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1、(10)申请公布号 CN 104342420 A (43)申请公布日 2015.02.11 CN 104342420 A (21)申请号 201310325056.X (22)申请日 2013.07.30 C12N 9/42(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 38/47(2006.01) A61K 47/48(2006.01) (71)申请人 惠觅宙 地址 浙江省杭州市江。
2、干区运河东路运新花 苑五区 (72)发明人 惠觅宙 刘珊 吴书音 谢波 张欣 (74)专利代理机构 北京方韬法业专利代理事务 所 11303 代理人 马丽莲 (54) 发明名称 一种重组长效人透明质酸酶、 其编码基因、 生 产方法及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种重组长效人透明质酸酶， 为人透明质酸酶 PH20 细胞外部分与人源蛋白 （人 白蛋白 HSA 片段或人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段） 的 融合蛋白 PH20-HSA 或 PH20-IgFc， 其氨基酸序列 分别如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示， 具有体 内安全性高、 半衰期长的优点 ； 本发明还公开了 上述。
3、重组长效人透明质酸酶的编码基因、 表达载 体、 宿主细胞、 生产方法及稳定制剂， 使用富含 GC 高表达系统表达和中国地仓鼠细胞 （CHO） 生产可 达到工业化水平和得到有活性能纯化的产物 ； 本 发明还公开了上述重组长效人透明质酸酶在配合 给药及生产小分子透明质酸中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 31 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书31页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104342420 A CN 104342420 A 1/1 页 2 1. 一种重组长效人透明质酸酶， 其特征在于， 为。
4、人透明质酸酶 PH20 细胞外部分与人源 蛋白的融合蛋白， 所述人源蛋白为人白蛋白 HSA 片段或人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段 ； 人透明质酸酶PH20细胞外部分与人白蛋白HSA片段的融合蛋白为PH20-HSA， 其氨基酸 序列如 SEQ ID No.4 所示 ； 人透明质酸酶PH20细胞外部分与人免疫球蛋白IgG2Fc片段的融合蛋白为PH20-IgFc， 其氨基酸序列如 SEQ ID No.5 所示。 2. 一种权利要求 1 所述重组长效人透明质酸酶的编码基因， 其特征在于， 其基因序列 如 SEQ ID No.6 或 SEQ ID No.7 所示。 3. 一种表达载体， 其特征在于， 。
5、含有权利要求 2 所述的基因。 4. 一种宿主细胞， 其特征在于， 含有权利要求 2 所述的基因。 5. 一种权利要求 1 所述的人透明质酸酶的生产方法， 其特征在于， 使用富含 GC 的动物 细胞表达载体 pMH3、 pMH4 或 pMH5 在中国地仓鼠细胞 CHO 内表达基因序列 SEQ ID No.6 或 SEQ ID No.7， 然后进行分离纯化即得 ； 所述表达载体pMH3、 pMH4或pMH5的基因序列分别如 SEQIDNo.8、 9、 10 所示。 6. 根据权利要求 5 所述的人透明质酸酶的生产方法， 其特征在于， 所述 PH20-HSA 使用 ProteinA 亲和纯化方法进。
6、行分离纯化 ； 所述 PH20-IgFc 采用离子串联疏水蓝胶方法进行分 离纯化。 7. 一种制剂， 其特征在于， 稳定储存有权利要求 1 所述的人透明质酸酶， 所述制剂包括 150-1500IU的PH20-HSA或者PH20-IgFc， 10mM Na2HPO4， 0.03%CaCl2， 0.1%EDTA-Na2， 145mM NaCl， 0.1%HSA， 且 pH 值为 5.5-7.5。 8. 一种复方制剂， 其特征在于， 包括权利要求 7 所述的稳定储存有人透明质酸酶的制 剂和特定治疗药物。 9. 权利要求 1 所述的重组长效人透明质酸酶在配合给药中的应用， 其特征在于， 将重 组长效人。
