鉴别多态性乙肝病毒和KRAS致癌基因突变及其临床应用.pdf

本发明提供了一种对慢性乙肝病毒(HBV)感染患者在接受核苷类似物/核酸类似物抗病毒治疗时的疗效监控和耐药危险评估的方法，这一方法在测定病毒DNA的量的同时可以鉴定耐药的突变病毒。本发明还提供了方法和试剂用来高度敏感鉴定/定量来自体液或肿瘤组织的KRas致癌基因的突变，以及这些方法用来评估患癌症危险性、早期癌症检测、治疗结果预测和治疗监测的用途。

权利要求书一种用于评估利用抗乙肝病毒(HBV)药物治疗受试者的疗法的方法，其中所述受试者具有或可能具有HBV感染，所述方法包括：
(a)提供来自所述受试者的核酸样品；
(b)确定在编码链或非编码链上逆转录酶基因开放阅读框204位的密码子的序列；和
(c)评估受试者是否应该接受利用所述HBV药物的治疗。
权利要求1的方法，其进一步包括鉴别具有HBV感染的受试者。
权利要求1或2的方法，其中，所述抗‑HBV药物是核苷类似物或核苷酸类似物。
权利要求3的方法，其中，所述核苷类似物是拉米夫定、替比夫定或恩替卡韦。
权利要求3的方法，其中，所述核苷酸类似物是阿德福韦或替诺福韦。
一种鉴别受试者中HBV逆转录酶rt 204突变的方法，所述方法包括：
(a)提供来自所述受试者的核酸样品；
(b)使所述核酸与第一引物和第二引物以及一个或者更多个可检测标记的探针接触以形成混合物，其中，所述第一引物与rt204密码子编码序列近端的核苷酸序列杂交，所述第二引物与rt204密码子编码序列远端的核苷酸序列杂交，所述可检测标记的探针与rt204密码子突变体的编码序列杂交；和
(c)扩增所述核酸。
权利要求6的方法，其进一步包括分析所扩增核酸的熔解曲线。
权利要求6或7的方法，其中，所述可检测标记的探针与所述rt204密码子突变体的编码序列杂交或与该编码序列的互补链杂交，并且所述可检测标记的探针与被所述第一引物识别的序列的一部分杂交。
权利要求6‑8任一项的方法，其中，每个可检测标记的探针包含不同的标记。
权利要求6‑9任一项的方法，其中，所述标记是6FAM、Cy5或HEX。
权利要求6‑10任一项的方法，其中，在所述一个或更多个可检测标记的探针中，编码rt204的核苷酸序列包括序列ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。
权利要求6或7和9‑11任一项的方法，其中，所述可检测标记的探针的长度小于约10个核苷酸。
一种鉴别受试者HBV逆转录酶rt204突变的方法，所述方法包括：
(a)提供来自所述受试者的核酸样品；
(b)使所述核酸与第一引物和第二引物接触以形成混合物，其中，所述第一引物与rt204密码子编码序列近端的核苷酸序列杂交，所述第二引物与rt204密码子编码序列远端的核苷酸序列杂交；
(c)扩增所述核酸；
(d)使扩增的核酸与第三引物和第四引物以及一个或者更多个可检测标记的探针接触以形成混合物，其中，所述第三引物与rt204密码子编码序列近端的序列杂交，所述第四引物与rt204密码子编码序列远端的核苷酸序列杂交，所述可检测标记的探针与rt204密码子突变体的编码序列杂交，其中，所述rt204密码子编码序列不包括被所述第三引物识别的序列；和
(e)进一步扩增所述核酸。
权利要求13的方法，其中，所述第二引物以及第四引物的序列是相同的。
权利要求13或14的方法，其进一步包括分析所扩增核酸的熔解曲线。
权利要求13‑15任一项的方法，所述可检测标记的探针与所述rt204密码子突变体的编码序列杂交，并且所述可检测标记的探针与被所述第一引物识别的序列的一部分杂交。
权利要求13‑16任一项的方法，其中，每个可检测标记的探针包含不同的标记。
权利要求13‑17任一项的方法，其中，所述标记是6FAM、Cy5或HEX。
权利要求13‑18任一项的方法，其中，在所述一个或更多个可检测标记的探针中，编码rt204的核苷酸序列包括序列ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。
权利要求13‑15或17‑20任一项的方法，其中，所述可检测标记的探针小于约10个核苷酸。
权利要求16的方法，其中从所述混合物中分离步骤(c)所扩增的核酸。
权利要求1‑21任一项的方法，其中，所述核酸样品来自生物流体或组织样本。
一种用于评估利用抗癌药物治疗受试者的疗法的方法，所述方法包括：
(a)获得来自所述受试者的核酸样品；
(b)确定KRAS原癌基因开放阅读框在12或13位密码子的序列；和
(c)评估所述受试者是否应该接受所述抗癌药物的治疗。
权利要求23的方法，其进一步包括鉴别具有突变的KRAS原癌基因的受试者，所述受试者具有或者可能具有癌症。
