使用防卫素对抗结核病 对序列表的参照
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发明背景
发明领域 本发明涉及结核病治疗，如用防卫素治疗由分枝杆菌属细菌 (Mycobacterium)， 例如结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 介导的疾病。
对相关技术的描述
结核病是一种由结核分枝杆菌感染介导的传染病。 结核病在发展中国家是一 种主要的疾病，并且在世界上发达地区也越来越成为问题。 尽管其感染可能在很长时 间内都不会有症状，但是该疾病最常见会以肺部的急性炎症为表现，导致发热和干咳 (nonproductive cough)。 如果不予治疗，通常会导致严重的并发症和死亡。 结核病通常 可通过抗生素疗法控制，如通过用下述药物治疗 ：异烟肼 (Isoniazid)，参见，例如， The Merck Index(Merck 索引 )，第 12 版，第 5203 项 ；利福平 (Rifampin(Rifampicin))，参 见，例如 TheMerck Index，第 12 版，第 8382 项 ；链霉素 (Streptomycin)，参见，例如 TheMerck Index，第 12 版，第 8983 项 ；但一个主要的问题是产生对上述抗生素具有抗药 性的菌株。
本发明的目标是提供基于防卫素的药物，及使用这些药物的方法，用于治疗由 分枝杆菌属细菌，例如，结核分枝杆菌介导的疾病。
发明内容
我们已经发现某些防卫素变体针对结核分枝杆菌显示良好的活性，且可用于治 疗由分枝杆菌属细菌导致的疾病，如结核病。
在一个方面，本发明提供用亲本防卫素的变体生产药物的用途，所述药物用于 治疗性处理由分枝杆菌属细菌介导的疾病，如结核病，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或 多个位置处的取代 ；其中所述变体能够杀灭或抑制结核分枝杆菌细胞 ；且其中所述亲本 防卫素是包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的氨基酸序列的多肽， 或由在高严紧条件下与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列或其互补链杂交的多核苷酸编 码的多肽。
在第二个方面，本发明提供亲本防卫素的变体，用于治疗性处理由分枝杆菌属 细菌介导的疾病，如结核病，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的多肽的位置 5、 9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个位置处的取代 ；其中所述 变体能够杀灭或抑制结核分枝杆菌细胞 ；且其中所述亲本防卫素是包含与 SEQ ID NO ： 2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的氨基酸序列的多肽，或由在高严紧条件下与 SEQ IDNO ：1 的成熟多肽编码序列或其互补链杂交的多核苷酸编码的多肽。
在第三个方面，本发明提供一种杀灭或抑制分枝杆菌属细菌细胞的方法，包括 将所述分枝杆菌属细菌细胞与亲本防卫素的变体接触，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的多肽的位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 位置处的取代 ；其中所述亲本防卫素是包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％ 同一性的氨基酸序列的多肽，或由在高严紧条件下与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列 或其互补链杂交的多核苷酸编码的多肽。
在另一个方面，本发明提供治疗由分枝杆菌属细菌介导的疾病的方法，包括 施与需要该治疗的受试者有效量的，例如，抗分枝杆菌有效量的 (anti-mycobacterium effective amount of) 亲本防卫素的变体，其中所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的多 肽的位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个位置处的取 代 ；且其中所述亲本防卫素是包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的 氨基酸序列的多肽，或由在高严紧条件下与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列或其互补 链杂交的多核苷酸编码的多肽。
致 病 性 的 分 枝 杆 菌 属 细 菌 包 括 结 核 分 枝 杆 菌、 牛 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium bovis)、 堪 萨 斯 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium kansasii)、 麻 风 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium leprae)、溃疡分枝杆菌 (Mycobacterium ulcerans) 和鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)。 由分枝杆菌属细菌介导的疾病包括分枝杆菌感染。 治疗 (treatment) 包括治疗和预防。 用 于根据本发明的用途或根据本发明用于治疗疾病的防卫素变体在后文中称为 “( 根据 ) 本 发明的防卫素”。
发明详述
本发明涉及供治疗由分枝杆菌属细菌介导的疾病的药物及其使用方法，其包括 亲本防卫素的变体，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9、 11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置处的取代 ；其中 所述变体能够杀灭或抑制结核分枝杆菌的生长。
定义
变体 ：术语 “变体” 在本文中定义为包含在 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的一个 或多个 ( 几个 ) 特定位置改变，如取代、插入和 / 或缺失一个或多个 ( 几个 ) 氨基酸残基 的多肽。 经改变的多核苷酸通过人为介入修饰 SEQ ID NO ：1 中公开的多核苷酸序列或 其同源序列得到。
防卫素 ：术语 “防卫素” 用于本文指本领域技术人员所识别属于抗微生物肽防 卫素类的多肽。 为确定一种多肽是否是根据本发明的防卫素，其氨基酸序列优选通过使 用可免费获得的 HMMER 软件包与 PFAM 数据库的隐蔽马尔科夫模型序型 (hidden markov model profile， HMM 序型 (HMM profile)) 比较 ( 参见实施例 1)。
PFAM 防卫素家族包括防卫素 _1 或 “哺乳类防卫素” ( 登录号 PF00323)、防卫 素 _2 或 “节肢动物防卫素” ( 登录号 PF01097)、防卫素 _β 或 “β 防卫素” ( 登录号 PF00711)、防卫素 _propep 或 “防卫素原肽” ( 登录号 PF00879) 与 γ- 硫素 (thionin) 或 “γ- 硫素家族” ( 登录号 PF00304)。
防卫素可属于 α- 防卫素类、 β- 防卫素类、 θ- 防卫素类、昆虫或节肢动物防卫素类、或植物防卫素类。
在一个实施方案中，根据本发明的防卫素的氨基酸序列包括 4、5、6、7、或 8 个半胱氨酸残基，优选 4、5、或 6 个半胱氨酸残基、更优选 4 或 6 个半胱氨酸残基、且最 优选 6 个半胱氨酸残基。
防卫素亦可为共有任何防卫素类特有特征的合成防卫素。
上述防卫素的实例包括但不仅限于 α- 防卫素 HNP-1( 人嗜中性粒细胞肽 )、 HNP-2 和 HNP-3 ；β- 防卫素 -12、果蝇霉素 (Drosomycin)、 Heliomicin、 γ1- 嘌呤硫 素 (γ1-purothionin)、昆虫防卫素 A、和 PCT 申请 WO 99/53053、 WO 02/06324、 WO 02/085934、 WO 03/044049、 WO 2006/050737 和 WO2006/053565 所公开的防卫素。
亲本防卫素 ：术语 “亲本” 防卫素用于本文指一种经修饰，例如，取代、插 入、缺失和 / 或截断 (truncation) 以产生本发明中使用的防卫素变体的防卫素。 该术语亦 指变体用以比较和比对的多肽。 所述亲本可为天然存在 ( 野生型 ) 的多肽或变体。 举例 而言，所述亲本多肽可为天然存在的多肽的变体，其氨基酸序列经修饰或改变。 亲本亦 可为等位基因变体，其为由占据相同染色体位点的基因的两种或更多可选形式中的任一 种所编码的多肽。 分离的变体或多肽 ：术语 “分离的变体” 或 “分离的多肽” 用于本文指一种自 来源分离的变体或多肽。 在一个方面，该变体或多肽至少是 1％纯的，优选至少是 5％ 纯的，更优选至少是 10％纯的，更优选至少是 20％纯的，更优选至少是 40％纯的，更优 选至少是 60％纯的，甚至更优选至少是 80％纯的，且最优选至少是 90％纯的，其纯度由 SDS-PAGE 确定。
基本上 (substantially) 纯的变体或多肽 ：术语 “基本上纯的变体” 或 “基本上 纯的多肽” 在本文中指一种多肽制备物，其包含最多 10％，优选最多 8％，更优选最多 6 ％，更优选最多 5 ％，更优选最多 4 ％，更优选最多 3 ％，甚至更优选最多 2 ％，最优 选最多 1％，且甚至最优选最多 0.5％以重量计的与其天然或重组结合的其他多肽物质。 因此，优选地，基本上纯的变体或多肽是以存在于该制备物中的总多肽物质重量计至少 92％纯的，优选至少 94％纯的，更优选至少 95％纯的，更优选至少 96％纯的，更优选至 少 96％纯的，更优选至少 97％纯的，更优选至少 98％纯的，甚至更优选至少 99％纯的， 最优选至少 99.5％纯的，且甚至最优选 100％纯的。 本发明的变体或多肽优选为基本上纯 的形式。 其可通过，例如，以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该变体或多肽而 达成。
成熟多肽 ：术语 “成熟多肽” 在本文中定义为具有防卫素活性的多肽，其为 经翻译和任何翻译后修饰，如 N 末端加工、 C 末端截断、糖化、磷酸化等之后的最终形 式。 在一个方面，所述成熟序列是 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 1 到 40，基于 SignalP 程序， 预期 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 -55 到 -33 是信号肽，而 kex- 位点出现在 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 -2 到 -1。
成熟多肽编码序列 ：术语 “成熟多肽编码序列” 在本文中定义为编码具有防卫 素活性的成熟多肽的核苷酸序列。 在一个方面，所述成熟多肽编码序列是 SEQ ID NO ： 1 的核苷酸 166 到 285，基于 SignalP 程序，预期 SEQ IDNO ：1 的核苷酸 1 到 69 编码信 号肽，而 kex- 位点出现在 SEQ ID NO ：1 的氨基酸 -2 到 -1。
同一性 ：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数” 同一性” 所描述。 就本发明而言，两个氨基酸序列间的同一性程度使用 Needleman-Wunsch 算 法 (Needleman 和 Wunsch，1970， J.Mol.Biol.48 ：443-453) 确 定， 如 用 EMBOSS 软 件 包 (EMBOSS ：欧洲分子生物开放软件组 (The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000， Trendsin Genetics 16 ：276-277 ；http://emboss.org) 的 Needle 程 序实施，优选为 3.0.0 版或之后的版本中。 所用的可选参数为缺口产生罚分 (gap open penalty)10， 缺 口 延 伸 罚 分 (gap extension penalty)0.5， 和 EBLOSUM62(BLOSUM62 的 EMBOSS 版 ) 取代矩阵。 使用标记为 “最长同一性” 的 Needle 输出 ( 使用 -nobrief 选 项获得 ) 作为百分比同一性并如下计算 ：
( 相同的残基 ×100)/( 比对长度 - 比对中缺口总数 )
就 本 发 明 而 言， 两 个 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 序 列 间 的 同 一 性 程 度 使 用 Needleman-Wunsch 算 法 (Needleman 和 Wunsch，1970， 见 上 ) 确 定， 如 用 EMBOSS 软 件 包 (EMBOSS ：欧 洲 分 子 生 物 开 放 软 件 组 (The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，见上 ；http://emboss.org) 的 Needle 程序实施的，优选 为 3.0.0 版或之后的版本。 所用的可选参数为缺口产生罚分 10，缺口延伸罚分 0.5，和 EDNAFULL(NCBI NUC4.4 的 EMBOSS 版 ) 取代矩阵。 使用标记为” 最长同一性” 的 Needle 输出 ( 使用 -nobrief 选项获得 ) 作为百分比同一性并如下计算 ：
( 相同的脱氧核糖核苷酸 ×100)/( 比对长度 - 比对中缺口总数 )。
变体命名规则 ：
就本发明而言，公开于 SEQ ID NO ：2 中的防卫素的氨基酸序列用于确定在其他 防卫素中对应的氨基酸残基。 将其他防卫素的氨基酸序列与公开于 SEQ ID NO ：2 中的 防卫素氨基酸序列进行比对，并基于该比对，可以确定 SEQ ID NO ：2 所公开的防卫素氨 基酸序列中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。
多 肽 序 列 的 比 对 可 使 用， 例 如， “ClustalW” (Thompson， J.D.， Higgins， D.G. 和 Gibson，T.J.，1994，CLUSTAL W ：Improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting， positions-specific gappenalties and weight matrix choice， Nucleic Acids Research 22 ：4673-4680) 得到。 DNA 序列的比对可以使用 所述多肽比对作为模板，将氨基酸用来自所述 DNA 序列的对应密码子替代来进行。
通常使用的逐对序列比较算法 (pairwise sequence comparison algorithm) 足以检测 出未分歧到少于大约 20-30％序列同一性的多肽序列间的相似性 (Doolittle，1992，Protein Sci.1 ：191-200 ；Brenner 等，1998， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，6073-6078)。 然 而， 具有相同折叠 (fold) 和相似生物学功能，真正同源的多肽经常分歧到传统的基于序列的 比较无法检测出其关系的程度 (Lindahl and Elofsson，2000， J.Mol.Biol.295 ：613-615)。 在 基 于 序 列 的 搜 索 中 较 高 的 敏 感 度 可 使 用 采 用 多 肽 家 族 的 概 率 表 现 (probabilistic representation)( 序型 ) 搜索数据库的搜索程序来获得。 举例而言， PSI-BLAST 程序通 过迭代的 (iterative) 数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物 (Atschul 等，1997， Nucleic Acids Res.25 ：3389-3402)。 当 目 标 多 肽 的 家 族 或 超 家 族 在 蛋 白 质结构数据库中具有一个或多个 ( 几个 ) 代表时，甚至可达成更高的敏感度。 程序
如 GenTHREADER(Jones 1999， J.Mol.Biol.287 ：797-815 ；McGuffin 和 Jones，2003， Bioinformatics 19 ：874-881) 使用来自不同来源 (PSI-BLAST、二级结构预测 (secondary structure prediction)、 结 构 比 对 序 型 (structural alignment profile) 以 及 溶 解 势 (solvation potential)) 的信息作为预测所查询序列 (query sequence) 结构折叠 (structural fold) 的神经 网络的输入。 同样地， Gough 等，2000， J.Mol.Biol.313 ：903-919 的方法可用于将未知 结构的序列与存在于 SCOP 数据库中的超家族模型进行比对，且上述模型可就其准确度 使用多种为此目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回 (retrieve) 和生成结构 比对。 举例而言，已将 SCOP 超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并 可下载的。 两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵 (distance alignment matrix)(Holm 和 Sander，1998， Proteins33 ：88-96) 或组合延伸 (combinatorial extension) (Shindyalov 和 Bourne，1998， Protein Eng.11 ：739-747) 进行比对，且这些算法的实施 可另外用于寻求具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物 ( 例如 Holm 和 Park，2000， Bioinformatics 16 ：566-567)。 这些结构比对可用于在相同结构超家族内的 蛋白质中预测结构和功能上对应的氨基酸残基。 该信息，与来源于同源性建模与序型搜 索的信息一同，可用于在将目标突变从一个蛋白质移到一个接近的或较远的蛋白质时预 测哪个残基会突变。
在描述本发明的不同防卫素变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命 名法。 在所有情况下，使用通用的 IUPAC 单字母或三字母氨基酸缩写。
对于氨基酸取代，使用下述命名法 ：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。 相应 的，在 226 位用丙氨酸取代苏氨酸命名为 “Thr226Ala” 或 “T226A”。 多重突变可以 用加号 ( “+” ) 分开，例如， “Gly205Arg+Ser411Phe” 或 “G205R+S411F”，分别代 表 205 和 411 位用精氨酸 (R) 取代甘氨酸 (G)，以及用苯丙氨酸 (F) 取代丝氨酸 (S) 的突 变。
亲本防卫素