7、透明质酸酶活性在不被降解的情况下传递到人白蛋白或人免疫球蛋白结合的组 织、 器官、 部位 ； 或将特定治疗药物传递到疾病所在的组织、 器官或部位。 10.权利要求1所述的重组长效透明质酸酶的IgFc和HSA片段提供非功能位点来化学 偶联诊断剂、 显影剂、 药物、 治疗用毒素、 基因进入疾病组织器官。 11. 权利要求 1 所述的重组长效人透明质酸酶在工业生产小分子透明质酸中的应用， 其特征在于， 所述重组长效人透明质酸酶作为工具酶降解大分子透明质酸产生小分子透明 质酸。 权 利 要 求 书 CN 104342420 A 2 1/31 页 3 一种重组长效人透明质酸酶、 其编码基因、 生产方法及。
8、应用 技术领域 0001 本发明主要涉及生物技术领域， 特别是涉及一种重组长效人透明质酸酶、 其编码 基因、 生产方法及应用。 背景技术 0002 透明质酸是真皮中主要的粘多糖形式， 是由重复的二糖单元 D- 葡萄糖醛酸及 N- 乙酰葡糖胺组成的线性多糖。透明质酸能够保持超过自身重量 500 倍的水分， 形成非常 粘稠的溶液， 填充在胞外基质胶原蛋白纤维骨架之内， 影响胞外基质的传质特征。 胞外基质 是许多药物进行皮下注射的主要障碍。 胶原蛋白纤维构成的固态基架与嵌入富含透明质酸 的黏性凝胶， 造成一定的传质阻力， 限制了药物代谢动力学以及能够从同一位点进行皮下 注射的液体体积， 以及到达血管。
9、的速度和数量。 0003 透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族， 通过催化透明质酸的水解， 透明质酸酶降 低透明质酸的黏度， 可逆性地改变真皮的结构， 由此提高组织的通透性。 透明质酸酶半衰期 15-20h， 在体内更新时间短， 皮肤能够快速修复。 基于透明质酸酶的打通胞外基质屏障给药 是一种新型高效给药平台。 根据作用机理与降解产物的不同， 可将透明质酸酶分为三类， 第 一类包括-D-乙酰-D-己糖胺酶， 将高分子量底物降解成四糖作为主要的终产物。 睾丸透 明质酸酶是这一种类的原型， 它能够催化转糖基作用， 因此， 在水解透明质酸的过程中也会 形成六碳糖、 二糖以及八碳糖。第二类， 以水蛭透明质。
10、酸酶为代表的透明质酸酶。第三类， 细菌透明质酸酶， 是一种裂解酶。 0004 自 1940s 以来， 动物组织中提取的含透明质酸酶活性的扩散因子已作为促扩散剂 用于临床给药， 但是其应用范围一直限定于紧急情况， 主要是因为对成分不完全明确的酶 制剂中其他杂质成分的顾虑。动物组织提取透明质酸酶制剂中有效成分小于 1%， 绝大部分 为异源杂质蛋白。继中性人透明质酸酶基因发现之后， 采用 DNA 来源的重组人源透明质酸 酶 （rHuPH20） 取代动物源纯化的透明质酸酶， 降低了免疫原性， 提升了安全性， 应用范围也 随之扩大， 主要用于皮下输液、 眼周手术麻醉、 化药和生物药促渗、 尿路造影术中造。
11、影剂的 吸收。 0005 在许多实体瘤 （包括前列腺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 结肠癌以及非小细胞肺癌） 细胞表 面都有透明质酸的富集， 富含透明质酸的细胞微环境常与肿瘤发展之间存在关联， 提供了 恶性肿瘤生长扩散的条件。 采用透明质酸酶处理肿瘤生长的组织或器官或处理肿瘤细胞表 面的透明质酸包裹层并联合肿瘤治疗药物， 提供了一种抗癌新策略。 0006 但未改造的 rHuPH20 体内血液中半衰期短于 1 分钟， 无法经血液输入并实现体内 治疗的效果， 已有人使用聚乙二醇化学偶联 rHuPH20， 生产了长效人透明质酸酶， 并已用于 人类临床实验治疗肿瘤。 0007 另一方面， 透明质酸酶能够降解。
12、人工生产的重组大分子量透明质酸， 产生出小分 子量透明质酸。小分子量透明质酸， 包括含 3-10 个双糖单位的小分子量透明质酸寡糖 （oHA） 能激活内皮细胞表面 CD44 并促进内皮细胞增殖， 还能与血管内皮生长因子 （VEGF） 相 说 明 书 CN 104342420 A 3 2/31 页 4 协同， 促进内皮细胞血管新生， 是有生物效应的透明质酸形式。 0008 因此， 小分子量透明质酸在化妆品领域应用广泛， 因其分子量小， 能渗入皮肤真皮 层真皮， 具有较强的生物效应。而目前工业生产小分子量透明质酸多采用酸碱降解或者超 声降解。 发明内容 0009 本发明的目的是提供一种体内安全性高。
13、、 半衰期长的重组长效人透明质酸酶。 0010 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 一种重组长效人透明质酸酶， 为人透 明质酸酶PH20细胞外部分与人源蛋白的融合蛋白， 所述人源蛋白为人白蛋白HSA片段或人 免疫球蛋白 IgG2Fc 片段 ； 人透明质酸酶 PH20 细胞外部分与人白蛋白 HSA 片段的融合蛋白 为 PH20-HSA， 其氨基酸序列如 SEQ ID No.4 所示 ； 人透明质酸酶 PH20 细胞外部分与人免疫 球蛋白 IgG2Fc 片段的融合蛋白为 PH20-IgFc， 其氨基酸序列如 SEQ ID No.5 所示。 0011 本发明的第二个目的是提供一种上述重组长。
