一种白念珠菌SMT3基因的用途及缺失SMT3基因的白念珠菌减毒株.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104342375 A (43)申请公布日 2015.02.11 CN 104342375 A (21)申请号 201310330386.8 (22)申请日 2013.07.31 C12N 1/16(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 31/10(2006.01) C12R 1/725(2006.01) (71)申请人 中国科学院上海生命科学研究院 地址 200031 上海市徐汇区岳阳路 320 号 (72)发明人 陈江野。

2、 鄢明辉 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所 31219 代理人 张艳 (54) 发明名称 一种白念珠菌 SMT3 基因的用途及缺失 SMT3 基因的白念珠菌减毒株 (57) 摘要 发明涉及基因工程领域， 具体涉及一种白念 珠菌SMT3基因的用途及缺失SMT3基因的白念珠 菌减毒株。本发明公开了白念珠菌SMT3基因的 用途， 为用于制备smt3/smt3缺失株， 或者用于制 备、 筛选白念珠菌治疗药物。本发明还公开了一 种白念珠菌减毒株， 所述减毒株中SMT3基因不表 达。本发明通过对白念珠菌中SMT3基因的敲除， 研究了其在细胞周期以及形态发生及转换过程中 的功能， 最后通过小鼠系统感。

3、染实验确立了SMT3 在白念珠菌毒性表现中的重要功能。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104342375 A CN 104342375 A 1/1 页 2 1. 白念珠菌 SMT3 基因的用途， 为用于制备 SMT3 基因不表达的白念珠菌 smt3/smt3 缺 失株， 或者用于制备、 筛选白念珠菌治疗药物。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， SMT3基因含有如SEQ ID NO ： 18所。

4、示的核苷 酸序列。 3. 如权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， SMT3 基因在白念珠菌中编码泛素相关小修 饰蛋白。 4. 一种白念珠菌减毒株， 为白念珠菌 smt3/smt3 缺失株， 所述减毒株中 SMT3 基因不表 达。 5. 如权利要求 4 所述的白念珠菌减毒株， 其特征在于， 所述白念珠菌减毒株为泛素相 关小修饰蛋白基因缺失株。 6. 如权利要求 5 所述的白念珠菌减毒株， 其特征在于， 所述泛素相关小修饰蛋白含有 SEQ ID NO ： 19 所示的氨基酸序列。 7.如权利要求4所述的白念珠菌减毒株， 其特征在于， 所述白念珠菌smt3/smt3缺失株 中， SMT3 基因通。

5、过同源重组的方法敲除。 8. 权利要求 4-7 任一权利要求所述白念珠菌减毒株的构建方法， 为通过同源重组的方 法对白念珠菌中 SMT3 基因的两个拷贝进行了敲除， 具体步骤如下 ： 1） SMT3基因第一个拷贝的敲除 ： 采用SEQ ID NO ： 1-2所示序列的引物从白念珠菌野生 型菌株基因组 DNA 中扩增 SMT3 的上游序列片段， 利用 XhoI PstI 酶切连接到载体 pCUB6 中， 得到质粒 pKO-SMT3Up ； 然后以 SEQ ID NO ： 3-4 所示序列的引物从白念珠菌野生型菌株 基因组中扩增得到 SMT3 的下游序列， 以 BamHI NotI 酶切连接到前述。

6、 pKO-SMT3Up 中， 得到敲除质粒pSMT3KO ； 将所述敲除质粒pSMT3KO酶切后转化白念珠菌， 经细胞内同源 重组得到第一拷贝 SMT3 敲除的单敲除菌株 ； 2） SMT3基因第二个拷贝的敲除 ： 采用SEQ ID NO ： 1-2所示序列的引物从白念珠菌野生 型菌株基因组 DNA 中扩增 SMT3 的上游序列片段， 利用 XhoI PstI 酶切连接到载体 pCUB6 中， 得到质粒 pKO-SMT3Up ； 然后以 SEQ ID NO ： 3、 5 所示序列的引物从白念珠菌野生型菌株 基因组中扩增得到 SMT3 的下游序列， 以 BamHI NotI 酶切连接到前述 pK。

7、O-SMT3Up 中， 得到敲除质粒pSMT3KO ； 将所述敲除质粒pSMT3KO酶切后转化白念珠菌， 经细胞内同源 重组得到第二拷贝 SMT3 敲除的 smt3/smt3 双敲除菌株。 9. 权利要求 4-7 任一权利要求所述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌生长及毒性功能 中的应用， 或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。 10. 一种制备白念珠菌治疗药物的方法， 为以白念珠菌中的 SMT3 基因为靶标， 沉默 SMT3 基因的表达。 权 利 要 求 书 CN 104342375 A 2 1/9 页 3 一种白念珠菌 SMT3 基因的用途及缺失 SMT3 基因的白念珠 菌减毒株 技术领域 。

