甘草提取物的抗微生物和抗炎分离物 背景
甘草(Glycyrrhiza sp.)属植物根的提取物被用作矫味剂，在各种用途中，所述提取物尤其赋予甘草(licorice或liquorice)香味。目前的提取法采用热水提取法。该方法优先分离出所述植物根的亲水性组分。用现有技术的提取法分离出的主要单一组分是甘草酸。甘草酸主要是用作甜味剂和矫味剂。现有技术的提取方法可除去少量或不除去植物根的疏水性或亲脂性组分。
其他现有技术方法在提取过程中利用有机溶剂。这些方法除去更多的植物根亲脂性组分但产生了与使用有机溶剂有关的严重的环境问题。此外，上述两种现有技术的提取法(热水法和有机溶剂法)都具有严重的问题，例如在废料产生与排放等方面。有机溶剂提取物，就其本质而言，问题在于处理或回收使用过的有机物。热水提取法在提取亲水性化合物时是优选的，对于提取亲脂性化合物则无效。另外，使用过的水必须经过处理后才返排到环境供水中。
业已表明甘草(Glycyrrhiza sp.)提取物的各种组分具有抗炎、抗菌和抗粘附的作用。然而，现有技术提取物所显示的各种作用并不一致。例如，在一项研究中报道了加入(incorporation)0.25-0.5％的甘草酸(通过现有技术的提取方法得到的甘草提取物的主要组分)对于除去或预防牙菌斑积聚(plaque build up)无效(Goultschin，et al.，J.Clin.Periodontol.18：210-212，1991)。
因此，需要的是以下的甘草(Glycyrrhiza sp.)根提取方法：该方法比现有技术产生更少废料并对环境造成更小影响，同时制成的提取物在提供抗炎、抗菌和抗粘附性质方面更有效，这通过分离出更大百分比的该植物根的总有效亲脂性组分，特别是更大百分比的该植物根的总有效异戊二烯化类黄酮来实现。
发明概述
本发明一方面提供了由甘草(Glycyrrhiza sp.)根制备提取物的新型非显而易见的方法。在一个实施方案中，本发明提取方法包括利用超临界CO2提取法。本发明所述方法的细节在下文的优选实施方案说明中给出。本发明方法解决了现有技术提取方法的问题，即通过在提取过程中大大减少或消除对有机溶剂的需要并提供富含异戊二烯化类黄酮(例如异黄烷、异黄酮醇、黄烷酮、异黄酮)的提取物，同时还几乎不含或不含甘草酸(例如没有可检测到的甘草酸)。此外，本发明方法提取到亲脂性组分，同时提取到非常少量的亲水性组分。本发明方法还因所述提取法而大大减少或消除了废水流的产生。
本发明还涉及由本发明提取方法得到的提取物。在一个实施方案中，本发明提取物包括来自乌拉尔甘草(G.uralensis)的提取物，该提取物主要包含作为亲脂性组分的甘草西定(licoricidin)和甘草异黄烷A(licorisoflavan A)(5-O-甲基甘草西定)。用本发明的提取方法没有回收到可检测的甘草酸(该植物根的亲水性组分)。甘草西定和甘草异黄烷A两者都是异戊二烯化异黄烷——类黄酮的一种特殊类型。对于甘草西定，其分子量为m/z＝424。对于甘草异黄烷A：分子量m/z＝438；UV(MeOH)：λmax＝283nm。在一个实施方案中，在提取过程中于不使用乙醇作为改性剂的情况下分离出本发明提取物。在该实施方案中，甘草西定和甘草异黄烷A两者的浓度范围都大约为0.5-6.0％。在另一个实施方案中，在提取过程中使用乙醇作为改性剂来制备本发明提取物。在该实施方案中，甘草西定和甘草异黄烷A的浓度范围为：大约2.0-20.0％甘草西定以及大约1.0-8.0％甘草异黄烷A。在又一个实施方案中，提取物中甘草酸的浓度小于0.10％。在另一个实施方案中，提取物中甘草酸的浓度小于0.01％或0.001％。此外，本发明超临界CO2提取物还包含显著量的脂肪酸(特别是例如棕榈酸和亚油酸)。
在进一步研究中发现，本发明超临界CO2甘草提取物的某些组分非常适合提供抗炎和抗微生物作用。在这点上，甘草西定和甘草异黄烷A提供了最大水平的抗微生物作用。另外，在这点上，本发明涵盖了口腔和身体护理组合物，所述组合物包含有效提供抗微生物和抗炎作用的量的甘草西定和甘草异黄烷A。
甘草(Glycyrrhiza)的其他种提供了以下提取物：其中主要的亲脂性组分仍为异戊二烯化类黄酮，但确切的异戊二烯化类黄酮可不同。例如，由本发明提取方法得到的光果甘草(G.glabra)的提取物将具有作为主要异戊二烯化类黄酮的光甘草定、甲基光甘草定和光甘草酚。
当在本发明提取方法中用乙醇作为改性剂时，乙醇的浓度在大约2.0％-10％之间。在一个优选实施方案中，乙醇改性剂在大约4.0％-6.0％之间。对于制备本发明提取物而言对乙醇的使用是非必要的。与单独使用CO2相比，乙醇有助于提取最大量的亲脂性较小地化合物。
本发明还涉及由所述提取物制成的制品。虽然本发明不受限于本发明提取物的任何具体用途，但是在一个优选实施方案中，该提取物用于口腔护理制品。其中可采用本发明提取物的合适口腔护理制品的实例包括但不限于洁齿剂(例如牙膏、牙膏凝胶(toothpaste gel)、牙粉、假牙清洁剂和假牙清洁化合物、漱口剂和口腔清洁剂、牙签、牙线、口香糖、软锭剂(pastille)、糖锭(lozenge)、可溶性片剂、咀嚼片剂等等)。此外，本发明提取物可以用于身体护理制品，例如(但不限于)护肤膏、润肤液、防晒组合物、肥皂、婴儿护理制品、剃须制品、除臭剂、洗发水等等。
附图简述
图1显示用A)热水提取，B)乙醇提取，C)乙酸乙酯提取，D)超临界CO2提取和E)用乙醇作为改性剂的超临界CO2提取得到的乌拉尔甘草(G.uralensis)提取物的HPLC色谱图。
图2显示甘草西定和甘草异黄烷A的化学结构，其中对于甘草西定，R＝H，而对于甘草异黄烷A，R＝Me。
优选实施方案说明