14、效人透明质酸酶的编码基因， 采用如 下技术方案 ： 其基因序列如 SEQ ID No.6 或 SEQ ID No.7 所示。 0012 本发明的第三个目的是提供一种包含SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示基因序列 的表达载体及宿主细胞。 0013 本发明的第四个目的是提供上述人透明质酸酶的生产方法， 采用如下技术方案 ： 使用富含 GC 的动物细胞表达载体 pMH3、 pMH4 或 pMH5 在中国地仓鼠细胞 CHO 内表达基因序 列SEQ ID No.6或SEQ ID No.7， 然后进行分离纯化即得 ； 所述表达载体pMH3、 pMH4或pMH5 的基因序列分别如 SEQ I。
15、D No.8、 9、 10 所示。 0014 进一步地， 所述 PH20-HSA 使用 ProteinA 亲和纯化方法进行分离纯化 ； 所述 PH20-IgFc 采用离子串联疏水串联蓝胶串联离子方法进行分离纯化。 0015 本发明的第五个目的是提供一种稳定储存有上述人透明质酸酶的制剂， 采用 如下技术方案 ： 所述制剂包括 150-1500IU 的 PH20-HSA 或者 PH20-IgFc， 10mM Na2HPO4， 0.03%CaCl2， 0.1%EDTA-Na2， 145mM NaCl， 0.1%HSA， 且 pH 值为 5.5-7.5。 0016 本发明的第六个目的是提供一种复方制剂。
16、， 采用如下技术方方案 ： 复方制剂包括 上述的稳定储存有人透明质酸酶的制剂和特定治疗药物。 0017 本发明的第七个目的是提供上述重组长效人透明质酸酶在配合给药中的应用， 采 用如下技术方方案 ： 将重组长效人透明质酸酶活性在不被降解的情况下传递到人白蛋白或 人免疫球蛋白结合的组织、 器官、 部位 ； 或将特定治疗药物传递到疾病所在的组织、 器官或 部位。 0018 本发明的第八个目的是提供上述重组长效透明质酸酶应用， 其中的IgFc和HSA片 段提供非功能位点来化学偶联诊断剂、 显影剂、 药物、 治疗用毒素、 基因进入疾病组织器官。 0019 本发明的第九个目的是提供上述重组长效人透明质酸。
17、酶在工业生产小分子透明 质酸中的应用， 采用如下技术方案 ： 所述重组长效人透明质酸酶作为工具酶降解大分子透 明质酸产生小分子透明质酸。 0020 由于采用上述技术方案， 本发明至少具有以下优点 ： 0021 （1） 人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段和人白蛋白 HSA 片段融合人透明质酸酶后， 延长了 人透明质酸酶的血液内半衰期， 可以经血液或其他方法输送到疾病部位， 有效期延长。 说 明 书 CN 104342420 A 4 3/31 页 5 0022 （2） 人免疫球蛋白IgG2Fc片段和人白蛋白HSA片段可以和人体内特定的受体和结 合蛋白结合， 可以将融合的人透明质酸酶携带到这些部位。 。
18、0023 （3） 与聚乙二醇化学偶联的人透明质酸酶 rHuPH20 相比， 人透明质酸酶人免疫球 蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 和人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 是 全人源蛋白质， 体内使用更安全。 0024 （4）虽然与透明质酸酶 rHuPH20 相比， 人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 体外活性 （比 活性） 降低， 但是他们的体内活性更优越。 0025 （5）本发明的 PH20-HSA 和 PH20-IgFc 哺乳动物细胞生产后， 可采用纯化 。
19、HSA 和 IgFc 的特异方法纯化， 在生产方法和生产价格方面优于聚乙二醇化学偶联 rHuPH20 生产长 效人透明质酸酶的方法。 0026 （6） 能否工业化生产人透明质酸酶长效融合蛋白对微生物表达系统是一个技术挑 战， 即使使用哺乳动物细胞液很难达到工业化水平和得到有活性能纯化的产物。本发明采 用富含 GC 的动物细胞表达载体和中国地仓鼠细胞 （CHO） 成功商业化生产了有活性能纯化 的人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段 融合蛋白 （PH20-IgFc） 。 0027 （7） 所述人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段。
