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脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸
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发明背景
发明领域
本发明涉及脂肪酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。本发明提供了与其亲本相比具有改进特性的脂肪酶变体。具体而言，这些变体在有机催化剂(如3,4-二氢异喹啉的两性离子硫酸盐衍生物)的存在下更稳定。
相关技术说明
在用于产生有效的清洁组合物的需求中，脂肪酶在其他组分之中被应用于配制此类组合物。然而，脂肪酶的活性可能受包含的其他组分的存在的影响。具体而言，已经显示引入一些漂白催化剂灭活某些酶。这一相容性问题构成一个可能并不总是通过单独的配制品即可令人满意的解决的挑战。
WO 07/001262涉及包括具有增强的酶相容性的有机催化剂以及用于制造和使用此类组合物的方法，其中所述催化剂是3,4-二氢异喹啉的两性离子硫酸盐衍生物。显示这些催化剂具有增强的淀粉酶相容性，但是不具有脂肪酶相容性。
因此，对于与有机催化剂(如3,4-二氢异喹啉的两性离子硫酸盐衍生物)具有改进的相容性的脂肪酶以及用于制造它们的方法存在需要。
发明概述
本发明涉及一种用于获得脂肪酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37、N39或G91的一个或多个位置处向亲本脂 肪酶中引入一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性并且与该亲本脂肪酶相比在一种选自下组的有机催化剂的存在下具有改进的性能，该组由具有以下化学式的有机催化剂组成：
a)化学式1；
b)化学式2；或
c)其混合物，
其混合物，其中每个R1独立地是包含从3个至24个碳的支链烷基基团或包含从1个至24个碳的直链烷基基团；并且回收该变体。
本发明还涉及一种脂肪酶变体，该脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q的一个或多个位置处包括一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
定义
脂肪酶：术语“脂肪酶”或“脂解酶”或“脂质酯酶”是如酶命名法所定义的EC 3.1,1类中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的(在所编码的多肽中没 有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA:术语“cDNA”意指一种DNA分子，该分子可以通过由获自一种真核或原核细胞的一种成熟剪接的mRNA分子反转录而制备。cDNA缺乏内含子序列，这些序列可能存在于相对应的基因组DNA中。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或者外源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于，前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一个方面，一个片段含有成熟多肽的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、以及至少95％。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖了一种亲本细胞的任何子代，该子代由于在复制期间发生的突变而与亲本细胞不相同。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。此类改进的特性包括在有机催化剂的存在下的改进的性能。在一些实施例中，本发明涉及一种选自下组的有机催化剂，该组由具有以下化学式的有机催化剂组成：
a)化学式1；
b)化学式2；或
c)其混合物，
其混合物，其中每个R1独立地是包含从3个至24个碳的支链烷基基团或包含从1个至24个碳的直链烷基基团，具体而言其中R是2-丁基辛基，并且优选地，改进的稳定性是在化学式2(其中R是2-丁基辛基)的存在下。
分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括(但不限于)从与其性质上相关的一种或多种或所有天然存在的组分至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然中发现的物质，由人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、 200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至269。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸67至873。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最终在60℃下将载体材料使用2×SSC、0.2％SDS洗涤三次各15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双链的核酸分子，它包括一个或多个控制序列。
可操作地连接:术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指一种脂肪酶，对该脂肪酶进行一个改变以产生本发明的酶变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，J.Mol.Biol.(《分子生物 学杂志》)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件套件)，Rice(赖斯)等人，2000，Trends Genet.(《遗传学趋势》)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用-nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用-nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列:术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的一个片段。在一个方面，一个子序列含有成熟多肽编码序列的核苷酸的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、以及至少95％。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代的具有脂肪酶活性的一种多肽。一个取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂 交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由见于自然界中的一种天然存在的微生物(如一种细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种脂肪酶。
用于变体的命名的公约