本发明涉及甘草(Glycyrrhiza sp.)提取物，其中提取所述提取物所用方法比现有技术提取方法对环境造成的影响更小，并且提取到比现有技术方法更大百分比的亲脂性组分，同时提取到更少亲水性组分。本发明还涉及本发明提取物的用途。另一方面，本发明涉及甘草的提取方法，所述方法利用了超临界CO2提取法。
提取物可提取自：来自甘草(Glycyrrhiza)属的许多不同种的豆科类植物的根，更准确地说是乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的根。所述植物原产于南欧和部分亚洲地区。乌拉尔甘草(G.uralensis)广泛用于传统的中医。虽然如此，本发明并不限于任何特定的植物来源。可通过本发明方法用来制成提取物的甘草(Glycyrrhiza)的其他已知种包括但不限于：Glycyrrhiza acanthocarpa、粗毛甘草(Glycyrrhiza aspera)、紫云英甘草(Glycyrrhiza astragalina)、Glycyrrhiza bucharica、刺毛甘草(Glycyrrhiza echinata)、无腺毛甘草(Glycyrrhiza eglandulosa)、Glycyrrhiza foetida、Glycyrrhizafoetidissima、光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、Glycyrrhizagontscharovii、Glycyrrhiza iconica、长序甘草(Glycyrrhizakorshinskyi)、北美甘草(Glycyrrhiza lepidota)、刺果甘草(Glycyrrhizapallidiflora)、圆果甘草(Glycyrrhiza squamulosa)、Glycyrrhizatriphylla、乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)和云南甘草(Glycyrrhizayunnanensis)。
超临界二氧化碳是指具有某些特殊性质的二氧化碳。二氧化碳通常在空气中表现为气体或表现为固体干冰。如果同时增加温度和压力，它则可表现介于气体与液体之间的性质。在高于其临界温度(31.1摄氏度)和压力(73atm＝73.96bar)的条件下，它表现为超临界流体状，即像气体一样膨胀以充满其容器，但却具有液体般的密度。产生超临界CO2所需的实际温度取决于压力，反之亦然。例如，压力越高，达到超临界状态所需的温度则越低。同样，温度越高，达到超临界状态所需的压力则越低。
虽然超临界CO2在某些情况下已被用作其他物质的萃取剂，但是据我们所知，它未被用作甘草(Glycyrrhiza sp.)根提取的萃取剂，尤其是其中所得的提取物主要包含异戊二烯化类黄酮(异戊二烯化异黄烷)且具体地说是来自乌拉尔甘草(G.uralensis)的甘草西定和甘草异黄烷A(且类似地，来自光果甘草(G.glabra)的异戊二烯化类黄酮：光甘草定、甲基光甘草定和光甘草酚)，并且基本上不含或无甘草酸。只有通过经验性实验，本发明方法和组合物才得以构思并付诸实践。没有市场压力或其他市场考虑促使本领域技术人员鉴定或开发本发明的组分、根据构想和实践本发明的需要来改造所述组分和构想和制备本发明的制品。只有当概念转化为本发明的实践之后，任何市场价值才能被认可。
使用超临界CO2的某些环境益处如下。首先，所述方法中所用的CO2基本上未改变并可以重复使用。其次，基本上没有废料流(waste stream)要处理，即不存在用过的溶剂、挥发性有机化合物、污染性废水等等。因此，本发明提取物比现有技术方法的提取物在环境方面更可靠。
本发明提取物与现有技术的甘草(Glycyrrhiza sp)提取物不同。本发明提取物的异戊二烯化类黄酮化合物(例如甘草西定和甘草异黄烷A)含量高。这两种化合物都具有抗炎、抗细菌、抗粘附和抗真菌的作用。例如，本发明提取物已被证明具有显著的抗革兰氏阳性细菌的抗菌活性，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和变异链球菌(Streptocuccus mutans)；抗革兰氏阴性厌氧菌的抗菌活性，例如牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)以及抗黑曲霉(Aspergillus niger)的抗真菌活性。此外，当通过高压液相色谱法(HPLC)检查时，本发明提取物不含甘草酸或基本不含甘草酸(参见下文实验部分)。在现有技术中甘草酸用作甜味剂和矫味剂，但在本发明组合物中并不需要。
甘草西定和甘草异黄烷A为本发明的超临界CO2提取物中的两种组分。它们在3.125μg/ml(最小抑菌浓度，MIC)下都显示出对变异链球菌(Streptococcus mutans)(携带者的主要病原体)的抗菌活性，对于甘草西定和甘草异黄烷A而言，它们分别在约0.78μg/ml和约1.56μg/ml下显示对中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)的抗菌活性，分别在0.39μg/ml和0.78μg/ml下显示对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗菌活性。普雷沃氏菌(Prevotella sp.)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)涉及到牙周炎。这两种组分还显示出优越的抗炎剂活性。因此，可以看出，上述提取物、特别是这些化合物一般都可具有作为抗炎剂、抗细菌剂和抗真菌剂的优越能力(参见下文实验部分)。
