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1、(10)申请公布号 CN 104313073 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313073 A (21)申请号 201410537234.X (22)申请日 2014.10.13 C12P 17/04(2006.01) C12R 1/72(2006.01) (71)申请人 青岛科技大学 地址 266061 山东省青岛市崂山区松岭路 99 号 (72)发明人 张媛媛 朱美虹 刘均洪 (54) 发明名称 一种 (2R,3R) 庚烯醇的生产方法 (57) 摘要 一种 (2R,3R) 庚烯醇的生产方法。用南极 假丝酵母细胞作为催化剂， 生物催化制备手性 (2R,3R)-1,2。
2、- （亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 加入棉纱布吸附底 物、 产物， 调控底物、 产物浓度， 可以有效减少对细 胞的抑制。 用酵母细胞进行生物催化反应， 产品收 率高， 对映体过量率高， 具有很好的应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104313073 A CN 104313073 A 1/1 页 2 1. 一 种 南 极 假 丝 酵 母 细 胞 生 物 催 化 制 备 (2R,3R)-1,2-（亚 环。
3、 己 基 二 氧 基） 庚 -6- 烯 -3- 醇的方法， 其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.6-0.7， pH 为 7， 加入吸附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的棉纱布， 使底物 R- 亚环己基 甘油醛添加量为 80-90 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡 萄糖含量为 8-9g/L， 木糖 12-15 g/L， 单硬脂酸甘油酯含量为 12-15g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 26-28时， 加入湿酵母细胞使浓度为 22-25g/L， 通气比为 0.15-0.2V/（V 分 钟） 。
4、， 进行生物催化反应， 反应时间为 74-79 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 棉纱布， 用乙 酸乙酯萃取反应液、 萃取棉纱布， 合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯， 蒸出乙酸 乙酯， 得到产物 (2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 94-96， 产 品收率 92-94， 对映体过量率 （ee%） 97-98。 2. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于湿酵母细胞制备过程如下 ： 南极假丝酵母经斜 面、 摇瓶、 种子罐培养得到种子液 ； 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.6-0.7， 121高压灭 菌 30 分钟， 冷却至 24。
5、-25， 将酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 9-10， 通气比为 1-1.3V/（V 分钟） ， 24-25培养 49-54 小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生 物催化反应催化剂。 3. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于培养液成份为 ： 葡萄糖 18-20 g/L， 淀粉 13-15g/L,黄豆粉28-29 g/L， 酵母浸膏6-7 g/L， 吐温80 0.6-0.8 g/L ， KH2PO4 2-2.4 g/ L， MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L， 豆油20-25 mL/L， 麦芽浸膏26-30 g/L ； 固体培养基成份 ： 在 液体培养基中加入 。
6、2% 的琼脂粉。 4. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述吸附了底物的棉纱布制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的棉纱布吸收此溶液， 即得到吸附了底物的棉纱布， 调节底物与棉 纱布用量， 使得底物与棉纱布的质量比率为 0.3-0.32。 权 利 要 求 书 CN 104313073 A 2 1/5 页 3 一种 (2R,3R) 庚烯醇的生产方法 技术领域 0001 本发明属于制药工程技术领域， 特别涉及到南极假丝酵母细胞生物催化制备手性 医药中间体 (。
7、2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇的技术。 背景技术 0002 手性 （亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇是合成手性药物、 精细化学品、 农药品和其 他特殊材料的重要中间体。 生物催化的不对称催化具有环境友好、 条件温和、 选择性高等优 点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的 手性化合物。生物催化制备手性 （亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇具有很好的应用前景。 0003 生物催化具有催化效率高、 选择性强、 条件温和、 环境友好等突出优点 , 是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。