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以确定另一种脂肪酶中的对应的氨基酸残基。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，《分子生物学杂志》48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，《遗传学趋势》16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以使用若干计算机程序通过多种多肽序列的比对来确定在另一种脂肪酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括，但不限于：MUSCLE(multiple sequence comparison by log‐expectation(基于日志-期望值的多序列比较)；版本3.5或更新版本；Edgar(埃德加)，2004，Nucleic Acids Research(《核酸研究》)32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh(卡托赫)和Kuma(库玛)，2002，Nucleic Acids Research(《核酸研究》)30:3059-3066；Katoh(卡托赫)等人，2005，Nucleic Acids Research(《核酸研究》)33:511-518；Katoh(卡托赫)和Toh(都)，2007，Bioinformatics(《生物信息学》)23:372-374；Katoh(卡托赫)等人，2009，Methods in Molecular Biology(《分子生物学方法》)537:39-64；Katoh(卡托赫)和Toh(都)，2010，Bioinformatics(《生物信息学》)26:1899-1900)，以及利用ClustalW的 EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson(汤普森)等人，1994，Nucleic Acids Research(《核酸研究》)22:4673-4680)，使用它们各自的缺省参数。
当其他酶与SEQ ID NO：2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl(林达尔)和Elofsson(埃洛弗松)，2000，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)295：613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个特征曲线并且能够检测远距离同源物(Atschul(阿特休尔)等人，1997，Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序(例如GenTHREADER)(Jones(琼斯)，1999，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)287:797-815；McGuffi(麦谷芬)和Jones(琼斯)，2003，Bioinformatics(《生物信息学》)19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST，二级结构预测、结构比对特征曲线、以及溶剂化可能性)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough(高夫)等人，2000，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法(例如距离比对矩阵(Holm(赫尔姆)和Sander(桑德尔)，1998，Proteins(《蛋白杂志》)33:88-96)或者组合扩展(Shindyalov(辛迪亚洛夫)和Bourne(伯恩)，1998，Protein Engineering《蛋白质工程》11:739-747))可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以额外利用这些算法的实施来随所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，赫尔姆和Park(帕克)，2000，Protein Engineering(《生物信息学》)16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用了以下命名法：原始氨基酸、位置、取代 的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或者“G205R+S411F”代表分别在位置205和411上的甘氨酸(G)被精氨酸(R)并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
多个取代。包括多个取代的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170和195上的精氨酸和甘氨酸被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同的取代。可以在一个位置上引入不同改变时，这些不同的变化由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
发明详细说明
变体
本发明涉及分离的脂肪酶变体，这些分离的脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q的一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性。
在一个实施例中，该变体与该亲本脂肪酶的氨基酸序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。
在一个方面，本发明的变体中的取代的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个取 代。
在另一个方面，一种变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q的一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代。在另一个方面，一种变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q中的任一者的两个位置处包括一个改变。在另一个方面，一种变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q中的任一者的三个位置处包括一个改变。
在另一个方面，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37的一个位置处包括一个取代，或由其组成，该位置被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T37A、T37D、T37E、T37F、T37G、T37H、T37I、T37L、T37N、T37P、T37Q、T37R、T37S、T37V、T37W、或T37Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置N39的一个位置处包括一个取代，或由其组成，该位置被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N39A、N39C、N39D、N39E、N39F、N39G、N39I、N39K、N39L、N39M、N39P、N39Q、N39R、N39T、N39V、N39W、N39Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置G91的一个位置处包括一个取代，或由其组成，该位置被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、 Tyr、或Val，优选被Asp、Gln、His、Ile、或Pro取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代G91D、G91H、G91I、G91P、G91Q或甚至G91A，或由其组成。在一个优选方面，该变体在对应于G91的一个位置处包括一个取代，或由其组成，该取代为G91A。
在另一个实施例中，在位置37、39和/或91处的任何这样的一个或多个取代与一个或多个优选T231R和N233R两者相组合。
在另一个方面，该变体在对应于位置T37和N39的位置处包括如上描述的那些取代，或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置T37和G91的位置处包括如上描述的那些取代，或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置N39和G91的位置处包括如上描述的那些取代，或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置T37、N39和G91的位置处包括如上描述的那些取代，或由其组成。
这些变体可以在一个或多个(例如若干个)其他位置处进一步包括一个或多个另外的取代。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的较小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。