如上所述，就其抗炎、抗细菌、抗粘附和抗真菌的性质而言，由本发明方法制成的提取物可用于许多制品中，包括口腔护理制品和身体护理制品。下面，我们描述一些适合与本发明提取物一起使用的制品。
口腔组合物
牙线
本发明的甘草(Glycyrrhiza sp.)根(即甘草提取物)可配制成牙线。例如，本发明提取物可浸渍到牙线中以便在使用牙线时它与使用者的牙齿接触。当用于牙线组合物时，本发明提取物的浓度为涂覆细线材料所用的蜡混合物的约0.1％-5.0％重量。优选浓度为涂覆细线材料所用的蜡混合物的约0.5％-3.0％重量。牙线可用于确保本发明提取物与难以通过所描述的一些其他手段所能触及的面对面的牙齿表面接触。当甘草西定和甘草异黄烷A在本发明的牙线中用作抗微生物剂时，它们可单独使用或以混合物形式使用，其总浓度为约0.01％重量-1.0％重量、约0.05％重量-0.5％重量或约0.1％重量-0.2％重量。
在本发明的某些实施方案中，所述牙线的制备如下论述。本领域技术人员将认识到对于牙线的制造，存在与基于甘草的本发明组合物相容的其他方法和组合物。
词语“牙线”的含义，在本文中应理解为包括牙线和洁牙带两者，以及任何其他类似的制品。此外，本发明中使用的牙线和洁牙带可包括任何合适的或市售的牙线或洁牙带。这些牙线和洁牙带可由从天然或合成的来源制成，其实例包括但不限于单独或组合形式的：高韧度聚合物和普通韧度聚合物的丝线或纱线、GoreTexTM、尼龙、聚烯烃、聚乙烯、聚丙烯、氟碳化合物、聚四氟乙烯、人造丝、涤纶、聚丙烯酸酯类、醋酸聚合物和其他塑料。天然的物质可包括但不限于单独或组合形式的：棉花、羊毛、丝绸、亚麻织物、大麻、大豆和其他短纤维。还可使用合成-天然纤维的共混物。但是，合成的丝线比天然的纤维易于磨损。
细线的拉伸强度必须沿着其长度均匀地分布。这是纤维的关键所在——它们将在其最薄弱的部分断开，因此均匀的(evenkeeled)拉伸强度是关键。因此，本发明的牙线涉及具有高拉伸强度、同时可用于牙齿之间清洁的纤维。细线或细线纤维的旦尼尔可衡量其重量且还可衡量拉伸强度。旦尼尔被定义为每9,000米未涂覆的细线重量的克数。旦尼尔值与一股细线的厚度之间有直接的相关性：如果此值增加，那么牙线的厚度也增加。因此，一般而言，在所有其他条件相同下，旦尼尔值越大，拉伸强度就越高。在本发明的一个实施方案中，圆形细线的旦尼尔为约750-950，扁平细线的旦尼尔为约950-1150。
所述细线自身的长度、直径、结构或设计也并不限于任何特定的大小、形状、排列或构造，因此，可经过制造以符合任何特定的目的。例如，它可由许多根组成在一起的单独丝线组成，以得到直径足够小以能够插入牙齿之间的较大股线。它也可包括连接到挤出的单丝或连接到另外的复丝上的复合式复丝。单根圆形、方形或矩形的单丝线也可使用。其他合适的变型也在本领域内众所周知，且这些变型也可在本文中公开的发明中使用。
例如，在本文所公开的发明中，粘合剂被用于使本发明于此所阐述的各成分粘合或附着到牙线上。它们还提供了以下能力：改变牙线的摩擦特性以及有助于使包括细线本身在内的各根丝线粘合在一起。此外，本文所使用的种类并不限于任何特定的类型或组合物，因此在其组成、结构或构成方面给与了很大的自由。因此某些适合的粘合剂的实例包括但不限于：来自植物的天然蜡(例如巴西棕榈蜡、大豆蜡和加州希蒙得木蜡)以及其他水溶性或非水溶性蜡或蜡状化合物或水溶性或非水溶性的聚合物、肥皂、树胶、树脂(例如没药和蜂胶)和本领域已知的其他物质。
细线还可利用例如一种或多种增溶剂。它们的功能类似地将有助于溶解。因此，合适的增溶剂可包括但不限于单独或组合形式的：滤过水、反渗透水、蒸馏水和去离子水。然而，业已发现去离子水比其他的更为优选。
牙线还可利用例如一种或多种矫味剂。这些矫味剂优选包括来源于植物和水果的油类或提取物，例如柑橘油、水果香精、薄荷、薄荷油、留兰香油、丁香油、冬青油、茴芹、檫木、鼠尾草、桉树、马郁兰、肉桂、柠檬、柑桔、香蕉、樱桃、小茴香、苹果、菠萝、葡萄、草莓和蓝莓。本领域技术人员将认识到这些天然的矫味剂可以单独使用或在任何感官上可接受的共混物中联用。所有这些矫味剂和矫味共混物都涵盖在本发明中。
为了促进消费者的更大兴趣，牙线还可包含例如一种或多种天然的甜味剂。这些甜味剂可包括但不限于：木糖醇、甘油、山梨醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、糊精、果糖、半乳糖等。
过去业已发现氟化物有助于预防龋损或龋齿的发生。当牙齿脱矿化的速度比其再矿化的速度快时，就会引起龋齿，大多数脱矿化作用是由产生酸的牙菌斑导致的。然而，再矿化作用由钙和磷酸盐促进，主要的再矿化剂也存在于唾液中。因此，基于氟化物的化合物提供了免受龋损或龋齿的保护作用，即通过起催化剂的作用以加速磷酸钙以羟基磷灰石的形式沉淀至牙齿上或牙齿内。然而，这不是氟化物唯一的作用。它还能够抑制一些细菌酶类的活性及其酸产生的过程，并且在非常高的浓度下它还可杀灭某些牙斑细菌。更重要的是，它易于掺入磷灰石，成为氟化羟基磷灰石或“氟磷灰石”，产生一种较少被酸溶解的矿物质。
因此，牙线可包含例如一种或多种基于氟化物的化合物。这些化合物还可微溶于水或可完全溶于水。然而，它们最重要的特征在于其在水中释放氟离子的能力并且其不会与所述牙线的其他化合物发生不合乎需要的反应。在这些原料中，存在许多基于氟化物的化合物，所述化合物可包括无机氟化物盐，例如可溶性碱金属盐、碱土金属盐及其他。当采用氟化物化合物时，用量很大程度上取决于氟化合物的类型、其溶解性和最终制剂及所选择的结构。根据这一点，只要可观察到正常的制剂和药物保护作用(pharmaceutical safeguard)，就可为分量或用量留有充分的余地(substantial leeway)。因此，每当在下面列举的制剂中使用基于氟化物的化合物时，其用量应该固定在不超过0.30％(w/w)。然而，已经发现将最大范围设定在0.24％(w/w)是优选的，而0.22％-0.24％(w/w)则为最佳的总使用范围。