8、0001 本发明涉及基因工程领域， 具体涉及一种白念珠菌 SUMO 的 SMT3 基因的用途及缺 失 SMT3 基因的白念珠菌减毒株。 背景技术 0002 白念珠菌 （Candida albicans）是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真 菌， 特别在免疫下调的病人中， 如器官移植病人， 艾滋病毒感染者等， 可以引起广泛的浅 部和深部系统感染， 感染部位包括口腔， 女性阴道等， 引起鹅口疮， 阴道炎等， 也可以侵 入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官， 如肾脏， 脑部等， 导致败血症， 严重可以导 致死亡 （Odds,F.C.1994.J.Am.Acad,Dermatol.31:S2-S。

9、5.） 。白念珠菌在不同的生长条 件下， 有不同的生长形态， 这些不同形态之间可以在一定条件下进行转换。包括酵母态 （yeast form） ， 和菌丝态 （hyphae） ， 以及白菌 （white phase）和灰菌 （opaque phase）之 间的转换。这种形态转化能力直接影响白念珠菌的致病能力 （Odds,F.C.1985.Crit Rev Microbiol.12:45-93;Brown,A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7:334-338.） ， 形态转 换能力缺陷的菌株其系统感染能力大大下降或消失 （Lo,H.J.et al,Cell90:9。

10、39-949.） 。 白 - 灰转换首先在临床上分离的 WO-1 菌株中发现。这两种形态的菌也具有不同的致病性， 白菌在系统感染中具有较强的致病能力， 而灰菌在表皮感染中具有较强的致病能力。因而 白灰转换是念珠菌为了适应不同的微环境而产生的两种形态， 这两种形态对于念珠菌的致 病能力有重要作用。同时， 白灰转换对于白色念珠菌实现其交配也是必要的。与酿酒酵母 类似， 白色念珠菌为了实现同源重组， 需要经过一个交配的过程， 有研究表明白念珠菌灰菌 形态交配效率大约是白菌形态的 106倍， 因此， 白色念珠菌要实现交配， 首先要进行白灰转 换， 由白菌转换为灰菌形态， 才可以实现交配。 0003 现。

11、有技术已通过功能互补的方法找到了调控白色念珠菌白灰转换的关键性因子， Wor1（White-Opaque Regulator1） ， Wor1 在念珠菌白灰形态转换中起着关键性的调控作 用。在随后的 Wor1 调控网络研究中， 我们通过酵母双杂交筛选并且鉴定了一些与之相互作 用的蛋白， 其中包括两个含有特征性的 SP-RING 结构的 SUMO E3 连接酶。 0004 SUMO（small ubiquitin-related modifier, 小泛素相关修饰物） 是二十多年前 发现的一种可逆的蛋白翻译后修饰， 在此之后， 许多参与SUMO化修饰以及去SUMO化过程的 酶被发现和鉴定。与此同。

12、时， 对于 SUMO 化底物的寻找也得出一系列可以发生 SUMO 化修饰 的蛋白， 这些蛋白参与到细胞功能的各个环节。 0005 SUMO 化修饰是一个高度动态化的过程， 其结果因具体蛋白而异， 包括改变蛋白的 定位， 调控蛋白的活性， 以及在某些情况下影响蛋白的稳定性。 乍一看这些结果似乎没有什 么共同性 ； 但其实这些结果都源自 SUMO 化修饰对于蛋白质的相互作用特性的改变。 0006 SUMO 在酿酒酵母中的研究已经很成熟， 但在白念珠菌中的已有研究还比较鲜见。 0007 Stephen W.Martin 等人对白念珠菌细胞周期中 Septin 的行为进行了研究。他 说 明 书 CN 。

13、104342375 A 3 2/9 页 4 们的研究表明， 虽然白念珠菌中 Septin 不发生 SUMO 化修饰， 但 SUMO 却特异性地定位于 Septin ； 进一步的研究表明， Septin 的一个组分 Cdc11 能够与一个 SUMO 化的蛋白结合， 从 而使其定位于 Septin。 0008 Michelle D.Leach 等人在白念珠菌中发现了大约 30 个 SUMO 化修饰的靶蛋白， 其 中大多数是具有典型的 SUMO 化修饰模式 -K-X-E， 这些蛋白主要涉及到对外界各种刺激 的应答过程。 发明内容 0009 本发明的目的在于通过基因敲除的方法， 研究 SMT3 基因在。

