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新梭菌的分离和表征
发明领域
本发明通常涉及能从废气制得生物燃料的细菌。特别地，本发明提供新的梭菌(具有ATCC保藏号BAA-622和/或PTA-7826的鉴别特征的Clostridium ragsdalei)和利用该梭菌由CO合成乙醇及其它有用产物的方法。
发明背景
直到二十世纪70年代石油危机，美国政府才开始资助更多行动来寻找开发可再生能源的方法，以缓解该国对石油进口的依赖(Klass，1998)。也是直到那时，该政府才重新关注用于气油调合的、基于生物的溶剂制品。备受关注之一并且最近甚至更为突出的是生物乙醇(来自生物质的乙醇)。
当前，制备生物乙醇的主要方法是通过直接发酵，其占到美国乙醇生产量的90％(Licht，2001)。直接发酵是解糖微生物比如酵母或细菌将糖类转化为乙醇的过程。这些糖类可为单糖(如葡萄糖)或多糖(如淀粉、纤维素和半纤维素)。玉米淀粉是当今乙醇生产工厂中使用的主要底物。除玉米淀粉之外，其它木质纤维生物质(如草、小树、废纸和锯末屑)也用作这一过程的底物研究。木质纤维素由纤维素、半纤维素、果胶和木质素组成。木质纤维生物质直接发酵的难点在于，在供微生物利用之前，必须增加预处理过程，以将该生物质降解为单个组分。这增加了在原料、工厂设计、废气管理等方面的更多支出。
为了尝试使可用于燃料乙醇制备的资源得到最大产出，正在研究备选方法。这些备选方法之一就是间接发酵。间接发酵是指热解木质纤维生物质(燃烧至生成气体)，并由细菌将该生成气体转化为乙醇的过程。所述生成气体通常定义为合成气。合成气(CO-H₂-CO₂)为热解生物质或煤炭的产物，从过去到现在都被普遍认可其在将生物质间接发酵成燃料乙醇中的潜在作用(Zeikus，1980，Bredwell等，1980)。
厌氧微生物例如产乙酸菌，提供了将合成气转化为有用产物、特别是例如乙醇的液体生物燃料的生物途径。这种由细菌催化的合成气的转化比起使用化学方法所能实现的，具有更高的专一性、更高产量和更低能耗(Vega等，1990；Phillips等，1994)。业已鉴定出几种能由废气和其它底物制备生物燃料的微生物：
三株产乙酸菌(Drake，1994)已描述用于由合成气制备液态燃料：食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)(Grethlein等，1990；Jain等，1994b)、Clostridium autoethanogenum(Abrini等，1994)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)(Arora等，1995；Barik等，1988；Barik等.1990和Tanner等，1993)。当然，Clostridium autoethanogenum和扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)将CO转化为乙醇是已知的。
Gaddy等的美国专利5,173,429公开了扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)ATCC编号为49587，一种将合成气中的CO与H₂O和/或CO₂与H₂制备成乙醇和乙酸盐的厌氧微生物。
Jain等的美国专利5,192,673公开了Clostridium acetobytylicum的突变株和用该菌株制备丁醇的方法。
Gaddy等的美国专利5,593,886中公开了ATCC编号为55380的扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)。该微生物可在厌氧条件下利用废气(如碳黑废气)作为底物，制备醋酸盐和乙醇。
Gaddy等的美国专利5,807,722公开了利用厌氧菌，如ATCC编号为55380的扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，将废气转化成例如有机酸和乙醇的有用产物的方法和装置。
Gaddy等的美国专利6,136,577公开了利用厌氧菌，如ATCC编号为55988和55989的扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，将废气转化为例如有机酸和醇类(特别是乙醇)的有用产物的方法和装置。
Gaddy等的美国专利6,136,577公开了利用扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)的厌氧菌株，将废气转化为例如有机酸和醇类(特别是乙酸)的有用产物的方法和装置。
Gaddy等的美国专利6,753,170公开了制备乙酸的厌氧微生物发酵方法。
其它产乙酸菌菌株也被描述用作从合成气制备液体燃料，例如食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)(Grethlein等，1990，Appl.Biochem.Biotech.24/24：875-884)和Clostridium autoethanogenum(Abrini等，1994，Arch.Microbiol.161：345-351)。
仍不断需要去发现和开发经发酵能生产有用产物例如生物燃料的其它微生物。尤其是提供生长能力强、相对易于培养和保藏且提供高产量的目标产物如生物燃料的微生物将会有利的。
发明简述