在本发明中，所述亲本防卫素是 (a) 包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的氨基酸序列的多肽 ；(b) 由在至少高严紧条件下与 SEQID NO ：1 的成熟多 肽编码序列、其互补链杂交的多核苷酸编码的多肽 ；或由包含与 SEQ ID NO ：1 的成熟 多肽编码序列具有至少 80％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽。
在第一个方面，所述亲本防卫素包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 80％，优选至少 85％、更优选至少 90％、最优选至少 95％、且甚至最优选至少 96％、至 少 97％、至少 98％或至少 99％同一性程度的氨基酸序列，其能够杀灭或抑制结核分枝杆 菌的生长 ( 后文中称为 “同源多肽”)。 在一个方面，所述同源多肽具有与 SEQ ID NO ： 2 的成熟多肽相差十个氨基酸、优选五个氨基酸、更优选四个氨基酸、甚至更优选三个氨 基酸，最优选两个氨基酸，且甚至最优选一个氨基酸的氨基酸序列。
基本上同源的亲本防卫素可具有一个或多个 ( 几个 ) 氨基酸取代、缺失和 / 或 插入。 这些变化优选是次要的 (of a minor nature)，即为上述保守氨基酸取代或其他不至 于显著影响所述蛋白质或多肽三维折叠或活性的取代 ；小缺失，通常为一到约 30 个氨基 酸 ；以及小的氨基 - 或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基、最多约 20-25 个残基的小接头肽或有助于提纯的小延伸 ( 亲和标记 )，如多组氨酸序列 (tract)，或蛋白质 A(Nilsson 等，1985， EMBO J.4 ：1075 ；Nilsson 等，1991， Methods Enzymol.198 ：3)。 亦可一般性的参见 Ford 等，1991， Protein Expression and Purification 2 ：95-107。
尽管上述变化优选为次要的，该变化亦可为实质性的，如融合多达 300 个氨基 酸或更多的较大多肽作为氨基或羧基末端的延伸。
除了所述 20 个标准氨基酸外，非标准氨基酸 ( 如 4- 羟脯氨酸、6-N- 甲基赖氨 酸，2- 氨基异丁酸、异缬氨酸以及 α- 甲基丝氨酸 ) 可用于取代野生型防卫素的氨基酸 残基。 有限数量的非保守氨基酸、非由遗传密码编码的氨基酸，以及非天然的氨基酸可 用于取代氨基酸残基。 “非天然的氨基酸” 在蛋白质合成后经修饰，和 / 或在其侧链具 有与标准氨基酸侧链不同的化学结构。 非天然氨基酸可为化学合成的，且优选为可市购 的，且包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烷羧酸 (thiazolidine carboxylic acid)、脱 氢脯氨酸、3- 和 4- 甲基脯氨酸以及 3，3- 二甲基脯氨酸。
亲本防卫素优选包含 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列或其等位变体。在一个方面， 所述亲本防卫素包含 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列。 在另一个方面，所述亲本防卫素包 含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽。 在另一个方面，所述亲本防卫素包含 SEQ ID NO ：2 的 氨基酸 1 到 40 或其等位变体。 在另一个方面，所述亲本防卫素包含 SEQ ID NO ：2 的氨 基酸 1 到 40。 在另一个方面，所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列或其等位 基因变体组成。 在另一个方面，所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列组成。 在另一个方面，所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽组成。在另一个方面，所述 亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 1 到 40 或其等位基因变体组成。 在另一个方面， 所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 1 到 40 组成。
在第二个方面，所述亲本防卫素由在中等严紧条件下，优选中 - 高严紧条件 下、更优选高严紧条件下，且最优选极高严紧条件下与 (i)SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编 码序列或其亚序列杂交的多核苷酸编码 (J.Sambrook， E.F.Fritsch 和 T.Maniatis，1989， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2dedition，Cold Spring Harbor，New York)。 在 一个方面，所述互补链为 SEQ IDNO ：1 的成熟多肽编码序列的全长互补链。
对于长度至少为 100 个核苷酸的长多核苷酸，极低到极高的严紧条件定义为在 42℃在 5XSSPE，0.3％ SDS，200 微克 /ml 经剪切 (sheared) 和变性的鲑精 DNA，以及对 于极低和低严紧性 25％甲酰胺，对于中等和中 - 高严紧性 35％甲酰胺，或对于高或极高 严紧性 50％甲酰胺中根据标准 Southern 印迹步骤预杂交和杂交最佳 12 到 24 小时。
对于长度至少为 100 个核苷酸的长多核苷酸，载体物质最终使用 2XSSC，0.2％ SDS，优选在 45℃ ( 极低严紧性 )，更优选在 50℃ ( 低严紧性 )，更优选在 55℃ ( 中等严 紧性 )，更优选在 60℃ ( 中等 - 高严紧性 )，甚至更优选在 65℃ ( 高严紧性 )，且最优选 在 70℃ ( 极高严紧性 ) 下洗涤三次，每次 15 分钟。
对于长度为约 15 个核苷酸到约 70 个核苷酸的短多核苷酸，严紧条件定义为在低 于使用根据 Bolton 和 McCarthy(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48 ：1390) 的计算法计算的 Tm 约 5℃到约 10℃的温度，在 0.9M NaCl、0.09Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5 ％ NP-40、1XDenhardt ′ s 溶液、1mM 焦磷酸钠、1mM 磷酸二氢 钠、0.1mM ATP 以及每 ml 0.2mg 的酵母 RNA 中，根据标准 Southern 印迹步骤预杂交、杂交并在杂交后洗涤最佳 12 到 24 小时。
对长度为约 15 个核苷酸到约 70 个核苷酸的短多核苷酸，所述载体物质在 6xSCC 加上 0.1％ SDS 中洗涤一次 15 分钟，并使用 6x SSC 在低于计算的 Tm 5℃到 10℃的温度下 洗涤两次，每次 15 分钟。
在第三个方面，所述亲本防卫素由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组 成的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列具有优选至少 80％，优选至少 85％，更优选至少 90％，最优选至少 95％，且甚至最优选 96％、97％、 98 ％或 99 ％的同一性程度，其编码活性多肽。 在一个方面，所述成熟多肽编码序列是 SEQ ID NO ：1 的核苷酸 166 到 285。
所述亲本防卫素可由任何属的微生物获取。 就本发明而言，术语 “由 ...... 获 取” 与给定来源相联系用于本文意为由多核苷酸编码的亲本防卫素由所述来源产生，或 由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。
在一个方面，所述亲本防卫素在细胞外分泌。
所 述 亲 本 防 卫 素 可 为 真 菌 防 卫 素。 在 另 一 个 方 面， 所 述 真 菌 防 卫 素 是 酵 母 防 卫 素， 如 假 丝 酵 母 属 (Candida)、 克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces)、 毕 赤 酵 母 属 (Pichia)、 酵 母 属 (Saccharomyces)、 裂 殖 酵 母 属 (Schizosaccharomyces) 或 西 洋 蓍 霉 属 (Yarrowia) 防卫素。 在另一个方面，所述真菌防卫素是丝状真菌防卫素如枝顶孢霉 属 (Acremonium)、 伞 菌 属 (Agaricus)、 链 格 孢 属 (Alternaria)、 曲 霉 属 (Aspergillus)、 短梗霉属 (Aureobasidium)、 Botryospaeria、拟蜡菌属 (Ceriporiopsis)、 Chaetomidium、 金 孢 子 菌 属 (Chrysosporium)、 Claviceps、 Cochliobolus、 Coprinopsis、 Coptotermes、 Corynascus、 Cryphonectria、隐球菌属 (Cryptococcus)、 Diplodia、 Exidia、 Filibasidium、 镰 孢 属 (Fusarium)、 赤 霉 属 (Gibberella)、 Holomastigotoides、 腐 质 霉 属 (Humicola)、 耙 菌 属 (Irpex)、 Lentinula、 Leptospaeria、 梨 孢 菌 属 (Magnaporthe)、 Melanocarpus、 多 孔 菌 属 (Meripilus)、 毛 霉 属 (Mucor)、 毁 丝 霉 属 (Myceliophthora)、 新 考 玛 脂 霉 属 (Neocallimastix)、 脉 孢 菌 属 (Neurospora)、 拟 青 霉 属 (Paecilomyces)、 青 霉 属 (Penicillium)、 平 革 菌 属 (Phanerochaete)、 瘤 胃 壶 菌 属 (Piromyces)、 Poitrasia、 假 黑 盘 菌 属 (Pseudoplectania)、 Pseudotrichonympha、 根 毛 霉 属 (Rhizomucor)、 裂 褶 菌 属 (Schizophyllum)、 柱 顶 孢 属 (Scytalidium)、 踝 节 菌 属 (Talaromyces)、 热 子 囊 菌 属 (Thermoascus)、 梭 孢 壳 属 (Thielavia)、 弯 颈 霉 属 (Tolypocladium)、 木 霉 属 (Trichoderma)、 Trichophaea、轮枝孢属 (Verticillium)、 Volvariella 或 Xylaria 防卫素。
在另一个方面，所述亲本防卫素是卡尔酵母 (Saccharomycescarlsbergensis)、 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)、 糖 化 酵 母 (Saccharomyces diastaticus)、 道 格 拉 氏 酵 母 (Saccharomyces douglasii)、 克 鲁 弗 酵 母 (Saccharomyces kluyveri)、 诺 地 酵 母 (Saccharomyces norbensis) 或卵形酵母 (Saccharomyces oviformis) 防卫素。
在 另 一 个 方 面， 所 述 亲 本 防 卫 素 是 解 纤 维 枝 顶 孢 霉 (Acremoniumcellulolyticus)、 棘 孢 曲 霉 (Aspergillus aculeatus)、 泡 盛 曲 霉 (Aspergillusawamori)、 烟 曲 霉 (Aspergillus fumigatus)、 臭 曲 霉 (Aspergillus foetidus)、 日 本 曲 霉 (Aspergillus japonicus)、 构 巢 曲 霉 (Aspergillus nidulans)、 黑 曲 霉 (Aspergillus niger)、 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae)、 嗜 角 质 金 孢 子 菌 (Chrysosporiumkeratinophilum)、 Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌 (Chrysosporium tropicum)、 Chrysosporium merdarium、 Chrysosporium inops、 毡 金 孢 子 菌 (Chrysosporium pannicola)、 Chrysosporium queenslandicum、 Chrysosporium zonatum、 杆 孢 状 镰 孢 (Fusarium bactridioides)、 禾 谷 镰 孢 (Fusarium cerealis)、 库 威 镰 孢 (Fusarium crookwellense)、大刀镰孢 (Fusariumculmorum)、禾本科镰孢 (Fusarium graminearum)、 禾 赤 镰 孢 (Fusariumgraminum)、 异 孢 镰 孢 (Fusarium heterosporum)、 合 欢 木 镰 孢 (Fusariumnegundi)、 尖 镰 孢 (Fusarium oxysporum)、 多 枝 镰 孢 (Fusarium reticulatum)、 粉红镰孢 (Fusarium roseum)、接骨木镰孢 (Fusarium sambucinum)、肤色镰孢 (Fusarium sarcochroum)、 拟 分 枝 孢 镰 孢 (Fusarium sporotrichioides)、 硫 色 镰 孢 (Fusarium sulphureum)、 圆 镰 孢 (Fusarium torulosum)、 拟 丝 孢 镰 孢 (Fusarium trichothecioides)、 镶 片 镰 孢 (Fusarium venenatum)、 灰 腐 质 霉 (Humicola grisea)、 特 异 腐 质 霉 (Humicola insolens)、 疏 棉 状 腐 质 霉 (Humicolalanuginosa)、 Irpex lacteus、 米 黑 毛 霉 (Mucor miehei)、嗜热毁丝霉 (Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)、 绳 状 青 霉 (Penicillium funiculosum)、 产 紫 青 霉 (Penicillium purpurogenum)、 黄 孢 平 革 菌 (Phanerochaete chrysosporium)、 Thielavia achromatica、 Thielavia albomyces、 Thielavia albopilosa、 Thielavia australeinsis、 Thielavia fimeti、 Thielaviamicrospora、 Thielavia ovispora、 Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳 (Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳 (Thielavia setosa)、 Thielavia subthermophila、土生梭孢霉 (Thielavia terrestris)、哈茨木 霉 (Trichoderma harzianum)、 康 宁 木 霉 (Trichoderma koningii)、 长 枝 木 霉 (Trichoderma longibrachiatum)、 里 氏 木 霉 (Trichoderma reesei) 或 绿 色 木 霉 (Trichoderma viride) 防 卫 素。
在另一个方面，所述亲本防卫素是淡黑假黑盘菌 (Pseudoplectanianigrella) 防卫 素，且最优选 SEQ ID NO ：2 的淡黑假黑盘菌防卫素或其成熟多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段 (perfect andimperfect states) 二者，和其他分类学的等同物 (equivalent)，例如无性型 (anamorph)，而无论其已 知的种名。 本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份 (identity)。
这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机 构如美国典型培养物保藏中心 (the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志 微生物和细胞培养物保藏中心 (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心 (Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS) 和农业 研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心 (Agricultural Research Service Patent Culture Collection， Northern Regional Research Center)(NRRL)。
所述亲本防卫素亦可使用上述探针从其他来源鉴定和获取，所述其它来源包括 从自然界 ( 例如，土壤、堆肥、水等 ) 分离的微生物或从天然材料 ( 例如，土壤、堆肥、 水等 ) 直接获取的 DNA 样本。 用于从天然生境 (habitat) 分离微生物和 DNA 的技术是本 领域内公知的。 随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或 cDNA 文库或者混合的 DNA 样本来获得编码防卫素的多核苷酸。 一旦用本文所述合适的探针检测到编码防卫素 的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员熟知的技术将其序列分离或克隆 ( 参 见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch 和 T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，ALaboratoryManual，2d cdition， Cold Spring Harbor， New York)。 如本文所定义， “分离的” 防卫 素是基本上 (essentially) 不含其他非防卫素多肽的多肽，例如至少约 20％纯，优选至少约 40％纯，更优选至少约 60％纯，甚至更优选至少约 80％纯，最优选约 90％纯，且甚至最 优选约 95％纯，所述纯度由 SDS-PAGE 确定。
所述亲本防卫素亦可包括融合多肽或可剪切的融合多肽，其中另一个多肽融合 于所述多肽或其片段的 N 末端或 C 末端。 融合多肽通过将编码另一个多肽的多核苷酸 ( 或其部分 ) 与本发明的多核苷酸 ( 或其部分 ) 融合来产生。 产生融合多肽的技术在 本领域为已知的，并包括连接编码所述多肽的编码序列从而使得它们的读码框相同 (in frame)，且融合的多肽的表达在同样的启动子和终止子的控制之下。 融合蛋白亦可使用 内蛋白 (intein) 技术构建，其中融合物在翻译后产生 (Cooper 等，1993， EMBO J.12 ： 2575-2583 ；Dawson 等，1994， Science 266 ：776-779)。
制备变体