14、细胞周期、 形态发生及 转换过程中的功能， 并且提供一种缺失 SMT3 基因的白念珠菌减毒株。 0010 本发明首先公开了白念珠菌 SMT3 基因的用途， 为用于制备 SMT3 基因不表达的白 念珠菌 smt3/smt3 缺失株， 或者用于制备、 筛选白念珠菌治疗药物。 0011 本发明的 SMT3 基因含有如 SEQ ID NO ： 18 所示的核苷酸序列， 其在白念珠菌中编 码 SUMO（small ubiquitin-related modifier 泛素相关小修饰蛋白） 。 0012 较优的， 所述 SUMO 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 19 所示。 0013 较优的，。

15、 本发明所述 smt3/smt3 缺失株为白念珠菌的减毒株。在所述白念珠菌 smt3/smt3 缺失株中 SMT3 基因不表达。 0014 本发明所述白念珠菌治疗药物为以 SMT3 基因为治疗靶基因， 使 SMT3 基因不表达 的药物、 或者以 SMT3 基因表达的蛋白 （SUMO） 为拮抗对象的药物 ； 或者以 SMT3 基因和其他 基因共同作为靶基因加以沉默的药物。通过以 SMT3 基因为靶点， 筛选或制备使该基因不表 达的药物， 用于使白念珠菌的毒性减弱， 从而治疗白念珠菌感染。例如， 该白念珠菌治疗药 物可以通过 RNA 干扰或者基因重组的方法使 SMT3 基因不表达 ； 或者通过制备。

16、 SMT3 蛋白拮 抗剂， 使 SMT3 基因表达的 SUMO 不发挥作用。 0015 本发明第二方面公开了一种白念珠菌减毒株， 为白念珠菌 smt3/smt3 缺失株， 所 述减毒株中 SMT3 基因不表达。 0016 进一步的， 本发明的白念珠菌减毒株属于泛素相关小修饰蛋白基因缺失株。 0017 较优的， 本发明所述白念珠菌 smt3/smt3 缺失株中， SMT3 基因通过同源重组的方 法敲除。 与野生型白念珠菌相比， 本发明的减毒株在生长方面出现严重缺陷， 即便是在丰富 培养基中也只能缓慢生长， 并且伴随菌落及细胞形态方面的异常。同时， 在白灰转换实验 中， smt3/smt3 对促进。

17、白灰转换的刺激条件不敏感， 白灰转换效率比同样处理的野生型显著 降低， 而且形成的灰菌菌落不稳定， 在低温条件下也能转换到白菌状态或者丝状生长状态。 0018 本发明第三方面公开了前述白念珠菌减毒株的构建方法， 为通过同源重组的方法 对白念珠菌中 SMT3 基因的两个拷贝进行了敲除， 具体步骤如下 ： 0019 1） SMT3 基因第一个拷贝的敲除 ： 采用 SEQ ID NO ： 1-2 所示序列的引物从白念珠 菌野生型菌株基因组 DNA 中扩增 SMT3 的上游序列片段， 利用 XhoI PstI 酶切连接到载体 pCUB6中， 得到质粒pKO-SMT3Up ； 然后以SEQ ID NO 。

18、： 3-4所示序列的引物从白念珠菌野生型 菌株基因组中扩增得到 SMT3 的下游序列， 以 BamHI NotI 酶切连接到前述 pKO-SMT3Up 中， 得到敲除质粒 pSMT3KO ； 将所述敲除质粒 pSMT3KO 酶切后转化白念珠菌， 经细胞内 同源重组得到第一拷贝 SMT3 敲除的单敲除菌株 ； 说 明 书 CN 104342375 A 4 3/9 页 5 0020 2） SMT3 基因第二个拷贝的敲除 ： 采用 SEQ ID NO ： 1-2 所示序列的引物从白念珠 菌野生型菌株基因组 DNA 中扩增 SMT3 的上游序列片段， 利用 XhoI PstI 酶切连接到载体 pCUB。

19、6中， 得到质粒pKO-SMT3Up ； 然后以SEQ ID NO ： 3、 5所示序列的引物从白念珠菌野生型 菌株基因组中扩增得到 SMT3 的下游序列， 以 BamHI NotI 酶切连接到前述 pKO-SMT3Up 中， 得到敲除质粒 pSMT3KO ； 将所述敲除质粒 pSMT3KO 酶切后转化白念珠菌， 经细胞内 同源重组得到第二拷贝 SMT3 敲除的 smt3/smt3 双敲除菌株。 0021 本发明第四方面公开了前述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌生长及毒性功能中 的应用， 或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。 0022 本发明最后还公开了一种制备白念珠菌治疗药物的方法， 为以。