权利要求23或24的方法，其中，所述核酸来自生物流体样品或活检样本。
权利要求23‑25任一项的方法，其中，所述抗癌药物是西妥昔单抗或帕尼单抗。
权利要求23‑26任一项的方法，其中，所述癌症包括结直肠癌、胰腺癌、肺癌或卵巢癌。
一种鉴别受试者KRAS原癌基因中突变的方法，所述方法包括：
(a)提供来自受试者的核酸样品；
(b)使所述核酸与第一引物和第二引物以及野生型PCR阻断寡核苷酸接触以形成混合物，其中，所述第一引物与密码子12或13编码序列近端的核苷酸序列杂交，所述第二引物与密码子12或13编码序列远端的核苷酸序列杂交，所述野生型PCR阻断寡核苷酸与密码子12或13的编码序列杂交或与密码子12或13的编码序列的互补序列杂交；和
(c)扩增所述核酸。
权利要求28的方法，其中，所述野生型PCR阻断寡核苷酸包含一个或更多个锁定核酸(LNA)。
权利要求28或29的方法，其中，所述野生型PCR阻断寡核苷酸与密码子12或13的编码序列杂交，并且所述野生型PCR阻断寡核苷酸与被所述第一引物识别序列的一部分杂交。
权利要求28‑30任一项的方法，其中，所述混合物进一步包括一个或更多个可检测标记的核苷酸探针，其中，所述核苷酸与密码子12或13的编码序列杂交或与密码子12或13的编码序列的互补序列杂交。
一种临床管理具有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
(a)获得来自所述受试者的核酸样品；
(b)确定KRAS原癌基因开放阅读框在12或13位密码子的序列；和和
(c)评估所述癌症是否已经复发。

说明书鉴别多态性乙肝病毒和KRAS致癌基因突变及其临床应用
相关申请
本申请请求2010年5月16日提交的美国临时申请No.61/345149和2010年5月17日提交的美国临时申请No.61/345181的申请日的权益。出于要求美国临时申请No.61/345149或No.61/345181的权益的美国申请或专利的目的，先前提交的申请的内容通过参照将其全部内容并入本文。
技术领域
本申请涉及人乙肝病毒的突变，人类KRas致癌基因(oncogene)的突变以及基因突变的检测和定量的方法。本申请还涉及用于治疗监测、疾病早期检测和/或风险评估筛选以及用于预后的方法和检测试剂盒。
背景
乙肝病毒(HBV)的慢性感染是全球的主要健康负担之一。如果没有进行有效的干预，多达四分之一的慢性感染者在几十年的反复肝损伤后会发展为肝硬化，这些患者的一部分会发生肝癌(Liaw，Y.F.和C.M.Chu，乙肝病毒感染。Lancet，2009，373(9663)：第582‑592页；Liang，T.J.，乙肝：病毒和疾病，Hepatology，2009，49(5增刊)：第S13‑21页；通过参照并入本文)。大量证据特别体现在“高病毒载量和相关的肝脏疾病风险评估”(REVEAL)研究已经表明，活跃的病毒复制，表现为血清HBV DNA水平＞每毫升104个拷贝，在疾病进展为肝硬化和肝癌中起着至关重要的作用(Chen，C.J.等人，肝癌风险在血清乙肝病毒DNA水平梯度的分布。JAMA，2006年295(1)：第65‑73页；Iloeje，U.H.，等人，血液乙肝病毒载量的水平预测肝硬化风险。Gastroenterology，2006年130(3)：678‑86页；通过参照并入本文)。因此，目前的治疗目标是集中在抑制病毒复制(Liaw，Y.F.等人，拉米夫定治疗中YMDD变异后出现的急性发作和乙肝病毒清除。肝脏病杂志Hepatology，1999年30(2)：第567‑72页，通过参照并入本文)。因为在肝脏中复制的病毒颗粒被直接释放到血液中，所以检测疗效的途径是检测血液中的病毒DNA的量。
在美国，已批准五个口服的抗HBV药物作为慢性乙肝的单用或联合疗法。他们是属于核苷类似物的拉米夫定、替比夫定和恩替卡韦，以及作为核苷酸类似物的阿德福韦和替诺福韦。与干扰素治疗相比，这些核苷(酸)类似物(NAs)使用方便，能有效地抑制病毒复制，并有很好的耐受性。利用NAs抑制病毒复制伴随有丙氨酸转氨酶水平转向正常，肝纤维化/肝硬化的逆转所显示的组织学改善以及HCC发病率的降低(Liaw，Y.F.等人，拉米夫定治疗慢性乙肝和晚期肝癌。新英格兰医学杂志N Engl J Med，2004年，351(15)：第1521‑1531页，通过参照并入本文)。另一方面，由于病毒基因组被稳定地维持于被感染的肝细胞中并且病毒基因组不被NAs直接靶向，所以多数患者需要长期治疗(Moraleda，G.，等人，在不分裂的肝细胞培养中缺乏对土拨鼠肝炎病毒闭合环状DNA的抗病毒治疗效果。病毒学杂志J Virol，1997年71(12)：第9392‑9页，通过参照并入本文)。然而，长期治疗在不同程度上与耐药病毒突变体的选择/产生有关，如果不及时启动救援治疗，其会导致急性发作或肝功能失代偿(Liaw，Y.F.，等人。拉米夫定治疗中YMDD变异后出现的急性发作和乙肝病毒清除。肝脏病杂志Hepatology，1999年30(2)：第567‑72页；Lok，A.S.等人。患者中，拉米夫定治疗慢性乙肝的长期安全性。胃肠病学Gastroenterology，2003年125(6)：第1714‑1722页，通过参照并入本文)。因此，早期检测或预测耐药性在慢性乙肝的管理中非常重要，特别是在高风险的患者，如肝硬化患者中。