亲本防卫素的变体可根据本领域任何已知的任何诱变方法，如定点诱变、 合 成 基 因 构 建 (synthetic gene construction)、 半 合 成 基 因 构 建 (semisynthetic gene construction)、随机诱变、改组 (shuffling) 等来制备。
定点诱变是在编码亲本防卫素的多核苷酸分子上的确定位点创建一个或多个突 变的技术。 所述技术可在体外或体内进行。
合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽分子的多核苷酸分 子。 基因合成可使用多种技术进行，如由 Tian 等所述基于多通道微芯片 (multiplex microchip-based) 的技术 (Tian， et.al.， Nature 432 ：1050-1054)，以及类似的技术，其中 合成寡核苷酸并在可用光编程 (photo-programmable) 的微流芯片 (microfluidic chip) 上组 装。
定点诱变可在体外通过 PCR 达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。 定点诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本防卫素的多核 苷酸的质粒中的位点进行剪切，然后将含有突变的寡核苷酸连接到所述多核苷酸上。 通 常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和插入物的粘性末 端能够彼此连接。 参见，例如， Scherer 和 Davis，1979， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76 ： 4949-4955 ；以及 Barton 等，1990， Nucleic Acids Research 18 ：7349-4966。
定点诱变可在体内通过本领域已知方法达成。 参见，例如，美国专利申请公 开 2004/0171154 ；Storici 等，2001， Nature Biotechnology 19 ：773-776 ；Kren 等， 1998，Nat.Med.4 ：285-290 ；以及 Calissano 和 Macino，1996，FungalGenet.Newslett.43 ： 15-16。
任何定点诱变方法可用于本发明。 有许多可用的市售试剂盒可用于制备亲本防 卫素的变体。
可使用已知的诱变、重组和 / 或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由 Reidhaar-Olson 和 Sauer，1988， Science 241 ：53-57 ；Bowie 和 Sauer，1989， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86 ：2152-2156 ；WO 95/17413 ；或 者 WO 95/22625 所 公 开 的 那 些， 进 行一个或多个氨基酸取代、缺失和 / 或插入并加以测试。 其他可使用的方法包括易错 PCR、噬菌体展示 ( 例如 Lowman 等，1991， Biochem.30 ：10832-10837 ；美国专利号5,223,409 ；WO 92/06204) 和区域定向诱变 (region-directed mutagenesis)(Derbyshire 等， 1986， Gene 46 ：145 ；等，1988， DNA 7 ：127)。
诱变 / 改组方法可与高通量、自动筛选方法合并以检测由宿主细胞表达的经克 隆、诱变的多肽的活性。 编码活性多肽的经诱变的 DNA 分子可自宿主细胞回收并使用本 领域标准方法迅速测序。 这些方法使快速确定目标多肽中单个氨基酸残基的重要性成为 可能。
半合成基因构建通过合并合成基因构建、和 / 或定点诱变、和 / 或随机诱变、和 / 或改组的特征达成。 半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与 PCR 技术组合的方 法。 基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用定点诱变引物扩增，还可 对另外的其他区域进行易错 PCR 或非易错 PCR(non-error prone PCR) 扩增。 多核苷酸片 段可随后进行改组。
变体
在本发明中，亲本防卫素的分离的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、 17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置处的取代 ；其中所述变体能够 杀灭或抑制结核分枝杆菌的生长，包含与亲本防卫素的氨基酸序列具有至少 80％，优选 至少 85％，更优选至少 90％，最优选至少 95％，且甚至最优选至少约 97％同一性程度的 氨基酸序列。
在一个方面，在本发明的变体中氨基酸取代的数目包括优选 4 个取代，更优选 3 个取代，甚至更优选 2 个取代，而最优选 1 个取代。 在另一个方面，在本发明的变体中 氨基酸取代的数目由优选 4 个取代，更优选 3 个取代，甚至更优选 2 个取代，而最优选 1 个取代组成。
在一个方面，亲本防卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、17、 20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置处的取代。 在另一个方面，亲本防 卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的两个 或更多位置处的取代。 在另一个方面，亲本防卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、 13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的三个或更多位置处的取代。 在另一个方面，亲 本防卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的 位置处的取代。
在一个方面，所述变体包含在对应于位置 5 的位置处的取代。 在另一个方面， 所述变体包含在对应于位置 5 的位置处用 Arg、Gly 或 Ser 取代。 在另一个方面，所述变 体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 N5R、 N5G 或 N5S 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 9 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 9 的位置处用 Asn、Gly 或 Ser 取代。 在另一个方面，所 述变体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 D9N、 D9G 或 D9S 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 11 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 11 的位置处用 Asn 或 Gly 取代。 在另一个方面，所述变 体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 D11N 或 D11G 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 13 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 13 的位置处用 Leu、 Lys 或 Val 取代。 在另一个方面，所述变体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 M13L、 M13K 或 M13V 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 14 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 14 的位置处用 Arg、Leu、Lys 或 Phe 取代。 在另一个方 面，所述变体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 Q14F、 Q14L、 Q14K 或 Q14R 取代。
在另一个方面，所述变体在对应于选自下组的位置的位置处包含取代 ：(a)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5 和 9 ；位置 5 和 13 ；位置 5 和 14 ；位置 9 和 13 ；位置 9 和 14 ；位置 13 和 14 ；位置 11 和 5 ；位置 11 和 9 ；位置 11 和 13 ；或位置 11 和 14 ；(b) SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9 和 13 ；位置 5、13 和 14 ；位置 9、13 和 14 ；或位 置 5、9 和 14 ；和 (c)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9、13 和 14 ；或位置 5、9、 11、13 和 14。
在另一个方面，所述变体在对应于下述位置的位置包含下述取代
位置 5 是 Gly、 Ser 或 Arg ；
位置 9 是 Gly、 Ser 或 Asn ；
位置 11 是 Asn 或 Gly ；
位置 13 是 Leu、 Val 或 Lys ； 位置 14 是 Leu、 Phe、 Lys 或 Arg ；
位置 17 是 Val 或 Gln ；
位置 20 是 Arg ；
位置 23 是 Arg ；
位置 26 是 Arg ；
位置 31 是 Ser 或 Thr ；
位置 36 是 Leu ；和
位置 38 是 Arg。
在另一个方面，所述变体包含一个或多个选自下组的取代 ：
N5G、 N5S 或 N5R ；
D9G、 D9S 或 D9N ；
D11N 或 D11G ；
M13L、 M13V 或 M13K ；
Q14L、 Q14F、 Q14K 或 Q14R ；
N17V 或 N17Q ；
K20R ；
K23R ；
K26R ；
A31S 或 A31T ；
V36L ；和
K38R。
在另一个方面，所述变体包含与 SEQ ID NO ：2、SEQ ID NO ：3、SEQ IDNO ： 4、SEQ ID NO ：5、SEQ ID NO ：6、SEQ ID NO ：7、SEQ ID NO ：8、SEQ IDNO ：9、 SEQ ID NO ：10、 SEQ ID NO ：11、 SEQ ID NO ：12、 SEQ ID NO ：13、 SEQID NO ：
14、 SEQ ID NO ：15、 SEQ ID NO ：16、 SEQ ID NO ：17、 SEQ ID NO ：18、 SEQ ID NO ：19、 SEQ ID NO ：20、 SEQ ID NO ：21、 SEQ ID NO ：22、 SEQ IDNO ：23、 SEQ ID NO ：24、 SEQ ID NO ：25、 SEQ ID NO ：26 或 SEQ ID NO ：27 的氨基酸序列具有至 少 80％同一性，优选至少 85％同一性，更优选至少 90％同一性，且最优选至少 95％同一 性的氨基酸序列。
在另一个方面，所述变体包含 SEQ ID NO ：2、 SEQ ID NO ：3、 SEQ IDNO ： 4、SEQ ID NO ：5、SEQ ID NO ：6、SEQ ID NO ：7、SEQ ID NO ：8、SEQ IDNO ：9、 SEQ ID NO ：10、 SEQ ID NO ：11、 SEQ ID NO ：12、 SEQ ID NO ：13、 SEQID NO ： 14、 SEQ ID NO ：15、 SEQ ID NO ：16、 SEQ ID NO ：17、 SEQ ID NO ：18、 SEQ ID NO ：19、 SEQ ID NO ：20、 SEQ ID NO ：21、 SEQ ID NO ：22、 SEQ IDNO ：23、 SEQ ID NO ：24、 SEQ ID NO ：25、 SEQ ID NO ：26 或 SEQ ID NO ：27 的氨基酸序列，或由 这样的氨基酸序列组成。
其他能够杀灭或抑制结核分枝杆菌的多肽
本发明亦涉及能够杀灭或抑制结核分枝杆菌的分离的多肽，其中所述多肽的氨 基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置上有差异。 在一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽在优选 4 个氨 基酸，更优选 3 个氨基酸，甚至更优选 2 个氨基酸，且最优选 1 个氨基酸上有差异。
在一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、 11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置上有差异。 在另 一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、11、13、14、 17、20、23、26、31、36 和 38 的两个或更多位置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的 氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、 36 和 38 的三个或更多位置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的位置上有差 异。
在一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5 的位置上 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5 的位 置上因 Arg、Gly 或 Ser 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 5 上因 Arg、 Gly 或 Ser 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 9 的位置 上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 9 的位 置上因 Gly、Ser 或 Asn 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 9 上因 Gly、 Ser 或 Asn 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 11 的位 置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 11 的位置上因 Asn 或 Gly 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 11 上因 Asn 或 Gly 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 13 的位
置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 13 的位置上因 Leu、 Lys 或 Val 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 13 上因 Leu、 Lys 或 Val 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 14 的位 置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 14 的位置上因 Phe、Leu、Lys 或 Arg 有差异。在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 14 上因 Phe、 Leu、 Lys 或 Arg 有差异。
在另一个方面，所述差异对应于 ：
位置 5 是 Gly、 Ser 或 Arg ；
位置 9 是 Gly、 Ser 或 Asn ；
位置 11 是 Asn 或 Gly ；
位置 13 是 Leu、 Val 或 Lys ；
位置 14 是 Leu、 Phe、 Lys 或 Arg ；
位置 17 是 Val 或 Gln ；
位置 20 是 Arg ；
位置 23 是 Arg ；
位置 26 是 Arg ；
位置 31 是 Ser 或 Thr ；
位置 36 是 Leu ；和
位置 38 是 Arg。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于选自下组的位 置的位置存在差异 ：(a)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5 和 9 ；位置 5 和 13 ；位置 5 和 14 ；位置 9 和 13 ；位置 9 和 14 ；位置 13 和 14 ；位置 11 和 5 ；位置 11 和 9 ；位置 11 和 13 ；或位置 11 和 14 ；(b)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9 和 13 ；位置 5、13 和 14 ；位置 9、13 和 14 ；或位置 5、9 和 14 ；和 (c)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、 9、13 和 14 ；或位置 5、9、11、13 和 14。
方法和用途
本发明亦涉及使用防卫素变体的方法。
本发明涉及本发明的防卫素变体治疗结核病的用途。 此外，本发明的抗微生物 多肽或组合物亦可用于制备治疗结核病的药物。
本发明的防卫素变体可用作抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂。 因此，本 发明的防卫素变体可用于制备供治疗结核病的兽用或人用治疗剂或预防剂。
本发明的防卫素变体可以足以杀灭或抑制分枝杆菌属细菌细胞、优选结核分枝 杆菌生长的量使用。
将本发明的防卫素变体的配制物施用给正罹患或易患上分枝杆菌属细菌感染， 如结核病的宿主。 施用可为局部的或系统性的。 一般而言，本发明的抗微生物多肽剂量 会足以通过杀灭至少约 50％，通常为至少 1 个数量级，且可为 2 个或更多个数量级而减小 微生物群体。 本发明的化合物以减小微生物群体同时最小化任何副作用的剂量施用。 考 虑对于体内用途，所述组合物可在医师的指导下获取并使用。可使用不同的施用方法。 所述多肽配制物可口服施用，或可静脉内、皮下、腹 膜内注射、通过气溶胶、眼部 (opthalmically)、膀胱内、局部等方式施用。举例而言，通 过吸入的施用方法在本领域是公知的。 治疗性配制物的剂量变化会较广泛，其取决于待 施用的特定抗微生物多肽、疾病的特性、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除 率 (clearance) 等。 初始剂量可较大，然后用较小的维持剂量。 剂量的施用可为不频繁 的，如每周或每两周，或可分为较小的剂量，并每日一次或数次，或半周一次等施用以 维持有效的剂量水平。 在许多情况下，口服施用会比静脉内施用需要更高的剂量。 酰胺 键，以及氨基与羧基端，可经修饰以在口服施用中具有较高的稳定性。 例如，羧基端可 以是酰胺化的。
配制物
