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1、(10)申请公布号 CN 102978115 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102978115 A *CN102978115A* (21)申请号 201210356231.7 (22)申请日 2012.09.21 CGMCC No. 6140 2012.05.14 C12N 1/12(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12P 23/00(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (71)申请人 中国科学院青岛生物能源。
2、与过程研 究所 地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路 189 号 申请人 波音 （中国） 投资有限公司 (72)发明人 马玉彬 张东远 周功克 王芝瑶 周翠燕 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称 一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方 法 (57) 摘要 本发明涉及微生物工程领域， 具体的说是一 种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方法。 微拟球藻突变株分类学命名 ： Nannochloropsis sp.OZ-1HP-1， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏日期 ： 2012。
3、 年 5月14日， 保藏号为 ： CGMCC No.6140。 本发明突变 藻株生物量积累在培养末期较野生株提高 19， 叶绿素 a 含量在培养第四天较野生株提高 45， 类胡罗卜素含量较野生株提高 47。该突变株 油脂积累末期生物量较野生株提高 33， 油脂产 率提高 28， 突变株脂肪酸组成与野生型藻株相 比未发生显著性变化， 突变株油脂成分分析显示 TAG 含量比野生型提高 14。该突变株生长速度 快、 油脂产率高、 TAG 含量高， 可以为微拟球藻生 物燃料产业化生产提供优质藻种。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 5 页 (19)。
4、中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种微拟球藻突变株， 其特征在于 ： 微拟球藻突变株分类学命名 ： Nannochloropsis sp.OZ-1 HP-1， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏日 期 ： 2012 年 5 月 14 日， 保藏号为 ： CGMCC No.6140。 2. 按权利要求 1 所述微拟球藻突变株的诱变选育方法， 其特征在于 ： 以野生型微拟球 藻 （Nannochloropsis sp.OZ-1） 作为出发藻株经光照培养至对数生长期， 再。
5、利用重离子加 速器对处于对数生长期的藻株进行诱变， 获得微拟球藻Nannochloropsis sp.OZ-1 HP-1突 变株。 3. 按权利要求 1 所述微拟球藻突变株诱变选育方法， 其特征在于 ： 利用重离子加速器 对生长至对数生长期的微拟球藻进行不同剂量的碳重离子的辐射， 将致死率在 50以上的 辐射剂量下的藻株分别进行活化， 再逐级传代培养， 选取在逐级传代培养中 Fv/Fm 和 OD750 值稳定提高的生长迅速突变藻株， 而后转接于鼓泡柱式光反应器中传代培养筛选得到微拟 球藻突变株 Nannochloropsis sp.OZ-1 HP-1。 4.按权利要求1所述的微拟球藻的应用， 。
6、其特征在于 ： 所述微拟球藻Nannochloropsis sp.OZ-1 HP-1 用于油脂、 生物柴油、 脂肪酸、 叶绿素 a、 类胡萝卜素和或生物质生产。 权 利 要 求 书 CN 102978115 A 2 1/6 页 3 一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物工程领域， 具体的说是一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选 育方法。 背景技术 0002 能源是人类社会赖以生存和发展的物质基础， 高效、 清洁的能源利用是实现经济 可持续发展的重要保证。随着常规不可再生化石资源的不断减少、 日益显著的全球气候变 暖， 使得能源、 资源与环境成为人类社会可持。