综上所述，有效的治疗监测需要(1)测量血液中的病毒DNA的量，和(2)早期检测潜在的耐药突变体病毒。在临床上，测定病毒DNA的量是通过使用TaqMan实时PCR方法进行的，但它不能同时检测突变，而突变目前是使用DNA测序或者线性探针杂交测定方法(LIPA)进行检测的，但DNA测序或者线性探针杂交测定方法(LIPA)都不能测量病毒DNA的量。
针对拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦的耐药性，都涉及在病毒逆转录酶基因的密码子204(rt204)的突变，其中，该密码子编码所谓的“YMDD基序”中的蛋氨酸(M)。基于实时PCR的检测方法可以同时测量WT病毒DNA的量和突变病毒DNA的量，以便以低成本早期检测耐药性。这样的测定法在过去的几年已有报道(Chieochansin，T.，等人。用PCR为基础的方法快速检测拉米夫定耐药的乙肝病毒基因突变。Tohoku J Exp Med，2006年。210(1)：第67‑78页；Yoshida，S.等人。用变体类型特异性的TaqMan小沟粘结剂探针从慢性乙肝患者定量检测乙肝病毒拉米夫定耐药突突变。Ann Clin Biochem，2008年45(1)：59‑64；Shih，Y.H.等人。用实时定量PCR和退火曲线分析在一个反应中定量乙肝病毒并检测YMDD突变。抗病毒疗法杂志Antivir Ther，2008，13(4)：第469‑80页，全部引作参考)。然而这些测定法都不能可靠地检测rt204突变。这是因为病毒的基因组在不同患者之间显示出高水平的多态性(变化性)；长度为15‑20个核苷酸的常规探针有可能遇到多态性，这导致定量和熔解曲线分析的错误结果。
KRas致癌基因编码KRas致癌蛋白，其在促进细胞生长中发挥重要作用。KRas蛋白活性被严格控制，在特定的时间“打开”和“关闭”。如果KRas蛋白一直被“打开”，则细胞生长就会失去控制，从而引起肿瘤。KRas基因密码子12和密码子13的突变可以导致KRas蛋白的组成型(constitutive)激活，即，KRas蛋白现在被锁定在“持续打开”的状态(Yamamoto，F.and M.Perucho，人c‑K‑ras致癌基因的激活，核酸研究杂志Nucleic Acids Res，1984年，12(23)：第8873‑85页，通过参照并入本文)。KRas基因密码子12/13突变已经被认为至少是人类癌症的致病因素之一，经常在胰腺癌、结直肠癌(CRC)和其他一些癌症中被检测到(Bos，JL，ras致癌癌基因与人类癌症：综述。癌症研究Cancer Res，1989年。49(17)：第4682‑9页，通过参照并入本文)。
肿瘤细胞死亡时，肿瘤细胞内的突变的KRas DNA可以被释放到血液循环中。因此，从血液循环检测到KRas突变有助于癌症的早期检测。监测癌症外科切除手术前后的KRas突变基因的量也将有助于发现是否有隐藏的肿瘤或肿瘤复发(Diehl，F.，等人，血液循环中的突变DNA评估肿瘤的动态。Nat Med，2008，14(9)：第985‑90页，列为参考文献)。为此必须以很高灵敏度定量KRas基因突变。
结直肠癌(CRC)是美国第二常见的癌症，也是癌症死亡的第二大原因。约40‑50％的CRC组织可以检测到KRas密码子12和13的突变，这些突变是肿瘤恶化和对某些化疗无响应的原因。目前常规地检测肿瘤组织中的KRas突变情况用来指导选择合适的化疗。这些方法包括DNA测序、实时PCR和高分辨率熔解分析。这些现有的方法需要突变体的量超过“总”KRas基因的5％。此外，这些方法是定性的(阳性或阴性)，而不是定量的。因此这些方法不能用于早期检测或手术后的监测。此外，目前使用的实时PCR检测KRas密码子12和13突变使用7个探针在7个独立的反应中检测7个最常见的突变。较不常见的基因突变可能是检测不到的。