可替代地，这些氨基酸变化具有改变这些多肽的物理化学特性的这样一种性质。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最适值、等。
例如，这些变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置D96、T143、A150、E210、G225、T231、N233以及P250的一个位置处可以包括一个取代。 在一些实施例中，该取代选自D96G、T143A、A150G、E210Q、G225R、T231R、N233R以及P250R。
在一些实施例中，本发明涉及选自以下各项的变体：

G91Q+T143A+E210Q+T231R+N233R+P250RG91Q+A150G+E210Q+T231R+N233R+P250RT37R+N39R+G91A+D96G+T231R+N233RG91Q+E210Q+T231R+N233R+P250RG91I+E210Q+T231R+N233R+P250R
G91A+D96G+T231R+N233RG91A+D96G+G225R+T231R+N233RG91N+E210Q+T231R+N233R+P250RG91L+E210Q+T231R+N233RG91A+D96G+A150G+T231R+N233R
可以根据本领域已知的程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham(坎宁安)和Wells(威尔斯)，1989，Science(《科学》)244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见Hilton(希尔顿)等人，1996，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如de Vos(德福斯)等人，1992，Science(《科学》)255:306-312；Smith(史密斯)等人，1992，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)224:899-904；Wlodaver(沃勒达尔)等人，1992，FEBS Lett.(《欧洲生物化学学会联盟通讯》)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。
这些变体可以由至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、以及至少95％的成熟多肽的氨基酸数目组成。
在一个实施例中，该变体在一种漂白组分或多于一种漂白组分的混合物的存在下具有改进的性能。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂 白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸及其混合物。通常，漂白组分可以按清洁组合物的重量计从约0.00001至90wt％，优选0.0001％至约50％或甚至从约0.001％至约25％的漂白组分存在。适合的漂白组分的实例包括：
(1)预先形成的过酸：适合的预先形成的过酸包括但不限于选自下组的化合物，该组由预先形成的过氧酸或其盐组成，典型地是过氧羧酸或其盐或过氧硫酸或其盐。
预先形成的过氧酸或其盐优选是一种过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁴选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁴基团可以是直链的或支链的、取代的或未取代的；并且Y是接受中性电荷的任何适合的反离子，优选地Y选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁴是直链的或支链的、取代的或未取代的C_6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、其任何盐、或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有处于从30℃至60℃的范围内的熔点。
预先形成的过氧酸或其盐还可以是一种过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁵选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁵基团可以是直链的或支链的、取代的或未取代的；并且Z是接受中性电荷的任何适合的反离子，优选地Z选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁵是直链的或支链的、取代的或未取代的C_6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01％至50％、最优选从0.1％至20％的量存在于组合物中。
(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)，过碳酸盐，过硫酸盐，过磷酸盐，过硅酸盐的钠盐及其 混合物。在本发明的一个方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自下组的那些，该组由以下各项组成：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的从0.05至40wt％或1至30wt％的量存在并且典型地被掺入进此类组合物中作为可以被包衣的结晶固体。适合的包衣包括无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。
优选地，此类漂白组分可以按从0.01％至50％、最优选从0.1％至20％的量存在于组合物中。
(3)适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(优选是支链的)，当该漂白活化剂是疏水的时候，具有从6个至14个碳原子或从8个至12个碳原子，并且当该漂白活化剂是亲水的时，具有少于6个碳原子或甚至少于4个碳原子；并且是L离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)以及壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)。适合的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可以使用任何适合的漂白活化剂，但是在本发明的一个方面，标的清洁组合物可以包括NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理产品，过酸和/或漂白活化剂通常以从约0.1至约60wt％、从约0.5至约40wt％或甚至从约0.6至约10wt％的量存在于消费品中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按从0.01％至50％、最优选从0.1％至20％的量存在于组合物中。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
(4)二酰基过氧化物–优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：
R¹-C(O)-OO-(O)C-R²
其中R¹表示一个包含具有至少5个碳原子的直链并且任选地包含一个或多个取代基(例如-N⁺(CH₃)₃、-COOH或-CN)和/或一个或多个在烷基的相邻碳原子之间插入的中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C₆-C₁₈烷基，优选是C₆-C₁₂烷基基团，并且R²表示一个与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得R¹和R²共同包含总共8个至30个碳原子。在一个优选方面，R¹和 R²是直链的未取代的C₆-C₁₂烷基链。最优选地，R¹和R²是相同的。二酰基过氧化物(其中R¹和R²均是C₆-C₁₂烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R¹或R²)中的至少一者、最优选地仅有一者在α位不包含分枝的或下垂的环，或优选在α位或β位都不包含分枝的或下垂的环，或最优选在α位或β位或γ位都不包含分枝的或下垂的环。在一个进一步优选的实施例中，DAP可以是不对称的，以使得优选地R¹酰基基团的水解是迅速的以产生过酸，但是R²酰基基团的水解是缓慢的。