20、白念珠菌中的 SMT3 基因为靶标， 沉默 SMT3 基因的表达。 0023 进一步的， 为以白念珠菌中的 SMT3 基因作为 RNA 干扰的靶标或者基因重组的靶 标， 沉默 SMT3 基因的表达。 0024 本发明利用 URA-BLAST 策略对 SUMO 蛋白的基因 SMT3 进行了基因敲除。敲除后 的 smt3/smt3 出现严重的生长缺陷， 包括生长速度缓慢， 形态异常以及不均一性 ； 同时， 在 形态转换方面， smt3/smt3 因为细胞分裂障碍而在非丝状生长条件下出现假菌丝生长， 而在 促进白灰转换的刺激条件下， 则出现明显的响应滞后， 相比野生型， 其白灰转换效率显著降 低。因。

21、此可以得出结论 ： SUMO 基因在白念珠菌细胞周期、 形态转换以及毒性中充当了重要 的角色。 0025 有益效果 ： 本发明研究了白念珠菌基因 SMT3 对菌丝生长和菌株毒性的影响， 并成 功构建了一种白念珠菌减毒株， 在本发明的减毒株中 SMT3 基因不表达。本发明的白念珠菌 菌丝生长和毒性相关因子基因 SMT3 和白念珠菌减毒株均可用于制备或筛选白念珠菌治疗 药物。 附图说明 0026 图 1 ： 基因缺失菌株的鉴定 0027 图 2 ： SUMO 缺失株在生长方面迟缓的实验结果 0028 图 3 ： SUMO 缺失株的菌落及细胞形态的实验结果 0029 图 4 ： 验证 SUMO 参与。

22、了 Wor1 的翻译后修饰的实验结果 0030 图 5 ： SUMO 在白念珠菌毒性方面作用的实验结果 具体实施方式 0031 在进一步描述本发明具体实施方式之前， 应理解， 本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案 ； 还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围。 0032 白念珠菌 （Candida albicans） 是一种人体机会性致病真菌， 可以引起广泛的感 染， 但是其真正的致病因子和致病机理还没有完全研究清楚。 已有研究表明， 白念珠菌存在 与其致病性密切相关的两种形态转换方式 ： 酵母 - 菌丝发育以及白灰形态。

23、转换。本发明利 用 URA-BLAST 策略对白念珠菌中唯一的 SUMO 基因 SMT3 进行了基因敲除。敲除后的 smt3/ smt3 在生长方面出现严重缺陷， 即便是在丰富培养基中也只能缓慢生长， 并且伴随菌落及 说 明 书 CN 104342375 A 5 4/9 页 6 细胞形态方面的异常 ； 同时， 在白灰转换实验中， smt3/smt3 对促进白灰转换的刺激条件不 敏感， 白灰转换效率比同样处理的野生型显著降低， 而且形成的灰菌菌落不稳定， 在低温条 件下也能转换到白菌状态或者丝状生长状态。小鼠毒理实验结果表明， smt3/smt3 在系统 感染中的毒力显著下降。 0033 本发明。

24、的白念珠菌 SMT3 基因可用 CaSMT3 表示， 在不会与酿酒酵母 SMT3 基因混淆 的情况下也用 SMT3 表示， 白念珠菌 SMT3 基因缺失株用 smt3/smt3 表示。 0034 基本实验方法 ： 0035 方法 1 ： 白念珠菌基因组 DNA 抽提 0036 白念珠菌培养过夜用 ddH2O 洗 1 次， 悬浮在 500l 溶液 A 中 （1M 山梨醇 , 100mM EDTA pH8.0） ， 加入 5l 20mg/ml 的 Zymolase， 37放置 1 小时后， 高速离心去上清， 细胞 用 500l of TE buffer（20mM TrisHCl pH7.5, 1m。

25、M EDTA） 洗一次， 悬浮在 350l of TE buffer 中， 并加入 90l of 溶液 B（250mM EDTA pH8.0, 400mM Tris HCl pH8.0, 2% SDS） , 65放置 30 分钟， 加入 80l of 5M KAc， 冰上放置 1 小时， 高速离心 5 分钟， 吸取 上清并加入1ml的无水乙醇， -20放置20分钟， 高速离心5分钟， 沉淀用70乙醇洗一次， 离心后烘干。 0037 方法 2 ： 白念珠菌的转化 0038 准备PEGLiAc溶液 （pH 7.5） 10m1 ； 在1.5mI Eppendof管中依次加入质粒5g， 10l10mg。