聚合酶链反应(PCR)仍然是最常用的突变检测方法，因为它可以扩增和检测微量的靶DNA。在最佳条件下，在没有未突变的野生型(WT)DNA存在的情况下，可以检测到最少10个拷贝的突变体。然而，在不使用额外技术前提下，当WT DNA的量超过突变DNA 20倍时，将无法检测到突变DNA。在血液中，由于正常细胞(如白血细胞)在不断的死亡和再生，对于任何特定的基因，WTDNA的量可以超过突变DNA的量100倍以上。因此，从血液(或其他体液如尿液)检测肿瘤衍生的突变DNA在技术上是很具有挑战性的。
在本发明中，开发出一种能抑制WT KRas DNA扩增的寡核苷酸，由此提高突变体的相对比例和提高突变检测的灵敏度。该WT抑制性寡核苷酸，或WT PCR阻断剂，含有修饰的核苷酸如锁定核酸(LNA)。LNA是一种核苷酸类似物，对互补的碱基有高特异性和亲和性(Singh，S.K.，等人，LNA(锁定核酸)：合成和高亲和力的核酸识别。Chem Commun，1998年，1998(4)：第455‑456页；Hertoghs，K.M.，J.H.Ellis和I.R.Catchpole，利用锁定核酸寡核苷酸增加质粒DNA新功能。核酸研究杂志Nucleic Acids Res，2003，31(20)：第5817‑30页，通过参照并入本文)。含LNA的寡核苷酸已经被用于通过抑制WT非突变DNA的扩增以提高突变的检测灵敏度性(Nagai，Y.，等人，使用含肽核酸(PNA)PCR钳的快速和敏感的检测系统发现非小细胞肺癌细胞的表皮生长因子受体的遗传异质性。癌症研究Cancer Res，2005年。65(16)：第7276‑82页；Laughlin，T.S.，等人，急性髓细胞性白血病的核磷蛋白基因突变的快速检测方法。J Mol Diagn，2008年。10(4)：第338‑45页，通过参照并入本文)。然而，这样的报告是罕见的，因为通常是难以开发含LNA的寡核苷酸来有效地抑制野生型DNA的扩增，同时又不影响突变DNA的扩增。
发明内容
由于不同患者之间病毒基因组显示出高水平的多态性(变化)，常规的长度15‑20个核苷酸的探针很可能会遇到多态性，导致定量和熔解曲线分析二者的错误结果。因此有必要设计尽可能短的探针。此外，rt204密码至少有5个变种，其包括ATG(WT)、ATT、ATC、ATA和GTG。上述提到的检验不能被设计用于鉴别ATA和ATC变种。在本发明中，重新设计测试以采用更短的探针。从而首次使用基于实时PCR的测试方法能够可靠地检测到HBV密码子rt204的所有5个变种，包括ATA、ATC。其结果是，这种改进的实时PCR测试现在适合在临床中使用。
本发明提出了一种新的乙肝病毒DNA定量检测和耐药性突变病毒检测的单管测试方法，用于接受核苷/核苷类似物长期治疗的患者。该测试是采用引物‑探针部分重叠方案开发的，使得探针的有效长度是只有几个核苷酸，从而使检测不容易发生由HBV基因组多态性引起的错误。采用该测试实现了HBV突变的可靠检测以及对治疗进行成本有效的监测。本发明人已经发现，通过保持探针尽可能的短，多态性检测被最小化，同时允许有效地检测编码rt204密码子其许多变体的突变，例如ATG(WT)、ATT、ATC、ATA和GTG。
此外，本发明还提出两个高度敏感的检测平台用于检测KRas密码子12/13的突变。其一是一种基于PCR的定性的突变检测系统，例如通过DNA测序，另一种是定量的突变检测系统，例如两步实时PCR。这两种方法都需要使用野生型的PCR阻断剂，可以有效地抑制WT KRas DNA的扩增但不影响KRas突变体的扩增。
本发明提出了一种WT PCR阻断剂，其能够在野生型KRas DNA 10,000倍过量的情况下对KRas基因的突变体进行定量检测，本发明还提出设计适用于其他基因突变检测的这类WT PCR阻断剂的通用设计原则。本发明还包括一种合理设计的PCR探针(KRas探针1号)，该探针实现可靠地鉴别密码子12/13的许多变种。其他探针正在开发之中，这些探针可与探针1号一起用于一个反应中，或者各自用于单独的反应之中。
附图说明
图1：短探针设计。
图2：引物‑探针部分重叠简化熔解模式。
图3：在单个测试中定量DNA并鉴别突变。
图4：用单个实验监测接受拉米夫定治疗的患者。
图5：使用WT PCR阻断剂和差异变性抑制WT DNA的扩增。
图6：KRas密码子12/13实时PCR以及在临床样品中的应用。
具体实施方式
参照图1，这里示出的探针覆盖发生目标突变的DNA序列区域。该探针可以是任何形式的实时PCR探针，如SimpleProbe，分子信标或TaqMan探针。在感应探针(sensor probe)与引物A重叠时，也可以使用杂交探针(或FRET探针)，但需要确保锚定探针不会受到潜在的核苷酸变异的影响。该探针与目标野生型(WT)或其互补链具有超过70％的序列同一性。在探针中设计错配或复数个错配，以在突变体和WT之间以及在不同的突变体之间形成更佳的区分。在某些实施例中，如果能够实现在WT和突变体之间以及在不同的突变体之间足够的区分，则探针序列可以与野生型序列相同。
