一种大批量快速分离昆虫围食膜的方法.pdf

本发明公开了一种大批量快速分离昆虫围食膜的方法，该方法可在短时间内从昆虫中肠中分离围食膜组织，然后再快速清洗掉里面的食物残渣，得到大量纯净的围食膜组织，比一般的方法效率提高了16倍，为昆虫围食膜中蛋白的后续研究提供了方便。

权利要求书一种大批量快速分离昆虫围食膜的方法，其特征在于，按照下列步骤进行：
步骤一，取昆虫幼虫标本100头～200头，将放在冰浴上冷却；
步骤二，取与昆虫幼虫标本数量相对应2mL的EP管，每管中加入2mL在0℃下提前冷却的浓度为0.7%的NaCI生理盐水，将所有装有生理盐水的EP管也放在冰浴上冷却；
步骤三，依次取昆虫幼虫标本，用解剖针将其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿昆虫幼虫的腹中线剪开体壁，暴露出整个消化道组织，用手术刀片从前肠前端切断消化道，再切断后肠后端的消化道，然后从后肠后端用镊子分离出整个含有食物的围食膜组织，立即将其放入EP管中，每EP管放一条围食膜，继续放在冰浴上冷却，直至所有的EP管全部装有昆虫幼虫的围食膜组织；
步骤四，将步骤三取出的全部含有围食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再将另一96孔塑料板压在上面，用橡皮筋将两个塑料板紧固，然后，将紧固后塑料板放在可控温摇床摇床中，将可控温摇床的温度设置为0℃，转速为200转/分钟；
步骤五，开启可控温摇床摇床15分钟，将EP管中的围食膜组织中的食物清洗出来；
步骤六，取100mL的烧杯2～3个，加入在0℃下提前冷却的浓度为0.7%的NaCI生理盐水100mL，放在冰浴上，将上述步骤五中每个EP管中的围食膜用镊子夹出来，立即依次逐一放在烧杯中清洗2‑3次，直到围食膜透明漂浮，无任何食物附着为止；
步骤七，将分离和清洗干净的围食膜收集，放在干净的EP管中，并立即放在液氮中快速冷却后，置‑80℃冰箱保存。