26、/ml 鱼精 DNA， 混匀 ； 加入 01ml 感受态细胞和 06m1 PEG LiAc， votex 混匀 ； 30 200rpm 培养 30min ； 加入 70l DMSO， 轻轻混匀 ； 42热冲击 15min， 期间不时轻轻摇 匀 ； 冰浴 2min ： 高速离心 15s， 吸掉上清， 用 02m1 TE 重悬细胞 ； 涂布于适当的营养筛选 SD 平板上。 0039 方法 3 ： 小鼠系统感染 0040 以体重在 16-18g ICR 雄性小鼠为实验对象， 通过尾静脉注射 100l 白念珠菌各 种菌株， 并培养观测 25 天。各个菌株分高低两个浓度注射， 注射浓度分别为 5l07细。

27、胞 毫升和 5l06细胞毫升。 0041 方法 4 ： 免疫共沉淀与 Western 杂交 0042 白念珠菌表达菌株在 YPD 培养基中于 30培养至饱和， 按 A600 0.05 转接于 YPD 培养基中于 25培养 6h， 至 A600为 0.6-1.0 或在 YPD+10 Serum 培养基中于 37培养 3.5h， 50ml 培养物离心收集， 10ml 无菌水洗一次。以下步骤均在 4进行。细胞重悬于 0.5ml酵母细胞裂解液 （200mM Tris-HCl pH8.0,400mM(NH4)2SO4,10mM MgCl2,1mM EDTA,10% Glycerol,7mM -merca。

28、ptoethanol,2mM benzamidine,1mM PMSF,2g/ml pepstatin A,2g/ml leupeptin,4g/ml antipain） ， 加入 0.4g 酸洗玻璃珠 （425-600m， Sigma） 。 在振荡器 FP120 上振 3 次， 每次 30s， 间隔冰浴 5min。裂解液 12,000rpm 离心 5min， 上清再 离心 5min， 收集上清并测定蛋白浓度， -70保存。 0043 取500l细胞抽提物， 与等体积的IP Buffer混合， 加入10l床体积的protein G agarose beads， 在 4旋转混合 1 小时后低速离。

29、心， 吸取上清加入 5g 的 FLAG 单抗， 在 4旋转混合 1 小时， 然后加入 30l 床体积的 protein G agarose beads， 继续混合 2 小 时。用 IP Buffer 洗免疫共沉淀物五次， 然后重悬在 2 蛋白质电泳上样缓冲液中， 进行 SDS-PAGE电泳。 用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上， 用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液 说 明 书 CN 104342375 A 6 5/9 页 7 封闭膜 2-3 小时， 一抗 4结合过夜。用 TBS-T 室温洗膜 1 次， 5 分钟。用相应的二抗于室 温结合 1 小时， 再用 TBS-T 洗膜四次， 每次 5 分钟。

30、， 用 ECL 试剂显色。 0044 实施例 1 smt3/smt3 双敲除白念珠菌株的构建 0045 通过同源重组的方法对白念珠菌中表达 SUMO 的 SMT3 基因的两个拷贝进行了敲 除。敲除株通过 PCR 进行了基因型鉴定， 具体方法如下 ： 0046 1. 第一条染色体 SMT3 基因的敲除 0047 用引物 SMT3-UP-F（SEQ ID NO ： 1） 和引物 SMT3-UP-R（SEQ ID NO ： 2） 从野生型 菌株 SC5314 基因组 DNA 中扩增 SMT3 的上游序列片段约 300bp， 利用 XhoI PstI 酶切连 接到载体 pCUB6 中， 得到质粒 pK。

31、O-SMT3Up。再以引物 SMT3-DOWN-F（SEQ ID NO ： 3） 和引物 SMT3-DOWN-R（SEQ ID NO ： 4） 从野生型菌株 SC5314 基因组中扩增得到 SMT3 的下游序列约 300bp， 以 BamHI NotI 酶切连接到 pKO-SMT3Up 中， 得到敲除质粒 pSMT3KO 。所得质粒 经扩增后以 XhoI 和 SstI 酶切后转化入野生型菌 （JYC5， 来自 SC5314 的 MTLa/a 型菌） 。 0048 2.SMT3 基因第二个拷贝的敲除 0049 第二拷贝敲除质粒的构建与第一拷贝类似， 只是为了避免第二轮转化时重组替换 掉第一轮正确。