20、融合蛋白 （PH20-IgFc） 和人透明 质酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 可用来做长效不易降解的工具酶， 降解大分子透明质 酸， 工业化生产小分子透明质酸。 0028 （8） 所述人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 和人透明 质酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 的 IgFc 和 HSA 片段可用提供非功能位点来化学偶联 诊断剂、 显影剂、 药物、 治疗用毒素、 基因进入疾病组织器官。 附图说明 0029 上述仅是本发明技术方案的概述， 为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 以下 结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
21、。 0030 图 1 是本发明的融合蛋白 PH20-IgFc37稳定性试验结果示意图。 0031 图 2 是本发明的融合蛋白 PH20-HSA37稳定性试验结果示意图。 0032 图3是本发明的融合蛋白PH20-IgFc和对照人透明质酸酶的比活性在大白鼠体内 实验结果示意图。 0033 图 4 是静脉注射 PH20-IgFc 动物 （A） 、 静脉注射 PH20-HSA 动物 （B） 、 静脉注射 PH20 动物 （C） 经皮下注射部位吸收 99mTc-sestamibi 的放射性吸收分布情况示意图。 0034 图 5 是 99mTc 标记的人透明质酸酶 PH20 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 。
22、IgG2Fc 片 段融合蛋白 PH20-IgFc 在大鼠体内的血液清除率情况。 0035 图 6 是 99mTc 标记的人透明质酸酶 PH20 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片 段融合蛋白 PH20-IgFc 在大鼠体内的分布情况。 具体实施方式 0036 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明， 应当理解此处所描述的优选实施 说 明 书 CN 104342420 A 5 4/31 页 6 例仅用于说明和解释本发明， 并不用于限定本发明。 0037 本发明主要是利用富含GC动物细胞表达技术(WO/2008/091276)和动物细胞反应 器 （WO2006/138143 和 WO2。
23、007/142664） 技术， 迅速生产出非聚乙二醇化学偶联 rHuPH20 的 长效人透明质酸酶， 包括人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白 PH20-HSA 和人透明质酸酶人免 疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 PH20-IgFc。人透明质酸酶 PH20， 其细胞外部分氨基酸序列 如SEQ ID No.1所示 ； 人白蛋白HSA片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示 ； 人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段的氨基酸序列如 SEQ ID No.3 所示。 0038 实施例一 0039 目的 ： 融合蛋白 PH20-HSA 或 PH20-IgFc 的基因构建、 表达、 免疫学检测、 活性检测 和。
24、反应器生产。 0040 方 法 ： 通 过 PCR 的 方 法 将 结 构 基 因 PH20-HSA（SEQIDNo.6）或 PH20-IgFc （SEQIDNo.7） 构建到富含 GC 的动物细胞表达载体 pMH3、 4、 5（SEQIDNo.8、 9、 10） 中。小量 制备这几种表达质粒后， 稳定转染到无血清悬浮培养的 CHO 细胞中。通过 G418 筛选， 用枪 头手动挑取稳定克隆到 96 孔板中。当细胞汇合度大于 50% 时， 更换无血清新鲜培养基 ； 3-6 小时后， 收集培养基样品， 通过抗IgG2Fc抗体点杂交或ELISA方法检测表达量， 选出表达量 最高的克隆多个， 继续在尖。