四酰基过氧化物漂白种类优选选自具有以下通式的四酰基过氧化物：
R³-C(O)-OO-C(O)-(CH₂)n-C(O)-OO-C(O)-R³
其中R³表示一个C₁-C₉烷基，优选是C₃-C₇基团并且n表示一个从2至12、优选4至10的整数(包含端值)。
优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、更优选至少10ppm、并且甚至更优选至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选实施例中，这些漂白种类以足够提供按重量计从约0.5至约300ppm、更优选从约30至约150ppm的洗涤液的量存在。
优选地，漂白组分包括一种漂白催化剂(5和6)。
(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将该氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子及聚离子；亚胺两性离子；改性的胺；改性的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-膦酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。
适合的亚胺阳离子及聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如Tetrahedron(《四面体》)(1992)，49(2)，423-38所述的进行制备(参见例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360569所述的进行制备(参见例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360568所述的进行制备(参见例如第10栏，实例3)。
适合的亚胺两性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5576282所述的进行制备(参见例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5817614所述的进行制备(参见例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二 氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264所述的进行制备(参见例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。
适合的改性胺氧传递催化剂包括但不限于可以根据Tetrahedron Letters(《四面体通讯》)(1987)，28(48)，6061-6064中描述的程序制造的1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇。适合的改性氧化胺氧传递催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧基-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。
适合的N-磺酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于根据Journal of Organic Chemistry(《有机化学杂志》)(1990)，55(4)，1254-61中描述的程序制备的3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物。
适合的N-膦酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于可以根据Journal of the Chemical Society,Chemical Communications(《化学学会杂志，化学通讯》)(1994)，(22)，2569-70中描述的程序制造的[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-P-苯基-P-(2,4,6-三甲基苯基)-次膦酰胺。
适合的N-酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于可以根据Polish Journal of Chemistry(《波兰化学杂志》)(2003)，77(5)，577-590中描述的程序制造的[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺。
适合的噻二唑二氧化物氧传递催化剂包括但不限于可以根据US5753599(第9栏，实例2)中所述的程序制造的3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物。
适合的全氟亚胺氧传递催化剂包括但不限于可以根据Tetrahedron Letters(《四面体通讯》)(1994)，35(34)，6329-30中所述的程序制造的(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(九氟丁基)丁亚胺酰基氟化物。
适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在US 6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。
优选地，漂白催化剂包括亚胺和/或羰基官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包括过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包括一个环 状亚胺官能团，优选其中该环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环尺寸。优选地，漂白催化剂包括一个芳基亚胺官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是一个季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一个方面，洗涤剂组合物包括一种具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或甚至不大于-3.5的logP_o/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logP_o/w的方法。
典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至约0.30、从0.05至约0.25或甚至从约0.10至0.20的X_SO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定X_SO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在这一实例中，X_SO是过氧亚胺正离子漂白种类的X_SO。
优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构