32、敲除的基因座， 用于敲除重组的 SMT3 下游片段扩增了 400bp， 具体方法如下。 0050 敲除质粒 pSMT3KO 的构建 ： 用引物 SMT3-UP-F（SEQ ID NO ： 1）和 SMT3-UP-R （SEQ ID NO ： 2） 从野生型菌株 SC5314 基因组 DNA 中扩增 SMT3 的上游序列片段约 300bp， 利 用 XhoI PstI 酶切连接到载体 pCUB6 中， 得到质粒 pKO-SMT3Up。再以引物 SMT3-DOWN-F （SEQ ID NO ： 3） 和引物 SMT3-DOWN400-R（SEQ ID NO ： 5） 从基因组中扩增得到 SMT3 。

33、的下游 序列约 400bp， 以 BamHI NotI 酶切连接到 pKO-SMT3Up 中， 得到敲除质粒 pSMT3KO 。所 得敲除质粒经酶切后转化入步骤 1 所得的第一拷贝敲除的菌株， 经细胞内同源重组后得到 第二拷贝 SMT3 敲除的 smt3/smt3 双敲除白念珠菌株。 0051 3. 双拷贝缺失菌株的鉴定 0052 通过 PCR 的方法对敲除子进行鉴定 ： 分别以 SMT3 基因座上游引物 （SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NOA ： 11） 、 开放阅读框内引物 （SEQ ID NOA ： 8 和 SEQ ID NOA ： 10， SEQ ID NOA ： 9 。

34、和 SEQ ID NOA ： 11） 以及敲除质粒引物 （SEQ ID NOA ： 8 和 SEQ ID NOA ： 7） 进行 PCR 鉴定， 具 体鉴定结果见附图 1。 0053 表 1 SMT3 敲除及鉴定所用引物 0054 0055 说 明 书 CN 104342375 A 7 6/9 页 8 0056 实施例 2 SUMO 在白念珠菌细胞生长中的功能 0057 SUMO缺失株smt3/smt3在生长方面出现严重缺陷， 即便是在丰富的YPD培养基中， 其生长也出现显著迟缓。本实施例分别在固体及液体培养基中展示了 SUMO 对于白念珠菌 生长速度的影响， 具体方法如下 ： 0058 1.。

35、 实验对象 ： 实施例 1 制备的 smt3/smt3 双敲除白念珠菌株作为实验样， 以未处 理的野生型白念珠菌株 （WT 即 SC5314) 作为对照样。 0059 2. 实验方法 0060 获得 smt3/smt3 敲除株的时候发现其转化子生长非常缓慢， 因此在缺失株鉴定完 成后， 为了确切地说明 SUMO 在白念珠菌细胞生长过程中的功能， 对其生长曲线进行测定。 0061 取过夜培养的野生型 SC5314(Wildtype) 及 SUMO 缺失株 （smt3/smt3） 菌液， 按照 终浓度为 OD600=0.1 转接到 3mL 新鲜 YPD 液体培养基中， 置于 30， 240rpm 。

36、下培养， 每隔 45 分钟取样监测其 OD600值， 实验结果见图 2A。 0062 同时， 在固体 YPD 平板上做了菌落生长实验。取过夜培养的野生型及缺失株菌液， 分别按浓度梯度稀释至 107、 106、 105、 104、 103、 102细胞 /mL， 然后各取 1mL 点在 YPD 平板上， 置于 30培养箱中， 培养约 2 天后取出观察菌落生长情况， 结果如图 2B 所示。 0063 3. 实验结论 0064 图 2 的 A 和 B 分别为在液体及固体培养基中 SUMO 对于白念珠菌生长速度的影响。 由图 2 可知， SUMO 缺失株 smt3/smt3 在生长方面出现严重缺陷 ；。

37、 即便是在丰富的 YPD 培养 基中， 其生长也出现显著迟缓。 0065 实施例 3SUMO 在白念珠菌形态发生及维持过程中的功能 0066 1. 实验方法 0067 鉴于SUMO缺失株smt3/smt3在生长速度方面的异常， 对其在白念珠菌形态发生方 面的表型进行进一步的考查。 0068 将过夜培养的 smt3/smt3 菌液转接到丰富的培养基 YPD 平板上， 在 30培养箱中 培养约 7 天后， 观察其菌落形态 ； 以野生型白念珠菌株 （SC5314) 作对照。 0069 2. 实验结果 0070 实验结果如图 3 所示 ： smt3/smt3 双敲除菌株在空气培养条件下出现菌落不均一 。