25、底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定性研究 ； 选出传代稳 定的克隆在 5L 激流式反应器内进行扩增。 0041 结果 ：（1）融合蛋白 PH20-IgFc 或 PH20-HSA 在 CHO 细胞中成功表达， 点杂交和 western blot 结果表明筛选到融合蛋白 PH20-IgFc 或 PH20-HSA 稳定高表达克隆所产生的 条带分子量大小正确 ；（2） 高表达克隆在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定 ；（3） 稳定的高表达克隆在 5L 激流式反应器内进行流加培养扩增， 各批次丰收液中透明质酸酶 活性达到 600-1000 活性单位 / 毫升， 达到了工业化生产水平。 0042 结。
26、论 ： 使用富含 GC 的动物细胞表达载体 pMH3、 4、 5， 融合蛋白 PH20-IgFc 或 PH20-HSA在CHO细胞中成功表达， 各批次丰收液中透明质酸酶活性达到600-1000活性单位 / 毫升， 可以满足工业化生产。 0043 实施例二 0044 目的 ： 融合蛋白 PH20-HSA 或 PH20-IgFc 的分离纯化。 0045 方法 ： 本实施例采用的蛋白分离纯化策略是 （1） PH20-IgFc 主要采用 ProteinA 亲 和纯化 ；（2） PH20-HSA 采用离子串联疏水蓝胶的纯化工艺。 0046 （1） PH20-IgFc 收液纯化。 0047 收获培养液后，。
27、 采用 5000rpm 离心 6min， 取离心上清液进行过滤， 三层滤膜孔 径分别为 0.8m， 0.45m， 0.22m。上样至已用平衡液 A 液 （20mM Tris+100mM NaCl， pH7.4） 平衡好的 Mabselect 柱子， 淋洗至基线不变后， 采用洗脱液 B 液 （100mM Gly+50mM Arg+0.01%Tween80， pH3.5） 进行洗脱。通过 SDS-PAGE 检测产物的分离纯化情况。 0048 （2） PH20-HSA 收液纯化 0049 PH20-HSA细胞培养液收液后， 采用5000rpm离心6min， 取离心上清液进行过滤， 三 层滤膜孔径分别。
28、为 0.8m， 0.45m， 0.22m。采用 Millipore30kDa 膜包将过滤后的上清 进行浓缩换液， 置换液为阴离子柱 QSFF 平衡缓冲液。 0050 将浓缩换液后蛋白液上样至已用 A 液 （20mMTris+50mMNaCl， pH7.4） 平衡好的 QSFF 说 明 书 CN 104342420 A 6 5/31 页 7 柱， 淋洗至基线不变后， 采用 C 液 （20mMTris+100mM NaCl， pH7.0） 预洗至基线不变， 用 E 液 （20mM Tris+450mM NaCl， pH7.0） 洗脱， 收集洗脱峰。 0051 将QSFF洗脱峰补加(NH4)2SO4。
29、至0.5M， 补加CaCl2至0.1mM， 调整pH至7.0， 以2ml/ min 流速上样至已用 A 液 （20mM Tris+0.5M(NH4)2SO4+0.1mMCaCl2， pH7.0） 平衡好的 Phenyl 柱， 淋洗至基线不变后， E 液 （20mM Tris+0.25M(NH4)2SO4+0.1mMCaCl2， pH7.0） 进行预洗， 用 B 液 （20mM Tris+0.1mMCaCl2， pH7.0） 进行洗脱。 0052 将 Phenyl 洗脱峰组分用水稀释至电导为 20mS/cm， 并用 1M HCl/1M NaOH 调整 pH 至 7.0。上样至已用 I 液 （10。
30、mM Tris+150mM KCl， pH7.0） 平衡 Blue 柱， 上样， 用 F 液 （10mM Tris+600mM KCl， pH8.0） 进行洗脱， 采用 H 液 （10mM Tris+1.5M KCl+50% 乙二醇， pH8.0） 进 行 Strip， 流速为 1ml/min， 收集洗脱峰。通过 SDS-PAGE 检测产物的分离纯化情况。 0053 结果 ： 采用上述分离纯化策略， 融合蛋白 PH20-IgFc 或 PH20-HSA 的纯度在 95% 以 上， 收率大于 30%。 0054 结论 ： 融合蛋白 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 可以采用 IgFc 和 。
31、HSA 特异性纯化方法来 纯化， 纯化产量符合进一步做皮下注射药物的要求。 0055 实施例三 0056 目的 ： 融合蛋白 PH20-IgFc 或 PH20-HSA 的制剂和体内外活性研究 0057 方法 ： 透明质酸酶的融合蛋白 PH20-IgFc 注射液的制剂配方如下 ： 0058 PH20-IgFc+10mM Na2HPO4+0.03%CaCl2+0.1%EDTA-Na2+145mM NaCl+0.1%HSA， pH5.5-7.5 0059 将500U/mlPH20-IgFc过滤后的溶液分装至2ml安培瓶中， 将25瓶溶液置于37， 湿度为 755% 的加速试验培养箱中。分别在第 0、。
