一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法.pdf

本发明公开了一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法，采用栉孔扇贝担轮幼虫专用无钙海水等渗缓冲液浸泡与机械法结合的方式实现了对栉孔扇贝担轮幼虫细胞的完全解离，无需经任何酶类的消化。使用密度梯度离心的方法实现了三种类型担轮幼虫体外培养细胞的分离，分离后的细胞能够在栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中保持良好活力，并实现传代培养。该方法对栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的损伤小，成本低效率高，具有可重复性，本发明建立了一种高效的海洋贝类细胞解离和分离的方法，能够实现解离和分离后细胞的传代培养，对海洋贝类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立具有重要的指导意义。

权利要求书一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法，其特征在于，细胞解离以及分离方法包括以下步骤：
步骤一，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；
步骤二，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；
步骤三，使用不同浓度的Percoll细胞分离液通过密度梯度离心的方法将刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞分离为三大类别；
步骤四，当分离后的三类栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在步骤二中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌且过滤的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。
如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在步骤二中，机械解离法的实现方法为：手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼虫的液体1分钟以上，以1000转/分钟的速度离心5分钟后，收集得到解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞。
如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在步骤三中，密度梯度离心的实现方法为：所配制的Percoll细胞分离液的浓度为10％，15％，25％，35％；离心条件为1500g离心力，时间20分钟。
如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在步骤三中，将细胞分离为三大类别的实现方法为：
第一步密度梯度离心，使用25％Percoll细胞分离液与35％Percoll细胞分离液，担轮幼虫细胞经离心后被分离为处于25％Percoll液段上层的A群细胞以及处于该液段底层的具黑色颗粒的B群细胞；
第二步密度梯度离心，A群细胞经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗，使用10％Percoll细胞分离液与15％Percoll细胞分离液，A群细胞经离心后被分离为处于10％Percoll液段上层的直径小且胞质暗的A1群细胞以及处于15％Percoll液段胞质透亮的A2群细胞；分离后的3类细胞具有各自独特的生物学特征，且在栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中能够实现传代培养。

说明书一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法。
背景技术
截至目前国内外尚无人建立海洋双壳类细胞的体外培养体系，将范围扩展至软体动物门类，目前仅有一个来自淡水蜗牛(Bromphalaria glabrat)胚胎细胞的永久细胞系成功建立。
细胞的取材：体外培养的细胞多取材于动物胚胎、成年动物组织、人体手术活体材料，幼虫细胞是兼具胚胎细胞和幼虫期特有细胞性质的高分裂能力的细胞，是一类具有体外培养前景的细胞来源。
虾夷扇贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Primary cell culture fromembryos of the Japanese scallop Mizuchopecten yessoensis(Bivalvia)(1991Cytotechnology)。
贻贝面盘幼虫细胞的体外培养(备注：面盘幼虫是担轮幼虫下一个发育阶段)。参考文献：Isolation and partial characterization of myogenic cells from mussellarvae in vitro(2000Tissue Cell)。
紫贻贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Comparative Characteristic ofMytilus Muscle Cells Developed In Vitro and In Vivo.(2003 Journal of ExperimentalZoology)。
紫贻贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Muscle and neuronaldifferentiation in primary cell culture of larval Mytilus trossulus(Mollusca：Bivalvia)(2010 Cell Tissue Research)。
幼虫细胞的解离方式：上述幼虫细胞均采用无钙水浸泡后再经0.25％或0.125％胶原酶解离的方式获得单个的细胞。
幼虫细胞的除菌方法：在虾夷扇贝幼虫细胞体外培养中，在经紫外线消毒的海水中添加500单位/毫升青霉素和40微克/毫升庆大霉素作为培养幼虫的消毒海水，并且在细胞培养基中添加了40微克/毫升庆大霉素；在紫贻贝幼虫细胞体外培养中，使用Percoll密度梯度离心法除去细菌。