本发明提供新的生物纯(biologically pure)的厌氧菌(Clostridiumragsdalei，于2002年10月保藏于Manassas VA的美国典型培养物保藏中心，命名为BAA-622并在2006年6月14日又命名为PTA-7826，也称为“P11”)，其能够从相对普通的底物中产生高产量有价值的有机液体。具体而言，该微生物可通过发酵CO产生乙醇和乙酸。CO的一个普遍来源是合成气，煤的气化的气态副产物。因此该微生物可将不利用则会成为废料的物质转化成有价值产物，而其中有些就是生物燃料。合成气再到CO还可以由易于获得的低成本农业原材料通过高温分解制得，这提供了兼顾经济和环境因素的制备能源的方法。因此本发明细菌经由气化/发酵途径参与生物质至生物燃料的间接转化。
Clostridium ragsdalei的培养物非常稳定，可以于室温或38℃培养箱存放一年以上同时维持活性。
本发明的目标是提供微生物Clostridium ragsdalei的生物纯培养物(biologically pure culture)。该微生物具有ATCC编号为BAA-622和/或PTA-7826的所有鉴定特征。另外，本发明提供了用于制备乙醇的组合物。该组合物包含1)CO来源；和2)Clostridium ragsdalei。在本发明的一个实施方案中，该CO来源为合成气。
在另一个实施方案中，该发明提供了制备乙醇的方法。该方法包括在允许所述Clostridium ragsdalei将CO转化为乙醇的条件下使CO来源和Clostridium ragsdalei结合的步骤。
本发明进一步地提供了制备乙醇的系统，该系统包括：1)容器，在该容器中CO来源与Clostridium ragsdalei结合；和2)控制器，其控制所述容器内的条件，允许Clostridium ragsdalei将所述CO转化为乙醇。在本发明的一个实施方案中，所述系统还包括：1)第二容器，用于制备合成气；和2)输送器(transport)，用于将该合成气输送至所述容器，其中该合成气作为CO来源。这样的系统在图5中说明，其中显示了容器100和控制器101，和任选的第二容器200和输送器201。

附图简述
图1负染细胞菌株P11.Bar，1μm的透射电子显微图。
图2菌株P11以果糖作底物时的最佳pH的确定。
图3菌株P11以果糖作底物时的最佳温度的确定。
图4基于16S rDNA基因序列相似性并利用邻接法构建的系统树，表明C.ragsdalei ATCC BAA-622和/或PTA-7826和梭菌(Clostridium)属的代表性菌种的位置。其16S rRNA序列基因的GenBank登录号在该菌株编号后给出。
图5利用P11由合成气制成乙醇的系统的简图。
本发明优选实施方案详述
本发明基于新的产乙酸菌的发现，所述产乙酸菌在厌氧条件下可从CO和其它易于利用底物制备高产的有价值产物。具体而言，该微生物通过发酵CO产生有价值的液态产物，如乙醇、丁醇和乙酸盐，其中乙醇为主要产物。对于“发酵”，我们意指所述底物同时作为电子源和电子穴的生理过程(所述底物的一部分氧化和一部分还原)，可以用于制备比如醇类和酸类的产物。因此，该有机物能将不利用则会成为废气的气体转化为有用的产物，例如生物燃料。本发明的厌氧微生物是新的梭菌属，其显示出ATCC保藏号BAA-622和/或PTA-7826所代表的纯培养物的特征，在本文中称为“P11”。
在以下实施例部分，本文业已对P11的形态学及生化性质作出了分析和描述。虽然P11的某些性质与其它梭菌相似，但P11具有其独特的特征，这表明它是该属的新种。P11已命名为Clostridiumragsdalei，且它被认为代表该种。
本发明生物纯培养物中的细菌具有在厌氧条件下由底物CO+H₂O和/或H₂+CO₂产生乙醇的能力，依照以下反应：
乙醇的合成
6CO+3H₂O-＞C₂H₅OH+4CO₂(1)
6H₂+2CO₂-＞C₂H₅OH+3H₂O(2)
关于这些底物的来源，本领域的技术人员应能认识到存在多种CO、CO₂和H₂来源。例如，所述底物的优选来源是“废”气，例如合成气、炼油厂废气、由酵母和某些梭菌发酵产生的气体(含有一些H₂)、气化纤维质原料、煤的气化物等。或者，这样的气态底物并非必须作为其它工艺的副产物产生，还可为了在本发明的利用P11的发酵反应中使用而专门制备。本领域的技术人员将认识到，任何来源的底物气体可用于本发明的实践中，只要有可能在适合该微生物进行发酵反应的条件下向该细菌提供足够量的底物气体。方程式(1)所表示的反应中的H₂O来源通常为培养该微生物的水性培养基。
在本发明的优选实施方案中，CO、CO₂和H₂的来源是合成气。用作底物的合成气，例如，可作为煤气化的气态副产物获得。因此该细菌将不利用则会成为废料的物质转化为有价值的生物燃料。或者，合成气可通过气化易于获得的、特别用于细菌发酵目的的低成本农业原料来制备，从而为生物质间接发酵成燃料乙醇提供了途径。有很多可转化为合成气的原料的实例，因大部分类型的植物均可用于此目的。优选的原材料包括但不限于：多年生牧草如柳枝稷、作物残茬如玉米秸杆、加工废料如锯屑等。本领域的技术人员熟悉从这些原材料中制备合成气。一般而言，合成气主要通过热解、部分氧化和蒸汽转化在气化器中由干燥生物质来制备，其主要产物是CO、H₂和CO₂。(术语“气化”和“热解”指的是相似方法。两种方法均限制所述生物质所接触的氧气量。气化允许少量氧气(这也可称为“部分氧化”，而热解允许更多氧气。术语“气化”有时用作包括气化和高温分解两者。)典型地，部分气体产物再循环，以使产物量最优化且使生成残留焦油最小化。可使用石灰和/或白云石来使合成气中多余的焦油和焦炭裂解成CO。这些方法已详细描述于例如，Reed，1981.(Reed，T.B.，1981，生物质气化：原理和技术(Biomass gasification：principle and technology)，NovesData Corporation，Park Ridge，NJ.)