38、性， 归为白菌菌落 （Wh） ， 灰菌菌落 （Op） 和皱褶状菌落 （如图 3 中 b、 d、 e 所示） ， 图 3 展示了这 三种菌落形态。 0071 对这三种菌落形态分别取样观察了细胞形态， 分别见图 3 中 g、 i、 j、 k， 这三种菌落 对应的细胞形态异于相应的野生型菌。同时还发现 smt3/smt3 在空气培养条件下出现类似 假菌丝的生长形态。联系到此前对于 Septin 的研究结果， 推测这是由于 Septin 的组织障 碍， 细胞分裂受阻而导致的异常生长形态。 0072 在白灰形态转换方面， smt3/smt3 也出现明显的缺陷。具体表现是对常见的促进 白灰转换的刺激响应滞。

39、后 ： 例如， 在 CO2培养条件下， 相比野生型菌， smt3/smt3 的白灰转换 说 明 书 CN 104342375 A 8 7/9 页 9 能力显著降低。同时， smt3/smt3 的灰菌不稳定， 能以很高的比率转换回白菌形态。 0073 综合以上结论可知， SUMO 的缺失在两个方面影响了白灰转换 ： 一是导致白灰转换 的效率降低 ； 二是导致灰菌状态不稳定。 0074 实施例 4SUMO 在调控因子 Wor1 翻译后修饰中的作用 0075 一、 SUMO 翻译后修饰作用的初步验证 0076 1. 实验材料 0077 为了便于检测内源的 Wor1 蛋白， 实验通过在该蛋白开放阅读框。

40、的 3 端整合了一 段编码 HA 标签的序列， 从而获得 Wor1-HA 融合蛋白。 0078 整合了WOR1-HA的野生型菌株的构建 ： 设计包含WOR1orf末端60bp以及包含WOR1 下游 60bp 的两条引物 （表 2SEQ ID NO ： 12-13 所示） ， 以 pJI HA-CaURA3-HA（来自 Jinmi Kim 实验室， K.-H.Lee et al.Biochemical and Biophysical Research Communications 337,2005） 为模版， PCR 法扩增 HA-URA3-HA 片段。PCR 产物经浓缩后转化入亲本菌 ( 来自。

41、 SC5314的MTLa/a型菌)， 经鉴定为阳性的转化子划至含有5-FOA的平板， 促使URA3基因 环出， 以便后续转化。 0079 整合了 WOR1-HA 的 smt3/smt3 缺失型菌株的构建 ： 设计包含 WOR1orf 末端 60bp 以 及包含 WOR1 下游 60bp 的两条引物 （表 1SEQ ID NO ： 12-13 所示） ， 以 pJI HA-CaURA3-HA 为 模版， PCR 扩增 HA-URA3-HA 片段。PCR 产物经浓缩后转化入实施例 1 构建的 smt3/smt3 缺 失型菌株， 经鉴定为阳性的转化子划至含有5-FOA的平板， 促使URA3基因环出，。

42、 以便后续 转化。 0080 表 2 整合 WOR1-HA 菌株构建所用引物 0081 0082 2. 实验方法 ： 0083 为了获得 Wor1 表达的克隆， 将上述野生型及 smt3/smt3 中 WOR1 整合了 HA 标签 的菌株通过 CO2刺激得到灰菌菌落， 对灰菌菌落进行扩大培养， 收取菌体并提取总蛋白用于 Western blot 检测及免疫沉淀分析。 0084 具体方法为 ： 将整合了 WOR1-HA 的野生型及 smt3/smt3 划线于 pH 为 6.8 的 SD 平 板， 置于 20 CO2、 常温下培养， 直至长出灰菌菌落。将所得的灰菌菌落转接到液体中并扩 大培养， 对。

43、所得培养物抽提总蛋白， 对灰菌培养物的总蛋白进行Western blot检测， 实验结 果见图 4B。 0085 3. 实验结果分析 0086 由图 4B 可知， 在 Wor1 自身条带的上方 12KDa 的位置检测到一条带， 将其定义为 HMW（Higher Molecular Weight） 条带， 从条带大小推测其为 Wor1 的 SUMO 化修饰条带 ； 而 在 smt3/smt3 中并未检测到这一 HMW 条带。这些结果显示， Wor1 在其调控白灰转换的过程 说 明 书 CN 104342375 A 9 8/9 页 10 中发生了 SUMO 化修饰。推测 Wor1 可能发生了 SU。