7、续发展所面临的重要问题。生物质能源， 包括 生物柴油、 生物乙醇等， 由于其具有可再生性和环境友好等特点， 被认为是解决能源危机的 最有潜力的途径之一。 0003 微藻由于具有生物质积累速度快、 环境适应性强、 含油量高、 具有综合利用价值等 特性， 被认为是最有潜力的生物质能源原料。 以微藻生产生物柴油为例， 专家做了一个保守 的估计， 与每公顷高产油植物 （如油棕榈、 麻疯树） 每年可以产生 1800-6000 升油脂相比， 每 公顷微藻每年可以产生 5 万 -13 万升油脂。微藻用于生产生物燃料的优势明显， 但目前进 行产业化生产还面临着巨大挑战， 微藻生物燃料生产成本依然较高。降低微藻。
8、生物燃料生 产成本主要集中在两个方面 ： 一是降低生产工艺成本 ； 二是降低生产原料成本。而微藻生 物燃料生产成本中的75是原料成本。 从降低生物原料成本入手成为降低微藻生物燃料生 产成本的重中之重。 提高微藻的油脂产率， 培育生物 量积累速率快、 油脂产率高的藻种， 提 供优质生物燃料原料， 是降低微藻生物燃料生产成本的有效手段。 0004 微拟球藻 （Nannochloropsis sp.OZ-1） 是直径为 2-3m 的真核单细胞绿色微藻， 归属于褐藻门， 大眼藻纲， 单珠藻科， 其细胞内油脂含量可达干重的 68， 是公认的最有希 望用于工业化的高产油海水藻之一。 近年来已有多例以微拟球。
9、藻为材料在实验室内进行生 物柴油制备的报道， 该藻的产业化前景非常广阔。 0005 近年来， 重离子束特别是低能碳离子束作为一种新兴的辐射源， 由于其对微生物 与植物种子有很强的致突变作用， 已经在微生物及植物诱变育种研究中取得了巨大的经济 与社会效益， 为育种提供了新的途径。与传统的诱变源相比， 重离子束具有以下重要特点 ： (1) 传能线密度大， 能在生物介质中产生高密度的电离、 激发、 能量和质量沉积， 造成生物介 质的损伤， 易于突变体的形成 ； (2) 能量沉积过程中， 在其射程末端存在一个尖锐的能量损 失峰， 使得生物样品的局部受损， 这种局部受损的位置可随离子能量的高低而变化， 。
10、是选择 可控的， 有利于宏观定点、 定位诱变， 实现定向育种 ； (3) 损伤后修复效应小， 可产生大量的 突变且突变体稳定 ； (4) 相对生物学效应高， 因此突变体的产生效率高且突变谱广。而目前 为止， 这种高效的诱变方式尚未应用于产油微藻的育种。 0006 微拟球藻油脂含量高， 是非常有潜力的生物柴油制备原料， 但微藻大规模养殖成 本高， 生物量累积比较缓慢。 采用生物技术手段诱变藻株， 针对生长速率筛选微拟球藻突变 株具有重要价值。而目前用于 藻类育种的诱变技术筛选时间较短， 通常只经过一次筛选， 得到的突变株遗传稳定性较差， 容易出现回复突变。 说 明 书 CN 102978115 。
11、A 3 2/6 页 4 发明内容 0007 本发明目的在于提供一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方法。 0008 为实现上述目的本发明采用技术方案为 ： 一种微拟球藻突变株， 其特征在于 ： 微 拟球藻分类学命名 ： Nannochloropsis sp.OZ-1 HP-1， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 ； 保藏日 期 ： 2012 年 5 月 14 日， 保藏号为 ： CGMCC No.6140。 0009 0010 所 述 微 拟 球 藻 的 诱 变 选 育 方 法，其 特 征 在 于 ：。
12、 以 野 生 型 微 拟 球 藻 （Nannochloropsis sp.OZ-1） 作为出发藻株经光照培养至对数生长期， 利用重离子加速器 对处于对数生长期的藻株进行诱变， 获得微拟球藻突变株Nannochloropsis sp.OZ-1HP-1。 0011 所述微拟球藻的诱变选育方法， 其特征在于 ： 利用重离子加速器对生长至对数生 长期的球藻进行不同剂量的碳重离子的辐射， 将致死率达到 50的辐射剂量的藻株分别 进行活化， 再逐级传代培养， 选取在逐级传代培养中 Fv/Fm 和 OD750 值稳定提高的生长迅 速突变藻株， 而后转接于鼓泡柱式光反应器中传代培养进一步筛选， 获得微拟球藻突。