仍参照图1，更详细地描述：PCR扩增引物之一与探针部分重叠，并且和探针具有相同的方向。为便于描述，此引物被指定为引物A(“第一引物”)，另一个扩增引物被指定为引物B(“第二引物”)。引物A不覆盖突变位点，因而在扩增过程中以及在扩增之后(通过熔解曲线分析)，可以由探针检测到突变。引物A可以长达50个核苷酸并可以含有简并核苷酸。然而，这样的简并核苷酸不能与探针重叠。
参照图1B，更详细地描述：可以采用两步PCR，其中，在第一步PCR中在不存在探针的情况下，使用与探针部分重叠的引物A序列。在第二步实时PCR反应中，在存在探针的情况下，使用于引物A重叠但不与探针重叠的引物C(“第三引物”)，以便获得更佳的PCR信号。在一些实施例中，引物B也可以是“第四引物”。两步PCR允许采用TaqMan探针进行定量。
现在参照图1C，实时PCR中可以使用长度5‑10个核苷酸的短探针，探针和引物重叠或不重叠。然而，因为该探针太短不能产生扩增信号，所以扩增必须依赖于DNA结合染料，如SYBR Green。因此，PCR扩增采用对称浓度或不对称浓度的引物C和引物B。SYBR Green信号用于记录扩增。探针(可以是任何形式的探针)用于熔解曲线分析。但是，探针的荧光通道必须不同于SYBR Green的信号。正因为如此，SimpleProbe或用6‑FAM或绿荧光素标记的探针不能与SYBR Green合用。
参照图2，PCR扩增使用引物A(与引物B)将消除任何对探针的潜在的多态影响。因此，探针的有效长度，就是响应突变/错配的探针部分，也就是不与引物A重叠的部分。与引物A重叠的探针部分是用来增加探针的熔解温度，以便将具有足够高熔点/退火温度的探针用于定量。因此，短探针涉及(最有效地通过引物‑探针部分重叠)，简化了熔解曲线模式(pattern)，使得测试结果更可读和更可靠。图2B显示序列模式被简化的一个例子。从GenBank通过BLAST检索到8983个HBV序列。与有效探针长度相对应的序列模式根据它们在GenBank的频率被排列出来。前5个模式是WT(204位密码子ATG)、GTG、ATT、ATC和ATA，他们的总和已超过所有HBV序列的99％。因此很明显，缩短的有效的探针长度(5核苷酸长)使得有可能正确地鉴别GenBank中99％以上的HBV序列。
野生型HBV编码聚合酶(逆转录酶)的序列具有高度多态性。示例性的序列包括GenBank序列条目：AB55402、JF439940、GU456642和HM358328。下面列出了示例性HBV引物序列：

大写字母表示LNA核苷酸。
可以采用对称浓度或不对称浓度的引物A和引物B进行PCR。在不对称PCR中，引物A的浓度是引物B浓度的2‑100分之一，但典型的是5‑10分之一。引物A的浓度是至少0.01微摩尔，但典型地使用0.1微摩尔。过量引物B的使用允许生产过量可以被探针结合的单链DNA，从而增强扩增曲线(图3)中的探针信号。这也允许扩增后熔解曲线分析(图3)。
参照图4，使用本发明的单一PCR检测对两例接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行回顾性“监控”。如图4所示，这两个病人最初表达野生型密码子rt204(“ATG”)，但随着治疗时间的推移，rt204突变成耐药型，例如，(“ATT”)和(“GTG”)。使用单个测试可以有效地确定病毒效价和变异的病毒。
现在参照图5，这里示出的WT PCR阻断剂跨越了这样一个DNA序列区域，在该区域发生目的突变。在突变位点，WT PCR阻断剂与WT KRas序列或WT KRas序列的互补链具有完美的匹配，并且由于突变的存在与突变DNA序列具有一个或复数个错配。PCR阻断剂具有多达50个核苷酸，并且包含至少一个锁定核苷酸(LNA)。WT PCR阻断剂在3′‑末端被磷酸化，从而它不会作为引物发挥功能。
示例性KRas的cDNA序列可以在GenBank登记为NM_004985中找到。KRas基因组DNA序列可以在GenBank登记为NT_009714.17中找到。示例性引物序列，包括：

大写字母表示LNA核苷酸。
“‑PH”代表3′‑末端的磷酸化。