洁齿剂
本发明的超临界CO2甘草提取物(甘草(Glycyrrhiza sp.)根提取物)还可用于牙膏、牙胶(tooth gel)和牙粉中。在本发明的一个实施方案中，本发明提取物在洁齿剂中所用的浓度范围为约0.002％-2.0％重量。优选的浓度范围为0.02％-1.0％重量之间。当甘草西定和甘草异黄烷A在本发明洁齿剂中用作抗微生物剂时，它们可单独使用或以混合物的形式使用，其总浓度为约0.01％重量-1.0％重量、约0.05％重量-0.5％重量或约0.1％重量-0.2％重量。
以牙膏、凝胶、液态凝胶、假牙清洁液和假牙清洁膏等为形式的组合物一般会包含粘合剂或增稠剂。适合在本文中使用的粘合剂包括角叉菜胶(优选)和/或天然树胶，例如刺梧桐树胶、黄原胶(优选)、阿拉伯树胶(优选)和黄蓍胶也可被使用，以及本领域已知的其他作用剂。胶质的镁铝硅酸盐或细碎的硅凝胶可用作增稠剂部分以进一步改善构造(texture)。基于组合物的总重量计算，粘合剂/增稠剂可按约0.1％-约15.0％、优选约1.0％-约12％的量使用。活性物质为氟化物和硝酸钾，其水平描述于它们各自的关于抗龋和敏感性的FDA专著中。用于龈炎的活性物质使对该专著的最终确定仍然悬而未决。研磨剂为碳酸钙、碳酸氢钠或硅凝胶。
这些组合物通常包含一种或多种甜味剂和矫味剂。用于洁齿剂的合适甜味剂和矫味剂的实例在上文中已作论述。pH平衡剂(例如柠檬酸、NaOH)以及表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)、防腐剂(例如苯甲酸、山梨酸)、稳定剂等等也经常用于洁齿组合物中，所述洁齿组合物的实例也已在上文中提供。本发明的组合物还可包括植物性治疗药物。
除了掺入本发明的甘草提取物之外，在洁齿剂中还可包含少量(例如0.01％-2％重量)的其他天然成分，例如抗氧化剂、防腐剂、pH调节剂、脱敏剂、稳定剂、胶凝剂、矫味剂等等。优选胶凝剂或粘合剂为一种或多种角叉菜胶或黄原胶。优选的矫味剂为天然的矫味剂，例如薄荷油、留兰香、杏子和肉桂等等。对于敏感性牙齿而言，该制剂可包含使牙齿敏感的人群疼痛缓解的作用剂。用于该目的的优选成分为硝酸钾。分散剂可用于本发明中。优选的分散剂为十二烷基硫酸钠或含皂角苷的植物提取物。
还期需的是，在牙膏中包含一种或多种保湿剂(湿度保持剂)材料，以防止组合物因暴露在空气中而硬化。优选的保湿剂为甘油和山梨醇。某些保湿剂还能赋予牙膏组合物需要的甜度。液态洁齿剂和漱口剂还可包含一定量的保湿剂。适合的保湿剂在本领域总所周知。当存在时，保湿剂通常以本发明组合物重量的约10％-约70％存在。
牙粉可利用许多与牙膏相同的组分，除了它们必须在干燥状态(即干燥研磨过的状态)下混合或作为液态组合物混合然后通过例如各种已知的喷雾干燥技术干燥之外。喷雾干燥被描述为：当液态形式的组合物以薄雾喷入干热室时，在所述干热室中薄雾的水分经室内干热蒸发，仅剩余粉末形式组合物的干燥组分。所述粉末形式组合物的水分含量在约0.1％-5％之间。随后，当通过在使用时加入水(例如由使用者加入水)或经使用者的唾液来使用时，牙粉得以重新水合。
可溶性片剂
本发明另一方面为包含本发明的超临界CO2甘草(Glycyrrhiza sp.)提取物的可溶性假牙清洁片剂。本发明又一方面为以下可溶性假牙清洁片剂：其包含分离自例如本发明超临界CO2提取物的甘草西定和甘草异黄烷A中的一种或两者。
这些片剂可为固态的、分层的、具有液体填充的中心等等。该片剂应在少于约1小时内、优选少于约15分钟内完全或几乎完全溶解在水溶液中。所述片剂可为泡腾片，但这并非必须。
水溶性假牙清洁片剂如下制得：首先在例如无水乙醇溶液中使用合适的粘合剂来制备并干燥各成分颗粒。接着使所得的颗粒混合物干燥至水分含量为0.4％或更少，经过筛分，然后与所需的活性成分连同粘合剂、填充剂、增量剂、染料、矫味剂及润滑剂等一起在适合的混合装置中彻底混合。将最终的共混物装入冲模压片机中，在该压片机中压制成片。之后将所形成的片剂释放并包装。
漱口剂和口腔清洁剂
通常，本发明的漱口剂和口腔清洁剂包含在例如水/甘油溶液中的本发明超临界CO2甘草(Glycyrrhiza sp.)提取物，并且还可包含一种或多种矫味剂、润湿剂、甜味剂、乳化剂(例如泊洛沙姆(poloxamer))和着色剂。本发明又一方面为漱口剂，其包含分离自例如本发明超临界CO2提取物中的甘草西定和甘草异黄烷A中的一种或两者。
漱口剂可包含水平为0-60％、优选0-30％重量的甘油。该漱口制剂的pH值一般为约3.5-约8.0、优选约4.0-约7.5。pH高于8.7将导致不适的口感。口腔液态制剂还可包含表面活性剂(surfaceactive agent)，即表面活性剂(surfactant)，其量至多约5.0％、更优选在约0.5-2.0％之间；提供氟化物的化合物的量占制剂重量的至多约2.0％，更优选约0.0442％的氟化钠或0.025％的氟离子。
本发明的漱口剂和口腔清洁剂还可包含一种或多种醇类。例如乙醇。
软锭剂、糖锭和口香糖