13、变株 Nannochloropsis sp.OZ-1HP-1。 0012 所述的微拟球藻的应用， 其特征在于 ： 所述微拟球藻 Nannochloropsis sp.OZ-1 HP-1 用于油脂、 生物柴油、 脂肪酸、 叶 绿素 a、 类胡萝卜素和或生物质成分。 0013 本发明所具有的优点 ： 0014 本发明通过重离子诱变微拟球藻， 采用叶绿素荧光成像系统 Imaging PAM 和酶标 仪， 以 Fv/Fm 和 OD750作为考察指标， 对突变体库进行高通量筛选， 具有快速便捷的特点， 保 证了一定数量的筛选量。而通过多步逐级筛选的方法， 进一步保证了微藻优良性状的稳定 性， 最终获得的。
14、优良藻株在不同规模的培养体积中都具有较高的生长速率。 0015 本发明对单细胞产油微藻 Nannochloropsis sp.OZ-1 进行重离子诱变， 获得一株 生长速率更快的突变株 HP-1。该突变藻株生物量积累在培养末期较野生株提高 19， 叶绿 素 a 含量在培养第四天较野生株提高 45， 类胡罗卜素含量较野生株提高 47。该突变株 油脂积累末期生物量较野生株提高 33， 含油量与野生株相比未显著性提高， 油脂产率提 高 28， 由 0.21gL-1d-1提高为 0.27gL-1d-1。油脂特性分析显示突变株脂肪酸组成与野生型 藻株相比未发生显著性差异， 突变株油脂成分中 TAG 含量。
15、较野生型藻株提高 14。 附图说明 0016 图 1 为本发明实施例提供的微拟球藻重离子诱变不同辐照剂量致死率效果图。 0017 图 2 为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株 WT 和突变株 HP-1 生长曲线图。 0018 图 3A 为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株 WT 和突变株 HP-1 叶绿素 a 含 量对比图。 0019 图 3B 为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株 WT 和突变株 HP-1 类胡萝卜含 量对比图。 0020 图 4A 为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株 WT 和突变株 HP-1 产油期生长 曲线图。 说 明 书 CN 102978115 A 4 3/。
16、6 页 5 0021 图 4B 为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株 WT 和突变株 HP-1 光系统 II 最 大光化学效率 (Fv/Fm) 图。 0022 图5A为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-1油脂含量图。 0023 图5B为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-1油脂产率图。 0024 图 6 为本发明实施例提供的气相色谱分析野生株 WT 油脂脂肪酸组成图。 0025 图 7 为本发明实施例提供的气相色谱分析突变株 HP-1 油脂脂肪酸组成图。 0026 图 8 为本发明实施例提供的薄层层析分析野生株 WT 油脂组成图。 0027 图 9 为本。
17、发明实施例提供的薄层层析分析突变株 HP-1 油脂组成图。 具体实施方式 0028 根据下列实施例及附图， 可以更好的理解本发明。 0029 实施例 1: 微拟球藻重离子诱变突变体库的创制及高生长速率突变株筛选 0030 1） 取微拟球藻野生藻株 （Nannochloropsis sp.OZ-1） 作为出发藻株 ； 将所述藻株 从平板上接种至含 100mL Blue-Green Medium( 简称 BG11) 培养液的 250mL 锥形瓶中， 置于 光照培养箱中 25， 100mol/m2s， 连续光照培养至对数生长期。 0031 BG11 培养液的组成和配制参见表 1， 在配置培养液时， 。