仍参照本发明的图5进一步细节描述，PCR扩增引物中的一个与WT PCR阻断剂部分重叠，并且是与PCR阻断剂在相同的方向上。为便于描述，该引物被指定为引物A。另一个扩增用引物被指定为引物B。本发明中的引物A不包括突变位点，因而允许突变被扩增并通过例如DNA测序或实时PCR的下游应用被检测出来。引物A可以具有长达50个核苷酸，其与靶序列具有80％以上的序列同一性。引物A和WT PCR阻断剂之间至少重叠一个核苷酸。引物A和引物B可以含有或可以不含有LNA核苷酸。在热循环中，由于LNA核苷酸的存在，PCR阻断剂能够紧密结合到野生型序列，但是由于错配(复数个错配)，因而与突变序列结合较弱。这导致野生型KRas DNA的PCR扩增的抑制，但允许突变KRas DNA的扩增。
仍参照本发明的图5进一步详细描述，PCR可以被编程为在95℃下变性DNA模板(通常是基因组DNA)少于10个循环，随后在较低的变性温度继续扩增，从而仅仅变性从引物A和引物B获得的扩增产物。这显著减少了WT反义链的合成(WT反义链的合成不会被WT PCR阻断剂抑制)，从而引起野生型DNA扩增的更强抑制。
检测KRas突变的超灵敏野生型抑制性直接DNA测序方法包括野生型抑制性PCR(Wi‑PCR)和随后的DNA测序。Wi‑PCR通过将WT PCR阻断剂添加到另外的常规PCR反应中被执行，其中常规PCR反应包含扩增引物(引物A和引物B)、DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTP和DNA模板。引物A和引物B的浓度可以是在0.1至1μM的范围内。Wi‑寡核苷酸的浓度可在0.2至50μM的范围内。Wi‑PCR进行25‑55个循环，直到产生足够量的DNA。将PCR产物纯化以除去游离的引物，然后用引物B进行DNA测序。为了和常规的直接DNA测序相区别，我们将它命名为Wi‑直接DNA测序用于表示野生型抑制直接DNA测序。
除了直接测序以外，Wi‑PCR后可以跟随任何其他的突变检测方法。这些方法可以是定性的或定量的，并且起初的Wi‑PCR可以显着增加它们的突变检测灵敏度。这些方法可以包括但并不限于固相杂交(例如，Southern印迹法和斑点杂交)、液相杂交(如熔解曲线分析)、反向杂交(标记的PCR产物与固定化的寡核苷酸杂交)、质谱和实时PCR。
超灵敏定量KRas突变检测系统包括Wi‑PCR和随后的使用荧光标记的寡核苷酸探针的实时PCR。该实时PCR可以是但不仅限于使用水解探针的TaqMan PCR、FRET PCR、SimpleProbe PCR、蝎型探针PCR(Scorpion probe PCR)或分子信标实时PCR。Wi‑PCR进行10‑20个循环，随后是30‑40个循环的实时PCR。这被称为Wi‑定量PCR或Wi‑qPCR。
KRas密码子12/13突变的“TaqMan”水解探针被开发用于在非水解非对称实时PCR。探针被设计成使得它可以在熔解曲线分析中区分11种已知的变体(包括野生型KRas序列)。
本发明提供一种用于评估利用抗乙肝病毒(HBV)药物治疗受试者的疗法的方法，其中所述受试者具有或可能具有HBV感染，该方法包括：(a)提供来自所述受试者的核酸样品；(b)确定在编码链或非编码链上，逆转录酶基因开放阅读框204位的密码子的序列；和(c)评估受试者是否应该接受利用所述HBV药物的治疗。在一些实施例中，所述方法进一步包括鉴别具有HBV感染的受试者。抗HBV药物可以是核苷类似物或核苷酸类似物。核苷类似物可以是拉米夫定、替比夫定或恩替卡韦。核苷酸类似物可以是阿德福韦或替诺福韦。本发明还提供了一种鉴别受试者中HBV逆转录酶rt204突变的方法：(a)提供来自所述受试者的核酸样品；(b)使所述核酸与第一引物和第二引物以及一个或者更多个可检测标记的探针接触以形成混合物，其中，第一引物与rt204密码子编码序列近端的核苷酸序列杂交，所述第二引物与rt204密码子编码序列远端的核苷酸序列杂交，所述可检测标记的探针与rt204密码子突变体的编码序列杂交；和(c)扩增所述核酸。该方法可以进一步包括分析所扩增核酸的熔解曲线。在一些实施例中，可检测标记的探针与rt204密码子突变体的编码序列杂交或与该编码序列的互补链杂交，并且该可检测标记的探针与被第一引物识别的序列的一部分杂交。每个可检测标记的探针包含不同的标记。该标记可以是6FAM、Cy5或HEX。在一个或更多个可检测标记的探针中，编码rt204的核苷酸序列包括序列ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。在一些实施例中，可检测标记的探针的长度小于约10个核苷酸。