包含本发明的超临界CO2甘草(Glycyrrhiza sp.)提取物的口香糖组合物可呈传统的口香糖的形式或任何其他适合咀嚼的制品形式。本发明又一个方面为口香糖，其包含分离自本发明超临界CO2提取物的甘草西定和甘草异黄烷A中的一种或两者。适合的外形包括棒状、块状和糖衣片(即糖包衣胶；例如ChicletsTM)。所述口香糖还可具有液体填充的中心，其中该液体中心包含基于甘草的组合物(参见，例如美国专利第6,280,780号)。该口香糖还可为适合咀嚼的易消化的或可分解的口香糖。以口腔活性为目的，该口香糖通常在口腔中保持一段时间，所述时间足以使得所释放的组分与几乎所有牙齿表面和/或口腔组织接触。
本文所用术语“载体材料”意指本发明口香糖组合物中使用的任何安全有效的另外的口香糖组分。这些材料包括：弹性体、树脂、增塑剂、脂肪、溶剂、蜡类、乳化剂、软化剂、膨胀剂、甜味剂、吸收剂、口腔活性金属离子、阳离子物质、氟离子源、额外的抗牙垢剂、抗微生物剂、缓冲液、增白剂、碱金属碳酸氢盐、增稠剂、保湿剂、水、表面活性剂、二氧化钛、矫味剂、木糖醇、着色剂及其混合物。
本发明的口香糖通过本领域已知的方法制备。例如将香糖胶基加热至45℃使其软化。在整个混合过程中使混合物容器维持在45℃，加入本文所述的添加剂以及本发明提取物，然后混合均匀。接着将口香糖混合物制成棒状、块状等等，包装并冷却。必要时，将口香糖用糖包衣或用不含糖分的糖(sugar free candy)包衣。
甘草组合物还可用于糖锭和软锭剂组合物。用于糖锭和软锭剂的载体合宜地为糖，例如葡萄糖、乳糖或蔗糖，或本质上非致龋材料，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇或山梨醇。
除活性组分和载体之外，所述糖锭优选包含一种或多种粘合剂，例如明胶(植物胶，例如优选阿拉伯胶)或液态葡萄糖BPC1963，其总共合宜地可占糖锭重量的约0.5％-10％。优选的范围为约1％-5％重量。
所述糖锭可另外包含润滑剂，例如硬脂酸或硬脂酸盐例如硬脂酸镁，以方便糖锭的制备。当存在一种或多种润滑剂时，其在糖锭中的总含量优选0.1％-5％重量。
所述糖锭可按照传统的糖锭制备方法来制备，例如通过混合1，3-双(2-羧基色酮-5-基氧基)-2-羟基丙烷或其盐与辅料、稀释剂或载体并压制该混合物。在优选的方法中，所述双色酮与辅料、稀释剂或载体需要在压缩成糖锭之前首先一起制粒。制粒步骤优选湿法制粒步骤，并且需要在加入润滑剂之后立即进行压制步骤。
软锭剂(有时被称为枣味胶糖(jujube)或软糖锭)是由掺入了本发明提取物的甘油、明胶(或其他天然的胶凝剂)与水的混合物制成的硬凝胶状制剂。还可加入矫味剂。所述甘油-明胶基料可经温和加热而融化并加入任何成分。接着将温热的基料倒入模具中并使其定型。例如参见www.rpsgb.org.uk/pdfs/mussheet04.pdf。
身体护理制品
典型的身体护理制品包括，例如爽身水、护肤膏、肥皂、头发护理制品(例如洗发水和护发素)、防晒剂、局部抗炎剂、脱毛组合物、剃须制品(例如剃须膏和须后水)、除臭剂、婴儿护理品等等。身体护理制品是通常作为局部处理用于体表(例如皮肤、头发等等)的制品。
本领域技术人员知道如何配制这些身体护理制品。例如Silva等人的美国专利第6,861,062号(在此引作参考)公开了制备护肤膏的例示性配方和方法。用于皮肤护理制品的草药组成也在本领域已知(参见，例如Fasano的美国专利第6,586,018号，其在此引作参考)，该专利公开了例示性配方和制备方法。
制备剃须制品的组合物和方法也在本领域已知。例如Lucas的美国专利第7,179,454号(其在此引作参考)公开了几种例示性配方和制备方法。Tietjen等人的美国专利第6,479,043号(在此引作参考)公开了制造脱毛剂的例示性配方和方法。
同样地，制备肥皂、防晒乳液和抗炎局部处理剂的配方和方法也在本领域已知。
在一个实施方案中，本发明的身体护理制品包含甘草(Glycyrrhiza sp.)植物根的提取物，所述提取物基本上不含甘草酸，其中该提取物的主要组分为异戊二烯化类黄酮并且所述根由超临界CO2提取法来进行提取。
在另一个实施方案中，所述提取物是来自甘草且提取物的主要组分为甘草西定和甘草异黄烷A。
在再一实施方案中，所述提取物来自光果甘草(Glycyrrhiza glabra)，并且该提取物的主要组分为光甘草定。
例如，在一个实施方案中，本发明的除臭剂包含与抗氧化剂化合物结合的本发明提取物，所述提取物优选与以下成分结合：生育酚及其衍生物、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、异抗坏血酸、没食子酸丙酯、异抗坏血酸钠、叔丁基氢醌(TBHQ)和迷迭香提取物，更优选与抗坏血酸及其盐结合。此外，所述除臭剂可包含一些不饱和羟基羧酸的金属盐，优选蓖麻油酸锌。在优选的实施方案中，本发明提取物的浓度为约0.01％-5.0％重量，在更优选的实施方案中，该提取物的浓度为约0.05％-2.0％重量。当甘草西定和甘草异黄烷A被用作本发明除臭剂中的抗微生物剂时，它们可单独使用或以混合物的形式使用，其总浓度为约0.01％重量-1.0％重量、约0.05％重量-0.5％重量或约0.1％重量-0.2％重量。
对于爽身水、护肤膏、肥皂、头发护理制品、防晒剂、局部抗炎剂、脱毛组合物、剃须制品、婴儿护理制品而言，本发明提取物的浓度为约0.01-2％、更优选0.1-1％。当甘草西定和甘草异黄烷A在本发明的身体护理制品中用作抗微生物剂时，它们可单独使用或以混合物的形式使用，其总浓度为约0.01％重量-1.0％重量、约0.05％重量-0.5％重量或约0.1％重量-0.2％重量。
实验