其中：n和m独立地是从0至4，优选n和m均是0；每个R¹独立地选自取代的或未取代的选自下组的基团，该组由以下各项组成：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的R¹取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R²独立地选自取代的或未取代的独立地选自下组的基团，该组由以下各项组成：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基基团、羧基烷基基团以及酰胺基团；任何R²可以与任何其他的R²结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R²可以合并以形成一个羰基；并且任何两个R²可以合并以形成一个取代的或未取代的稠合的不饱和部分；R³是C₁至C₂₀取代的或未取代的烷基；R⁴是氢或部分Q_t-A，其中：Q是一个支链或无支链的亚烷基，t＝0或1并且A是一个选自下组的阴离子基团，该组由以下各项组成：OSO₃^-、SO₃^-、CO₂^-、OCO₂^-、OPO₃^2-、OPO₃H^-以及OPO₂^-；R⁵是氢或部分 -CR¹¹R¹²-Y-G_b-Y_c-[(CR⁹R¹⁰)_y-O]_k-R⁸，其中：每个Y是独立地选自下组，该组由以下各项组成：O、S、N-H或N-R⁸；并且每个R⁸是独立地选自下组，该组由以下各项组成：烷基、芳基以及杂芳基，所述部分是取代的或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G是独立地选自下组，该组由以下各项组成：CO、SO₂、SO、PO以及PO₂；R⁹和R¹⁰独立地选自下组，该组由以下各项组成：H和C₁-C₄烷基；R¹¹和R¹²独立地选自下组，该组由以下各项组成：H和烷基，或当合起来时可以结合以形成一个羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是一个从1至6的整数；k是一个从0至20的整数；R⁶是H、或烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代的或未取代的；并且如果存在的话，X是一种适合的电荷平衡反离子，优选地当R⁴是氢时，X存在，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲硫酸盐、磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、四氟化硼以及磷酸盐。
在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：

其中R¹³是一个包含从三个至24个碳原子的支链烷基基团(包括分枝的碳原子)或一个包含从一个至24个碳原子的直链烷基基团；优选地，R¹³是一个包含从八个至18个碳原子的支链烷基基团或包含从八个至十八个碳原子的直链烷基基团；优选地，R¹³选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基；优选地，R¹³选自下组，该组由以下各项组成：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异十三烷基以及异十五烷基。
优选地，除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包括过酸源。过酸源可以选自(a)预先形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过碳酸盐(过氧化氢源)，优选与一种漂白活化剂组合；以及(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从约0.1至约60wt％、从约0.5至约40wt％或甚至从约0.6至约10wt％的量存在于组合物中。可以将一种 或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
(6)包含金属的漂白催化剂-可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的包含金属的漂白催化剂是以下催化系统，该催化系统包括一种具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，一种具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及一种对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO 00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为跨桥(cross-bridged)多齿N-供体配体的配体。
如果希望的话，可以借助一种锰化合物催化在此的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。
在此有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936；US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，例如像US 5597936和US 5595967中传授的程序。
在此的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调整在此的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从约0.005ppm至约25ppm、从约0.05ppm至约10ppm、或甚至从约0.1ppm至约5ppm的MRL。
即成的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，例如像US 6225464和WO 00/32601中传授的程序。
(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化酞菁锌、磺化酞菁铝、呫吨染料及其混合物；用于在本发明的这些组合物中使用的优选漂白组分包括过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活 化剂与一种漂白催化剂相组合的反应原位产生。优选的漂白组分包括漂白催化剂，优选以上所述的有机漂白催化剂。
特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。
组合物可以是固体或液体清洁和/或处理组合物或具有单个或多个区室单位剂量形式的组合物。
在一个实施例中，在一种选自下组的有机催化剂的存在下，该变体具有改进的性能，该组由具有以下化学式的有机催化剂组成：
a)化学式1；
b)化学式2；或
c)其混合物，
其中每个R1独立地是包含从3个至24个碳的支链烷基基团或包含从1个至24个碳的直链烷基基团。
在一些实施例中，R1独立地是包含从8个至18个碳的支链烷基基团或包含从8个至18个碳的直链烷基基团。在一些实施例中，R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基、以及异十五烷基。优选地，R1选自下组，该组由以下各项组成：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异十三烷基、以及异十五烷基。在具有化学式b)(其中R是2-丁基辛基)的催化剂的存在下，优选的变体具有改进的性能。
典型地以提供0.001-0.02g活性材料/升洗涤液的量或以提供0.01至4.5、0.5至4.0、1.0至3.5、1.5至3.0或2.0至2.5ppm活性材料/升洗涤液的量使用有机催化剂。
在一些实施例中，有机过氧酸源作为漂白剂存在。有机过氧酸源可以是一种预先形成的过酸或二酰基过氧化物，或它可以包括一种过氧化氢源以及一种漂白活化剂。适合的漂白剂包括二酰基过氧化物、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸及其混合物。
通常，当使用一种漂白剂时，本发明的组合物可以包括按标的清洁组合 物的重量计从约0.1％至约50％或甚至从约0.1％至约25％的漂白剂。漂白剂典型地是一种有机过氧酸源或活化的过氧化物源。当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从约0.1至约60wt％、从约0.5至约40wt％或甚至从约0.6至约10wt％的量存在于该组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
为了评定脂肪酶变体的氧化降解作用的稳定性，确定相对性能值(RP_洗涤)，即有待测试的脂肪酶变体的洗涤性能(P)并且除以SEQ ID NO:2的脂肪酶的洗涤性能。因此，RP_洗涤＝P(发明脂肪酶变体)/P(SEQ ID NO:2脂肪酶)。对氧化降解作用具有改进的稳定性的脂肪酶变体将具有至少1.01、优选至少1.1或甚至至少1.5的RP_洗涤值。
亲本脂肪酶
亲本脂肪酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；(b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性。
在一个方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，它们具有脂肪酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过20个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。