此外，可利用底物气体来源的组合。例如，CO、CO₂和H₂的主要来源可为合成气，但这可用其它来源(比如从各种商业来源)的气体作补充。例如，上述方程式(1)反应生成4分子的CO₂，而方程式(2)反应利用6分子H₂，但仅2分子CO₂。除非H₂充足，否则可能会产生CO₂积累。然而，向该培养基补充额外的H₂，则会导致CO₂利用率的提高并随之产出更多的乙醇。
由本发明细菌通过发酵CO所产生的主要产物是乙醇。然而，也可产生乙酸盐。乙酸盐的产生很有可能通过以下反应进行：
乙酸盐的合成
4CO+2H₂O-＞CH₃COOH+2CO₂(3)
4H₂+2CO₂-＞CH₃COOH+2H₂O(4)
本发明的生物体必须在厌氧条件下培养。对于“厌氧条件”，我们意指该培养基中不存在溶解氧。
一般而言，用于培养本发明产乙酸菌的培养基是液体培养基，例如ATCC培养基1754(由R.S.Tanner开发)。然而，本领域技术人员将认识到，可利用其它培养基，比如在H2∶CO₂或CO∶CO₂气氛中初始pH为6的ATCC培养基1045。另外，可根据几个目的中的任何一个添加不同的培养基补充物，比如缓冲剂、金属、维生素、盐类等。具体而言，本领域技术人员应对例如营养调控和改良的技术非常熟悉，这些技术导致目标产物产量增加或最优化，例如，培养的微生物在“非生长”条件下(即不适宜细菌生长和复制的条件)可导致发酵产物产量更高。这有可能是因为在非生长条件下细菌资源不专注于复制，所以在其它合成活动上不受限制。非生长条件的实例包括，例如，使培养物维持在非最适温度或pH、限制营养和碳源等。通常，非生长条件应用于该培养物中细菌达到所需密度之后。另外，有可能通过优化培养基以促进一种产物的产量超过其它产物，比如促进乙醇的产量超过乙酸盐。例如，增加相比标准培养基的10倍浓度的铁会使产出的乙醇浓度加倍，同时乙酸的产量会降低。本领域的技术人员熟悉用于优化所需产物产量的方法，且本发明有意包括所有这些利用P11细菌的优化方法。作出例如以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)开展的引用，其为这样的技术提供指导(见例如Bahl等，1986，ApplEnviron.Microbiol.52：169-172；和Jain等的美国专利5,192,673；和Gaddy的美国专利5,173,429，这两者的全部内容通过引用结合到本文中)。
特别地，可利用Balch技术培养Clostridium ragsdalei(Balch和Wolfe，1976，Appl.Environ.Microbiol.32：781-791；Balch等，1979，Microbiol.Rev.43：260-296)，这在以下综述中有描述：Tanner，1997，Manual Environ.Microbiol.，第52-60页，ASM Press；Tanner，2002，Manual Environ.Microbiol.第2版，第62-70页；Wiegel等，2005，AnIntroduction to the Family Clostridiaceae，The Prokaryotes，Release 3.20；Tanner，2006，Manual Environ.Microbiol.第3版，ASM Press。这需要用于制备培养基材料的厌氧培养室和气体交换复合管的协助，以建立在密封试管或容器中进行培养所需的气相条件。关于培养产溶剂的产乙酸菌的更具体内容如酸性pH的运用参见Tanner等.，1993，Int.J.Syst.Bacteriol.43：232-236和Liou等，2005，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.55：2085-2091。提高乙醇产量的方法包括：使每种培养基组分最优化(例如铵盐、磷酸盐和微量金属)、控制培养pH、诱变和克隆筛选等。
本发明生物体的CO发酵可在本领域技术人员已知的、经过或不经过另外修改的几种类型装置中任何一种中进行，或者在目前正在开发中的其它样式的发酵设备中进行。实例包括但不限于：泡罩塔反应器、两段式生物反应器(two stage bioreactor)、滴流床反应器、膜反应器、含固定化细胞填充床反应器等。这样的装置的主要需要包括：维持无菌、厌氧条件、和适宜条件或温度、压力和pH；以及向该培养物提供足够量的底物；该产物可以易于回收等。所述反应器可为，例如，传统搅拌罐反应器、具有固定化或悬浮细胞塔式发酵罐、连续流动反应器、高压反应器、细胞再循环的悬浮细胞反应器及如上所列举的其它实例等。此外，反应器可排列成串联和/或并联的包含任何上述反应器的反应器系统。例如，多级反应器可用于在一组条件下使细胞生长，而在另一组条件下使生长最小化且产生乙醇(或其它产物)。
通常，允许发酵继续进行，直至所产生的产物达到所需水平，例如，直至培养基中乙醇达到所需量。典型地，乙醇的这个水平范围在至少约1克/升培养基-约50克/升，优选水平为至少约30克/升(或更高)。然而，还考虑优化的细胞或细胞培养系统产生约1-10、或约10-20、或约20-30、或约30-40、或约40-50克/升。在乙醇浓度为至少60g/L中，P11仍保持存活且可生长。或者，当到达某一产率时，例如当所需产物的产率因为以下原因下降时可停止生产：由于比如细菌废料堆积、可用底物的减少、产物的反馈抑制和活菌数量的减少或本领域技术人员已知的任何其它几种原因。另外，现存连续培养技术允许持续补充新鲜培养基，并同时移除包括其中的任何液态产物在内的已用培养基(即恒化器模式)。