8、。 其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中 , 水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品 , 在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来 , 氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前 , 采用水解酶动力学拆分法、 生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为 4:2:1。 0004 (2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇是合成手性药物、 精细化学品、 农药品的重要手性砌块， 由于有 2 个手性中心， 使得化学合成较为困难， 成本高。本发明将 采用生物催化制备 (2R,3R)-1,2-（亚。
9、环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇。 发明内容 0005 本发明采用南极假丝酵母细胞催化制备 (2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应式如下 ： 底物 R- 亚环己基甘油醛 （1） 和 4- 溴 -1- 丁烯 （2） 经近南极假丝酵母催化催化， 得到产 物 (2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇 （3） 。有多种微生物可以催化此反应， 经过大量实验筛选， 最终确定采用近南极假丝酵母作为催化剂， 因为其催化反应1和2反应 的效果最好， 反应收率、 对映体过量率 （ee%） 均很高。 说 明 书 CN 104313073。
10、 A 3 2/5 页 4 0006 许多南极假丝酵母都可以进行生物催化此反应， 然而， 其效果不同， 相差很大， 经 实验， 本发明选用南极假丝酵母菌株为 CBS 6821， 其催化反应效果最佳。 0007 培养介质 ： 1、 培养液成份 ： 葡萄糖 18-20 g/L， 淀粉 13-15g/L, 黄豆粉 28-29 g/L， 酵母浸膏 6-7 g/L， 吐温 80 0.6-0.8 g/L ， KH2PO4 2-2.4 g/L， MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L， 豆油 20-25 mL/ L， 麦芽浸膏 26-30 g/L。 0008 2、 固体培养基成份 ： 在液体培养基中加入。
11、 2% 的琼脂粉。 0009 酵母细胞制备。南极假丝酵母经斜面、 摇瓶、 种子罐培养得到种子液 ； 发酵罐加入 培养液， 装料系数为 0.6-0.7， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 24-25， 将酵母种子液接种 至发酵罐， 接种比例为 9-10， 通气比为 1-1.3V/（V 分钟） ， 24-25培养 49-54 小时， 用过 滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催化反应催化剂。 0010 由于底物、 产物均对酵母细胞有抑制作用， 为了减少底物、 产物对细胞的抑制， 本 发明采用棉纱布吸附底物， 反应中， 当底物被细胞催化反应， 浓度降低时， 底物从棉纱布溶 出， 补充反应消耗。
12、的底物。 同时， 产物被棉纱布吸附， 减少了其在水中的浓度， 从而大幅度降 低了底物、 产物对细胞的抑制。 底物与棉纱布的比率， 决定了反应液中底物、 产物的浓度， 而 且， 浓度还与反应温度、 反应液成份有关。不同细胞对底物、 产物的敏感度不同， 所以， 要进 行大量实验， 才能确定最佳的底物与棉纱布的比率。实验表明， 对于本发明的菌株、 反应液 成份、 反应温度， 最佳的底物与棉纱布的比率为 0.3-0.32。具体吸附时， 将底物 R- 亚环己 基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的棉纱布。
13、吸收此溶液， 即得到吸附了底物的棉纱布。调节底物与棉纱布用量， 使得底物与棉纱布的质量比率为0.3-0.32。 所用棉纱布为普通棉纱布， 从市场上购买后， 切 成 0.5cmX0.5cm 小块， 灭菌， 无菌保存待用。 0011 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.6-0.7， pH 为 7， 加入吸 附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的棉纱布， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添加 量为 80-90 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 由此 2 种底物 浓度均确定了。葡萄糖含量为 8-9g/L， 木糖 12-。
14、15 g/L， 单硬脂酸甘油酯含量为 12-15g/ L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 26-28时， 加入湿酵母细胞使浓度为 22-25g/L， 通气比 为 0.15-0.2V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.1-0.12 倍反应液体积， 进行生物催化反应， 反应时间为 74-79 小时 ； 反应结束后， 先滤出细胞， 再滤出棉纱布， 用 0.3 倍反应体积的乙 酸乙酯萃取反应液 2 次， 用 3 倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布 3 次， 合并乙酸乙酯萃 取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 。
15、-3- 醇， 反应转化率 94-96， 产品收率 92-94， 对映体过量率 （ee%） 97-98。 0012 本发明所开展工作包括菌株选择 （从近百个菌株中选择） 、 催化反应条件优化 （反 应温度、 通气量、 pH） 、 反应介质选择和浓度优化 （底物浓度、 葡萄糖含量、 木糖含量、 表面活 性剂种类 （20 多种选 1） 及浓度、 其它多种成份选择排除） ， 采用固体吸附控制底物产物浓 度， 从而减少对细胞的抑制， 试验了白土、 硅藻土、 棉纱布、 苎麻纱布、 大孔树酯等多种固体 材料， 还曾进行了水 - 有机溶剂 2 相体系试验。由于试验量很大， 尽管采用了响应面优化设 计试验， 大。
16、幅度减少了试验量， 试验量仍然很大， 全部试验进行 2 年多才完成， 达成目前的 技术方案。对于光活性产物而言， 当反应转化率 94-96， 产品收率 92-94时， 对映体过量 说 明 书 CN 104313073 A 4 3/5 页 5 率 （ee%） 仍然高达 97-98， 是非常不易的， 我们的工作取得了显著进步。 0013 实施例 1 培养液培养液成份为 ： 葡萄糖18-20 g/L， 淀粉13-15g/L,黄豆粉28-29 g/L， 酵母浸膏 6-7 g/L， 吐温 80 0.8 g/L ， KH2PO4 2.2g/L， MgSO4.7H2O 0.3 g/L， 豆油 20 mL/L。
