为内参。结果如图2所示：K562‑siWnt5a细胞中Wnt5a基因mRNA表达水平低于K562‑si对照组细胞（如图1）。
实施例6 Western Blotting 检测Wnt5a表达水平及JNK活性的变化
JNK是参与非经典Wnt信号通路一个分子，其活性形式为磷酸化水平。
离心收集培养瓶中细胞，0.1M PBS漂洗一次，取5×106细胞收集于1.5 ml 离心管中，加入100μl 总蛋白提取液和10 μl Cocktail (0.1M PBS 溶解)，混匀，冰浴30分钟，10000 rpm、4℃离心15分钟，收集上清，测定总蛋白浓度。配制10%Tricine SDS‑PAGE分离胶和浓缩胶。电泳80V 30分钟, 120V 1小时。电泳结束后，取下凝胶置于转印缓冲液中平衡50分钟，剪下凝胶大小的PVDF膜和厚滤纸，将PVDF膜在100%的甲醇中浸泡1分钟后与滤纸一起置于转印缓冲液中浸泡5分钟，12V恒压电转印1小时，取下PVDF膜，蒸馏水洗膜5分钟3次，TBST洗涤10分钟3次，室温下5%脱脂奶粉封闭膜1小时，TBST洗涤10分钟3次，加入用3%BSA/TBS稀释至1:1000的抗体（β‑actin, phosphor‑JNK, Wnt5a），4℃孵育过夜，TBST洗涤10分钟3次，加入3%BSA/TBS稀释至1: 1000的二抗，37℃孵育2 小时，TBST洗涤10分钟3次，将发光液A和B等体积混匀制成工作液，滴于膜上，作用5分钟，化学发光检测并采集图像（如图2）。
结果显示：K562细胞中Wnt5a mRNA表达水平下降，蛋白表达水平下降，达到了构建基因Wnt5a抑制的K562细胞的目的。并且，据报道文献（Nomachi, A., Nishita, M., Inaba, D., Enomoto, M., Hamasaki, M. and Minami, Y. (2008). Receptor tyrosine kinase Ror2 mediates Wnt5a‑induced polarized cell migration by activating c‑Jun N‑terminal kinase via actin‑binding protein filamin A. J Biol Chem 283, 27973‑81），Wnt5a可以激活JNK活性，结果显示，K562细胞中本身表达Wnt5a蛋白，并且通过与对照细胞相比，所得到细胞K562‑siWnt5a细胞株稳定低表达Wnt5a基因；磷酸化JNK表达较低，表明JNK活性受到抑制；β‑actin作为内参。表明本发明中，K562细胞中 Wnt5a表达被抑制后，可抑制Wnt5a下游信号。