说明书一种大批量快速分离昆虫围食膜的方法
技术领域
本发明涉及一种昆虫组织的分离技术，具体涉及一种大量快速地分离昆虫围食膜的新方法。
背景技术
围食膜（Peritrophic membrane，PM）是昆虫中肠细胞分泌的一层厚薄均匀的非细胞结构薄膜，由中肠前端一直延伸至后肠。围食膜主要由蛋白质和几丁质组成。具有保护中肠上皮细胞，阻止病原物入侵等多种功能，是昆虫抵御随食物摄入的病原微生物入侵的第一道天然保护性屏障，凡是能破坏蛋白与几丁质高度结合的位点都可能成为害虫防治的靶标位点。所以，近年来对围食膜几丁质与蛋白质的组装机制、病原微生物与围食膜相互作用的分子机理、避免昆虫对病原微生物产生抗性等方面的研究已成为学者们普遍关注的新热点。
蛋白质是昆虫围食膜的主要成分，约占围食膜的35%‑55%。其中糖蛋白能增加围食膜的致密性、坚韧性及半渗透性，蛋白多糖形成围食膜其余部分，它的多聚糖侧链形成高度伸展的缠绕结构。蛋白质对于维持围食膜的致密结构至关重要，一般研究昆虫围食膜都是因为分离围食膜很困难，而且获得的量很少，无法满足围食膜蛋白所需的量，而且方法很费时费力，通常是将围食膜分离出来后，用充满浓度为0.7%的NaCI生理盐水注射器反复清洗掉里面的食物，获得一条昆虫围食膜需约10分钟时间。因此，研究昆虫围食膜蛋白对于以围食膜为靶标的昆虫生物防治具有重要的指导价值。
目前，关于围食膜中蛋白研究比较少，大部分蛋白结构和功能还不清楚。目前研究围食膜蛋白种类的基本方法都是采用单向SDS‑PAGE或双向电泳技术获得的。在这些研究中，关键的问题就是要获得和快速分离大批量的围食膜组织才能保证后续试验研究顺利进行。然而，昆虫围食膜非常薄，而且一头昆虫的围食膜要把它从中肠中解剖和分离出来也需要相当熟练和有耐心才行，分离出来的围食膜组织里面还有食物，如何在保证围食膜蛋白不被降解的情况下，快速清洗掉里面的食物，又是一个技术难关，并且一头像棉铃虫大小的五龄幼虫围食膜分离后仅仅才有53.45μg干重，工作量相当大。因此，迫切需要一种能够快速而大批量地分离昆虫围食膜的新方法，以便研究昆虫围食膜的功能和作用。
发明内容
鉴于以上研究背景和存在问题，本发明的目的在于，提供一种大批量快速分离昆虫围食膜的方法，该方法能够快速从昆虫中肠中分离围食膜组织，并快速清洗掉里面的食物残渣，得到大量纯净的围食膜组织。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种大批量快速分离昆虫围食膜的方法，其特征在于，按照下列步骤进行：
步骤一，取昆虫幼虫标本100头～200头，将放在冰浴上冷却；
步骤二，取与昆虫幼虫标本数量相对应2mL的EP管，每管中加入2mL在0℃下提前冷却的浓度为0.7%的NaCI生理盐水，将所有装有生理盐水的EP管也放在冰浴上冷却；
步骤三，依次取昆虫幼虫标本，用解剖针将其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿昆虫幼虫的腹中线剪开体壁，暴露出整个消化道组织，用手术刀片从前肠前端切断消化道，再切断后肠后端的消化道，然后从后肠后端用镊子分离出整个含有食物的围食膜组织，立即将其放入EP管中，每EP管放一条围食膜，继续放在冰浴上冷却，直至所有的EP管全部装有昆虫幼虫的围食膜组织；
步骤四，将步骤三取出的全部含有围食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再将另一96孔塑料板压在上面，用橡皮筋将两个塑料板紧固，然后，将紧固后塑料板放在可控温摇床摇床中，将可控温摇床的温度设置为0℃，转速为200转/分钟；
步骤五，开启可控温摇床摇床15分钟，将EP管中的围食膜组织中的食物清洗出来；
步骤六，取100mL的烧杯2～3个，加入在0℃下提前冷却的浓度为0.7%的NaCI生理盐水100mL，放在冰浴上，将上述步骤五中每个EP管中的围食膜用镊子夹出来，立即依次逐一放在烧杯中清洗2‑3次，直到围食膜透明漂浮，无任何食物附着为止；
步骤七，将分离和清洗干净的围食膜收集，放在干净的EP管中，并立即放在液氮中快速冷却后，置‑80℃冰箱保存。
本发明的大批量快速分离昆虫围食膜的方法，比一般的方法效率约提高了16倍，为昆虫围食膜中蛋白的后续研究提供了方便。
具体实施方式
为了清楚的理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
本实施例以棉铃虫围食膜的大批量快速分离为例，需要说明的是，本发明不限于该实施例。在以下的实施例中，棉铃幼虫标本的制作是选择健康5龄棉铃幼虫，在0℃条件下快速冷冻（15分钟或15分钟以上）所得到。
具体实施步骤如下：
1、取5龄棉铃幼虫标本100头～200头，将放在冰浴上冷却；
2、取与5龄棉铃幼虫标本数量相对应2mL的EP管，每个EP管中加入2mL在0℃下提前冷却好的浓度为0.7%的NaCI生理盐水，将这些装有生理盐水的EP管也放在冰浴上冷却；
3、依次取5龄棉铃幼虫标本，用解剖针将其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿5龄棉铃幼虫的腹中线剪开体壁，暴露出整个消化道组织，用手术刀片从前肠前端切断其消化道，再切断后肠后端的消化道，然后从后肠的后端用镊子拉出整个含有食物的围食膜组织，立即将其放入上面的EP管中，每EP管放一条围食膜，继续放在冰浴上冷却，直至所有的EP管全部装有5龄棉铃幼虫的围食膜组织。
4、将可控温摇床设置在0℃，转速设置在200转/分钟，等待后续操作使用。
5、将步骤3中解剖取出的全部含有围食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再将另一96孔塑料板压在上面，用橡皮筋将两个96孔塑料板紧固，然后，将96孔塑料板放在上面已经设好的可控温摇床中，打开可控温摇床15分钟，就可以将EP管中的围食膜组织中的食物清洗出来。
6、取100mL的烧杯2‑3个，加入在0℃下提前冷却好的浓度为0.7%的NaCI生理盐水100mL，放在冰浴上，将上述步骤5中每个EP管中的围食膜用镊子夹出来，立即逐一放在烧杯中清洗2‑3次，直到围食膜透明漂浮，无任何食物附着为止。
7、将分离和清洗干净的围食膜收集，放在干净的EP管中，每个EP管中放的围食膜的数量根据试验不同而不同，一般每10条围食膜放在一个EP管中，并立即放在液氮中快速冷却后，置‑80℃冰箱保存备用。
采用本发明的方法，可在1‑2小时内获得100‑200条昆虫的围食膜，其效率是一般方法的16倍以上。