本发明的化合物可并入不同配制物中以供治疗施用。 更具体而言，本发明 的化合物可通过与适合的、药学上可接受的载体或稀释剂结合而配制成药物组成物， 且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，例如片剂、胶囊、粉末、细粒 (granules)、软膏、乳霜、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球体、洗剂、 以及气溶胶。 如此，所述化合物的施用可通过不同的方式达成，包括口服、含服、直 肠、胃肠外、腹膜内、皮内、经皮、气管内施用等。 本发明的抗微生物多肽在施用后可 为系统性的，或通过使用发挥在植入位点保持活性剂量的作用的植入物或其他配制物而 为局部的。
本发明的化合物可单独施用、彼此组合施用、或其可与其他已知化合物 ( 例 如，穿孔素 (perforin)、抗炎剂、抗生素、等等 ) 组合使用。 在药物剂量形式中，所述化 合物可以其药学上可接受的盐形式施用。 以下方法与赋形剂仅为示例性的，而决非限制 性的。
对于口服制备物，所述化合物可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、 粉末、细粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀 粉组合 ；与结合剂，例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶组 合 ；与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠结合 ；与润滑剂，例如 滑石或硬脂酸镁组合 ；以及若需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂以及调味剂组 合。
所述化合物可通过将其溶解、悬浮、或乳化于水性或非水性溶剂，如植物油或 其他类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中，以及若需要，与常规的 添加物，如助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂与防腐剂组合，而配制成用于注 射的制备物。
所述化合物可用于气溶胶配制物中通过吸入施用。 本发明的化合物可配制到经 加压可接受的推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和类似物中。
此外，所述化合物可通过与不同基底，如乳化基底或水溶性基底混合而制成栓 剂。 本发明的化合物可通过栓剂经直肠施用。 栓剂可包括媒介，如可可油、碳蜡与聚乙 二醇，其在体温下会融化，但在室温下会凝固。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂量形式，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每 个剂量单位，例如，一茶匙的量、一大匙的量、片剂或栓剂包含预定量的组合物，其包含一种或多种本发明的化合物。 类似的，用于注射或静脉内施用的单位剂量形式可包括 在组合物中的本发明的化合物，而所述组合物是无菌水、生理盐水或另一个药学上可接 受载体的溶液。
用于持续释放配制物的移植物在本领域是公知的。 移植物用生物可降解的或非 生物可降解的聚合物配制为微球体、厚板 (slab) 等。例如，乳酸和 / 或羟基乙酸的聚合物 形成可受到侵蚀的聚合物，其可良好地被宿主所容忍。 将包含本发明的抗微生物多肽的 移植物置于接近感染的位置，使得活性药剂的局部浓度相对于身体其他部分有所增加。
如本文所使用的术语” 单位剂量形式” 指物理上分开的单位，其适合作为用于 人类和动物受试者的单位剂量，每个单位包含预定量的本发明化合物，该量经计算足以 产生期望的效果，所述化合物与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介结合。 本发明单位 剂量形式的规格取决于所使用的特定多肽以及所欲达到的效果、以及在宿主中所述化合 物的药物动力学。
药学上可接受的赋形剂，例如媒介、佐剂、载体或稀释剂，是公众可轻易获得 的。 此外，药学上可接受的辅助物质，例如 pH 调整与缓冲剂、渗透压调整剂、稳定剂、 湿润剂、以及类似物，是公众可轻易获得的。
用 于 系 统 性 施 用 的 典 型 剂 量 范 围 是 从 每 次 施 用 每 公 斤 受 试 者 体 重 0.1pg 至 100 毫克。 典型剂量可为每天服用一个片剂二到六次，或每天服用一个经时间 - 释放 (time-release) 的胶囊或片剂一次，其包含成比例较高含量的活性成分。 经时间 - 释放效 果可通过溶于不同 pH 值的胶囊物质、通过渗透压缓慢释放的胶囊、或任何其他已知的控 制性释放方法而获得。
本领域技术人员会容易的了解到剂量水平可作为所述特定化合物、症状严重性 和受试者对副作用的敏感性的函数而变化。 一些特定化合物比其他的更具效力。 对于给 定化合物的优选剂量可由本领域技术人员容易的通过不同的方式确定。 一个优选的方式 为测定给定化合物的生理效力。
使用脂质体作为递送媒介为一种受关注的方法。 脂质体与靶位点的细胞融合并 将其内腔的内容物递送至细胞内。 将脂质体维持与细胞接触足够的时间以融合，其使用 不同的方法以维持接触，例如分离、结合剂以及类似物。 在本发明的一个方面，脂质体 经设计为气溶胶化的以供肺部施用。 脂质体可用介导膜融合的纯化蛋白质或肽，如仙台 病毒或流感病毒等制备。 脂质可为任何已知的脂质体形成性脂质的有用组合，包括阳离 子或两性离子脂质，如磷脂酰胆碱。 剩下的脂质一般会为中性或酸性脂质，如胆固醇、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油以及类似物。
为了制备脂质体，可使用 Kato 等 (1991)J.Biol.Chem.266 ：3361 所叙述的方法。 简而言之，脂质与包含肽的内腔组合物在适合的水性介质，方便的为盐水介质中组合， 其中总固体范围将为大约 1-10 重量百分比。 在短时间 ( 大约 5-60 秒 ) 激烈搅动后，将 试管置于温水浴 ( 大约 25-40℃ ) 并重复此循环约 5-10 次。 接着将组合物用超声处理一 段方便的时间 ( 一般约 1-10 秒 ) 并可进一步通过漩涡震荡而搅动。 接着通过加入水性介 质扩增体积，通常增加体积大约 1-2 倍，接着摇动并冷却。 此方法使得将高分子量分子 并入内腔中成为可能。
与其他活性剂一起配制为了用于本主题的方法，本发明的抗微生物多肽可与其他药学上有活性的试 剂，特别是其他抗微生物剂一起配制。 关注的其他试剂包括种类广泛的抗生素，如 本领域中已知的。 抗生素的类型包括青霉素，如青霉素 G、青霉素 V、甲氧西林、苯 唑西林 (oxacillin)、羧苄西林、萘夫西林 (nafcillin)、氨苄西林等 ；青霉素与 β- 内酰 胺酶抑制剂、头胞菌素的结合，如头孢克洛 (cefaclor)、头孢唑啉 (cefazolin)、头孢呋 辛 (cefuroxime)、拉氧头孢 (moxalactam) 等 ；碳青霉烯 (carbapenem) 类 ；单酰胺菌素 (monobactam) 类 ；氨基糖苷类 ；四环素 ；大环内酯类 ；林可霉素类 ；多粘霉素类 ；磺 胺类 ；喹诺酮 (quinolone) 类 ；氯霉素 ；甲硝唑 (metronidazole) ；大观霉素 ；甲氧苄啶 (trimethoprim) ；万古霉素等。
抗酶菌剂，包括多烯类，例如两性霉素 B、制霉菌素 ；5-flucosyn ；以及唑类， 例如咪康唑、酮康唑 (ketoconazol)、伊曲康唑 (itraconazol) 与氟康唑 (fluconazol) 亦为 有用。 抗结核药物包括异烟肼 (isoniazid)、乙胺丁醇 (ethambutol)、链霉素与利福平 (rifampin)。 细胞因子如干扰素 γ、肿瘤坏死因子 α、白介素 12 等亦可包括于本发明的 抗微生物多肽的配制物中。
体外合成
本发明的多肽可通过体外合成使用本领域中已知的常规方法制备。 不同的商业 合成设备，例如 Applied Biosystems Inc.， Beckman 等的自动化合成仪，是可获得的。 通 过使用合成仪，可以用非天然存在的氨基酸，特别是 D- 异构体 ( 或 D- 型 )，例如 D- 丙 氨酸与 D- 异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能基的侧链以及类似物取代天然 存在的氨基酸。 制备的特定顺序与方式会依据方便性、经济因素、所需纯度以及类似因 素而确定。
可将化学结合提供给不同的肽或蛋白质，包括常规的用于链接的官能团，例如 用于形成酰胺或取代胺，例如还原性胺化的氨基基团、用于形成硫醚或双硫键的巯基基 团、用于形成酰胺的羧基基团以及类似物。
若需要，可在合成过程中或在表达过程中将不同的基团引入肽中，其允许结合 至其他分子或表面。 因此，可使用半胱氨酸以制备硫醚、使用组氨酸以连结至金属离子 络合物、使用羧基基团以形成酰胺或酯、使用氨基基团以形成酰胺以及类似物。
多肽亦可根据常规的重组合成方法而分离与纯化。 可制备表达宿主的裂解液， 而将该裂解液使用 HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化。 在大 多数情况下，所使用的组合物会包括至少 20 重量百分比的所期望的产物，更通常为至少 大约 75 重量百分比，优选为至少大约 95 重量百分比，以及为了治疗性目的，通常至少为 大约 99.5 重量百分比，其是相对于与产物制备和产物纯化的方法有关的污染物而言。 通 常，百分比会基于总蛋白质。
本发明进一步通过以下实施例叙述，其不应被视为对本发明之范围加以任何限 制。 实施例
实施例 1 使用来自 PFAM 数据库的 HMM 档案以鉴定防卫素可在互联网在线或在本地计算机上，使用公知的 HMMER 免费可得软件包，使 用隐蔽马尔科夫模型序型进行序列分析。 目前的版本是自 2003 年 10 月以来的 HMMER 2.3.2。
HMM 序型可自公知的 PFAM 数据库获得。 目前的版本是自 2004 年 11 月以来的 PFAM 16.0。 用于所有的计算机平台的 HMMER 与 PFAM 两者皆可自 ( 例如 ) 美国华盛 顿大学圣路易斯分校医学院 (Washington University in St.Louis(USA)，School of Medicine) (http://pfam.wustl.edu 与 http://hmmer.wustl.edu) 获得。
若查询的氨基酸序列或其片段属于以下五个 PFAM 家族之一，则该氨基酸序列 是根据本发明的防卫素 ：
- 防卫素 _β 或 “β 防卫素”，登录号 ：PF00711 ；
- 防卫素 _propep 或 “防卫素原肽”，登录号 ：PF00879 ；
- 防卫素 _1 或 “哺乳类防卫素”，登录号 ：PF00323 ；
- 防卫素 _2 或 “节肢动物防卫素”，登录号 ：PF01097 ；
-γ- 硫素或 “γ- 硫素家族”，登录号 ：PF00304。
当在线使用 PFAM 数据库时，或当本地使用 hmmpfam 程序 ( 来自 HMMER 软件 包 ) 时，若氨基酸序列产生大于 0.1 的 E- 值与大于或等于零的分数，则根据本发明其属 于 PFAM 家族。
当序列分析是使用 hmmpfam 程序本地进行时，需要自 PFAM 数据库获得 ( 下载 ) HMM 序型。 每个家族有两个序型 ；用于全体搜索的 xxx_ls.hmm，以及用于局部搜索的 xxx_fs.hmm( “xxx” 是家族的名称 )。 对于以上所提及五个家族共有十个序型。
这十个序型可独立使用，或可结合 ( 附加 ) 成单一序型 ( 使用文本编辑软件 - 该 序型为 ASCII 文件 )，其可命名为，例如，defensin.hmm。 所查询的氨基酸序列可接着使 用以下命令行评估 ：
hmmpfam-E 0.1 defensin.hmm sequence_file
- 其中” sequence_file” 是具有任何可由 HMMER 软件包辨识的格式所查询的氨 基酸序列的文件。
若分数大于或等于零 (0.0)，且 E- 值大于 0.1，则所查询氨基酸序列是根据本发 明的防卫素。
PFAM 数 据 库 进 一 步 叙 述 于 Bateman 等 (2004) “The Pfam Protein FamiliesDatabase”， Nucleic Acid s Research， Vol.32(Database Issue)pp.D138-D141。
实施例 2
基于萤光素酶的抗微生物测定法
常规的，抗生素的抗微生物活性使用标准规程测定。 效力最常表达为最低抑制 浓度 (Minimal Inhibitory Concentrations， MIC)。 为确定致病的、缓慢生长的分枝杆菌， 如结核分枝杆菌的 MIC，可使用数种经改良的系统，其利用放射性 (BACTEC) 或荧光 (MGIT) 作为可量化的读数。 然而，因为这些方法均需要特定设备，创立了使用细菌萤 光素酶的 MIC 试验规程。 一旦其编码基因转化至给定生物并在其中表达，萤光素酶就可 用作该生物存活力的指示。 使用萤光素酶 (LUX) 分析回避了如缓慢生长 ( 需～ 30 日在 营养平板上形成菌落 ) 和结块 (clumping) 的问题，后者妨碍了大部分基于 CFU 的结核分枝杆菌测定法。 结果迅捷 (2-4 日内 )，且可给出关于给定化合物效力的大致情况——特 别是当其与其他使用相同设定的化合物比较时。
在该实施例中，结核分枝杆菌 H37Rv 用表达萤光素酶的质粒转化。
1. 用 单 独 的 结 核 分 枝 杆 菌 甘 油 原 种， 接 种 50-100ml 的 7H9(Fisher， 产 品 号 271310)ADC(Fisher，产品号 L12240)+0.05 ％ Tween(Sigma，产品号 T8761) 在一升滚瓶 中。 塞紧瓶盖并在 37℃以 30-60rpm 温育滚瓶。
2. 温育所述瓶子直至 OD600 在 0.5-0.8 间。 这通常需要约 4-7 日。
3. 在实验日，将培养物在早上稀释 ( 之前 6-8h) 至 OD600 ～ 0.075。 用新鲜培 养基将体积填至～ 50-100ml，并温育 6-8h，从而使得 OD600 在 0.125-0.200 之间。 这就 是实验培养物。
4. 用不同浓度的肽加入 96 孔板中，铭记每孔的总体积不应超过 250μl。
5. 通过将所述板封于可透气的袋中，在 37℃ ±5％ CO2 温育 96h。
6. 将平板从培养箱移出，并将袋舍弃。 在通气橱中敞盖温育平板 60min，从而 使得其平衡到室温下。
7. 使用光度计的自动注射器通过注射 25μl 癸醛 (1％，在 95％乙醇中 ) 起始萤光 素酶反应，在光度计中对平板进行读数，并分析数据。 MIC 测定为将相对光单位 (relative light unit， RLU) 减少 90％ (1 个数量级 ) 的 化合物的浓度。 菌丝霉素 (plectasin)(SEQ ID NO ：2) 的 MIC 确定为约 25μg/ml，而菌 丝霉素变体肽 SEQ ID NO ：14 的 MIC 确定为约 6μg/ml。
实施例 3
用 CFU 或传统平板测定法确证 RLU 分析的有效性
确证所述相对光单位测定法 (RLU) 通过将其与常规菌落形成单位 (CFU) 测定法 比较来进行。 在该测定法中，将细胞暴露于不同浓度的肽 96h，然后铺于 7H10 板上。 将 平板在 37℃温育 30 日，并对菌落进行计数。
由 RLU 获取的 6.25μg/ml 的 MIC 等价于由 CFU 获取的 MBC，因此指出下述事 实 ：即 SEQ ID NO ：14 的肽针对其他革兰氏阳性细菌是杀菌的，有如菌丝霉素。
结论为现在的萤光素酶设定可用于精准确定 MIC，且具有作为高通量筛选方法 实施的潜力。
实施例 4
基于 OD600 确定 MIC
通 过 用 OD600 测 定 其 作 用， SEQ ID NO ：14 肽 的 抑 制 作 用 亦 与 生 长 相 关。 NZ2109 于 6.25μg/ml 能够完全抑制结核分枝杆菌在 T-25 烧瓶中的生长。
综上所述，实施例 3 和 4 中的测定法均确证 SEQ ID NO ：14 肽的 MIC( ＝ MBC) 为 6.25μg/ml。
实施例 5
鉴定具有针对结核分枝杆菌的强力活性的抗微生物肽
对多种抗微生物肽就其针对结核分枝杆菌 H37Rv 的抗微生物活性使用萤光素酶 测定法如实施例 2 所述进行了测试。 在此特定测定法中肽的浓度为 25μg/ml。 这些肽 中最强力的是菌丝霉素或含有特定氨基酸改变的衍生物。 所述肽，其相应的氨基酸序列
和其抑制程度列于下面的表 1 ：
表1
SEQ ID NO ： 缓冲液对照 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
与 SEQ ID NO ：2 相比的氨基酸取代 NA 无 Q14K+K26R K26R Q14F Q14R+K26R+K38R Q14R+K20R Q14L N5R+M13V M13K+K38R Q14R+K26R N5S+D9S+M13L+Q14R+N17V+A31S N5G+M13L N5G+D9S+M13L+N17Q+A31T D9N+M13L+Q14R D9G+Q14R+K23RRLU 53503 2070 2310 1903 1567 4483 1339 2145 1685 1152 3604 3901 2576 1083 4165 4495减少倍数 1 25.7 23.2 28.1 34.1 11.9 40.0 24.9 31.8 46.4 14.8 13.7 20.8 49.4 12.9 11.9在类似的实验设定中，对菌丝霉素的其它变体就其针对结核分枝杆菌 H37Rv 的 抗微生物活性使用萤光素酶测定法如实施例 2 所述进行了测试。 在该特定分析中肽的浓度为 6.25μg/ml。 最好的肽，均为菌丝霉素的衍生物， 列于下面的表 2。
表2
所有上面的肽具有 25μg/ml 或更低的 MIC。 有些肽，SEQ ID NO ：14、SEQ ID NO ：7、 SEQ ID NO ：9 和 SEQ ID NO ：20 亦在较低浓度进行了测试，并具有 6.25μg/ ml 的 MIC。 肽 SEQ ID NO ：17、SEQ ID NO ：18 和 SEQ ID NO ：19 几乎显示所需的 10 倍 RLU 减少，并因此具有非常接近 6.25μg/l 的 MIC。
实施例 6
其他针对结核分枝杆菌具有强力活性的抗微生物肽
基本上遵循实施例 3 和 4 勾画的步骤，并如 NCCLS 指南 (M24-A) 所述，衡量 了更多的菌丝霉素变体，如示于下面的表 3。 相应的 MIC 值示于表 3。
表3
表 3 所示的结果表明所有经测试的肽显示针对结核分枝杆菌的强力活性。实施例 7
SEO ID NO ：14 肽针对早期静止细胞 (stationary cell) 具有活性
表达 LUX 的 H37Rv 同时以～ 0.1 OD600 和～ 1.0 OD600 在含 6.25μg/ml 的 SEQ ID NO ：14 肽的 96 孔板中进行测试。 密封平板并在 37℃，5％ CO2 下温育 96 小时。 之 后，读取光单位数。 相对后续的生长期，选取了～ 1.0 的 OD600，这是因为当 OD600 高于～ 1 时， LUX 和 OD 间的相关性看来偏离了曲线。 而且，后续的生长期使实验变得更加复 杂，这是因为过多可见的结块将干扰任何微生物方法。
本申请包含计算机可读取形式的序列表。 该计算机可读取形式以参照的方式并 入本文中。
发明背景
发明领域 本发明涉及结核病治疗，如用防卫素治疗由分枝杆菌属细菌 (Mycobacterium)， 例如结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 介导的疾病。
对相关技术的描述