18、将以下成分以固体形式加 入蒸馏水中配成 100-1000 倍的母液， 使用时再按需稀释配置成培养液。而后将 BG11 培养 基分装封口， 灭菌处理。取出灭过菌的培养基， 冷却至室温后， 待用。 0032 表 1 BG11 培养基的组成及其含量 0033 成分 储液浓度 使用时终浓度 NaNO3 150g/L 1.5g/L MgSO4.7H2O 75.0g/L 0.075g/L CaCl2.2H2O 36.0g/L 0.036g/L 柠檬酸 6.0g/L 0.006g/L Na2EDTA 1.0g/L 0.001g/L 柠檬酸铁铵 6.0g/L 0.006g/L Na2CO3 20.0g/L 0。
19、.002g/L K2HPO4 40.0g/L 0.004g/L H3BO3 2.86g/L 0.000286g/L MnCl2.4H2O 1.47g/L 0.000147g/L ZnSO4.7H2O 0.222g/L 0.0000222g/L Na2MoO4.2H2O 0.39g/L 0.000039g/L CuSO4.5H2O 0.079g/L 0.0000039g/L Co(NO3)2.6H2O 0.494g/L 0.0000222g/L 0034 2） 取处于对数生长期的微拟球藻野生株， 利用重离子加速器提供的碳重离子对藻 株进行诱变创制突变体库 ; 0035 取处于对数生长期的微拟球藻。
20、， 使用血球计数板测定细胞数目后， 稀释至 0.5-1107， 分别取藻液 1.5mL， 置于无菌平皿中。然后在重离子加速器垂直辐照终端装置 下， 进行诱变， 诱变能量重离子束流为 12C6+， 能量为80MeV/u。 将剂量范围设定为20Gy、 40Gy、 60Gy、 80Gy、 100Gy、 120Gy、 140Gy 和 160Gy。使用血球计数板对各辐照后样品进行细胞计数， 并稀释到 1500 个 /mL， 分别取 200uL 稀释液涂布平板， 使每个平板数目在 300 个左右， 将上 述各不同剂量辐照的稀释后藻液涂布海水 BG11 固体平板后的存活藻的数目与野生株进行 说 明 书 CN。
21、 102978115 A 5 4/6 页 6 比较， 计算致死率 （参见图 1） ， 选取致死在率 50以上的藻株进行重点筛选， 得到含约 2000 株诱变藻株的突变体库。 0036 3） 高生长速率突变藻株的初筛 ; 0037 利用 24 孔细胞培养板可以实现藻株的大规模筛选， 同时经过多步逐级筛选可以 确保优良性状的稳定。上述经分离后平板保存的 2000 株诱变藻株转接于 BG11 固体培养 基平板进行活化， 而后从平板上将活化后的藻株接种于 24 孔细胞培养板中， 每孔添加 2mL BG11 液体培养基， 在温度为 251、 光强为 100mol/m2s 条件下连续光照培养 8 天后， 。
22、采用叶绿素荧光成像系统Imaging-PAM(德国WALZ公司)和酶标仪 （Bio-Tech） 对突变体库 进行大规模筛选， 考察指标为Fv/Fm值和OD750值， 调整同样OD750值传代接种至新的24孔板 中， 生长 8 天后， 测量 OD750值和 Fv/Fm 值， 挑选两次 24 孔板筛选 OD750和 Fv/Fm 值提高 10 突变株， 调整相同 OD750值传代接种入 50mL 锥形瓶中， 在温度为 251、 光强为 100mol/ m2 s连续光照条件下培养10天后， 测量OD750值和Fv/Fm， 选择OD750值和Fv/Fm值提高10 突变株接种于 200mL 锥形瓶中。在上。
23、述条件下培养 10 天后， 测量 OD750值和 Fv/Fm 值， 最终 得到生长迅速的 15 株诱变藻株保存于固体 BG11 培养基平板。 0038 4） 高生长速率的藻株的复筛 ; 0039 经过初筛得到的生长迅速的 15 株诱变藻株经过复筛进一步筛选， 并经过多步筛 选步骤确定其优良性状的稳定。上述经分离后平板保存的 15 株诱变藻株转接于 BG11 固体 培养基平板进行活化， 而后从平板上将活化后的藻株分别接种于添加100mL BG11液体培养 基的锥形瓶中在温度为 251， 光强为 100mol/m2s， 连续光照培养条件下培养至对数 生长期， 测定干重。以干重 0.3g/L 接种于。
24、含 400mL BG11 液体培养基的鼓泡柱式光反应器 中， 每株设三个平行样， 温度为 251， 光强为 100mol/m2s， 连续光照培养。并在反应 器底部持续鼓泡通气， 通气量为 0.25vvm， 通入气体为纯 CO2和自然空气混合， 使培养液中 CO2的浓度为 2 （体积比） ， 并使用 0.22m 滤膜过滤除菌 , 培养 10 天后， 测量干重。以干 重 0.3g/L 的突变藻株接种于含 400mL BG11 液体培养基的鼓泡柱式光反应器中， 每株设三 个平行样， 上述条件下培养 10 天后， 测量干重， 以干重 0.3g/L 的突变藻株接种于含 400mL BG11 液体培养基的。
