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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410667204.0 (22)申请日 2014.11.20 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区农业科学院植物保 护研究所 地址 530007 广西壮族自治区南宁市大学东 路 174 号 (72)发明人 高利军 邓国富 陈小林 周萌 颜群 周维永 戴高兴 梁海福 陈仁天 李瑞芳 陈韦韦 马茜茜 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (54) 发明名称 水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记及 其专。
2、用引物 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 水 稻 抗 稻 瘟 病 基 因 Pi1 的特异性分子标记及其专用引物， 属于 分子生物学领域。获得水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记的引物对， 其正向引 物 为 ： GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反 向 引 物 为 ： AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。用该引物对在含 Pi1 的 C101LAC 序列中扩增出来的核苷酸序列即为本发 明水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记。通 过本发明的特异性分子标记及引物对能特异检测 水稻样品中是否含有抗稻瘟病基因 Pi1， 100准 确跟踪遗传分离群体中的抗稻瘟病基因 。
3、Pi1 存在 与否。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104388425 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104388425 A 1/1 页 2 1. 一种获得水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记的引物对， 其特征在于 ： 正向引 物为 ： GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG， 反向引物为 ： AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。 2. 一种水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记， 其特征在于 ： 所述的分子标记为用 权利要求 1 所述的。
4、引物对在含 Pi1 的 C101LAC 序列中扩增出来的核苷酸序列。 3.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的分子标记在检测水稻样品是否含有抗 稻瘟病基因 Pi1 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104388425 A 2 1/8 页 3 水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记及其专用引物 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记 及其专用引物。 背景技术 0002 水稻是世界上最重要的粮食作物之一， 全球约一半以上的人口以稻米作为主食。 稻瘟病是由子囊菌 (Magnaporthe grisea(Hebert)Barr) 。
5、引起的广泛发生在世界各稻区的 重要病害之一， 严重威胁着世界的粮食安全。目前主要通过化学防治和种植抗性品种来控 制稻瘟病。化学防治在一定程度上能减轻病害、 减少产量损失， 但对环境造成污染， 因而通 过选育抗病品种来预防稻瘟病是最佳选择， 但由于其病菌小种遗传的复杂性和致病性的多 样性， 抗病新品种在推广 3-5 年后丧失抗性。目前， 抗稻瘟病分子标记辅助育种主要利用与 抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择， 大大提高了育种效率， 但往往也存在分 子标记与抗病基因不连锁导致辅助选择失败的情况。 而利用抗病基因序列建立与稻瘟病抗 病基因完全共分离的基因标签， 则能让辅助选择理论上达到 10。
6、0的准确性。 0003 抗稻瘟病基因 Pi1 是较为广谱的抗性基因， 但目前尚未有基因内特异性标记开发 应用的报道。 0004 目前， 跟踪抗稻瘟病基因 Pi1 的分子标记一般用紧密连锁的 SSR 标记 RM224 或 MGR4766， 距离 Pi1 均有一定的距离， 选择效率无法达到 100； 也无法直接用来检测水稻样 品中是否含有 Pi1 基因。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足， 开发一种水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记。本发明的目的还在于提供扩增该特异性分子标记的专用引物 ( 引物 对 )。 0006 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0007。
7、 一种获得水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记的引物对， 其正向引物为 ： GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG， 反向引物为 ： AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。 0008 所述的水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记为用上述引物对在含 Pi1 的 C101LAC 序列中扩增出来的核苷酸序列。 0009 所述的引物对及分子标记可用于检测水稻样品是否含有抗稻瘟病基因 Pi1。 0010 通过本发明的特异性分子标记及专用引物能特异检测水稻样品中是否含有抗稻 瘟病基因 Pi1， 100准确跟踪遗传分离群体中的抗稻瘟病基因 Pi1 存在与否。 附图说明 0011 图 1 是用。