结核病是一种由结核分枝杆菌感染介导的传染病。 结核病在发展中国家是一 种主要的疾病，并且在世界上发达地区也越来越成为问题。 尽管其感染可能在很长时 间内都不会有症状，但是该疾病最常见会以肺部的急性炎症为表现，导致发热和干咳 (nonproductive cough)。 如果不予治疗，通常会导致严重的并发症和死亡。 结核病通常 可通过抗生素疗法控制，如通过用下述药物治疗 ：异烟肼 (Isoniazid)，参见，例如， The Merck Index(Merck 索引 )，第 12 版，第 5203 项 ；利福平 (Rifampin(Rifampicin))，参 见，例如 TheMerck Index，第 12 版，第 8382 项 ；链霉素 (Streptomycin)，参见，例如 TheMerck Index，第 12 版，第 8983 项 ；但一个主要的问题是产生对上述抗生素具有抗药 性的菌株。
本发明的目标是提供基于防卫素的药物，及使用这些药物的方法，用于治疗由 分枝杆菌属细菌，例如，结核分枝杆菌介导的疾病。
对相关技术的描述
结核病是一种由结核分枝杆菌感染介导的传染病。 结核病在发展中国家是一 种主要的疾病，并且在世界上发达地区也越来越成为问题。 尽管其感染可能在很长时 间内都不会有症状，但是该疾病最常见会以肺部的急性炎症为表现，导致发热和干咳 (nonproductive cough)。 如果不予治疗，通常会导致严重的并发症和死亡。 结核病通常 可通过抗生素疗法控制，如通过用下述药物治疗 ：异烟肼 (Isoniazid)，参见，例如， The Merck Index(Merck 索引 )，第 12 版，第 5203 项 ；利福平 (Rifampin(Rifampicin))，参 见，例如 TheMerck Index，第 12 版，第 8382 项 ；链霉素 (Streptomycin)，参见，例如 TheMerck Index，第 12 版，第 8983 项 ；但一个主要的问题是产生对上述抗生素具有抗药 性的菌株。
本发明的目标是提供基于防卫素的药物，及使用这些药物的方法，用于治疗由 分枝杆菌属细菌，例如，结核分枝杆菌介导的疾病。
【发明内容】
我们已经发现某些防卫素变体针对结核分枝杆菌显示良好的活性，且可用于治 疗由分枝杆菌属细菌导致的疾病，如结核病。
在一个方面，本发明提供用亲本防卫素的变体生产药物的用途，所述药物用于 治疗性处理由分枝杆菌属细菌介导的疾病，如结核病，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或 多个位置处的取代 ；其中所述变体能够杀灭或抑制结核分枝杆菌细胞 ；且其中所述亲本 防卫素是包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的氨基酸序列的多肽， 或由在高严紧条件下与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列或其互补链杂交的多核苷酸编 码的多肽。
在第二个方面，本发明提供亲本防卫素的变体，用于治疗性处理由分枝杆菌属 细菌介导的疾病，如结核病，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的多肽的位置 5、 9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个位置处的取代 ；其中所述 变体能够杀灭或抑制结核分枝杆菌细胞 ；且其中所述亲本防卫素是包含与 SEQ ID NO ： 2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的氨基酸序列的多肽，或由在高严紧条件下与 SEQ IDNO ：1 的成熟多肽编码序列或其互补链杂交的多核苷酸编码的多肽。
在第三个方面，本发明提供一种杀灭或抑制分枝杆菌属细菌细胞的方法，包括 将所述分枝杆菌属细菌细胞与亲本防卫素的变体接触，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的多肽的位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 位置处的取代 ；其中所述亲本防卫素是包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％ 同一性的氨基酸序列的多肽，或由在高严紧条件下与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列 或其互补链杂交的多核苷酸编码的多肽。
在另一个方面，本发明提供治疗由分枝杆菌属细菌介导的疾病的方法，包括 施与需要该治疗的受试者有效量的，例如，抗分枝杆菌有效量的 (anti-mycobacterium effective amount of) 亲本防卫素的变体，其中所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的多 肽的位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个位置处的取 代 ；且其中所述亲本防卫素是包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的 氨基酸序列的多肽，或由在高严紧条件下与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列或其互补 链杂交的多核苷酸编码的多肽。
致 病 性 的 分 枝 杆 菌 属 细 菌 包 括 结 核 分 枝 杆 菌、 牛 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium bovis)、 堪 萨 斯 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium kansasii)、 麻 风 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium leprae)、溃疡分枝杆菌 (Mycobacterium ulcerans) 和鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)。 由分枝杆菌属细菌介导的疾病包括分枝杆菌感染。 治疗 (treatment) 包括治疗和预防。 用 于根据本发明的用途或根据本发明用于治疗疾病的防卫素变体在后文中称为 “( 根据 ) 本 发明的防卫素”。
发明详述
本发明涉及供治疗由分枝杆菌属细菌介导的疾病的药物及其使用方法，其包括 亲本防卫素的变体，所述变体包含在对应于 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9、 11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置处的取代 ；其中 所述变体能够杀灭或抑制结核分枝杆菌的生长。
定义
变体 ：术语 “变体” 在本文中定义为包含在 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的一个 或多个 ( 几个 ) 特定位置改变，如取代、插入和 / 或缺失一个或多个 ( 几个 ) 氨基酸残基 的多肽。 经改变的多核苷酸通过人为介入修饰 SEQ ID NO ：1 中公开的多核苷酸序列或 其同源序列得到。
防卫素 ：术语 “防卫素” 用于本文指本领域技术人员所识别属于抗微生物肽防 卫素类的多肽。 为确定一种多肽是否是根据本发明的防卫素，其氨基酸序列优选通过使 用可免费获得的 HMMER 软件包与 PFAM 数据库的隐蔽马尔科夫模型序型 (hidden markov model profile， HMM 序型 (HMM profile)) 比较 ( 参见实施例 1)。
PFAM 防卫素家族包括防卫素 _1 或 “哺乳类防卫素” ( 登录号 PF00323)、防卫 素 _2 或 “节肢动物防卫素” ( 登录号 PF01097)、防卫素 _β 或 “β 防卫素” ( 登录号 PF00711)、防卫素 _propep 或 “防卫素原肽” ( 登录号 PF00879) 与 γ- 硫素 (thionin) 或 “γ- 硫素家族” ( 登录号 PF00304)。
防卫素可属于 α- 防卫素类、 β- 防卫素类、 θ- 防卫素类、昆虫或节肢动物防卫素类、或植物防卫素类。
在一个实施方案中，根据本发明的防卫素的氨基酸序列包括 4、5、6、7、或 8 个半胱氨酸残基，优选 4、5、或 6 个半胱氨酸残基、更优选 4 或 6 个半胱氨酸残基、且最 优选 6 个半胱氨酸残基。
防卫素亦可为共有任何防卫素类特有特征的合成防卫素。
上述防卫素的实例包括但不仅限于 α- 防卫素 HNP-1( 人嗜中性粒细胞肽 )、 HNP-2 和 HNP-3 ；β- 防卫素 -12、果蝇霉素 (Drosomycin)、 Heliomicin、 γ1- 嘌呤硫 素 (γ1-purothionin)、昆虫防卫素 A、和 PCT 申请 WO 99/53053、 WO 02/06324、 WO 02/085934、 WO 03/044049、 WO 2006/050737 和 WO2006/053565 所公开的防卫素。
亲本防卫素 ：术语 “亲本” 防卫素用于本文指一种经修饰，例如，取代、插 入、缺失和 / 或截断 (truncation) 以产生本发明中使用的防卫素变体的防卫素。 该术语亦 指变体用以比较和比对的多肽。 所述亲本可为天然存在 ( 野生型 ) 的多肽或变体。 举例 而言，所述亲本多肽可为天然存在的多肽的变体，其氨基酸序列经修饰或改变。 亲本亦 可为等位基因变体，其为由占据相同染色体位点的基因的两种或更多可选形式中的任一 种所编码的多肽。 分离的变体或多肽 ：术语 “分离的变体” 或 “分离的多肽” 用于本文指一种自 来源分离的变体或多肽。 在一个方面，该变体或多肽至少是 1％纯的，优选至少是 5％ 纯的，更优选至少是 10％纯的，更优选至少是 20％纯的，更优选至少是 40％纯的，更优 选至少是 60％纯的，甚至更优选至少是 80％纯的，且最优选至少是 90％纯的，其纯度由 SDS-PAGE 确定。
基本上 (substantially) 纯的变体或多肽 ：术语 “基本上纯的变体” 或 “基本上 纯的多肽” 在本文中指一种多肽制备物，其包含最多 10％，优选最多 8％，更优选最多 6 ％，更优选最多 5 ％，更优选最多 4 ％，更优选最多 3 ％，甚至更优选最多 2 ％，最优 选最多 1％，且甚至最优选最多 0.5％以重量计的与其天然或重组结合的其他多肽物质。 因此，优选地，基本上纯的变体或多肽是以存在于该制备物中的总多肽物质重量计至少 92％纯的，优选至少 94％纯的，更优选至少 95％纯的，更优选至少 96％纯的，更优选至 少 96％纯的，更优选至少 97％纯的，更优选至少 98％纯的，甚至更优选至少 99％纯的， 最优选至少 99.5％纯的，且甚至最优选 100％纯的。 本发明的变体或多肽优选为基本上纯 的形式。 其可通过，例如，以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该变体或多肽而 达成。
成熟多肽 ：术语 “成熟多肽” 在本文中定义为具有防卫素活性的多肽，其为 经翻译和任何翻译后修饰，如 N 末端加工、 C 末端截断、糖化、磷酸化等之后的最终形 式。 在一个方面，所述成熟序列是 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 1 到 40，基于 SignalP 程序， 预期 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 -55 到 -33 是信号肽，而 kex- 位点出现在 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 -2 到 -1。
成熟多肽编码序列 ：术语 “成熟多肽编码序列” 在本文中定义为编码具有防卫 素活性的成熟多肽的核苷酸序列。 在一个方面，所述成熟多肽编码序列是 SEQ ID NO ： 1 的核苷酸 166 到 285，基于 SignalP 程序，预期 SEQ IDNO ：1 的核苷酸 1 到 69 编码信 号肽，而 kex- 位点出现在 SEQ ID NO ：1 的氨基酸 -2 到 -1。
同一性 ：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数” 同一性” 所描述。 就本发明而言，两个氨基酸序列间的同一性程度使用 Needleman-Wunsch 算 法 (Needleman 和 Wunsch，1970， J.Mol.Biol.48 ：443-453) 确 定， 如 用 EMBOSS 软 件 包 (EMBOSS ：欧洲分子生物开放软件组 (The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000， Trendsin Genetics 16 ：276-277 ；http://emboss.org) 的 Needle 程 序实施，优选为 3.0.0 版或之后的版本中。 所用的可选参数为缺口产生罚分 (gap open penalty)10， 缺 口 延 伸 罚 分 (gap extension penalty)0.5， 和 EBLOSUM62(BLOSUM62 的 EMBOSS 版 ) 取代矩阵。 使用标记为 “最长同一性” 的 Needle 输出 ( 使用 -nobrief 选 项获得 ) 作为百分比同一性并如下计算 ：
( 相同的残基 ×100)/( 比对长度 - 比对中缺口总数 )
就 本 发 明 而 言， 两 个 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 序 列 间 的 同 一 性 程 度 使 用 Needleman-Wunsch 算 法 (Needleman 和 Wunsch，1970， 见 上 ) 确 定， 如 用 EMBOSS 软 件 包 (EMBOSS ：欧 洲 分 子 生 物 开 放 软 件 组 (The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，见上 ；http://emboss.org) 的 Needle 程序实施的，优选 为 3.0.0 版或之后的版本。 所用的可选参数为缺口产生罚分 10，缺口延伸罚分 0.5，和 EDNAFULL(NCBI NUC4.4 的 EMBOSS 版 ) 取代矩阵。 使用标记为” 最长同一性” 的 Needle 输出 ( 使用 -nobrief 选项获得 ) 作为百分比同一性并如下计算 ：
( 相同的脱氧核糖核苷酸 ×100)/( 比对长度 - 比对中缺口总数 )。
变体命名规则 ：
就本发明而言，公开于 SEQ ID NO ：2 中的防卫素的氨基酸序列用于确定在其他 防卫素中对应的氨基酸残基。 将其他防卫素的氨基酸序列与公开于 SEQ ID NO ：2 中的 防卫素氨基酸序列进行比对，并基于该比对，可以确定 SEQ ID NO ：2 所公开的防卫素氨 基酸序列中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。
多 肽 序 列 的 比 对 可 使 用， 例 如， “ClustalW” (Thompson， J.D.， Higgins， D.G. 和 Gibson，T.J.，1994，CLUSTAL W ：Improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting， positions-specific gappenalties and weight matrix choice， Nucleic Acids Research 22 ：4673-4680) 得到。 DNA 序列的比对可以使用 所述多肽比对作为模板，将氨基酸用来自所述 DNA 序列的对应密码子替代来进行。
通常使用的逐对序列比较算法 (pairwise sequence comparison algorithm) 足以检测 出未分歧到少于大约 20-30％序列同一性的多肽序列间的相似性 (Doolittle，1992，Protein Sci.1 ：191-200 ；Brenner 等，1998， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，6073-6078)。 然 而， 具有相同折叠 (fold) 和相似生物学功能，真正同源的多肽经常分歧到传统的基于序列的 比较无法检测出其关系的程度 (Lindahl and Elofsson，2000， J.Mol.Biol.295 ：613-615)。 在 基 于 序 列 的 搜 索 中 较 高 的 敏 感 度 可 使 用 采 用 多 肽 家 族 的 概 率 表 现 (probabilistic representation)( 序型 ) 搜索数据库的搜索程序来获得。 举例而言， PSI-BLAST 程序通 过迭代的 (iterative) 数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物 (Atschul 等，1997， Nucleic Acids Res.25 ：3389-3402)。 当 目 标 多 肽 的 家 族 或 超 家 族 在 蛋 白 质结构数据库中具有一个或多个 ( 几个 ) 代表时，甚至可达成更高的敏感度。 程序
如 GenTHREADER(Jones 1999， J.Mol.Biol.287 ：797-815 ；McGuffin 和 Jones，2003， Bioinformatics 19 ：874-881) 使用来自不同来源 (PSI-BLAST、二级结构预测 (secondary structure prediction)、 结 构 比 对 序 型 (structural alignment profile) 以 及 溶 解 势 (solvation potential)) 的信息作为预测所查询序列 (query sequence) 结构折叠 (structural fold) 的神经 网络的输入。 同样地， Gough 等，2000， J.Mol.Biol.313 ：903-919 的方法可用于将未知 结构的序列与存在于 SCOP 数据库中的超家族模型进行比对，且上述模型可就其准确度 使用多种为此目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回 (retrieve) 和生成结构 比对。 举例而言，已将 SCOP 超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并 可下载的。 两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵 (distance alignment matrix)(Holm 和 Sander，1998， Proteins33 ：88-96) 或组合延伸 (combinatorial extension) (Shindyalov 和 Bourne，1998， Protein Eng.11 ：739-747) 进行比对，且这些算法的实施 可另外用于寻求具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物 ( 例如 Holm 和 Park，2000， Bioinformatics 16 ：566-567)。 这些结构比对可用于在相同结构超家族内的 蛋白质中预测结构和功能上对应的氨基酸残基。 该信息，与来源于同源性建模与序型搜 索的信息一同，可用于在将目标突变从一个蛋白质移到一个接近的或较远的蛋白质时预 测哪个残基会突变。
在描述本发明的不同防卫素变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命 名法。 在所有情况下，使用通用的 IUPAC 单字母或三字母氨基酸缩写。
对于氨基酸取代，使用下述命名法 ：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。 相应 的，在 226 位用丙氨酸取代苏氨酸命名为 “Thr226Ala” 或 “T226A”。 多重突变可以 用加号 ( “+” ) 分开，例如， “Gly205Arg+Ser411Phe” 或 “G205R+S411F”，分别代 表 205 和 411 位用精氨酸 (R) 取代甘氨酸 (G)，以及用苯丙氨酸 (F) 取代丝氨酸 (S) 的突 变。