提取方法：用新型非显而易见的超临界CO2提取法来提取用于下述实施例和制备本发明洁齿剂的甘草提取物。在一个实施方案中，本发明提取方法如下。将乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的根切断、磨碎并粉末化以制成原料。将该原料装入提取室(提取器)中。向提取室中加入液态CO2。将取自工作罐/储存罐的液态CO2冷却，并在300巴、50℃和加入5％的96％乙醇下将其泵入提取室。接着通过蒸发器计量CO2提取物并使其流入分离罐。
在提取器中设定的超临界条件下，CO2具有用于亲脂性组分的溶剂性质，而在分离器中的条件(60巴，30℃)下，气相中的CO2没有溶剂能力。因此，在分离罐中，提取物被沉淀而气体得以再生。接着，通过使所述CO2流经冷凝器而使其液化，并再循环到工作罐中。
本发明超临界CO2甘草提取物与现有技术方法制成的提取物的比较。
液体培养基微稀释法测定最小抑菌浓度：对于厌氧菌，向96孔板中试验系列的第一孔加入190μL含0.075％半胱氨酸的无菌预还原的Wilkins Chalgren(WC)厌氧液体培养基，接着向另外四个试验孔中各加入100μL所述厌氧液体培养基。将10μL过滤除菌的CO2甘草提取物储备液(以40mg/mL在乙醇中制备)加入系列的第一孔中。将第一孔中的内容物充分混合，并将系列中剩下的四个孔进行系列稀释(1∶1)；从系列的最后一个孔中取走100μL。使牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanas gingivalis)ATCC 3327或中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)ATCC 25611的悬浮液稀释至大约每毫升1x106cfu(菌落形成单位)，以100μL的量加入各试验孔中。使用适合的促生长对照和无菌对照。将孔板在37℃厌氧条件下孵育，直到观察到生长对照孔浑浊。将MIC(最小抑菌浓度)记录为用肉眼观察到的抑制试验菌生长的最低浓度。使用胰胨豆胨培养液(Tryptic Soy Broth，TSB)作为试验培养基并使孔板在37℃于5％CO2中孵育，以类似的方式对变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175进行试验。使用胰胨豆胨培养液(TSB)作为试验培养基并将孔板在37℃下孵育，来对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538进行试验。用胰胨豆胨培养液(TSB)作为试验培养基并在室温(25℃)下孵育，来对黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 16404进行试验，。
结果记录为来自对每种细菌进行的三个重复实验的模式值(mode value)。中间普雷沃氏菌(P.intermedia)和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)为涉及牙周炎的革兰氏阴性细菌。变异链球菌(Streptococcus mutans)参与龋齿的形成。在最低浓度试的验提取物下，两种超临界提取物都能抑制上述三种病原菌的生长。本发明超临界甘草提取物(使用或不使用乙醇作为改性剂)均能够以12.5μg/ml的浓度抑制中间普雷沃氏菌(P.intermedia)。使用乙醇作为改性剂的提取物能够以与氯己定(chlorhexidine)相同的水平抑制牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的生长。本发明超临界甘草提取物(含乙醇)能够以12.5μg/ml的浓度抑制变异链球菌(S.mutans)(作为致龋菌)的生长。本发明超临界甘草提取物(不含乙醇)仅测定为31.25μg/ml。参见表1A。表1A.针对口腔细菌的抗菌活性 CO2甘草提 取物(μg/ml) CO2-乙醇甘草提取物 (μg/ml) 氯己定 中间普雷沃氏菌 (Prevotella intermedia) 12.5 12.5 3.125 牙龈卟啉单胞菌 12.5 6.25 6.25 (Porphyromanas gingivalis) 变异链球菌 (Streptococcus mutans) ＜31.25* 12.5 1.56*最低试验浓度为31.25μg/ml
甘草西定和甘草异黄烷A的抗菌活性
甘草西定和甘草异黄烷A是本发明超临界CO2提取物中的两种组分。如表1B所示，它们都以3.125μg/ml显示出对变异链球菌(Streptococcus mutans)(龋齿的主要病原菌)的抗微生物活性，对于甘草西定和甘草异黄烷A而言，其分别以约0.78μg/ml和约1.56μg/ml表现出对中间普雷沃氏菌(Prevotells intermedia)的抗微生物活性，分别以0.39μg/ml和1.56μg/ml表现出对抗牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanas gingivalis)的抗微生物活性。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanas gingivalis)和普雷沃氏菌(Prevotella sp)涉及牙周炎。这些浓度均为最小抑制浓度(MIC)。这两种组分还显示出作为抗炎剂的良好活性。MIC被本领域技术人员定义为：在培养过夜后，抑制可观察到的微生物生长的抗微生物剂的最低浓度。最小抑制浓度被本领域技术人员用于监测新型抗微生物剂的活性。此处氯己定用作阳性对照，其一般作为抗菌剂存在于例如漱口剂中。