25、鼓泡柱式光反应器中， 每株设三个平行样， 上述条件下培养 10 天。经 过上述连续三次传代培养的筛选， 获得高生长速率的微拟球藻 Nannochloropsis sp.OZ-1 HP-1 突变株。 0040 所述突变藻株HP-1于2012年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC， 中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所， 100101)， 保藏号为 ： CGMCC No.6140。 0041 上述诱变方法也适用于诱变其他单细胞生物， 筛选方法经过初筛和复筛的多步筛 选步骤可从大量诱变株系中筛选出具有高生长速率性状稳定的单细胞藻类。 0042 实施例。
26、 2 ： 微拟球藻突变株 HP-1 和野生型藻株生物曲线绘制 0043 将上述所得高生长速率突变株 HP-1 和野生株分别于含 400mLBG11 液体培养基的 鼓泡柱式光反应器 （外径 4.0cm， 内径 3.8cm， 柱高 60cm） 中培养至对数生长期， 其培养条件 为 251， 光强为 100mol/m2s， 连续光照培养。并在反应器底部持续鼓泡通气， 通气 量为 0.25vvm， 通入气体为纯 CO2和自然空气混合， 使培养液中 CO2 的浓度为 2 （体积比） ， 使用 0.22m 滤膜过滤除菌 ； 将上述培养至对数生长期的突变株和野生株做为种子液分别 说 明 书 CN 10297。
27、8115 A 6 5/6 页 7 接种于含 400mL BG11 液体培养基的鼓泡柱式光反应器中， 初始接种量 0.8g/L， 突变株和野 生株分别设三个平行。在上述培养条件下培养， 分别取出培养第 0 天、 第 2 天、 第 4 天、 第 6 天、 第 8 天、 第 10 天、 第 12 天、 第 16 天和第 18 天藻液 10mL， 使用清洗好的醋酸纤维素膜 （孔 径0.45m） 抽滤， 105烘至恒重后称重， 测定干重即得生物量， 绘制生长曲线 （参见图2） 。 0044 由图 2 显示突变株 HP-1 生物量显著高于野生型藻株， 在培养的第 18 天可以提高 19。 0045 实施例。
28、 3 ： 微拟球藻突变株和和野生型藻株色素含量的测定分别取 2mL 上述 实施例中分别培养第 0 天、 第 2 天、 第 4 天、 第 6 天、 第 8 天、 第 10 天、 第 12 天、 第 16 天 和第 18 天的突变体藻液及野生型藻液， 分别以 5000rpm 离心 10min 后， 加入 2mL 甲醇， 60水浴 1h 后， 再以 5000rpm 离心 10min， 最后利用分光光度计在 665、 666、 470nm 下分 别测定其吸光度， 根据计算公式 C叶绿素 ag/mg=13.43A665v/(lV)/D 和 C类胡萝卜素g/ mg=(1000A470-44.76A666/。
29、221)v/(lV)/D 分别测定其叶绿素 a 和类胡萝卜素含量， 公式 中 A665、 A470、 A666 分别为 665、 666 和 470nm 下的吸光度值， v 为甲醇体积， l 比色杯光程， V 为样品体积。 0046 由图3显示突变株HP-1较野生型藻株叶绿素a含量在培养第四天提高45， 类胡 罗卜素含量提高 47。 0047 实施例 4 ： 微拟球藻突变株和野生型藻株产油期生长曲线、 油脂含量和油脂产率 测定 0048 采用两步法诱导产油， 将处于对数生长末期野生型和突变体藻液， 分别低速离 心后 （3000rpm， 10min） ， 沉淀接种于无氮海水的 BG11 培养基中。
30、 （BG11 培养基无 NaNO3） 在 251 , 光强 300mol/m2s, 连续光照培养， 通气量为 0.25vvm， 通入气体为纯 CO2和自 然空气混合， 使培养液中 CO2的浓度为 2（体积比） , 并使用 0.22m 滤膜过滤除菌。在 上述培养条件下高光缺氮诱导产油， 在培养的第 0 天， 第 3 天， 第 5 天， 第 7 天， 第 9 天， 第 11 天分别取 5mL 藻液， 使用清洗好的醋酸纤维素膜 （孔径 0.45m） 抽滤， 105烘至恒重后称 重， 测定产油期生物量 （参见图 4） 。 0049 采用重量法测定油脂含量， 以氯仿 - 甲醇 （甲醇 ： 氯仿 =2 ：。