17、， 麦芽浸 膏 26 g/L。固体培养基成份 ： 在液体培养基中加入 2% 的琼脂粉。 0014 湿酵母细胞制备过程如下 ： 南极假丝酵母菌株 CBS 6821 经斜面、 摇瓶、 种子罐培 养得到种子液 ； 10L 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.6， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 24， 将酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 9， 通气比为 1V/（V 分钟） ， 即每分钟通气 量为1倍反应液体积， 24培养49小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催 化反应催化剂。 0015 吸附了底物的棉纱布制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯。
18、混 溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的棉纱布吸收 此溶液， 即得到吸附了底物的棉纱布， 调节底物与棉纱布用量， 使得底物与棉纱布的质量比 率为 0.3。所用棉纱布为普通棉纱布， 从市场上购买后， 切成 0.5cmX0.5cm 小块， 灭菌， 无菌 保存待用， 其它实施例棉纱布处理相同。 0016 15L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为0.6， pH为7， 加入吸附 了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的棉纱布， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添加量为 80 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油。
19、醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄糖含量为 8g/L， 木 糖12 g/L， 单硬脂酸甘油酯含量为12g/L， 121高压灭菌30分钟 ； 冷却至26时， 加入湿酵 母细胞使浓度为 22g/L， 通气比为 0.15V/ （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.15 倍反应液体积， 进行生物催化反应， 反应时间为74小时 ； 反应结束后， 先滤出细胞， 再滤出棉纱布， 用0.3倍 反应体积的乙酸乙酯萃取反应液 2 次， 用 3 倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布 3 次， 合并 乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (2R,3R)-1,2- （亚环己 。
20、基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 94， 产品收率 92， 对映体过量率 （ee%） 98。 0017 实施例 2 培养液培养液成份为 ： 葡萄糖 20 g/L， 淀粉 15g/L, 黄豆粉 29 g/L， 酵母浸膏 7 g/L， 吐 温80 0.6 g/L ， KH2PO4 2.4 g/L， MgSO4.7H2O 0.4 g/L， 豆油20 mL/L， 麦芽浸膏30 g/L。 固 体培养基成份 ： 在液体培养基中加入 2% 的琼脂粉。 0018 湿酵母细胞制备过程如下 ： 南极假丝酵母菌株 CBS 6821 经斜面、 摇瓶、 种子罐培 养得到种子液 ； 50L 发酵罐加入。
21、培养液， 装料系数为 0.7， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 25， 将酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 10， 通气比为 1.3V/ （V 分钟） ， 即每分钟通 气量为 1.3 倍反应液体积， 25培养 54 小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作 生物催化反应催化剂。 0019 吸附底物的棉纱布制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的棉纱布吸收此溶 液， 即得到吸附了底物的棉纱布， 调节底物与棉纱布用量， 使得底物与棉纱布的质量比率为。
22、 0.32。所用棉纱布为普通棉纱布， 从市场上购买后， 切成 0.5cmX0.5cm 小块， 灭菌， 无菌保存 待用， 其它实施例棉纱布处理相同。 0020 100L 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.7， pH 为 7， 加入 说 明 书 CN 104313073 A 5 4/5 页 6 吸附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的棉纱布， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添 加量为 90 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄糖含量为 8-9g/L， 木糖 15g/L， 单硬脂酸甘油酯含量为 15g/L， 1。
23、21高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 28 时， 加入湿酵母细胞使浓度为 25g/L， 通气比为 0.2V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.2 倍 反应液体积， 进行生物催化反应， 反应时间为 79 小时 ； 反应结束后， 先滤出细胞， 再滤出 棉纱布， 用 0.3 倍反应体积的乙酸乙酯萃取反应液 2 次， 用 3 倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃 取棉纱布 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 96， 产品收率 94， 对映 体过量率 （ee%） 98。 0021 。