细胞传代方式：目前尚无关于幼虫细胞传代方法的报道，传代培养的核心工作有两方面，一是分割培养物，二是再次接种。把贴壁依赖型细胞从培养基质上解离下来的方法主要有：1).胰蛋白酶溶液消化；2).对于贴壁不牢的细胞可采用机械的振荡法。
幼虫培养基的优化：虾夷扇贝担轮幼虫细胞：L15基础培养基；25微克/毫升牛磺酸，50微克/毫升葡萄糖，100微克/毫升谷氨酰胺，2％胎牛血清，40微克/毫升庆大霉素。紫贻贝担轮幼虫细胞：L‑15基础培养基；2％胎牛血清，胰岛素(50微克/毫升)，维生素E(1.75微克/毫升)。
现有技术的缺点是在细胞培养过程中，经酶类解离后的细胞损伤较大，细胞寿命有限，无法实现贝类细胞的传代培养，同时细胞培养体系中的细胞种类复杂，不利于对其细胞生物学的确切描述与深入研究。
发明内容
本发明提供了一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法，旨在解决现有技术无法实现体外培养的贝类细胞传代培养的问题以及分离纯化问题。
本发明的目的在于提供一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞的解离方法和体外培养细胞的分离方法，该细胞解离以及分离方法包括以下步骤：
步骤一，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；
步骤二，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；
步骤三，使用不同浓度的Percoll细胞分离液通过密度梯度离心的方法将刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞分离为三大类别；
步骤四，当分离后的三类栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
进一步，在步骤二中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌且过滤的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。
进一步，在步骤二中，机械解离法的实现方法为：手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼虫的液体1分钟以上，以1000转/分钟的速度离心5分钟后，收集得到解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞。
进一步，在步骤三中，密度梯度离心的实现方法为：所配制的Percoll细胞分离液的浓度为10％，15％，25％，35％；离心条件为1500g离心力，时间20分钟。
进一步，在步骤三中，将细胞分离为三大类别的实现方法为：
第一步密度梯度离心，使用25％Percoll细胞分离液与35％Percoll细胞分离液，担轮幼虫细胞经离心后被分离为处于25％Percoll液段上层的A群细胞以及处于该液段底层的具黑色颗粒的B群细胞；
第二步密度梯度离心，A群细胞经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗，使用10％Percoll细胞分离液与15％Percoll细胞分离液，A群细胞经离心后被分离为处于10％Percoll液段上层的直径小且胞质暗的A1群细胞以及处于15％Percoll液段胞质透亮的A2群细胞。分离后的3类细胞具有各自独特的生物学特征，且在栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中能够实现传代培养。
本发明提供的高效和节约的海洋贝类细胞解离和分离的方法，解离和分离后的细胞能够实现体外增殖和传代培养，是首个海洋贝类的连续细胞系，对除栉孔扇贝之外的其他贝类细胞的解离、分离以及细胞系的建立具有重要的指导意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法的实现流程图。
图2是本发明实施例提供的分离方法的具体实施方案的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
图1示出了本发明实施例提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离方法的实现流程。
一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞的解离方法和体外培养细胞的分离方法，该细胞解离以及分离方法包括以下步骤：
步骤S101，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；
步骤S102，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；
步骤S103，使用不同浓度的Percoll细胞分离液通过密度梯度离心的方法将刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞分离为三大类别；
步骤S104，当分离后的三类栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
在步骤S102中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌且过滤的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。
在步骤S102中，机械解离法的实现方法为：手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼虫的液体1分钟以上，以1000转/分钟的速度离心5分钟后，收集得到解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞。
在步骤S103中，密度梯度离心的实现方法为：所配制的Percoll细胞分离液的浓度为10％，15％，25％，35％；离心条件为1500g离心力，时间20分钟。
在步骤S104中，将细胞分离为三大类别的实现方法为：
第一步密度梯度离心，使用25％Percoll细胞分离液与35％Percoll细胞分离液，担轮幼虫细胞经离心后被分离为处于25％Percoll液段上层的A群细胞以及处于该液段底层的具黑色颗粒的B群细胞；