31、 1(v/v)） 共溶剂提取。分 别取上述高光缺氮诱导产油中的第 0 天， 第 3 天， 第 5 天， 第 7 天， 第 9 天， 第 11 天的野生型 藻株和突变藻株各 50mg 的藻粉， 藻粉通过高速离心 （8000rpm， 10min） 获得藻体后经冷冻真 空干燥器冻干24h后得到。 分别向突变株和野生株冻干藻粉中加入7.5mL甲醇/氯仿甲醇 ： 氯仿 =2 ： 1(v/v) 混合溶液， 于 37下振荡提取 24h 后， 6000rpm 离心 10min 后分别收集上层 有机相。两藻株残渣再用 7.5mL 甲醇 / 氯仿混合溶剂重复提取一次。合并两次提取的有机 相， 分别加入 5mL 1。
32、 NaCl 和氯仿 （1 NaCl 和氯仿按体积比 1:1 混合） ， 混匀后分别离心 收集下层氯仿相， 氮吹仪下吹干， 真空干燥器烘干后分别测定其油脂重量， 与干重相比计算 野生株和突变株总脂含量。利用生物量和总脂含量相乘除以培养天数计算油脂产率。 0050 由图4和5结果显示该突变株HP-1油脂积累末期生物量较野生株提高33， 含油 量与野生株相比未显著性提高， 由于其生物量大， 导致油脂产率提高28， 由0.21gL-1d-1提 高为 0.27gL-1d-1。 0051 实施例 5 ： 微拟球藻突变株和野生型藻株油脂脂肪酸组成测定 0052 分别取上述约 10g 溶于氯仿的高光缺氮诱导第。
33、五天的野生型藻株和突变藻株 说 明 书 CN 102978115 A 7 6/6 页 8 总脂， 将两种藻株的总脂分别经过甲醇甲酯化 （甲醇甲酯化条件 2硫酸， 85， 2.5h） 和正 己烷萃取后， 分别利用 Agilent 气相色谱 - 四级杆质谱联用仪对其脂肪酸组成进行分析。 GC 条件 ： HP-5MS 石英毛细管柱 (30.00mm0.25mm0.25m) ； 柱温 120 240， 程序升 温 10 /min ； 柱流量 1.0mL/min ； 进样口温度 250 ； 柱前压 100kPa ； 进样量 1L ； 分流比 10 1 ； 载气为高纯氮气。MS 条件 ： 电离方式 EI 。
34、； 电子能量 70eV ； 传输线温度 250 ； 离子 源温度 230 ； 四极杆温度 150 ； 质量范围 35 450m/z ； 采用 wiley7n.l 标准谱库， 计算 机检索定性 （参见表 1 及图 6、 7） 。 0053 实施例 6 ： 微拟球藻突变株和野生型藻株油脂成分分析 0054 分别取上述约 10g 溶于氯仿的高光缺氮诱导第五天的野生型藻株和突变藻株 总脂， 利用棒状薄层层析对其油脂成分进行分析， 展开剂 1 体系为 ： 苯 ： 氯仿 ： 无水乙酸的 体积比为 150 ： 60 ： 2， 展开至 7cm， 展开剂 2 体系为 ： 苯 ： 己烷的体积比为 1 ： 1， 展。
35、开至 10cm。 完毕后取出点样板， 待溶剂挥发后， 置于氢火焰检测器， 氢气流量为 0.16L/min， 空气流量为 0.2L/min。使用外标法分别对两种藻株的 油脂成分进行定量， 标准样品为甘油三酯、 甘油 二酯、 甘油单酯、 固醇酯、 固醇和脂肪酸甲酯 （参见表 2 和图 8、 9） 。 0055 表 2 突变株 (HP-1) 和野生型 (WT) 微拟球藻油脂脂肪酸组成和油脂成分分析 0056 0057 注 ： SE， 固醇酯 ； FAME， 脂肪酸甲酯 ； TAG， 三酯酰甘油 ； FS， 固醇 ； DAG， 二酯酰甘油 ； MAG， 单酯酰甘油 ； PL， 极性酯。* 代表与野生型。
36、藻株存在显著性差异， p 0.05。 0058 由表2显示突变株HP-1油脂中脂肪酸组成与野生型藻株相比未发生显著性差异。 突变株 HP-1 油脂成分中 TAG 含量比野生型藻株提高 14。 说 明 书 CN 102978115 A 8 1/5 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102978115 A 9 2/5 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102978115 A 10 3/5 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102978115 A 11 4/5 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102978115 A 12 5/5 页 13 图 9 说 明 书 附 图 CN 102978115 A 13 。