24、实施例 3 培养液培养液成份为 ： 葡萄糖 19 g/L， 淀粉 14g/L, 黄豆粉 28.5 g/L， 酵母浸膏 6.5 g/ L， 吐温80 0.7g/L ， KH2PO4 2.2 g/L， MgSO4.7H2O 0.35 g/L， 豆油25 mL/L， 麦芽浸膏28 g/ L。固体培养基成份 ： 在液体培养基中加入 2% 的琼脂粉。 0022 湿酵母细胞制备过程如下 ： 南极假丝酵母菌株 CBS 6821 经斜面、 摇瓶、 种子罐培 养得到种子液 ； 500L 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.65， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 24.5， 将酵母种子液接种至发酵罐， 接种。
25、比例为 9.5， 通气比为 1.2V/（V 分钟） ， 即每分 钟通气量为1.2倍反应液体积， 24.5培养52小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催化反应催化剂。 0023 吸附了底物的棉纱布制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混 溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的棉纱布吸收 此溶液， 即得到吸附了底物的棉纱布， 调节底物与棉纱布用量， 使得底物与棉纱布的质量比 率为 0.31。 0024 1000L 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.65， pH 为 。
26、7， 加 入吸附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的棉纱布， 使底物 R- 亚环己基甘油醛 添加量为 85 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄糖含量 为 8.5g/L， 木糖 13.5g/L， 单硬脂酸甘油酯含量为 13g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 27时， 加入湿酵母细胞使浓度为 23g/L， 通气比为 0.18V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.18 倍反应液体积， 进行生物催化反应， 反应时间为 78 小时 ； 反应结束后， 先滤出细胞， 再 滤出棉纱布， 用 0.3 倍反应体积的乙酸乙酯。
27、萃取反应液 2 次， 用 3 倍棉纱布质量的乙酸乙酯 萃取棉纱布 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (2R,3R)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 95， 产品收率 93， 对映 体过量率 （ee%） 97.5。 0025 实施例 4 培养液培养液成份为 ： 葡萄糖 19 g/L， 淀粉 14g/L, 黄豆粉 28.5 g/L， 酵母浸膏 7 g/L， 吐温80 0.8 g/L ， KH2PO4 2.4 g/L， MgSO4.7H2O 0.4 g/L， 豆油25 mL/L， 麦芽浸膏30 g/L。 固体培养基成。
28、份 ： 在液体培养基中加入 2% 的琼脂粉。 0026 湿酵母细胞制备过程如下 ： 南极假丝酵母菌株 CBS 6821 经斜面、 摇瓶、 种子罐培 养得到种子液 ； 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.7， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 25， 将酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 10， 通气比为 1.3V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量 说 明 书 CN 104313073 A 6 5/5 页 7 为 1.3 倍反应液体积， 25培养 54 小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物 催化反应催化剂。 0027 吸附了底物的棉纱布制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘。
29、油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混 溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的棉纱布吸收 此溶液， 即得到吸附了底物的棉纱布， 调节底物与棉纱布用量， 使得底物与棉纱布的质量比 率为 0.3-0.32。 0028 5000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为0.7， pH为7， 加入吸 附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的棉纱布， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添加量 为90 g/L， 底物R-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1， 葡萄糖含量为9g/L， 木 糖14 g/L， 单硬脂酸甘。
30、油酯含量为15g/L， 121高压灭菌30分钟 ； 冷却至28时， 加入湿酵 母细胞使浓度为25g/L， 通气比为0. 2V/ （V分钟） ， 即每分钟通气量为0.2倍反应液体积， 进 行生物催化反应， 反应时间为78.5小时 ； 反应结束后， 先滤出细胞， 再滤出棉纱布， 用0.3倍 反应体积的乙酸乙酯萃取反应液 2 次， 用 3 倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布 3 次， 合并 乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (2R,3R)-1,2- （亚环己 基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 96， 产品收率 94， 对映体过量率 （ee%） 97.5。 说 明 书 CN 104313073 A 7 。