由本发明细菌产生的产物可通过本领域技术人员已知的几种方法中的任意一种从培养物中移出并纯化。例如，乙醇可以经移出并作进一步处理，如通过溶剂萃取；蒸馏成共沸物随后进行共沸蒸馏；分子筛脱水；渗透蒸发；或流过沸石管(zeolite tube)。本领域技术人员将认识到，工业上用于蒸馏后乙醇脱水的两种主要技术是共沸蒸馏和分子筛脱水。(参见例如Kohl，S.″Ethanol 101-7：Dehydration″EthanolToday，March 2004：40-41)。另外，根据产物的数目，可能需要运用几种分离技术，以得到几种纯产物。同样，可用类似方法将乙酸盐移出并作进一步处理。
在本发明的一些实施方案中，P11作为纯培养物来培养以生产乙醇(或其它目标产物)。然而，在其它实施方案中，P11可与其它生物体一起培养。
实施例
实施例1
在致力于发现能有效代谢合成气并产乙醇的新的微生物催化剂过程中，分离出嗜中温、利用CO的新的产乙酸菌Clostridiumragsdalei，并随后对其作出描述。对该新生物体的表征部分通过与已知扬氏梭菌(Clostridium ljundahlii)菌株PETC作比较来完成。
材料与方法
生物体。扬氏梭菌(Clostridium ljundahlii)菌株PETC获自Dr.RalphS.Tanner保藏的果糖储用培养物并用作参考的对照菌株。通过先前描述的方法(Bryant，1972)在CO∶N₂∶CO₂(75∶15∶10)的气氛、初始pH为6.0下，从接种有来自Oklahoma大学Duck Pond的淡水沉积物的厌氧富集(anaerobic enrichment)中得到菌株P11。此处所描述的氧化CO的梭菌命名为Clostridium ragsdalei。这种细菌名为菌株P11，且最初以菌株ATCC BAA-622保藏于美国典型培养物保藏中心，随后再次保藏为ATCC PTA-7826。
培养基。本研究中的所用培养基运用Balch和Wolfe(1976)描述的严格厌氧技术来制备，且根据Tanner(2002)所描述，包含无机盐、微量金属和维生素溶液，并补充酵母提取物(1g/L，Difco)(表1-4)。
表1.无机盐贮存液^a

 组分 g/升 NaCl 80 NH₄Cl 100 KCl 10 KH₂PO₄ 10 MgSO₄·7H₂O 20 CaCl₂·2H₂O 4
a.室温贮存。
表2.微量金属溶液^a
 组分 g/升 亚硝基乙酸(Nitroloacetic acid) 用KOH调整pH至6 2.0 MnSO₄·H₂O 1.0 Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O 0.8 CoCl₂·6H₂O 0.2 ZnSO₄·7H₂O 0.2 CuCl₂·2H₂O 0.02 NiCl₂·6H₂O 0.02 Na₂MoO₄·2H₂O 0.02 Na₂SeO₄ 0.02
 Na₂WO₄ 0.02
a.4℃贮存。
表3.维生素溶液^a
组分g/升吡哆醇·HCl10硫胺素·HCl5核黄素5泛酸钙5硫辛酸5对氨基苯甲酸5烟酸5维生素B125MESA^b5生物素2叶酸2
a.4℃避光贮存。
b.巯基乙磺酸。
表4.菌株P11的培养基的描述^a
组分量为每1000mL蒸馏H₂O无机盐溶液25mL
微量金属溶液10mL维生素溶液10mL酵母提取物1.0gMES^b10g还原剂2.0mL
a.pH 6.1-6.3
b.2-[N-吗啉代]乙磺酸。
除缺少NaHCO₃和初始为pH 6.3以外，如先前所描述的(Tanner等，1993)在有机底物和气态底物上进行培养。用刃天青(1mg/L)作为氧化还原指示剂。将纯化琼脂以2％的浓度加入到该培养基中用以描述菌落形态(表5)。不耐热的底物进行过滤灭菌(非高压灭菌)，并在接种前从无菌贮存液中加至终浓度为5g/L。在含有果糖作为底物的培养基中确定最适温度和pH(初始pH)。为了确定其最适pH，培养基用HOMOPIPES(高哌嗪-N，N′-二-2-[乙磺酸](Research Organics，Cleveland，OH)、MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)或TES(N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)以(1.0g/L)作缓冲。使用0.1ml(约2％)果糖生长细胞接种物作起始培养。这些实验中所用的全部培养基组分，若无特别说明，则从Sigma购得(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
表5.用于描述菌落形态的营养琼脂
组分量为每100mL蒸馏H2O无机盐溶液2.5mL微量金属溶液1.0mL维生素溶液1.0mL
  酵母提取物  0.1g  MES^b  1.0g  纯化琼脂(w/v)  2％  还原剂  0.2mL
a.pH 6.1-6.3
b.巯基乙磺酸。
生化反应。通过Smibert和Krieg(1994)描述的方法对七叶灵、淀粉水解、明胶酶生产和吲哚生产进行生化测定。利用CHEMetrics试剂盒和设定在520nm的Spectronic 2OD测定硝酸盐还原作用。将补充有果糖培养基中的、生长到指数期中后期的细胞以用于所述测定。发酵平衡。通过在果糖上的生长情况确定发酵平衡。通过使用苯酚-硫酸糖类测定法(Dubois等，1956)测量果糖。通过在配备填有80/120Carbopak B-DA/4％carbowax resin 20M的2m钢柱的Varian 3400上装有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱仪(GC)(Supelco，Bellfonte，PA)，对乙酸盐和乙醇同时进行测定。所述柱、进样器和检测器的温度分别为155、200和200℃。载气为氦气，流速设定为30ml min^-1。CO₂由装有热导检测器(TCD)(Varian，Sugar Land，TX)和PorapakSuper Q 2m钢柱(Alltech，Deerfield，MI)的气相色谱仪测定。柱温设定为60℃，流速为15ml min^-1，载气为氦气。