本发明还提供了一种鉴别受试者HBV逆转录酶rt204突变的方法，该方法包括：(a)提供来自受试者核酸样品；(b)使所述核酸与第一引物和第二引物接触以形成混合物，其中，第一引物与rt204密码子编码序列近端的核苷酸序列杂交，第二引物与rt204密码子编码序列远端的核苷酸序列杂交；(c)扩增该核酸；(d)使扩增的核酸与第三引物和第四引物以及一个或者更多个可检测标记的探针接触，其中，第三引物与rt204密码子编码序列近端的序列杂交，第四引物与rt204密码子编码序列远端的核苷酸序列杂交，可检测标记的探针与rt204密码子突变体的编码序列杂交，其中，rt204密码子编码序列不包括被所述第三引物识别的序列；和(e)进一步扩增该核酸。第二引物以及第四引物的序列可以是相同。该方法可以进一步包括分析所扩增核酸的熔解曲线。在一些实施例中，可检测标记的探针与所述rt204密码子突变体的编码序列杂交，并且所述可检测标记的探针与被所述第一引物识别的序列的一部分杂交。每个可检测标记的探针可以包括不同的标记。该标记可以是6FAM、Cy5或HEX。该一个或更多个可检测标记的探针中，编码rt204核苷酸序列包括ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。在一些实施例中，可检测标记的探针是小于约10个核苷酸。在一些实施例中，从混合物中分离步骤(c)所扩增的核酸。核酸样品可以来自生物流体或组织样本。
还提供了一种用于评估利用抗癌药物治疗受试者的疗法的方法，该方法包括：(a)获得来自受试者的核酸样品；(b)确定KRAS原癌基因开放阅读框在12或13位密码子的序列；和(c)评估受试者是否可以接受该抗癌药物的治疗。该方法还可以包括鉴别具有突变的KRAS原癌基因的受试者，所述受试者具有或者可能具有癌症。该核酸可以来自生物流体样品或活检样本。该抗肿瘤药物可以是西妥昔单抗或帕尼单抗。癌症可以是任何在12或13位包含KRAS突变的癌症，例如，结直肠癌、胰腺癌、肺癌或卵巢癌。还提供了一种鉴别受试者KRAS原癌基因中突变的方法，该方法包括：(a)提供来自受试者的核酸样品；(b)使核酸与第一引物和第二引物以及野生型PCR阻断寡核苷酸接触以形成混合物，其中，第一引物与密码子12或13编码序列近端的核苷酸序列杂交，第二引物与密码子12或13编码序列远端的核苷酸序列杂交；该野生型PCR阻断寡核苷酸与密码子12或13的编码序列杂交或与密码子12或13的编码序列的互补序列杂交；以及(c)扩增该核酸。该野生型PCR阻断寡核苷酸可以包含一个或更多个锁定核酸(LNA)。该野生型PCR阻断寡核苷酸与密码子12或13的编码序列杂交，并且所述野生型PCR阻断寡核苷酸与被第一引物识别序列的一部分杂交。该混合物可以进一步包括一个或更多个可检测标记的核苷酸探针，其中，所述核苷酸与密码子12或13的编码序列杂交或与密码子12或13的编码序列的互补序列杂交。还提供了一种临床管理具有癌症的受试者的方法，该方法包括：(a)获得来自受试者的核酸样品；(b)确定KRAS原癌基因开放阅读框在12或13位密码子的序列；及(c)评估该癌症是否已经复发。
在一些实施例中，WT PCR阻断剂与引物A部分重叠，该引物与WT PCR阻断剂具有相同的方向。WT PCR阻断剂可以与WT DNA[Tm(阻断剂/WT)]具有高于70℃但低于90℃的熔解温度(Tm)。在一些实施例中，WT PCR阻断剂的Tm(阻断剂/WT)比它与突变DNA的熔解温度[Tm(阻断剂/突变体)]高至少4℃。在一些实施例中，引物A的熔解温度比Tm(阻断剂/WT)低，但等于或略微高于或低于Tm(阻断剂/突变体)。在一些实施例中，引物A和引物B的扩增产物在PCR反应的第一步中被选择性地变性，以增强抑制野生型DNA扩增。
示例
示例1：HBV rt204密码子的定量PCR。探针与扩增引物A和扩增引物B分别为5′‑[6FAM]‑tggctttcagttaTGTTGa‑[BHQ 1]，5′‑ttcccccactgtttggctttcagttat‑3′和5′‑atgacgtcacagacttggcccccaatac‑3′。大写字母表示锁定核酸。使用基因分型母液(Roche公司)、0.1μM引物A、0.5μM引物B、0.1μM的探针以及模板DNA进行PCR。加热程序是95℃10分钟以激活聚合酶，随后进行40个循环的95℃10秒、55℃10秒并记录荧光信号(fluorescene requisition)和72℃1秒。扩增后即刻，在从40℃线性温度升高至75℃的过程中，进行熔解曲线分析。以定量为目的，包括系列稀释携带rt204(ATG)的质粒，以便产生浓度标准曲线。为了区分样品中是何种rt204变体，实验还包括携带不同变体的质粒以便产生标准的熔解曲线。