32、 7、 14、 21、 28、 35、 42 天取样按照 2010 版 药典附录玻璃酸酶活性检测， 稳定性试验结果 （表1、 图1） 显示， 从第28天开始， 透明质酸酶 的活性出现显著性下降 （约 15%） 。 0060 表 1PH20-IgFc37稳定性试验结果 0061 0062 0063 透明质酸酶的融合蛋白 PH20-HSA 注射液的制剂配方如下 ： 0064 150-1500IU PH20-HSA+10mM Na2HPO4+0.03%CaCl2+0.1EDTA-Na2+145mM 说 明 书 CN 104342420 A 7 6/31 页 8 NaCl+0.1%HSA， pH5.5。
33、-7.5 0065 稳定性试验 ： 将 500U/mlPH20-HSA 过滤后的溶液分装至 2ml 安培瓶中， 将 25 瓶溶 液置于 37， 湿度为 755% 的加速试验培养箱中。分别在第 0、 7、 14、 21、 28、 35、 42 天取样 按照 2010 版药典附录玻璃酸酶活性检测， 稳定性试验结果 （表 2、 图 2） 显示， 从第 28 天开 始， 透明质酸酶的活性出现显著性下降 （约 15%） 。 0066 表 2PH20-HSA37稳定性试验结果 0067 时间123平均值 （U/ml）偏差CV 1468513481487.1722.884.70 7420520534491.。
34、3362.1712.65 14496547507516.6726.845.19 21443489502478.0031.006.49 28486434450456.6726.635.83 35485459437460.3324.035.22 42447390448428.3333.207.75 0068 融合蛋白 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 的比活性和对照人透明质酸酶做了体外对比研 究， 通过建立幼鼠体内台盼蓝扩散模型， 测定了PH20-IgFc或PH20-HSA的体内活性， 还用于 血浆内半衰期测定。 0069 结果 ： 体外试管内制剂稳定性实验结果表明， 融合蛋白 PH20-。
35、IgFc 和 PH20-HSA 的 活性在以上制剂中 37 度的稳定性都大于 20 天， 活性损失小于 10%。 0070 体外试管内实验结果还表明， 对照生产的人透明质酸酶比活性为 110000 单位 / 毫克蛋白， 融合蛋白 PH20-IgFc 的比活性为 40000 单位 / 毫克蛋白， PH20-HSA 的比活性为 20000单位/毫克蛋白， 融合蛋白PH20-IgFc的比活性比对照生产的人透明质酸酶比活性低 40% 左右 ； 而 PH20-HSA 比活性仅为对照生产的人透明质酸酶 10% 左右。 0071 大白鼠体内血管内实验结果还表明， 对照生产的人透明质酸酶半衰期很短， 仅 为 。
36、1-2min， 融合蛋白 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 的半衰期长达 2.5h， 融合蛋白 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 的血液内半衰期是对照生产的人透明质酸酶比活性的 100 倍左右。 0072 结论 ： 融合蛋白 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 的活性在以上制剂中 37 度的稳定性大于 20天， 融合蛋白PH20-IgFc和PH20-HSA的体外比活性低于对照生产的人透明质酸酶的比活 性， 融合蛋白 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 的半衰期远大于对照生产的人透明质酸酶半衰期。 0073 本发明采用透明质酸降解活性和 Westernblot 的方法。
37、测定了融合蛋白的体内 半衰期。PH20-IgFc 或 PH20-HSA 较 PH20 在小鼠体内存在时间 （即半衰期）明显延长， 提 示 PH20-IgFc 或 PH20-HSA 其体内降解透明质酸效果也应该较 PH20 延长， 即药效延长。 PH20-IgFc 或 PH20-HSA 是比 PH20 更长效的降解透明质酸的药物。 说 明 书 CN 104342420 A 8 7/31 页 9 0074 实施例四 0075 目的 ： 测定融合蛋白 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 的 N 端 15 个氨基酸序列 0076 方法 ： 用 SDS-PAGE 电泳将样品分离后不染色， 用 CA。