电子相差显微镜术。将生长于作为底物的0.5％酵母提取物上的指数生长期细胞用于透射电子显微镜检查。使细胞分布在碳包被的Formvar网格上，用1％戊二醛固定，0.5％磷钨酸(phosphotunsgate)(pH7.0)染色。使用JEOL JEM 2000FX TEM检查细胞并拍照。OlympusCH-2相差显微镜用于观察细胞。
分析方法。在铝制密封管(Balch和Wolfe，1976)中于600nm通过分光光度(Spectronic 2OD；Milton Roy)测量生长情况。为了证明菌株P11能利用底物，生长必须发生在重复管中的连续转移(consecutivetransfer)后。对于所述底物苹果酸盐，利用情况通过以下条件进行分析：装有设定在214nm处的UV检测器的HPLC(“高效液相色谱仪”)，使用Alltech Prevail有机酸色谱柱(4.6x150mm，5μm；A1ltech，Deerfield，MI)，其中流动相为25mM KH₂PO₄，pH 2.5和10％(体积比)甲醇。
用于分析G+C(鸟嘌呤加胞嘧啶)的摩尔％的DNA，依照Marmur步骤(Johnson，1994)的改良法来分离，包括用溶菌酶、蛋白酶K和RNA酶进行处理。用溶菌酶处理至少6小时发现是最有效的。G+C含量通过HPLC进行测定(Mesbah等，1989)。使用Alltech，Prevail C18反相柱(4.6x250mm，5μm颗粒尺寸；Alltech，Deerfield，DL)，流动相为25mMKH₂PO₄，pH 2.5和4％(体积比)乙腈，UV检测器设定在254nm。
BOX-PCR基因指纹分析。利用由Invitrogen(Carlsbad，CA)购得的BOXA1R引物和来自Versalovic等(1994)的实验方案进行重复DNAPCR指纹分析。PCR混合物包含：2.5μl 10X缓冲液B(500mM KCl和100mM Tris·HCl，Fisher Scientific)、2μl MgCl₂·6H₂O(25mM，FisherScientific)、0.25μl Taq聚合酶(Fisher Scientific)、0.5μl每种脱氧核苷三磷酸(10mM，Promega，Madison，WI)、1μl引物和样品DNA，终体积为25μl。所述PCR反应在Robocycler Gradient 40Temperature Cycler(Stratagene，Cedar Creek，TX)中运行，采用以下方案：起始变性步骤(94℃，四分钟，一个循环)，30个反应循环(94℃一分钟，50℃一分钟，72℃八分钟)，和最终延伸步骤(72℃八分钟)。使PCR产物(10μl)和100bp ladder(Fisher Scientific)于26℃和120mAmp下经5％聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳17个小时。利用NucleoCam Digital ImageDocumentation System(Nucleo Tech Corp.，San Mateo，CA)分析溴化乙锭染色胶图像。16S rDNA序列分析。所述序列分析依照Chandler等(1997)描述的方法进行。
DNA杂交。利用先前描述的Wayne等(1987)的方法于DSMZ进行所述DNA杂交测定。
核苷酸序列分析。菌株P11 ATCC BAA-622的16s rDNA基因序列在GenBank中登录号为AY1700378和DQ20022。
结果与讨论
细胞形态学。菌株P11细胞几乎不动、棒状、革兰氏染色阳性、并以单个或成链状存在。细胞为0.7-0.8μm乘4-5μm，周生鞭毛(见图1)，芽胞罕有发生，但芽胞存在时表现为不肿大且位于末端附近。菌落在营养琼脂上呈现圆形、半透明且扁平。
生理学。Clostridium ragsdalei为严格厌氧菌。酵母提取物剌激其生长，尽管没有酵母提取物时，在延长的停滞期后也可观察到其边缘生长。在H₂/CO₂或CO/CO₂中发生自养生长，有以下底物时观察到化能有机营养生长：丙酮酸盐、D-苏糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、乙醇、1-丙醇、酪蛋白氨基酸、谷氨酸盐、丝氨酸、胆碱和丙氨酸(表6)。即使当在pH 5.0-6.5的范围进行检测时，苹果酸盐或甲酸盐起初并不支持其生长。然而，在经过约三十天的温育期后，在测试pH范围内扬氏梭菌(C.ljungdahlii)能以苹果酸盐作为唯一碳源生长。这表明这种生物体可能需要在该测试条件下适应苹果酸盐。扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)在葡萄糖中生长时也表现出类似需要。图6显示菌株P11和扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株PETC之间、及它们以底物作为唯一碳源和能源的生长情况的比较。
图6.Clostridium ragsdalei菌株P11和扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株PETC的底物利用情况的比较




+，阳性(表示终OD600大于或等于0.1.)