液体培养基微稀释法测定最小抑制浓度如下进行。将10μL过滤除菌的纯化合物储备液(甘草西定或甘草异黄烷A，以1mg/mL在乙醇中制备)加入系列的第一孔中。将第一孔中的内容物充分混合，并对系列中剩下的七个孔进行系列稀释(1∶1)；从系列的最后一个孔中取走100μL。将牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanas gingivalis)ATCC 33277或中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)ATCC 25611的悬浮液稀释至大约每毫升1x106 cfu(菌落形成单位)，以100μL的量将其加入各试验孔中。使用适合的促生长对照和无菌对照。将孔板在37℃厌氧条件下孵育，直到观察到生长对照孔浑浊。将MIC(最小抑菌浓度)记录为用肉眼观察到的抑制试验菌生长的最低浓度。使用胰胨豆胨培养液(TSB)作为试验培养基并使孔板在37℃于5％CO2中孵育，以类似的方式对变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175进行试验。
结果记录为来自对每种细菌进行的三个重复实验的模式值(mode value)。中间普雷沃氏菌(P.intermedia)和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)为涉及牙周炎的革兰氏阴性细菌。变异链球菌(Streptococcus mutans)参与龋齿的形成。两种化合物都能抑制上述三种病原菌的生长。表1B 提取物 (μg/ml) 甘草西定 (μg/ml) 甘草异黄烷A (μg/ml) 氯己定 (μg/ml) 变异链球菌 (S.mutans) 12.50 3.125 3.125 1.56 牙龈卟啉单胞菌 (P.gingivalis) 6.25 0.39 0.78 6.25 中间普雷沃氏菌 (P.intermedia) 6.25 0.78 1.56 3.125
生物膜的形成和活力：取牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)(ATCC 33277)在补充有氯高铁血红素和维生素K(THB-HK)的Todd-Hewitt液体培养基中的24小时培养物，将其稀释在新鲜液体培养基中，以获得在655nm(OD655)处0.07的光密度。向包含100μL含无菌植物提取物的THB-HK系列稀释液(0至500μg/ml)的96孔组织培养板孔中加入样品(100μL)。也接种不含提取物的对照孔。在37℃厌氧条件下孵育48小时后，使用26G针经吸走使用过的培养基和浮游的细菌，并用蒸馏水洗涤各孔三遍。用0.4％结晶紫(100μL)染色牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)生物膜15分钟。用蒸馏水洗涤各孔四遍，以除去未结合的结晶紫染料，在37℃下干燥2小时。在向各孔加入100μL 95％(v/v)乙醇后，将孔板振荡10分钟，以使染色剂从生物膜上释放，记录550nm处的吸光度(A550)。进行三个重复测定，计算两个独立实验的数值±标准差。参见表2。
使用3′-{1-[(苯基氨基)-羰基]-3，4-四唑鎓}-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸四唑鎓钠水合物(XTT)还原测定法，来研究植物分离物对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)细胞活力的作用。简单地说，以1mg/mL将XTT溶解在PBS中，以1mM将甲萘醌制备于丙酮中。XTT/甲萘醌试剂包含12.5份XTT/1份甲萘醌。如上制备牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的48小时生物膜，用植物分离物(0-250μg/ml)处理2小时(厌氧条件，37℃)，然后加入25μL XTT/甲萘醌。于37℃下1小时后，使用微板读数器读出490nm处的吸光度(A490)。本发明的甘草提取物能够抑制牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的生长，还能抑制牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的形成。此外，牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)不能够粘附(抗粘附)。当在生物膜形成后施用甘草提取物时，没有生物膜解吸附但生物膜的活力减少，这意味着生物膜并没有被除去，而是形成生物膜的细菌死亡。参见表2。表2：CO2甘草提取物对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的生物膜形成、粘附性质和活力的作用。 抑制牙龈卟啉单 胞菌(P. gingivalis)生物 膜(抗粘附) (μg/ml) 使牙龈卟啉单胞 菌(P.gingivalis) 生物膜解吸 (μg/ml) 牙龈卟啉单胞菌 (P.gingivalis)生 长(μg/ml) 对生物膜中牙龈 卟啉单胞菌(P. gingivalis)的杀 菌作用(细胞活 力)(μg/ml) CO2甘草提取物 4.2 - 4.2 8
LPS制备物：将Aggregatibacter actinomycetemcomitansATCC 29522(同义词伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans))和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)ATCC 33277培养于其适合的培养基。通过我们实验室中常规使用的方法，从这些菌株中分离LPS。