亲本防卫素
在本发明中，所述亲本防卫素是 (a) 包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 90％同一性的氨基酸序列的多肽 ；(b) 由在至少高严紧条件下与 SEQID NO ：1 的成熟多 肽编码序列、其互补链杂交的多核苷酸编码的多肽 ；或由包含与 SEQ ID NO ：1 的成熟 多肽编码序列具有至少 80％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽。
在第一个方面，所述亲本防卫素包含与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽具有至少 80％，优选至少 85％、更优选至少 90％、最优选至少 95％、且甚至最优选至少 96％、至 少 97％、至少 98％或至少 99％同一性程度的氨基酸序列，其能够杀灭或抑制结核分枝杆 菌的生长 ( 后文中称为 “同源多肽”)。 在一个方面，所述同源多肽具有与 SEQ ID NO ： 2 的成熟多肽相差十个氨基酸、优选五个氨基酸、更优选四个氨基酸、甚至更优选三个氨 基酸，最优选两个氨基酸，且甚至最优选一个氨基酸的氨基酸序列。
基本上同源的亲本防卫素可具有一个或多个 ( 几个 ) 氨基酸取代、缺失和 / 或 插入。 这些变化优选是次要的 (of a minor nature)，即为上述保守氨基酸取代或其他不至 于显著影响所述蛋白质或多肽三维折叠或活性的取代 ；小缺失，通常为一到约 30 个氨基 酸 ；以及小的氨基 - 或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基、最多约 20-25 个残基的小接头肽或有助于提纯的小延伸 ( 亲和标记 )，如多组氨酸序列 (tract)，或蛋白质 A(Nilsson 等，1985， EMBO J.4 ：1075 ；Nilsson 等，1991， Methods Enzymol.198 ：3)。 亦可一般性的参见 Ford 等，1991， Protein Expression and Purification 2 ：95-107。
尽管上述变化优选为次要的，该变化亦可为实质性的，如融合多达 300 个氨基 酸或更多的较大多肽作为氨基或羧基末端的延伸。
除了所述 20 个标准氨基酸外，非标准氨基酸 ( 如 4- 羟脯氨酸、6-N- 甲基赖氨 酸，2- 氨基异丁酸、异缬氨酸以及 α- 甲基丝氨酸 ) 可用于取代野生型防卫素的氨基酸 残基。 有限数量的非保守氨基酸、非由遗传密码编码的氨基酸，以及非天然的氨基酸可 用于取代氨基酸残基。 “非天然的氨基酸” 在蛋白质合成后经修饰，和 / 或在其侧链具 有与标准氨基酸侧链不同的化学结构。 非天然氨基酸可为化学合成的，且优选为可市购 的，且包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烷羧酸 (thiazolidine carboxylic acid)、脱 氢脯氨酸、3- 和 4- 甲基脯氨酸以及 3，3- 二甲基脯氨酸。
亲本防卫素优选包含 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列或其等位变体。在一个方面， 所述亲本防卫素包含 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列。 在另一个方面，所述亲本防卫素包 含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽。 在另一个方面，所述亲本防卫素包含 SEQ ID NO ：2 的 氨基酸 1 到 40 或其等位变体。 在另一个方面，所述亲本防卫素包含 SEQ ID NO ：2 的氨 基酸 1 到 40。 在另一个方面，所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列或其等位 基因变体组成。 在另一个方面，所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸序列组成。 在另一个方面，所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽组成。在另一个方面，所述 亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 1 到 40 或其等位基因变体组成。 在另一个方面， 所述亲本防卫素由 SEQ ID NO ：2 的氨基酸 1 到 40 组成。
在第二个方面，所述亲本防卫素由在中等严紧条件下，优选中 - 高严紧条件 下、更优选高严紧条件下，且最优选极高严紧条件下与 (i)SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编 码序列或其亚序列杂交的多核苷酸编码 (J.Sambrook， E.F.Fritsch 和 T.Maniatis，1989， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2dedition，Cold Spring Harbor，New York)。 在 一个方面，所述互补链为 SEQ IDNO ：1 的成熟多肽编码序列的全长互补链。
对于长度至少为 100 个核苷酸的长多核苷酸，极低到极高的严紧条件定义为在 42℃在 5XSSPE，0.3％ SDS，200 微克 /ml 经剪切 (sheared) 和变性的鲑精 DNA，以及对 于极低和低严紧性 25％甲酰胺，对于中等和中 - 高严紧性 35％甲酰胺，或对于高或极高 严紧性 50％甲酰胺中根据标准 Southern 印迹步骤预杂交和杂交最佳 12 到 24 小时。
对于长度至少为 100 个核苷酸的长多核苷酸，载体物质最终使用 2XSSC，0.2％ SDS，优选在 45℃ ( 极低严紧性 )，更优选在 50℃ ( 低严紧性 )，更优选在 55℃ ( 中等严 紧性 )，更优选在 60℃ ( 中等 - 高严紧性 )，甚至更优选在 65℃ ( 高严紧性 )，且最优选 在 70℃ ( 极高严紧性 ) 下洗涤三次，每次 15 分钟。
对于长度为约 15 个核苷酸到约 70 个核苷酸的短多核苷酸，严紧条件定义为在低 于使用根据 Bolton 和 McCarthy(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48 ：1390) 的计算法计算的 Tm 约 5℃到约 10℃的温度，在 0.9M NaCl、0.09Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5 ％ NP-40、1XDenhardt ′ s 溶液、1mM 焦磷酸钠、1mM 磷酸二氢 钠、0.1mM ATP 以及每 ml 0.2mg 的酵母 RNA 中，根据标准 Southern 印迹步骤预杂交、杂交并在杂交后洗涤最佳 12 到 24 小时。
对长度为约 15 个核苷酸到约 70 个核苷酸的短多核苷酸，所述载体物质在 6xSCC 加上 0.1％ SDS 中洗涤一次 15 分钟，并使用 6x SSC 在低于计算的 Tm 5℃到 10℃的温度下 洗涤两次，每次 15 分钟。
在第三个方面，所述亲本防卫素由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组 成的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与 SEQ ID NO ：1 的成熟多肽编码序列具有优选至少 80％，优选至少 85％，更优选至少 90％，最优选至少 95％，且甚至最优选 96％、97％、 98 ％或 99 ％的同一性程度，其编码活性多肽。 在一个方面，所述成熟多肽编码序列是 SEQ ID NO ：1 的核苷酸 166 到 285。
所述亲本防卫素可由任何属的微生物获取。 就本发明而言，术语 “由 ...... 获 取” 与给定来源相联系用于本文意为由多核苷酸编码的亲本防卫素由所述来源产生，或 由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。
在一个方面，所述亲本防卫素在细胞外分泌。
所 述 亲 本 防 卫 素 可 为 真 菌 防 卫 素。 在 另 一 个 方 面， 所 述 真 菌 防 卫 素 是 酵 母 防 卫 素， 如 假 丝 酵 母 属 (Candida)、 克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces)、 毕 赤 酵 母 属 (Pichia)、 酵 母 属 (Saccharomyces)、 裂 殖 酵 母 属 (Schizosaccharomyces) 或 西 洋 蓍 霉 属 (Yarrowia) 防卫素。 在另一个方面，所述真菌防卫素是丝状真菌防卫素如枝顶孢霉 属 (Acremonium)、 伞 菌 属 (Agaricus)、 链 格 孢 属 (Alternaria)、 曲 霉 属 (Aspergillus)、 短梗霉属 (Aureobasidium)、 Botryospaeria、拟蜡菌属 (Ceriporiopsis)、 Chaetomidium、 金 孢 子 菌 属 (Chrysosporium)、 Claviceps、 Cochliobolus、 Coprinopsis、 Coptotermes、 Corynascus、 Cryphonectria、隐球菌属 (Cryptococcus)、 Diplodia、 Exidia、 Filibasidium、 镰 孢 属 (Fusarium)、 赤 霉 属 (Gibberella)、 Holomastigotoides、 腐 质 霉 属 (Humicola)、 耙 菌 属 (Irpex)、 Lentinula、 Leptospaeria、 梨 孢 菌 属 (Magnaporthe)、 Melanocarpus、 多 孔 菌 属 (Meripilus)、 毛 霉 属 (Mucor)、 毁 丝 霉 属 (Myceliophthora)、 新 考 玛 脂 霉 属 (Neocallimastix)、 脉 孢 菌 属 (Neurospora)、 拟 青 霉 属 (Paecilomyces)、 青 霉 属 (Penicillium)、 平 革 菌 属 (Phanerochaete)、 瘤 胃 壶 菌 属 (Piromyces)、 Poitrasia、 假 黑 盘 菌 属 (Pseudoplectania)、 Pseudotrichonympha、 根 毛 霉 属 (Rhizomucor)、 裂 褶 菌 属 (Schizophyllum)、 柱 顶 孢 属 (Scytalidium)、 踝 节 菌 属 (Talaromyces)、 热 子 囊 菌 属 (Thermoascus)、 梭 孢 壳 属 (Thielavia)、 弯 颈 霉 属 (Tolypocladium)、 木 霉 属 (Trichoderma)、 Trichophaea、轮枝孢属 (Verticillium)、 Volvariella 或 Xylaria 防卫素。
在另一个方面，所述亲本防卫素是卡尔酵母 (Saccharomycescarlsbergensis)、 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)、 糖 化 酵 母 (Saccharomyces diastaticus)、 道 格 拉 氏 酵 母 (Saccharomyces douglasii)、 克 鲁 弗 酵 母 (Saccharomyces kluyveri)、 诺 地 酵 母 (Saccharomyces norbensis) 或卵形酵母 (Saccharomyces oviformis) 防卫素。
在 另 一 个 方 面， 所 述 亲 本 防 卫 素 是 解 纤 维 枝 顶 孢 霉 (Acremoniumcellulolyticus)、 棘 孢 曲 霉 (Aspergillus aculeatus)、 泡 盛 曲 霉 (Aspergillusawamori)、 烟 曲 霉 (Aspergillus fumigatus)、 臭 曲 霉 (Aspergillus foetidus)、 日 本 曲 霉 (Aspergillus japonicus)、 构 巢 曲 霉 (Aspergillus nidulans)、 黑 曲 霉 (Aspergillus niger)、 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae)、 嗜 角 质 金 孢 子 菌 (Chrysosporiumkeratinophilum)、 Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌 (Chrysosporium tropicum)、 Chrysosporium merdarium、 Chrysosporium inops、 毡 金 孢 子 菌 (Chrysosporium pannicola)、 Chrysosporium queenslandicum、 Chrysosporium zonatum、 杆 孢 状 镰 孢 (Fusarium bactridioides)、 禾 谷 镰 孢 (Fusarium cerealis)、 库 威 镰 孢 (Fusarium crookwellense)、大刀镰孢 (Fusariumculmorum)、禾本科镰孢 (Fusarium graminearum)、 禾 赤 镰 孢 (Fusariumgraminum)、 异 孢 镰 孢 (Fusarium heterosporum)、 合 欢 木 镰 孢 (Fusariumnegundi)、 尖 镰 孢 (Fusarium oxysporum)、 多 枝 镰 孢 (Fusarium reticulatum)、 粉红镰孢 (Fusarium roseum)、接骨木镰孢 (Fusarium sambucinum)、肤色镰孢 (Fusarium sarcochroum)、 拟 分 枝 孢 镰 孢 (Fusarium sporotrichioides)、 硫 色 镰 孢 (Fusarium sulphureum)、 圆 镰 孢 (Fusarium torulosum)、 拟 丝 孢 镰 孢 (Fusarium trichothecioides)、 镶 片 镰 孢 (Fusarium venenatum)、 灰 腐 质 霉 (Humicola grisea)、 特 异 腐 质 霉 (Humicola insolens)、 疏 棉 状 腐 质 霉 (Humicolalanuginosa)、 Irpex lacteus、 米 黑 毛 霉 (Mucor miehei)、嗜热毁丝霉 (Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)、 绳 状 青 霉 (Penicillium funiculosum)、 产 紫 青 霉 (Penicillium purpurogenum)、 黄 孢 平 革 菌 (Phanerochaete chrysosporium)、 Thielavia achromatica、 Thielavia albomyces、 Thielavia albopilosa、 Thielavia australeinsis、 Thielavia fimeti、 Thielaviamicrospora、 Thielavia ovispora、 Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳 (Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳 (Thielavia setosa)、 Thielavia subthermophila、土生梭孢霉 (Thielavia terrestris)、哈茨木 霉 (Trichoderma harzianum)、 康 宁 木 霉 (Trichoderma koningii)、 长 枝 木 霉 (Trichoderma longibrachiatum)、 里 氏 木 霉 (Trichoderma reesei) 或 绿 色 木 霉 (Trichoderma viride) 防 卫 素。
在另一个方面，所述亲本防卫素是淡黑假黑盘菌 (Pseudoplectanianigrella) 防卫 素，且最优选 SEQ ID NO ：2 的淡黑假黑盘菌防卫素或其成熟多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段 (perfect andimperfect states) 二者，和其他分类学的等同物 (equivalent)，例如无性型 (anamorph)，而无论其已 知的种名。 本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份 (identity)。
这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机 构如美国典型培养物保藏中心 (the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志 微生物和细胞培养物保藏中心 (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心 (Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS) 和农业 研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心 (Agricultural Research Service Patent Culture Collection， Northern Regional Research Center)(NRRL)。
所述亲本防卫素亦可使用上述探针从其他来源鉴定和获取，所述其它来源包括 从自然界 ( 例如，土壤、堆肥、水等 ) 分离的微生物或从天然材料 ( 例如，土壤、堆肥、 水等 ) 直接获取的 DNA 样本。 用于从天然生境 (habitat) 分离微生物和 DNA 的技术是本 领域内公知的。 随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或 cDNA 文库或者混合的 DNA 样本来获得编码防卫素的多核苷酸。 一旦用本文所述合适的探针检测到编码防卫素 的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员熟知的技术将其序列分离或克隆 ( 参 见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch 和 T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，ALaboratoryManual，2d cdition， Cold Spring Harbor， New York)。 如本文所定义， “分离的” 防卫 素是基本上 (essentially) 不含其他非防卫素多肽的多肽，例如至少约 20％纯，优选至少约 40％纯，更优选至少约 60％纯，甚至更优选至少约 80％纯，最优选约 90％纯，且甚至最 优选约 95％纯，所述纯度由 SDS-PAGE 确定。
所述亲本防卫素亦可包括融合多肽或可剪切的融合多肽，其中另一个多肽融合 于所述多肽或其片段的 N 末端或 C 末端。 融合多肽通过将编码另一个多肽的多核苷酸 ( 或其部分 ) 与本发明的多核苷酸 ( 或其部分 ) 融合来产生。 产生融合多肽的技术在 本领域为已知的，并包括连接编码所述多肽的编码序列从而使得它们的读码框相同 (in frame)，且融合的多肽的表达在同样的启动子和终止子的控制之下。 融合蛋白亦可使用 内蛋白 (intein) 技术构建，其中融合物在翻译后产生 (Cooper 等，1993， EMBO J.12 ： 2575-2583 ；Dawson 等，1994， Science 266 ：776-779)。