-，阴性(表示终OD600小于其阴性对照.)
*，与之前报道(Tanner，1993)不同的结果.
H，本研究结果
菌株P11生长的最佳初始pH为6.3；生长发生的初始pH值在4.0至8.5之间(图2)。当培养于初始pH为6.3的非缓冲培养基时，测得终pH为4.1。其生长的最佳温度为37℃(图3)；P11的生长温度范围为18-37℃。
当菌株P11以最佳条件在果糖和CO中生长时，倍增时间分别为0.143h^-1和0.175h^-1。然而，当在木糖中生长时，倍增时间显著降低(0.220h^-1)，表明木糖可能为菌株P11的优选碳源和能源。
菌株P11从1mmol的果糖中生成2.35mmol的乙酸；另外，产生作为终产物的0.63mmolCO2和0.5mmol乙醇(表7)。还观察到其它产乙酸生物体，伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、威氏醋酸杆菌(Acetohacterium wieringae)和甲醇醋酸杆菌(Acetobacteriumcarbinolicum)在发酵己糖过程中生成乙醇(Buschhorn等，1989)。当在H₂/CO₂中生长时，乙酸盐是唯一产量可观的产物，表明C.ragsdalei不止可能利用乙酰辅酶A(乙酰-Co-A)Wood/Ljungdahl途径(Drake1994)。
表7.使用果糖的菌株P11发酵平衡


碳回收率，99.8％
氢回收率，98％
氧回收率，100％
BOX-PCR基因组指纹分析。对扬氏梭菌(C.ljungdahlii)和菌株P11的PCR产物的凝胶电泳结果进行比较(未出示)。两者都有约1,310bp大小的条带、约1,210bp大小的条带、约980bp大小的条带、约820bp大小的条带和约400bp大小的条带。C.ljungdahlii还有2,000bp、1,770bp、1,410bp、1,370bp、1,260bp、1,040bp、680bp和360bp大小的PCR产物条带。菌株P11有1,500bp的独特条带。
因此，这两种梭菌很容易用这种技术显示出有差异。尽管基因组指纹分析并非DNA-DNA杂交的替代品，但这种技术的运用，对于很多想要区分亲缘紧密细菌菌株的实验室来说可以是有价值的工具。
遗传分析。P11的16S rDNA基因序列的系统进化分析表明，该生物体属于梭菌属的簇(cluster)I(Collins等，1994)，实质上就是ohnson和Francis(1975)的群I。在此簇中，菌株P11位于其它五种梭菌的单元中：扬氏梭菌(C.ljungdahlii)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、大梭菌(C.magnum)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)和粪味梭菌(C0scatologenes)。菌株P11的16S rDNA序列与扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)ATCC M59097的16S rDNA序列有最大的相似性(99.9％)(图4)，后者为也能依靠CO生长的产乙酸菌(Tanner等，1993)。
基于菌株P11和扬氏梭菌(C.ljungdahlii)之间的16S rDNA高相似性，进行DNA-DNA杂交研究。确定值为57％，明确表明菌株P11为新物种。其DNA的G+C mol％为29-30％(n＝5)，同样类似于亲缘紧密的梭菌的G+C mol％。
基于扬氏梭菌(C.ljungdahlii)和相关种的表型差异和少于70％DNA-DNA相关性的明确标准(Wayne等，1987)，此实例表明Clostridium ragsdalei菌株P11是与独特的新种。
实施例2
对在生物体中业已发现所包含的效应和某些特征进行改进、最大化或最小化、同时不改变其内在特性以获得最理想结果的研究可定义为最优化。最优化研究是促进生长和提高所需发酵产物产量的策略的关健要素。就本实例而言，乙醇是所需终产物。
材料与方法
菌株和培养基。本研究自始至终使用梭菌菌株P11。一氧化碳培养基(COM)用于培养和维持该培养物。其生长温度为37℃。COM为未定义的缓冲培养基，其首先经过N₂/CO₂加压至10psi(70kPa)，然后在121℃高压灭菌15分钟。所述培养基含有按每升蒸馏水计算的：25ml无机盐溶液(表1)、10ml微量金属溶液(表2，10ml维生素溶液(表3)、1.0g酵母提取物、10g MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)、0.001g刃天青、4.0g半胱氨酸·盐酸、和4.0Na₂S·9H₂O；该培养基的初始pH为6.1-6.3。所述培养基按照严格厌氧技术来制备(Balch和Wolfe，1976)。CO作为唯一底物于210kPa(30psi)下供给。除非另作说明，否则所有培养实验均在压力为30psi、CO作为唯一或主要底物下进行，并采用水平温育(incubate horizontally)以使气体最大程度扩散到该培养基中。除非另作说明，否则转移的标准接种物大小约为生长到对数生长期中后期的储用培养物的2％(体积比)。