44、MO 化修饰并借此调控其功能。 0087 二、 SUMO 翻译后修饰作用的进一步验证 0088 1. 实验材料 0089 his-SMT3 融合表达的质粒的构建方法为 ： 以引物 SEQ ID NO ： 14 和引物 SEQ ID NO ： 15 从 SC5314 基因组中扩增出 SMT3 基因， 以 BglII+ClaI 酶切处理后连接到 pBA1 载体 （BES116+ADH1promoter， 来自刘浩平实验室） 中， 得到 his-SMT3-pBA1， 在白念珠菌 ADH1 启 动子的控制下实现 his-SMT3 的融合表达。 0090 Smt3抗体的制备 ： 以SEQ ID NO ：。

45、 16和SEQ ID NO ： 17所示序列的引物从SC5314基 因组 DNA 中扩增出 SMT3 基因开放阅读框片段， 使用 NcoI 和 XhoI 双酶切后插入到 pET-28a 载体 （Novagene） 中， 得到 his-SMT3 原核表达质粒。将上述 his-SMT3 表达质粒转化入原 核表达菌株 BL21 中， 以 IPTG 诱导其表达， 表达出来的融合蛋白 his-Smt3 经镍柱 （Ni-NTA Sefinose Resin） 富集纯化， 得到终浓度约 5mg/mL、 纯度 95以上的原核蛋白。依次作为 抗原免疫兔子获得兔源的抗血清， 经 proA-Agarose 纯化获得。

46、抗白念珠菌 SUMO 蛋白的抗体 （-Smt3） 。 0091 表 3 SMT3 原核表达质粒及白念珠菌中 his-SMT3 融合表达质粒构建所用的引物 0092 0093 2. 实验方法 0094 为了进一步验证检测到的 HMW 条带为 SUMO 化修饰条带， 将构建的 his-SMT3 融合 表达的质粒导入步骤一中制备的整合了 WOR1-HA 的野生型菌株作为实验组 （His-Smt3） ； 同 时， 以导入了pBA1载体的整合了WOR1-HA的野生型菌株作为空载体对照组(untagged)。 通 过 CO2 刺激获得灰菌培养物， 扩大培养， 抽提总蛋白， 通过镍柱 （Ni-NTA） 进行。

47、富集纯化。纯 化到的蛋白以 HA 抗体检测是否有 Wor1 蛋白。同时以制备的 Smt3 抗体进行免疫沉淀作为 对照， 实验结果见图 4A。 0095 3. 实验结果分析 0096 如图 4A 所示， 在导入了融合表达的 his-SMT3-pBA1 质粒的菌株中， 菌体裂解液经 Ni-NTA富集纯化获得的样品经Western blot检测， 得到一条Wor1的条带， 该条带的位置与 之前所述的 Wor1 的 HMW 条带位置一致， 同时， 在没有 his-SMT3 标签的对照菌株对应的泳道 则未检测到 Wor1 条带。因此， 经 Ni-NTA 富集纯化得到的蛋白即为带有 SUMO（在该菌种中 。

48、具体为 His-Smt3） 修饰的 Wor1 蛋白。 0097 同时， 作为对照， 我们以纯化过的抗 Smt3 抗血清对上述裂解液进行免疫沉淀分 析， 结果是两个菌株的裂解液中都有SUMO修饰的Wor1。 这证明我们导入的融合表达质粒对 Wor1 蛋白的状态没有影响， 在没有导入标签的菌株中 SUMO 化的 Wor1 只是不能被镍柱富集 下来。 0098 综合以上， 我们通过镍柱富集纯化以及免疫沉淀的方法， 证明了 Wor1 在白念珠菌 说 明 书 CN 104342375 A 10 9/9 页 11 中是存在 SUMO 化修饰的。 0099 实施例 5CaSMT3 基因缺失的白念珠菌减毒株的毒性 0100 为了进一步阐述 SUMO 对于形态转换的影响以及在白念珠菌致病性中扮演的角 色， 本实施例对缺失株 smt3/smt3 进行了小鼠系统感染实验。 0101 1. 实验对象 ： 0102 体重在 16 18g ICR 雄性小鼠 ； 0103 实施例 1 制备的 smt3/smt3 双敲除白念珠菌株， 野生型白念珠菌株 （WT， SC5314) 0104 2. 实验方法 0105 以体重在 16 18g ICR 雄性小鼠作为实验对象， 分为实验组 （smt3/smt3） 和对照 组 （wildtype） ， 每组 6 只小鼠， 通过尾静脉注射 100l 。