对巨噬细胞的处理：于37℃下、5％CO2气氛中，将U937细胞(ATCC CRL-1593.2)(人单核母细胞白血病细胞系)培养在补充有10％FBS和100μg/ml的青霉素-链霉素(RPMI-FBS)的RPMI-1640中。将所述单核细胞(2x105个细胞/毫升)在含有10ng/ml乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)的RPMI-10％FBS中孵育48小时，以诱导其分化成粘附性巨噬细胞样细胞。在PMA处理之后，用新鲜培养基取代上述培养基，将分化的细胞再孵育24小时，随后使用。将粘附性巨噬细胞悬浮在RPMI-10％FBS中，离心(200xg)8分钟。将他们洗涤，以1x106个细胞/毫升的密度悬浮于RPMI-10％FBS中，并于37℃下在5％CO2气氛中接种到6孔板中(2ml含2x106个细胞/孔)。
用至多250μg/ml浓度的甘草提取物处理巨噬细胞，于37℃下、5％CO2中孵育2小时，随后用最终浓度为1μg/ml的LPS进行刺激。在孵育(37℃于5％CO2中)24小时之后，收集培养基上清液，储存在-20℃中待用。将细胞孵育在含或不含甘草提取物的培养基中，但不用LPS刺激，以此作为对照。
细胞因子水平的测定：根据制造商的方案，使用市售的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，U.S.A.)来定量在无细胞培养上清液中的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。在微板读数器中用550nm的波长校正设定读出450nm处的吸光度。
统计分析：进行双向方差分析以比较不同条件的平均值。在0.05水平(P值)下差异被认为是显著的。
抗炎作用。本发明提取物在10μg/ml的浓度下造成对以下过程的显著体外抑制作用：巨噬细胞受Aggregatibacteractinomycetemcomitans的LPS刺激产生白介素1β、白介素8和肿瘤坏死因子α；在5μg/ml的浓度下造成对以下过程的显著体外抑制作用：巨噬细胞受Aggregatibacter actinomycetemcomitans的LPS刺激产产生白介素6，所述巨噬细胞由U937细胞(人单核母细胞白血病细胞系)形成。这些结果在两个独立实验中得以证实。
甘草提取物在5-10μg/ml的浓度范围内造成对以下过程的显著体外抑制作用：巨噬细胞受牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的LPS刺激产生白介素6、白介素8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。这些结果在两个独立实验中得以证实。
超临界CO2提取物的HPLC分析
通过高压液相色谱法(HPLC)，对本发明提取物的样品和由现有技术方法制备的提取物样品进行分析。该方法中使用的说明如下：
HPLC是在Zorbax Eclipse XDB C-18(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)250x4.6mm内径，5μm和Zorbax C-18 GuardColumn：(产品目录号HP 990967-902和HP 820950-925)上进行。流动相：MeCN(0.05％TFA)-H2O(0.05％TFA)0分钟 45 553分钟 45 5525分钟 100 025.1分钟 45 55预处理：至少20分钟。流速：1.0毫升/分钟柱温：30℃探测器：280nm(bw 16，参考450nm，bw 100)运行时间：25分钟滞后时间(post time)：5分钟
结果显示在图1中。第一个色谱图(A)显示了热水提取物，它仅包含亲水性化合物。在4.5分钟后洗脱峰是甘草酸。根据UV光谱和保留时间，仅甘草酸存在于热水提取物中。第二个色谱图(B)为100％乙醇提取物，色谱图(C)为乙酸乙酯提取物，两者在组成上非常相近，例外的是B包含更多亲水性化合物(在0-4分钟之间洗脱)。CO2提取物的主要组分为甘草西定(1，在16.5分钟后洗脱)和甘草异黄烷A(2，在21分钟后洗脱)，以及未鉴定的类黄酮峰3(在18分钟左右)。使用乙醇(EtOH)作为改性剂的超临界提取物比没用改性剂的超临界提取物包含更多亲水性化合物，并且包含最大量的甘草西定和甘草异黄烷A。此外，从环境角度考虑，CO2提取物仅使用少量％的乙醇(5-10％)便可实现亲水性和亲脂性化合物的良好平衡。在两种超临界提取物中，所述甘草西定和甘草异黄烷A为高度占优的。
根据以下来从本发明超临界CO2提取物中分离甘草西定和甘草异黄烷A。对用量约433毫克的CO2/EtOH甘草提取物进行中压液相色谱(MPLC)，所用条件为Büchi C-600MPLC系统(BüchiAnalytical，Flawil，Switzerland)，使用基于ODS(Phenomenex Luna C-18(2)，100)的固定相，使用乙腈-水(45∶55)作为溶剂且流速为5mL/min。包含甘草西定(32.8mg)和甘草异黄烷A(21.5mg)的分离物3由分离物7中获得。甘草西定的纯度为约89％，甘草异黄烷A的纯度为约91％。在本发明的上下文中，对于本发明的甘草西定和甘草异黄烷A而言，术语“分离的”包括以下纯度：约50％或更高，约60％或更高，约70重量％或更高，约80重量％或更高，约90重量％或更高，约95重量％或更高或约99重量％或更高。