分析方法。在铝制密封管中于600nm(Spectronic 20D；Milton Roy)对生长情况进行分光光度测量(Balch和Wolfe，1976)。通过在配备填有80/120Carbopak B-DA/4％carbowax resin 20M的2m钢柱的Varian3400上装有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱仪(GC)(Supelco，Bellfonte，PA)，对乙酸盐和乙醇同时进行测定。所述柱、进样器和检测器的温度分别为155、200和200℃。载气为氦气，流速设定为30mlmin^-1。氦离子浓度由电极测量。
代谢抑制剂研究。将已过滤除菌的氟乙酸盐(FA)和三氟乙酸盐(TFA)(Sigma Chemical Co.)的厌氧贮存液制成终浓度为4.5M。制备前，允许FA和TFA粉末在厌氧室内的小烧杯中放置过夜，以使任何携获的氧气从该粉末中散走。对范围为5mM-210mM的终浓度进行测定，以尝试确定抑制乙酸形成的最小抑制浓度(MIC)和最有效浓度，以使乙醇产量相对于生长量最大化。上述抑制剂通常在接种P11前一天加入培养基中，以确保厌氧性的维持。所有加入均在厌氧条件下通过注射来完成。在本研究中，定期用光谱学方法测量其生长情况。接近静息细胞期结束时，取液态样品(1mL)并冷冻保存(-20℃)，直至进行GC和HPLC分析。
半连续式分批培养法。用含有100-200mL未修改(unamended)的COM的500mL血清瓶进行长期的半连续式分批培养实验。也加入修改至pH 5.5的COM，以观察一培养物在振荡条件下(50rpm)的生长。通过每7-10天用新的未修改和修改的COM交换消耗的液体培养基，并加入/交换H₂/CO₂至大气压和CO，来维持培养。CO至少加至30psi。在交换培养基时，测量生长情况和pH，并从中取(1.0mL)液态样品，作冷冻保存(-20℃)直至对乙醇和乙酸盐进行GC和HPLC分析。
乙醇耐受。以菌株P11来研究乙醇对CO代谢和溶剂产生的作用。在这些研究过程中，确定菌株P11可存活的初始最大浓度。将P11接种到具有含乙醇浓度范围为15-35克/升的COM的Balch管中，持续约10天对生长情况进行测量。该细胞一旦维持在稳定期，马上提取液态样品(1.0mL)并冷冻保存(-20℃)，直至进行GC和HPLC分析。在确定了细胞存活的最大乙醇浓度后，使用具有含不同乙醇浓度(20、30、40和50g/L)的100-200mL COM的500mL血清瓶，来进行半连续式分批培养实验，以使菌株P11适应高溶剂条件。通过将过滤灭菌的乙醇加入预灭菌的Balch管中，然后用N/CO₂吹扫以去除氧气，来制备含乙醇的修改的COM。待培养基灭菌后，接着加入乙醇至适宜的浓度。把来自以上已建立的半连续式分批培养物的P11细胞接种到些瓶中。定期测量生长情况和pH。将经过提取用于所述测量的一部分培养基用以分析乙醇和乙酸盐浓度。
微量金属。检测不同浓度下的铁(Fe)、钼(Mo)、钴(Co)、铜(Cu)和镍(Ni)，以确定它们对生长量和乙醇产量的影响。向未修改(1X)和修改(0X和10X)培养基的三管重复接种菌株P11，其中将每种以上单独的微量金属以10X的原始金属浓度加入，或以0X的浓度将其从中去除。对所述培养物每隔48小时进料CO。
也在160mL血清瓶中重复完成以上步骤，以模拟小规模分批条件。制备上述每种金属的贮存液，并在煮沸和脱气之前制备培养基时加入。为了使携带金属离子最小化并除尽细胞中存在的上述金属的量以实现0μM金属测试浓度，在生长实验开始前至少作6次转移。为了使细胞适应更高的金属浓度，每个实验(set-up)至少作2次转移。该实验重复进行三次，经过7天测量生长情况，随后进行pH和乙醇浓度分析。
酵母提取物。测试验范围在0-2.0％的不同浓度酵母提取物，以确定它对生长和乙醇产量的影响。经过7天时间测量生长情况，且在实验结束时测定其pH和乙醇浓度。以下面百分比浓度测试酵母提取物：0、0.025、0.05、0.1和0.2。CO为主要底物和碳源。如之前一样，通过进行6次连续转移使菌株P11适合更低浓度，而通过至少2次转移来适合更高浓度。
pH。进行最佳pH研究，以确定提高由CO代谢所得乙醇产量的最好条件。为了确定最佳pH，培养基用HOMOPIPES(高哌嗪-N，N′-二-2-[乙磺酸](Research Organics，Cleveland，OH)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、或TES(N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)于(1.0g/L)作缓冲。用0.1ml(约2％)稳定期的CO生长细胞接种物作起始生长。这些实验中所用的全部培养基组分从Sigma购得(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，除非另外说明。这些实验完成时，确定pH并分析乙醇和乙酸盐浓度。