示例2：HBV rt204密码子的定量PCR。扩增引物A和扩增引物B分别为5′‑ttcccccactgtttggctttcagttat‑3′和5′‑atgacgtcacagacttggcccccaatac‑3′。单个反应中使用三个探针以增强区别五个变种的能力，它们是探针1号(5′‑[6FAM]‑tggctttcagttaTGTTGa‑[BHQ1])，探针2号(Cy5‑tcagttataTAGa‑IowaBlack)和探针3号(HEX‑ttggctttcagttatatcga‑BBQ)。大写字母表示锁定核酸。使用基因分型母液(Roche公司)、0.1μM引物A、0.5μM引物B、每个探针0.1μM和模板DNA进行PCR。加热程序是95℃10分钟以激活聚合酶，随后进行40个循环的95℃10秒、50℃10秒并记录荧光信号和72C℃1秒。扩增后即刻，在从20℃线性温度升高至75℃的过程中，进行熔解曲线分析。为了患者样品的定量，用从正常人血清中纯化的DNA系列稀释携带rt204(ATG)的质粒，并用于PCR以产生浓度标准曲线。为了区分样品中是何种rt204变体，实验包括携带不同变体的质粒以产生熔解标准。
示例3：KRas基因密码子12或13位突变的WT‑抑制性PCR检测。WT PCR阻断剂，扩增引物A和扩增引物B的序列分别是5′‑gcctacgCcaCCagctc‑PH，5′‑gtcaaggcactcttgcctacg‑3′和5′‑ggacgtccgtcacattttcattatttttattataaggc‑3′。大写字母表示LNA核苷酸。“‑PH”代表3′‑末端磷酸化。使用在适当的PCR缓冲液中的热启动Taq DNA聚合酶，200μM的dNTP，每个扩增引物0.5μM，2μM的WT PCR阻断剂，和模板DNA进行Wi‑PCR。加热程序是95℃2‑10分钟以激活聚合酶，然后是20个循环的(用于下游qPCR)或45个循环(用于DNA测序)的95℃10秒、76℃20秒、60℃下10秒和65℃10秒。加热程序也可以是2个循环的95℃10秒、60℃10秒和68℃10秒，然后是18个循环的84℃10秒、60℃10秒和68℃10秒。
示例4：KRas基因密码子12或13位突变的WT‑抑制性定量PCR检测。用水或Tris/EDTA缓冲液对上述20个循环的Wi‑PCR反应进行1比32倍稀释。取1微升稀释的PCR加入PCR反应，该PCR反应包含基因型母液(Roche)、5mM的氯化镁、0.1μM的正向引物(5′‑tcaaggcactcttgcctacg‑3′)、0.5μM反向引物(5′‑ggacgtccgtcacattttcattatttttattataaggc‑3)，和0.1μM KRas探针1号(5′‑[6FAM]tgcctacgtcattagctccaac[BHQ1])。扩增进行30个循环的84℃10秒、57℃10秒、68℃10秒和50℃15秒，使用荧光检测。扩增后即刻，在25‑75℃的温度范围内，进行熔解曲线分析。为了可以定量突变体的量，系列稀释的携带突变(12D变体)的质粒被包括在Wi‑PCR中，并在实时PCR中进一步扩增。为了进行熔解曲线分析，携带不同KRas序列的质粒出于比较目的被包括在实验中。在某些情况下，当野生型DNA不能被完全抑制时，熔解曲线将显示两个峰混合，一个代表突变体，另一个代表野生型DNA。突变DNA的量可以基于两峰的相对高度来估计。应当指出，额外的探针可以被加入到同一个反应或在分开的反应中以提高不同KRas密码子12或13位变体之间的区分，特别是在12D和12S之间以及12C和12V之间。
示例5：通过SYBR Green实时PCR的KRas 12或13突变的定量。如在示例3中所描述的，进行PCR反应，添加SYBR Green染料，50个循环。为了能够定量突变体的量，系列稀释携带突变(12D变体)的质粒被包括在PCR中。然后选择阳性扩增的样品，用H2O或Tris/EDTA缓冲液1∶32稀释，进行实例4中描述的WT抑制定量PCR以进行熔解曲线分析。携带不同的KRas序列的质粒被包括作为熔解曲线的标准。
本发明的优点包括但不限于，增加功能而无需额外成本(除病毒负荷测定外，半定量HBV药物抗性突变体)，并因为缩短探针的有效长度而增加准确性。在广泛的实施例中，本发明可以应用到其它HBV药物抗性突变体和其他一般的基因突变的检测。在不对称PCR中，使用无5′‑3′外切功能的Taq聚合酶和TaqMan探针允许低成本的多重熔解曲线分析。在本发明的优点还包括但不限于KRas突变的检测和定量具有异常高的灵敏度。在广泛的实施例中，本发明可以应用到其他的基因突变的超高灵敏度检测。
尽管前面的说明书能够使得本领域技术人员可以制造和利用目前被认为的本发明最佳实施方式，但本领域技术人员能够理解和接受存在本文所提出具体实施例、方法和示例的变型、组合以及等同。因此，本发明不应该局限于上面所述的实施例、方法和示例，而是要求保护在本发明范围和主旨内的所有实施例和方法。