制备变体
亲本防卫素的变体可根据本领域任何已知的任何诱变方法，如定点诱变、 合 成 基 因 构 建 (synthetic gene construction)、 半 合 成 基 因 构 建 (semisynthetic gene construction)、随机诱变、改组 (shuffling) 等来制备。
定点诱变是在编码亲本防卫素的多核苷酸分子上的确定位点创建一个或多个突 变的技术。 所述技术可在体外或体内进行。
合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽分子的多核苷酸分 子。 基因合成可使用多种技术进行，如由 Tian 等所述基于多通道微芯片 (multiplex microchip-based) 的技术 (Tian， et.al.， Nature 432 ：1050-1054)，以及类似的技术，其中 合成寡核苷酸并在可用光编程 (photo-programmable) 的微流芯片 (microfluidic chip) 上组 装。
定点诱变可在体外通过 PCR 达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。 定点诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本防卫素的多核 苷酸的质粒中的位点进行剪切，然后将含有突变的寡核苷酸连接到所述多核苷酸上。 通 常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和插入物的粘性末 端能够彼此连接。 参见，例如， Scherer 和 Davis，1979， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76 ： 4949-4955 ；以及 Barton 等，1990， Nucleic Acids Research 18 ：7349-4966。
定点诱变可在体内通过本领域已知方法达成。 参见，例如，美国专利申请公 开 2004/0171154 ；Storici 等，2001， Nature Biotechnology 19 ：773-776 ；Kren 等， 1998，Nat.Med.4 ：285-290 ；以及 Calissano 和 Macino，1996，FungalGenet.Newslett.43 ： 15-16。
任何定点诱变方法可用于本发明。 有许多可用的市售试剂盒可用于制备亲本防 卫素的变体。
可使用已知的诱变、重组和 / 或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由 Reidhaar-Olson 和 Sauer，1988， Science 241 ：53-57 ；Bowie 和 Sauer，1989， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86 ：2152-2156 ；WO 95/17413 ；或 者 WO 95/22625 所 公 开 的 那 些， 进 行一个或多个氨基酸取代、缺失和 / 或插入并加以测试。 其他可使用的方法包括易错 PCR、噬菌体展示 ( 例如 Lowman 等，1991， Biochem.30 ：10832-10837 ；美国专利号5,223,409 ；WO 92/06204) 和区域定向诱变 (region-directed mutagenesis)(Derbyshire 等， 1986， Gene 46 ：145 ；等，1988， DNA 7 ：127)。
诱变 / 改组方法可与高通量、自动筛选方法合并以检测由宿主细胞表达的经克 隆、诱变的多肽的活性。 编码活性多肽的经诱变的 DNA 分子可自宿主细胞回收并使用本 领域标准方法迅速测序。 这些方法使快速确定目标多肽中单个氨基酸残基的重要性成为 可能。
半合成基因构建通过合并合成基因构建、和 / 或定点诱变、和 / 或随机诱变、和 / 或改组的特征达成。 半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与 PCR 技术组合的方 法。 基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用定点诱变引物扩增，还可 对另外的其他区域进行易错 PCR 或非易错 PCR(non-error prone PCR) 扩增。 多核苷酸片 段可随后进行改组。
变体
在本发明中，亲本防卫素的分离的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、 17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置处的取代 ；其中所述变体能够 杀灭或抑制结核分枝杆菌的生长，包含与亲本防卫素的氨基酸序列具有至少 80％，优选 至少 85％，更优选至少 90％，最优选至少 95％，且甚至最优选至少约 97％同一性程度的 氨基酸序列。
在一个方面，在本发明的变体中氨基酸取代的数目包括优选 4 个取代，更优选 3 个取代，甚至更优选 2 个取代，而最优选 1 个取代。 在另一个方面，在本发明的变体中 氨基酸取代的数目由优选 4 个取代，更优选 3 个取代，甚至更优选 2 个取代，而最优选 1 个取代组成。
在一个方面，亲本防卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、17、 20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置处的取代。 在另一个方面，亲本防 卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的两个 或更多位置处的取代。 在另一个方面，亲本防卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、 13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的三个或更多位置处的取代。 在另一个方面，亲 本防卫素的变体包含在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的 位置处的取代。
在一个方面，所述变体包含在对应于位置 5 的位置处的取代。 在另一个方面， 所述变体包含在对应于位置 5 的位置处用 Arg、Gly 或 Ser 取代。 在另一个方面，所述变 体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 N5R、 N5G 或 N5S 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 9 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 9 的位置处用 Asn、Gly 或 Ser 取代。 在另一个方面，所 述变体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 D9N、 D9G 或 D9S 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 11 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 11 的位置处用 Asn 或 Gly 取代。 在另一个方面，所述变 体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 D11N 或 D11G 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 13 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 13 的位置处用 Leu、 Lys 或 Val 取代。 在另一个方面，所述变体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 M13L、 M13K 或 M13V 取代。
在另一个方面，所述变体包含在对应于位置 14 的位置处的取代。 在另一个方 面，所述变体包含在对应于位置 14 的位置处用 Arg、Leu、Lys 或 Phe 取代。 在另一个方 面，所述变体包含 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽上的 Q14F、 Q14L、 Q14K 或 Q14R 取代。
在另一个方面，所述变体在对应于选自下组的位置的位置处包含取代 ：(a)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5 和 9 ；位置 5 和 13 ；位置 5 和 14 ；位置 9 和 13 ；位置 9 和 14 ；位置 13 和 14 ；位置 11 和 5 ；位置 11 和 9 ；位置 11 和 13 ；或位置 11 和 14 ；(b) SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9 和 13 ；位置 5、13 和 14 ；位置 9、13 和 14 ；或位 置 5、9 和 14 ；和 (c)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9、13 和 14 ；或位置 5、9、 11、13 和 14。
在另一个方面，所述变体在对应于下述位置的位置包含下述取代
位置 5 是 Gly、 Ser 或 Arg ；
位置 9 是 Gly、 Ser 或 Asn ；
位置 11 是 Asn 或 Gly ；
位置 13 是 Leu、 Val 或 Lys ； 位置 14 是 Leu、 Phe、 Lys 或 Arg ；
位置 17 是 Val 或 Gln ；
位置 20 是 Arg ；
位置 23 是 Arg ；
位置 26 是 Arg ；
位置 31 是 Ser 或 Thr ；
位置 36 是 Leu ；和
位置 38 是 Arg。
在另一个方面，所述变体包含一个或多个选自下组的取代 ：
N5G、 N5S 或 N5R ；
D9G、 D9S 或 D9N ；
D11N 或 D11G ；
M13L、 M13V 或 M13K ；
Q14L、 Q14F、 Q14K 或 Q14R ；
N17V 或 N17Q ；
K20R ；
K23R ；
K26R ；
A31S 或 A31T ；
V36L ；和
K38R。
在另一个方面，所述变体包含与 SEQ ID NO ：2、SEQ ID NO ：3、SEQ IDNO ： 4、SEQ ID NO ：5、SEQ ID NO ：6、SEQ ID NO ：7、SEQ ID NO ：8、SEQ IDNO ：9、 SEQ ID NO ：10、 SEQ ID NO ：11、 SEQ ID NO ：12、 SEQ ID NO ：13、 SEQID NO ：
14、 SEQ ID NO ：15、 SEQ ID NO ：16、 SEQ ID NO ：17、 SEQ ID NO ：18、 SEQ ID NO ：19、 SEQ ID NO ：20、 SEQ ID NO ：21、 SEQ ID NO ：22、 SEQ IDNO ：23、 SEQ ID NO ：24、 SEQ ID NO ：25、 SEQ ID NO ：26 或 SEQ ID NO ：27 的氨基酸序列具有至 少 80％同一性，优选至少 85％同一性，更优选至少 90％同一性，且最优选至少 95％同一 性的氨基酸序列。
在另一个方面，所述变体包含 SEQ ID NO ：2、 SEQ ID NO ：3、 SEQ IDNO ： 4、SEQ ID NO ：5、SEQ ID NO ：6、SEQ ID NO ：7、SEQ ID NO ：8、SEQ IDNO ：9、 SEQ ID NO ：10、 SEQ ID NO ：11、 SEQ ID NO ：12、 SEQ ID NO ：13、 SEQID NO ： 14、 SEQ ID NO ：15、 SEQ ID NO ：16、 SEQ ID NO ：17、 SEQ ID NO ：18、 SEQ ID NO ：19、 SEQ ID NO ：20、 SEQ ID NO ：21、 SEQ ID NO ：22、 SEQ IDNO ：23、 SEQ ID NO ：24、 SEQ ID NO ：25、 SEQ ID NO ：26 或 SEQ ID NO ：27 的氨基酸序列，或由 这样的氨基酸序列组成。
其他能够杀灭或抑制结核分枝杆菌的多肽
本发明亦涉及能够杀灭或抑制结核分枝杆菌的分离的多肽，其中所述多肽的氨 基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置上有差异。 在一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 的成熟多肽在优选 4 个氨 基酸，更优选 3 个氨基酸，甚至更优选 2 个氨基酸，且最优选 1 个氨基酸上有差异。
在一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、 11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的一个或多个 ( 几个 ) 位置上有差异。 在另 一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、11、13、14、 17、20、23、26、31、36 和 38 的两个或更多位置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的 氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、 36 和 38 的三个或更多位置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5、9、11、13、14、17、20、23、26、31、36 和 38 的位置上有差 异。
在一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5 的位置上 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 5 的位 置上因 Arg、Gly 或 Ser 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 5 上因 Arg、 Gly 或 Ser 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 9 的位置 上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 9 的位 置上因 Gly、Ser 或 Asn 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 9 上因 Gly、 Ser 或 Asn 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 11 的位 置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 11 的位置上因 Asn 或 Gly 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 11 上因 Asn 或 Gly 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 13 的位
置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 13 的位置上因 Leu、 Lys 或 Val 有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 13 上因 Leu、 Lys 或 Val 有差异。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 14 的位 置上有差异。 在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于位置 14 的位置上因 Phe、Leu、Lys 或 Arg 有差异。在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在 SEQ ID NO ：2 的成熟序列的位置 14 上因 Phe、 Leu、 Lys 或 Arg 有差异。
在另一个方面，所述差异对应于 ：
位置 5 是 Gly、 Ser 或 Arg ；
位置 9 是 Gly、 Ser 或 Asn ；
位置 11 是 Asn 或 Gly ；
位置 13 是 Leu、 Val 或 Lys ；
位置 14 是 Leu、 Phe、 Lys 或 Arg ；
位置 17 是 Val 或 Gln ；
位置 20 是 Arg ；
位置 23 是 Arg ；
位置 26 是 Arg ；
位置 31 是 Ser 或 Thr ；
位置 36 是 Leu ；和
位置 38 是 Arg。
在另一个方面，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO ：2 在对应于选自下组的位 置的位置存在差异 ：(a)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5 和 9 ；位置 5 和 13 ；位置 5 和 14 ；位置 9 和 13 ；位置 9 和 14 ；位置 13 和 14 ；位置 11 和 5 ；位置 11 和 9 ；位置 11 和 13 ；或位置 11 和 14 ；(b)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、9 和 13 ；位置 5、13 和 14 ；位置 9、13 和 14 ；或位置 5、9 和 14 ；和 (c)SEQ ID NO ：2 的成熟多肽的位置 5、 9、13 和 14 ；或位置 5、9、11、13 和 14。
方法和用途
本发明亦涉及使用防卫素变体的方法。
本发明涉及本发明的防卫素变体治疗结核病的用途。 此外，本发明的抗微生物 多肽或组合物亦可用于制备治疗结核病的药物。
本发明的防卫素变体可用作抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂。 因此，本 发明的防卫素变体可用于制备供治疗结核病的兽用或人用治疗剂或预防剂。
本发明的防卫素变体可以足以杀灭或抑制分枝杆菌属细菌细胞、优选结核分枝 杆菌生长的量使用。
将本发明的防卫素变体的配制物施用给正罹患或易患上分枝杆菌属细菌感染， 如结核病的宿主。 施用可为局部的或系统性的。 一般而言，本发明的抗微生物多肽剂量 会足以通过杀灭至少约 50％，通常为至少 1 个数量级，且可为 2 个或更多个数量级而减小 微生物群体。 本发明的化合物以减小微生物群体同时最小化任何副作用的剂量施用。 考 虑对于体内用途，所述组合物可在医师的指导下获取并使用。可使用不同的施用方法。 所述多肽配制物可口服施用，或可静脉内、皮下、腹 膜内注射、通过气溶胶、眼部 (opthalmically)、膀胱内、局部等方式施用。举例而言，通 过吸入的施用方法在本领域是公知的。 治疗性配制物的剂量变化会较广泛，其取决于待 施用的特定抗微生物多肽、疾病的特性、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除 率 (clearance) 等。 初始剂量可较大，然后用较小的维持剂量。 剂量的施用可为不频繁 的，如每周或每两周，或可分为较小的剂量，并每日一次或数次，或半周一次等施用以 维持有效的剂量水平。 在许多情况下，口服施用会比静脉内施用需要更高的剂量。 酰胺 键，以及氨基与羧基端，可经修饰以在口服施用中具有较高的稳定性。 例如，羧基端可 以是酰胺化的。