38、PS 缓冲液将其电转至 PVDF 膜， 考马斯亮蓝染色、 漂洗、 脱色至无蓝色背景， 自然干燥后备用 ； 将目的蛋白条带剪下， 用 ABIPROCISETM494cLC 仪器， 按照蛋白质 N 端测序标准方法 （SCI-S-006） 进行蛋白质 N 端测 序。 0077 结果 ： 测序结果显示 N 端氨基酸序列为 Leu-Asn-Phe-Arg-Ala-Pro-Pro-Val-Ile- Pro-Asn-Val-Pro-Phe-Leu 与理论值相符合。 0078 实施例五 0079 目的 ： 人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 和人透明质 酸酶人白蛋白融。
39、合蛋白 （PH20-HSA） 降解大分子透明质酸活性。 0080 方法 ： 0081 1） 取 3 支 250ml 的三角瓶， 分别加入 100ml 纯化水， 标记为 1、 2、 3 号， 向每个三角 瓶中加入 1.17gNaCl， 使其浓度为 0.2mol/L， 调节 pH 为 7.0。 0082 2） 向每支三角瓶中各加入 1-3g 透明质酸干粉， 使其浓度为 10-30g/L， 溶解过夜。 0083 3） 待透明质酸完全溶解后， 向 1、 2、 3 号瓶中， 加入样品酶液， 样品中酶量分别为 6000U、 12000U、 18000U， 酶浓度分别为 60U/ml、 120U/ml， 1。
40、80U/ml ； 搅拌均匀后置于摇床内， 40酶切 4h。 0084 4） 等待酶切结束后将溶液温度增加至 80， 30min 进行酶灭活 ； 0085 5） 向三个样品中各加入 300ml95% 乙醇溶液沉淀， 待沉淀后弃去上清液， 用 95% 乙 醇脱水后抽滤。 0086 6） 抽滤后 60真空干燥， 用 HPLC 检测。 0087 结果 ： 溶解后透明质酸钠溶液为凝胶状液体， 酶切 2h 时， 3 支三角瓶中溶液开始变 稀， 呈现水状 ； HPLC 检测结果显示 ： 透明质酸的分子量与酶的用量有关， 酶的用量越大分子 量越小。 （60U/ml 时 500KDa ； 120U/ml 时 3。
41、00KDa ； 180U/ml 时 200KDa） 0088 结论 ： 所述人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 和人透 明质酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 可用来做长效不易降解的工具酶， 降解大分子透明 质酸， 工业化生产小分子透明质酸。 0089 实施例六 0090 目的 ： 应用放射性示踪显像比较研究生物促渗剂人透明质酸酶、 人透明质酸 酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 、 人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 强化组织药物吸收的效果。 0091 方法 ： 人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG。
42、2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 、 人透明质 酸酶人白蛋白融合蛋白 （PH20-HSA） 、 人透明质酸酶 （PH20） 经静脉分别注入四组健康 ICR 小鼠， 治疗后 2 小时， 在左或右大腿部位皮下注射 99mTc 标记的示踪剂甲氧基异丁基异腈 （99mTc-sestamibi） ， 应用高分辨小动物专用 相机获取活体鼠全身成像， 观测放射性标 记的药物模拟化合物皮下注射后吸收速度和全身组织分布。注 ： 99mTc-sestamibi 作为药 物替代物已多年用于肿瘤耐药评价 , 应用该法检测透明质酸酶强化药物吸收， 具有灵敏、 快速、 直观、 可靠等优点。 说 明 书 CN 。
43、104342420 A 9 8/31 页 10 0092 结果 ： 如图 4 所示， 静脉注射 PH20-IgFc 动物 （A） 、 静脉注射 PH20-HSA 动物 （B） 、 静 脉注射 PH20 动物 （C） 经皮下注射部位吸收 99mTc-sestamibi 的放射性吸收分布情况显示， PH20-IgFc和PH20-HSA治疗组小鼠体内99mTc-sestamibi的放射性分布及主要器官放射水 平明显高于 PH20 动物 , 经图像定量分析， 治疗后 2 小时， 在促进 99mTc-sestamibi 皮下吸 收性能上， PH20-IgFc 和 PH20-HSA 较 PH20 强 2.。