8、引物对 M-Pi1 检测 72 个水稻品系的电泳图 ( 部分 )， 1 为 Marker2000， 从 上到下的条带依次为 2000、 1000、 750、 500、 250、 100bp ； 条带 2 为水稻品系中编号为 1 含抗 说 明 书 CN 104388425 A 3 2/8 页 4 稻瘟病基因 Pi1 的单基因系 IRBL1-CL， 其余品种名见表 1。 0012 图 2 是 用 引 物 对 M-Pi1 检 测 LTH/IRBL1-CL 的 F2 代 单 株 的 电 泳 图， 1 为 Marker2000， 从上到下的条带依次为 2000、 1000、 750、 500、 250、。
9、 100bp ； 有条带的单株对稻 瘟病叶瘟表现为抗 (R)， 无带的单株对稻瘟病叶瘟表现为感病 (S)。 具体实施方式 0013 下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述。应理解， 下面的实施例仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例中所用的技术手段均 为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0014 实施例 1 0015 根据抗稻瘟病基因 Pi1 与其等位基因 Pikm， 日本晴上的感病基因序列比对， 设计 出了能特异跟踪 Pi1 的引物对， 命名为 M_Pi1， 其中， 正向引物 ： GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG， 反 向引物 ： AGTCCCCG。
10、CTCAATTTTTCT。 0016 用引物对 M_Pi1 在含 Pi1 的 C101LAC 序列中可扩增出 460bp 的片段， 该片段即为 本发明水稻抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记。 0017 实施例 2 特异性检验 0018 1. 材料与方法 0019 1.1 水稻材料 ： 水稻品系共 72 份 ( 表 1)。 0020 1.2 水稻基因组 DNA 提取 0021 分别取种植于南宁的 72 份水稻叶片， 通过 CTAB 法 (Murray M G,ThompsonW F.Rapid isolation ofhigh molecular weight plant DNA.Nucle。
11、ic Acids Research,1980,8(19):4321-4326.) 提取水稻基因组 DNA。 0022 1.3PCR 扩增 0023 PCR 反应体系为 20L 的体系 ： 2.0L 10Buffer， 2.0L dNTPs， 正、 反向引物 各 1.0L(4mol/L)， 0.2L Taq DNA 聚合酶， 2.0L 模板 DNA， 13.8L ddH2O。PCR 反应程 序 94 5min， 然后 35 个循环 94 30s、 58 30s、 72 45s， 最后 72延伸 10min。扩增产 物在 1.2琼脂糖凝胶中电泳， 溴化乙锭染色， 紫外灯下观察拍照。 0024 2.。
12、 结果与分析 0025 在 72 个水稻品系中， 只有含抗稻瘟病基因 Pi1 的抗稻瘟病单基因系 IRBL1-CL 有 460bp 的扩增产物， 其余 71 个水稻品系均没有 ( 图 1)， 从而说明用引物对 M-Pi1PCR 扩增得 到的序列为抗稻瘟病基因 Pi1 的特异性分子标记。 0026 表 172 个水稻品系及 M-Pi1 检测的基因型 0027 说 明 书 CN 104388425 A 4 3/8 页 5 0028 说 明 书 CN 104388425 A 5 4/8 页 6 0029 说 明 书 CN 104388425 A 6 5/8 页 7 0030 实施例 3 准确性测定 。
13、0031 1 材料与方法 0032 1.1 水稻材料 0033 水稻品系 IRBL1-CL 与丽江新团黑谷 (LTH) 的 F2代 384 个单株于 2013 年早稻种 植于岑溪梨木镇稻瘟病病圃。 0034 1.2 水稻基因组 DNA 提取 0035 插秧后 14 天分别取种植于 384 个单株的水稻叶片， 通过 CTAB 法提取水稻基因组 DNA。 0036 1.3PCR 扩增 0037 PCR 反应体系为 20L 的体系 ： 2.0L 10Buffer， 2.0L dNTP， 正、 反向引物各 1.0L(4mol/L)， 0.2L Taq DNA 聚合酶， 2.0L 模板 DNA， 13.。
14、8L ddH2O。PCR 反应程序 94 5min， 然后 35 个循环 94 30s， 58 30s， 72 45s， 最后 72延伸 10min。扩增产物在 1.2琼脂糖凝胶中电泳， 溴化乙锭染色， 紫外灯下观察拍照。 0038 1.4 抗性调查插秧后 35 天， 对 F2群体的叶瘟发病情况进行调查， 有稻瘟病典型 病斑的记为 S( 对稻瘟病叶瘟表现为感病 )， 无典型病斑的记为 R( 对稻瘟病叶瘟表现为抗 说 明 书 CN 104388425 A 7 6/8 页 8 病 )。 0039 结果如下 ： 水稻品系 IRBL1-CL 表现为抗 (R)， LTH 表现为感 (S)。384 个单株。
15、中， 有 293 个单株表现为抗 (R)， 91 个单株表现为 S， R:S 分离比为 3:1( 卡方 0.35)。用引物对 M-Pi1PCR 扩增检测这 384 个单株， 293 个抗性单株均有 460bp 的产物， 而 91 个单株无扩增 产物 ( 图 2)。从而说明 M-Pi1 能 100准确跟踪抗稻瘟病基因 Pi1。 0040 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 0041 说 明 书 CN 104388425 A 8 7/8 页 9 0042 说 明 书 CN 104388425 A 9 8/8 页 10 说 明 书 CN 104388425 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104388425 A 11 。