配制物
本发明的化合物可并入不同配制物中以供治疗施用。 更具体而言，本发明 的化合物可通过与适合的、药学上可接受的载体或稀释剂结合而配制成药物组成物， 且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，例如片剂、胶囊、粉末、细粒 (granules)、软膏、乳霜、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球体、洗剂、 以及气溶胶。 如此，所述化合物的施用可通过不同的方式达成，包括口服、含服、直 肠、胃肠外、腹膜内、皮内、经皮、气管内施用等。 本发明的抗微生物多肽在施用后可 为系统性的，或通过使用发挥在植入位点保持活性剂量的作用的植入物或其他配制物而 为局部的。
本发明的化合物可单独施用、彼此组合施用、或其可与其他已知化合物 ( 例 如，穿孔素 (perforin)、抗炎剂、抗生素、等等 ) 组合使用。 在药物剂量形式中，所述化 合物可以其药学上可接受的盐形式施用。 以下方法与赋形剂仅为示例性的，而决非限制 性的。
对于口服制备物，所述化合物可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、 粉末、细粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀 粉组合 ；与结合剂，例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶组 合 ；与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠结合 ；与润滑剂，例如 滑石或硬脂酸镁组合 ；以及若需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂以及调味剂组 合。
所述化合物可通过将其溶解、悬浮、或乳化于水性或非水性溶剂，如植物油或 其他类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中，以及若需要，与常规的 添加物，如助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂与防腐剂组合，而配制成用于注 射的制备物。
所述化合物可用于气溶胶配制物中通过吸入施用。 本发明的化合物可配制到经 加压可接受的推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和类似物中。
此外，所述化合物可通过与不同基底，如乳化基底或水溶性基底混合而制成栓 剂。 本发明的化合物可通过栓剂经直肠施用。 栓剂可包括媒介，如可可油、碳蜡与聚乙 二醇，其在体温下会融化，但在室温下会凝固。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂量形式，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每 个剂量单位，例如，一茶匙的量、一大匙的量、片剂或栓剂包含预定量的组合物，其包含一种或多种本发明的化合物。 类似的，用于注射或静脉内施用的单位剂量形式可包括 在组合物中的本发明的化合物，而所述组合物是无菌水、生理盐水或另一个药学上可接 受载体的溶液。
用于持续释放配制物的移植物在本领域是公知的。 移植物用生物可降解的或非 生物可降解的聚合物配制为微球体、厚板 (slab) 等。例如，乳酸和 / 或羟基乙酸的聚合物 形成可受到侵蚀的聚合物，其可良好地被宿主所容忍。 将包含本发明的抗微生物多肽的 移植物置于接近感染的位置，使得活性药剂的局部浓度相对于身体其他部分有所增加。
如本文所使用的术语” 单位剂量形式” 指物理上分开的单位，其适合作为用于 人类和动物受试者的单位剂量，每个单位包含预定量的本发明化合物，该量经计算足以 产生期望的效果，所述化合物与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介结合。 本发明单位 剂量形式的规格取决于所使用的特定多肽以及所欲达到的效果、以及在宿主中所述化合 物的药物动力学。
药学上可接受的赋形剂，例如媒介、佐剂、载体或稀释剂，是公众可轻易获得 的。 此外，药学上可接受的辅助物质，例如 pH 调整与缓冲剂、渗透压调整剂、稳定剂、 湿润剂、以及类似物，是公众可轻易获得的。
用 于 系 统 性 施 用 的 典 型 剂 量 范 围 是 从 每 次 施 用 每 公 斤 受 试 者 体 重 0.1pg 至 100 毫克。 典型剂量可为每天服用一个片剂二到六次，或每天服用一个经时间 - 释放 (time-release) 的胶囊或片剂一次，其包含成比例较高含量的活性成分。 经时间 - 释放效 果可通过溶于不同 pH 值的胶囊物质、通过渗透压缓慢释放的胶囊、或任何其他已知的控 制性释放方法而获得。
本领域技术人员会容易的了解到剂量水平可作为所述特定化合物、症状严重性 和受试者对副作用的敏感性的函数而变化。 一些特定化合物比其他的更具效力。 对于给 定化合物的优选剂量可由本领域技术人员容易的通过不同的方式确定。 一个优选的方式 为测定给定化合物的生理效力。
使用脂质体作为递送媒介为一种受关注的方法。 脂质体与靶位点的细胞融合并 将其内腔的内容物递送至细胞内。 将脂质体维持与细胞接触足够的时间以融合，其使用 不同的方法以维持接触，例如分离、结合剂以及类似物。 在本发明的一个方面，脂质体 经设计为气溶胶化的以供肺部施用。 脂质体可用介导膜融合的纯化蛋白质或肽，如仙台 病毒或流感病毒等制备。 脂质可为任何已知的脂质体形成性脂质的有用组合，包括阳离 子或两性离子脂质，如磷脂酰胆碱。 剩下的脂质一般会为中性或酸性脂质，如胆固醇、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油以及类似物。
为了制备脂质体，可使用 Kato 等 (1991)J.Biol.Chem.266 ：3361 所叙述的方法。 简而言之，脂质与包含肽的内腔组合物在适合的水性介质，方便的为盐水介质中组合， 其中总固体范围将为大约 1-10 重量百分比。 在短时间 ( 大约 5-60 秒 ) 激烈搅动后，将 试管置于温水浴 ( 大约 25-40℃ ) 并重复此循环约 5-10 次。 接着将组合物用超声处理一 段方便的时间 ( 一般约 1-10 秒 ) 并可进一步通过漩涡震荡而搅动。 接着通过加入水性介 质扩增体积，通常增加体积大约 1-2 倍，接着摇动并冷却。 此方法使得将高分子量分子 并入内腔中成为可能。
与其他活性剂一起配制为了用于本主题的方法，本发明的抗微生物多肽可与其他药学上有活性的试 剂，特别是其他抗微生物剂一起配制。 关注的其他试剂包括种类广泛的抗生素，如 本领域中已知的。 抗生素的类型包括青霉素，如青霉素 G、青霉素 V、甲氧西林、苯 唑西林 (oxacillin)、羧苄西林、萘夫西林 (nafcillin)、氨苄西林等 ；青霉素与 β- 内酰 胺酶抑制剂、头胞菌素的结合，如头孢克洛 (cefaclor)、头孢唑啉 (cefazolin)、头孢呋 辛 (cefuroxime)、拉氧头孢 (moxalactam) 等 ；碳青霉烯 (carbapenem) 类 ；单酰胺菌素 (monobactam) 类 ；氨基糖苷类 ；四环素 ；大环内酯类 ；林可霉素类 ；多粘霉素类 ；磺 胺类 ；喹诺酮 (quinolone) 类 ；氯霉素 ；甲硝唑 (metronidazole) ；大观霉素 ；甲氧苄啶 (trimethoprim) ；万古霉素等。
抗酶菌剂，包括多烯类，例如两性霉素 B、制霉菌素 ；5-flucosyn ；以及唑类， 例如咪康唑、酮康唑 (ketoconazol)、伊曲康唑 (itraconazol) 与氟康唑 (fluconazol) 亦为 有用。 抗结核药物包括异烟肼 (isoniazid)、乙胺丁醇 (ethambutol)、链霉素与利福平 (rifampin)。 细胞因子如干扰素 γ、肿瘤坏死因子 α、白介素 12 等亦可包括于本发明的 抗微生物多肽的配制物中。
体外合成
本发明的多肽可通过体外合成使用本领域中已知的常规方法制备。 不同的商业 合成设备，例如 Applied Biosystems Inc.， Beckman 等的自动化合成仪，是可获得的。 通 过使用合成仪，可以用非天然存在的氨基酸，特别是 D- 异构体 ( 或 D- 型 )，例如 D- 丙 氨酸与 D- 异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能基的侧链以及类似物取代天然 存在的氨基酸。 制备的特定顺序与方式会依据方便性、经济因素、所需纯度以及类似因 素而确定。
可将化学结合提供给不同的肽或蛋白质，包括常规的用于链接的官能团，例如 用于形成酰胺或取代胺，例如还原性胺化的氨基基团、用于形成硫醚或双硫键的巯基基 团、用于形成酰胺的羧基基团以及类似物。
若需要，可在合成过程中或在表达过程中将不同的基团引入肽中，其允许结合 至其他分子或表面。 因此，可使用半胱氨酸以制备硫醚、使用组氨酸以连结至金属离子 络合物、使用羧基基团以形成酰胺或酯、使用氨基基团以形成酰胺以及类似物。
多肽亦可根据常规的重组合成方法而分离与纯化。 可制备表达宿主的裂解液， 而将该裂解液使用 HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化。 在大 多数情况下，所使用的组合物会包括至少 20 重量百分比的所期望的产物，更通常为至少 大约 75 重量百分比，优选为至少大约 95 重量百分比，以及为了治疗性目的，通常至少为 大约 99.5 重量百分比，其是相对于与产物制备和产物纯化的方法有关的污染物而言。 通 常，百分比会基于总蛋白质。
本发明进一步通过以下实施例叙述，其不应被视为对本发明之范围加以任何限 制。 实施例
实施例 1 使用来自 PFAM 数据库的 HMM 档案以鉴定防卫素可在互联网在线或在本地计算机上，使用公知的 HMMER 免费可得软件包，使 用隐蔽马尔科夫模型序型进行序列分析。 目前的版本是自 2003 年 10 月以来的 HMMER 2.3.2。
HMM 序型可自公知的 PFAM 数据库获得。 目前的版本是自 2004 年 11 月以来的 PFAM 16.0。 用于所有的计算机平台的 HMMER 与 PFAM 两者皆可自 ( 例如 ) 美国华盛 顿大学圣路易斯分校医学院 (Washington University in St.Louis(USA)，School of Medicine) (http://pfam.wustl.edu 与 http://hmmer.wustl.edu) 获得。
若查询的氨基酸序列或其片段属于以下五个 PFAM 家族之一，则该氨基酸序列 是根据本发明的防卫素 ：
- 防卫素 _β 或 “β 防卫素”，登录号 ：PF00711 ；
- 防卫素 _propep 或 “防卫素原肽”，登录号 ：PF00879 ；
- 防卫素 _1 或 “哺乳类防卫素”，登录号 ：PF00323 ；
- 防卫素 _2 或 “节肢动物防卫素”，登录号 ：PF01097 ；
-γ- 硫素或 “γ- 硫素家族”，登录号 ：PF00304。
当在线使用 PFAM 数据库时，或当本地使用 hmmpfam 程序 ( 来自 HMMER 软件 包 ) 时，若氨基酸序列产生大于 0.1 的 E- 值与大于或等于零的分数，则根据本发明其属 于 PFAM 家族。
当序列分析是使用 hmmpfam 程序本地进行时，需要自 PFAM 数据库获得 ( 下载 ) HMM 序型。 每个家族有两个序型 ；用于全体搜索的 xxx_ls.hmm，以及用于局部搜索的 xxx_fs.hmm( “xxx” 是家族的名称 )。 对于以上所提及五个家族共有十个序型。
这十个序型可独立使用，或可结合 ( 附加 ) 成单一序型 ( 使用文本编辑软件 - 该 序型为 ASCII 文件 )，其可命名为，例如，defensin.hmm。 所查询的氨基酸序列可接着使 用以下命令行评估 ：
hmmpfam-E 0.1 defensin.hmm sequence_file
- 其中” sequence_file” 是具有任何可由 HMMER 软件包辨识的格式所查询的氨 基酸序列的文件。
若分数大于或等于零 (0.0)，且 E- 值大于 0.1，则所查询氨基酸序列是根据本发 明的防卫素。
PFAM 数 据 库 进 一 步 叙 述 于 Bateman 等 (2004) “The Pfam Protein FamiliesDatabase”， Nucleic Acid s Research， Vol.32(Database Issue)pp.D138-D141。
实施例 2
基于萤光素酶的抗微生物测定法
常规的，抗生素的抗微生物活性使用标准规程测定。 效力最常表达为最低抑制 浓度 (Minimal Inhibitory Concentrations， MIC)。 为确定致病的、缓慢生长的分枝杆菌， 如结核分枝杆菌的 MIC，可使用数种经改良的系统，其利用放射性 (BACTEC) 或荧光 (MGIT) 作为可量化的读数。 然而，因为这些方法均需要特定设备，创立了使用细菌萤 光素酶的 MIC 试验规程。 一旦其编码基因转化至给定生物并在其中表达，萤光素酶就可 用作该生物存活力的指示。 使用萤光素酶 (LUX) 分析回避了如缓慢生长 ( 需～ 30 日在 营养平板上形成菌落 ) 和结块 (clumping) 的问题，后者妨碍了大部分基于 CFU 的结核分枝杆菌测定法。 结果迅捷 (2-4 日内 )，且可给出关于给定化合物效力的大致情况——特 别是当其与其他使用相同设定的化合物比较时。
在该实施例中，结核分枝杆菌 H37Rv 用表达萤光素酶的质粒转化。
1. 用 单 独 的 结 核 分 枝 杆 菌 甘 油 原 种， 接 种 50-100ml 的 7H9(Fisher， 产 品 号 271310)ADC(Fisher，产品号 L12240)+0.05 ％ Tween(Sigma，产品号 T8761) 在一升滚瓶 中。 塞紧瓶盖并在 37℃以 30-60rpm 温育滚瓶。
2. 温育所述瓶子直至 OD600 在 0.5-0.8 间。 这通常需要约 4-7 日。
3. 在实验日，将培养物在早上稀释 ( 之前 6-8h) 至 OD600 ～ 0.075。 用新鲜培 养基将体积填至～ 50-100ml，并温育 6-8h，从而使得 OD600 在 0.125-0.200 之间。 这就 是实验培养物。
4. 用不同浓度的肽加入 96 孔板中，铭记每孔的总体积不应超过 250μl。
5. 通过将所述板封于可透气的袋中，在 37℃ ±5％ CO2 温育 96h。
6. 将平板从培养箱移出，并将袋舍弃。 在通气橱中敞盖温育平板 60min，从而 使得其平衡到室温下。
7. 使用光度计的自动注射器通过注射 25μl 癸醛 (1％，在 95％乙醇中 ) 起始萤光 素酶反应，在光度计中对平板进行读数，并分析数据。 MIC 测定为将相对光单位 (relative light unit， RLU) 减少 90％ (1 个数量级 ) 的 化合物的浓度。 菌丝霉素 (plectasin)(SEQ ID NO ：2) 的 MIC 确定为约 25μg/ml，而菌 丝霉素变体肽 SEQ ID NO ：14 的 MIC 确定为约 6μg/ml。
实施例 3
用 CFU 或传统平板测定法确证 RLU 分析的有效性
确证所述相对光单位测定法 (RLU) 通过将其与常规菌落形成单位 (CFU) 测定法 比较来进行。 在该测定法中，将细胞暴露于不同浓度的肽 96h，然后铺于 7H10 板上。 将 平板在 37℃温育 30 日，并对菌落进行计数。
由 RLU 获取的 6.25μg/ml 的 MIC 等价于由 CFU 获取的 MBC，因此指出下述事 实 ：即 SEQ ID NO ：14 的肽针对其他革兰氏阳性细菌是杀菌的，有如菌丝霉素。
结论为现在的萤光素酶设定可用于精准确定 MIC，且具有作为高通量筛选方法 实施的潜力。
实施例 4
基于 OD600 确定 MIC
通 过 用 OD600 测 定 其 作 用， SEQ ID NO ：14 肽 的 抑 制 作 用 亦 与 生 长 相 关。 NZ2109 于 6.25μg/ml 能够完全抑制结核分枝杆菌在 T-25 烧瓶中的生长。
综上所述，实施例 3 和 4 中的测定法均确证 SEQ ID NO ：14 肽的 MIC( ＝ MBC) 为 6.25μg/ml。
实施例 5
鉴定具有针对结核分枝杆菌的强力活性的抗微生物肽
对多种抗微生物肽就其针对结核分枝杆菌 H37Rv 的抗微生物活性使用萤光素酶 测定法如实施例 2 所述进行了测试。 在此特定测定法中肽的浓度为 25μg/ml。 这些肽 中最强力的是菌丝霉素或含有特定氨基酸改变的衍生物。 所述肽，其相应的氨基酸序列
和其抑制程度列于下面的表 1 ：
表1
SEQ ID NO ： 缓冲液对照 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
与 SEQ ID NO ：2 相比的氨基酸取代 NA 无 Q14K+K26R K26R Q14F Q14R+K26R+K38R Q14R+K20R Q14L N5R+M13V M13K+K38R Q14R+K26R N5S+D9S+M13L+Q14R+N17V+A31S N5G+M13L N5G+D9S+M13L+N17Q+A31T D9N+M13L+Q14R D9G+Q14R+K23RRLU 53503 2070 2310 1903 1567 4483 1339 2145 1685 1152 3604 3901 2576 1083 4165 4495减少倍数 1 25.7 23.2 28.1 34.1 11.9 40.0 24.9 31.8 46.4 14.8 13.7 20.8 49.4 12.9 11.9在类似的实验设定中，对菌丝霉素的其它变体就其针对结核分枝杆菌 H37Rv 的 抗微生物活性使用萤光素酶测定法如实施例 2 所述进行了测试。 在该特定分析中肽的浓度为 6.25μg/ml。 最好的肽，均为菌丝霉素的衍生物， 列于下面的表 2。
表2
所有上面的肽具有 25μg/ml 或更低的 MIC。 有些肽，SEQ ID NO ：14、SEQ ID NO ：7、 SEQ ID NO ：9 和 SEQ ID NO ：20 亦在较低浓度进行了测试，并具有 6.25μg/ ml 的 MIC。 肽 SEQ ID NO ：17、SEQ ID NO ：18 和 SEQ ID NO ：19 几乎显示所需的 10 倍 RLU 减少，并因此具有非常接近 6.25μg/l 的 MIC。
实施例 6
其他针对结核分枝杆菌具有强力活性的抗微生物肽
基本上遵循实施例 3 和 4 勾画的步骤，并如 NCCLS 指南 (M24-A) 所述，衡量 了更多的菌丝霉素变体，如示于下面的表 3。 相应的 MIC 值示于表 3。
表3
表 3 所示的结果表明所有经测试的肽显示针对结核分枝杆菌的强力活性。实施例 7
SEO ID NO ：14 肽针对早期静止细胞 (stationary cell) 具有活性
表达 LUX 的 H37Rv 同时以～ 0.1 OD600 和～ 1.0 OD600 在含 6.25μg/ml 的 SEQ ID NO ：14 肽的 96 孔板中进行测试。 密封平板并在 37℃，5％ CO2 下温育 96 小时。 之 后，读取光单位数。 相对后续的生长期，选取了～ 1.0 的 OD600，这是因为当 OD600 高于～ 1 时， LUX 和 OD 间的相关性看来偏离了曲线。 而且，后续的生长期使实验变得更加复 杂，这是因为过多可见的结块将干扰任何微生物方法。
如所述数据所示， SEQ ID NO ：14 肽看来并不显著地区分所测试的细菌 ( 即大 约 0.1 OD600 和 1.0 OD600) 的生理学。 因此，所述 SEQ ID NO ：14 肽针对在生长的对数期 早期和静止期早期的生物均显示强烈活性。24CN 102015759 A CN 102015769 A
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