第二步密度梯度离心，A群细胞经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗，使用10％Percoll细胞分离液与15％Percoll细胞分离液，A群细胞经离心后被分离为处于10％Percoll液段上层的直径小且胞质暗的A1群细胞以及处于15％Percoll液段胞质透亮的A2群细胞。分离后的3类细胞具有各自独特的生物学特征，且在栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中能够实现传代培养。
以下为本发明实施例的分离方法的一种具体实施方案，该方案包括以下步骤：
该分离方法包括以下步骤：
步骤S201，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；
步骤S202，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；
步骤S203，第一步密度梯度离心，使用25％Percoll细胞分离液与35％Percoll细胞分离液，担轮幼虫细胞经离心后被分离为处于25％Percoll液段上层的A群细胞以及处于该液段底层具黑色颗粒的B群细胞。
步骤S204，第二步密度梯度离心，A群细胞经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗，使用10％Percoll细胞分离液与15％Percoll细胞分离液，A群细胞经离心后被分离为处于10％Percoll液段上层直径小且胞质暗的A1群细胞以及处于15％Percoll液段胞质透亮的A2群细胞。
步骤S205，分离后的栉孔扇贝担轮幼虫细胞经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗后，将A1群、A2群和B群细胞置于栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中进行培养。
步骤S206，当分离后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
在本发明实施例中，在步骤S202中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌过滤海水的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。
在本发明实施例中，在步骤S202中，机械解离法的实现方法为：手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼虫的液体1分钟以上，以1000转/分钟的速度离心5分钟后，收集得到解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞。
在本发明实施例中，在步骤S203与S204中，Percoll细胞分离液的配制方法为：9份的Percoll商品化原液与1份0.3克/毫升的氯化钠溶液混匀配置成为100％Percoll细胞分离液，随后使用0.03克/毫升的氯化钠溶液将100％Percoll细胞分离液，稀释成为10％、15％、25％与35％的Percoll细胞分离液，按照密度由高到低的顺序分别将两种Percoll细胞分离液填入离心管中，每个液段3厘米高。
在本发明实施例中，在步骤S203与S204中，密度梯度离心的条件为：离心力设定为1500g，离心时间为20分钟。
在本发明实施例中，在步骤S204中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗的实现方法为：使用10厘米不锈钢长针头将分离的细胞吸取出来置于新的1.5毫升的离心管中，加入1毫升栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液重新悬起细胞，1000转/分钟离心5分钟收集，再重复使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗细胞和离心收集细胞两次。
在本发明实施例中，Percoll细胞分离液的浓度可根据离心力以及离心时间稍作调整。
在本发明实施例中，密度梯度离心的条件的最宽范围为离心力1000g至2500g，根据离心力以及Percoll细胞分离液的体积的离心时间的最宽范围为5分钟至30分钟。
在本发明实施例中，步骤S205，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基由L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素构成。
在本发明实施例中，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中添加物的最宽范围：胎牛血清添加量2％‑20％，扇贝血清1％‑10％，青霉素100‑500单位/毫升、链霉素100‑500微克/毫升。
在本发明实施例中，步骤S206，所述采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养的实现方法为：当分离后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取获得解离的单个细胞，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
在本发明实施例中，由于细胞贴壁能力较低，使用机械法方法即能够完成细胞的传代培养，除了用细胞刮刀和移液管吹打法外，一切可以将细胞机械摇晃下的办法均可行。
在本发明实施例中，可取材的细胞范围包括：栉孔扇贝原肠胚晚期胚胎、担轮幼虫、D型幼虫的细胞。理论上，该分离方法是可以应用在其他种类贝类生物胚胎和幼虫细胞的培养中。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明的技术方案：首先将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；将得到的单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞置于栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养液进行体外培养；将3毫升刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞液或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞液置于已含有3毫升25％Percoll细胞分离液与3毫升35％Percoll细胞分离液的15ml离心管中，在1500g离心力下离心20分钟；离心后分别将处于25％Percoll液段上层的A群细胞以及处于该液段底层具黑色颗粒的B群细胞吸出；经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗3遍后，将3毫升A群细胞液重新置于已含有3毫升10％Percoll细胞分离液与3毫升15％Percoll细胞分离液的15ml离心管中，离心后得到处于10％Percoll液段直径小且胞质暗的A1群细胞以及处于15％Percoll液段胞质透亮的A2群细胞。