进行关于pH的两组实验。第一组pH实验在Balch管中进行，在不维持pH情况下，经过5天测定其生长情况。第二组在小血清瓶(120mL)中进行，以确定制备乙醇的最佳pH。第二组实验通过加入已灭菌的HCl或NaOH控制其pH。
结果
代谢抑制剂-FA/TFA。所确定的氟乙酸盐(FA)和三氟乙酸(TFA)的MIC分别为100mM和150mM。没有对在所测定不同浓度FA和TFA存在下P11的乙醇和乙酸盐产量建立起明确趋势(见表8)。当生长于含有20mM FA的COM时，观察到生长量(OD)或终产物与P11对照相比无显著差异。然而，当存在30mM以上FA时，乙酸盐产量降低近90％，乙醇产量和生长量分别降低50％和40％。乙醇对乙酸盐的比率升高80％。
当生长于含30mM TFA的COM中时，尽管溶剂对酸的比率仅稍微增长(50％)，但所产生的乙醇和乙酸盐分别有126％和52％的增长。生长量保持不变。这表明，使用这两种抑制剂会使碳流从酸转移到溶剂产生，仅在使用FA时影响生长。
表8.存在和不存在代谢抑制剂下终OD和乙醇和乙酸盐产量
  终产物  P11FA对照  P11含15mM  FA  P11TFA对  照  P11含60mM  TFA  终OD 600  0.788  0.741  0.694  0.641  乙醇(mM)  38.91  39.62  39.05  45.60  乙酸盐(mM)  445.86  48.72  45.18  34.58
半连续式分批培养法
在四个月时间监测中，所述P11生长量保持稳定或有所增长。经过稀释校正(correct for dilution)后，一P11培养物的生长量达到2.4个OD单位。所有培养物的pH始终测量在4.3左右。上述修改的COM(pH5.5)达到了最高乙醇产量252mM(11.6g/L)和乙醇对乙酸盐的比率，而未修改的COM的最高乙醇产量为95mM(4.4g/L)。在这段时间段内，在培养物中显现出乙酸盐浓度增高和乙醇产量降低的总体趋势(可能表明菌株退化)。例外的是以pH 5.5为起始的P11培养物(数据未出示)。
乙醇耐受
在经过15、20、25、30和35g/L乙醇修改的COM中培养菌株P11，发现当乙醇浓度达到30g/L时其开始耐受，最小抑制浓度为35g/L。相对于没有乙醇的未修改对照，所有乙醇浓度的存在均会造成生长迟缓。除25g/L的修改培养物在98小时生长之外，直至48小时均无法测到所述修改的培养物的生长(数据未显示)。最佳生长的最高乙醇浓度为20g/L。
使用生长于20g/L浓度的培养物开始并维持半连续式分批培养。待该培养物在20g/L下建立起来后，成功地尝试使其适应30g/L。此适应过程直到50g/L的浓度。在该点之后，尽管作了几次尝试，均不能使该培养物在50g/L之上的浓度建立起来。在浓度50g/L下的生长无法维持在0.55OD单位以上，但整个监测过程中始终保持接近该水平。在整个监测过程中，乙酸盐和乙醇的产量具有相互影响的结果(mixed result)，因此没有用这些培养物建立明确趋势。
微量金属
测试去除和加入金属对P11的CO代谢的影响。去除Fe、Co、Cu和Ni会限制CO代谢。然而，没有Mo，CO则代谢稍微增强。Mo、Fe、Co、Cu和Ni的水平提高(分别为200μM、80μM、12μM和8μM)会刺激CO代谢，且在48小时进料后尤其显著(数据未出示)。
除Mo外所有金属的去除均将会增加溶剂对酸的比率。当去除Fe和Ni时，溶剂对酸的比率会有接近300％和400％的增长。Co和Cu的去除降低乙酸盐产量，增加溶剂对酸的比率，而Mo的去除会使乙酸盐产量增加。
酵母提取物
起初，菌株P11在酵母提取物浓度为0％时并不生长，该生长实验只在上述的其它浓度下进行。然而在近四周后，观察到明显的生长。从那时起，每一至两周进行转移，且向该起始管重新灌注CO。至少进行15次转移。结果，P11可以适应在缺少复合培养基组分酵母提取物下生长。
最佳pH对乙醇制备的影响
测量生长情况和乙醇∶酸之比。对于C.ragsdalei的CO代谢和乙醇产生的最佳pH确定为5.5-6.0之间。培养物最初pH为5.5和6.0时，乙醇∶乙酸盐比分别为0.7∶1和0.6∶1。
讨论
FA/TFA
先前业已表明浓度为50mM的氟乙酸盐抑制嗜热梭菌的生长(Rothstein，1986)。这里所给数据的重要性表现为：当与维持在相同条件下的对照菌株比较时，在氟乙酸盐和三氟乙酸存在下P11的乙醇产量得以增加。
在初始分离时，菌株P11受浓度为30g/L的乙醇抑制。与Yamano等，1998中适应技术相似，通过适应法(adaptation)使培养物适应更高浓度乙醇的耐受。迄今为止，该培养物已适应于在50g/L的乙醇浓度下完全发挥功能。该实例显示：用于工业微生物的适应方法可用于提高菌株P11作为微生物催化剂用于乙醇和/或乙酸制备的性能。参考文献，其中的每一篇通过引用结合到本文中
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虽然业已根据本发明优选实施方案对本发明作出描述，但本领域技术人员将认识到可以在所附权利要求的范围和精神内的修改下实践本发明。因此，本发明不应受限于上述实施方案，而应该还包括落入本文所提供说明书的精神和范围内的其所有修改和等同物。