44、3 倍。 0093 结论 ： 由于 PH20-IgFc 和 PH20-HSA 血液半衰期的改变， PH20-IgFc 和 PH20-HSA 在 促进药物吸收方面， 明显优于 PH20。 0094 实施例七 0095 目的 ： 研究 99mTc 标记的人透明质酸酶 (PH20) 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 (PH20-IgFc) 的血浆半衰期。 0096 方法 ： 将 99mTc 标记的人透明质酸酶 (PH20 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 静脉注入到 Sprague Dawley 大鼠体内， 使用活体成像仪测定它 们。
45、的血浆半衰期 （Blood clearance(%peak)of99mTc-labeled PH20-Fc andPH20） 。 0097 结果 ： 如图 5 所示， 99mTc 标记的人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋 白 (PH20-IgFc) 的血浆半衰期明显比人透明质酸酶 (PH20) 的血浆半衰期长。 0098 结论 ： 人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白(PH20-IgFc)的血浆半衰 期明显比人透明质酸酶 (PH20) 的血浆半衰期长。 0099 实施例八 0100 目的 ： 研究 999mTc 标记的人透明质酸酶 (PH20) 和人透明质酸酶人免疫。
46、球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 (PH20-IgFc) 在大鼠体内的吸收分布。 0101 方法 ： 将 99mTc 标记的人透明质酸酶 (PH20 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 （PH20-IgFc） 静脉注入到 Sprague Dawley 大鼠体内， 3 小时后， 使用活体成像 仪定量测定它们在不同器官的吸收分布。 0102 结果 ： 如图 6 所示， 99mTc 标记的人透明质酸酶 (PH20) 和人透明质酸酶人免疫球 蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 (PH20-IgFc) 在大鼠体内的吸收分布不同。 0103 结论 ： 99mTc 标记的人透明质酸酶 (。
47、PH20) 和人透明质酸酶人免疫球蛋白 IgG2Fc 片段融合蛋白 (PH20-IgFc) 在大鼠体内的吸收分布不同。 0104 本发明采用哺乳动物细胞生产了非聚乙二醇化学偶联的长效重组融合人透明质 酸酶人白蛋白片段 （PH20-HSA）和透明质酸酶人免疫球蛋白 Fc 片段 （PH20-IgFc） ， 可使 rHuPH20 体内血液半衰期延长， 从而应用于肿瘤治疗。本发明的 PH20-HSA 和 PH20-IgFc 哺 乳动物细胞生产后， 可采用纯化 HSA 和 IgFc 的特异方法纯化， 在生产方法和生产价格方面 优于聚乙二醇化学偶联 rHuPH20 生产长效人透明质酸酶的方法。另外， HS。
48、A 和 IgFc 是人源 蛋白， 体内安全性优于聚乙二醇。 0105 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非对本发明作任何形式上的限制， 本 领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、 等同变化或修饰， 均落在本发 明的保护范围内。 0106 说 明 书 CN 104342420 A 10 9/31 页 11 0107 说 明 书 CN 104342420 A 11 10/31 页 12 0108 说 明 书 CN 104342420 A 12 11/31 页 13 0109 说 明 书 CN 104342420 A 13 12/31 页 14 0110 说 明 书 CN 1。
49、04342420 A 14 13/31 页 15 0111 说 明 书 CN 104342420 A 15 14/31 页 16 0112 说 明 书 CN 104342420 A 16 15/31 页 17 0113 说 明 书 CN 104342420 A 17 16/31 页 18 0114 说 明 书 CN 104342420 A 18 17/31 页 19 0115 说 明 书 CN 104342420 A 19 18/31 页 20 0116 说 明 书 CN 104342420 A 20 19/31 页 21 0117 说 明 书 CN 104342420 A 21 20/31 页 22 0118 说 明 书 CN 104342420 A 22 21/31 页 23。