经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗3遍后，将分离的到的A1群、A2群和B群细胞分别置于栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养液进行体外培养。当分离后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，仅使用机械传代法即用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取得到解离的单个细胞，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
采用栉孔扇贝担轮幼虫专用无钙海水等渗缓冲液浸泡与机械法结合的方式不经任何酶类的消化实现对细胞的完全解离，该方法对栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的损伤小，成本低效率高，具有可重复性。
所述的栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌过滤海水的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。
所述的机械解离法为手动剧烈晃动盛有栉孔扇贝担轮幼虫个体的容器，以获得分散的单个细胞的方法。
所述的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基，其中含有：L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素。栉孔扇贝担轮幼虫专用细胞培养基中添加维持细胞代谢需求的少量营养因子，即实现栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的良好生长状态，随着细胞的分裂能够实现细胞的稳定传代培养，该方法操作简单且成本低廉。
培养基添加物的最宽范围：胎牛血清添加量2％‑20％；扇贝血清1％‑10％；青霉素100‑500单位/毫升、链霉素100‑500微克/毫升。
所述的密度梯度离心条件的最宽范围为离心力1000g至2500g，根据离心力以及Percoll细胞分离液的体积的离心时间的最宽范围为5分钟至30分钟。
Percoll细胞分离液的配制方法为：9份的Percoll商品化原液与1份0.3克/毫升的氯化钠溶液混匀配置成为100％Percoll细胞分离液，随后使用0.03克/毫升的氯化钠溶液将100％Percoll细胞分离液，稀释成为10％、15％、25％与35％的Percoll细胞分离液，按照密度由高到低的顺序分别将两种Percoll细胞分离液填入离心管中，每个液段3厘米高。
所述的Percoll细胞分离液其浓度可根据离心力以及离心时间稍作调整。
所述的Percoll细胞分离液液段，其高度可根据离心管的大小稍作调整。
所述的栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗的实现方法为：使用10厘米不锈钢长针头将分离的细胞吸取出来置于新的1.5毫升的离心管中，加入1毫升栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液重新悬起细胞，1000转/分钟离心5分钟收集，再重复使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗细胞和离心收集细胞两次。
所述的机械法方法进行细胞的传代培养：由于细胞贴壁能力较低，除了用细胞刮刀和移液管吹打法外，一切可以将细胞机械摇晃下的办法均可行。
可取材的细胞范围包括：栉孔扇贝原肠胚晚期胚胎、担轮幼虫、D型幼虫的细胞。理论上，该分离方法是可以应用在其他种类贝类生物胚胎和幼虫细胞的培养中。
本发明提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；将得到的单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞置于栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养液进行体外培养；将3毫升刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞液或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞液置于已含有3毫升25％Percoll细胞分离液与3毫升35％Percoll细胞分离液的15ml离心管中，在1500g离心力下离心20分钟；离心后分别将处于25％Percoll液段上层的A群细胞以及处于该液段底层的B群细胞吸出；经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗3遍后，将3毫升A群细胞液重新置于已含有3毫升10％Percoll细胞分离液与3毫升15％Percoll细胞分离液的15ml离心管中，离心后得到处于10％Percoll液段的A1群细胞以及处于15％Percoll液段的A2群细胞。经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗3遍后，将分离的到的A1群、A2群和B群细胞分别置于栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养液进行体外培养。当分离后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
本发明建立了一种高效和节约的海洋贝类细胞解离和分离的方法，解离和分离后的细胞能够实现体外增殖和传代培养，是首个海洋贝类的连续细胞系，对除栉孔扇贝之外的其他贝类细胞的解离、分离以及细胞系的建立具有重要的指导意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。