在另一个方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至269或由其组成。
在另一个方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，包含该成熟多肽的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少 70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、以及至少95％。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个等位基因变体。
在另一方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(Sambrook(萨拉布鲁克)等人，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是长度应该为至少15个，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA，来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸67至873。在另一个方面，该核酸探针是对SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段进行编码的多核苷酸。在另一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，该亲本由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N末端或C末端。
该亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本发明的多肽的N-末端或C-末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且例如连接编码这些多肽的编码序列，以使得它们在框内且融合多肽的表达处于一个或多个相同启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper(库珀)等人，1993，EMBO J(《欧洲分子生物学学会杂志》)12:2575-2583；Dawson(道森)等人,1994,Science(《科学》)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：Martin(马丁)等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(《工业微生物学与生物技术杂志》)3:568-576；Svetina(斯韦蒂纳)等人，2000，J.Biotechnol.(《生物技术杂志》)76:245-251；Rasmussen(拉斯马森)-Wilson(威尔逊)等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.(《应用环境微生物学》)63:3488-3493；Ward(华德)等人，1995，Biotechnology(《生物技术》)13:498-503；以及Contreras(孔特拉斯)等人，1991，Biotechnology(《生物技术》)9:378-381；Eaton(伊顿)等人，1986，Biochemistry(《生物化学》)25:505-512；Collins(柯林斯)-Racie(莱斯)等人，1995，Biotechnology(《生物技术》)13:982-987；Carter(卡特)等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics(蛋白质:结构、功能和遗传学)6:240-248； 以及Stevens(史蒂文斯)，2003，Drug Discovery World(《世界药物发现》)4:35-48。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由一种多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是一种细菌脂肪酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如一种芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、褐色嗜热裂孢菌(别名褐色高温单孢菌)脂肪酶，或一种革兰氏阴性细菌多肽，如一种曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属或尿素原体脂肪酶。
在一个方面，该亲本是一种嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌脂肪酶。
在另一个方面，该亲本是一种类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)脂肪酶。
在另一个方面，该亲本是一种不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、或浅青紫链霉菌脂肪酶。
该亲本可以是一种真菌脂肪酶。例如，该亲本可以是一种酵母脂肪酶，如一种假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属或耶氏酵母属(Yarrowia)脂肪酶；或一种丝状真菌脂肪酶，如一种枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、家白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、稻瘟菌属、马兰诺菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、 新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属、裂褶菌属、柱霉属(Scytalidium)、踝节菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳菌属、弯颈霉菌、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属或炭角菌属脂肪酶。
在另一个方面，该亲本是一种卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母或卵形酵母脂肪酶。
在另一个方面，该亲本是一种解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、因奥普斯金孢子菌属(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带多金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢菌、库威镰孢菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳菌(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳菌(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳菌(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳菌(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳菌(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳菌(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳菌(Thielavia spededonium)、亚嗜热梭孢壳菌(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭孢壳菌(Thielavia terrestris)、哈茨木霉、康氏木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉脂肪酶。
在另一个方面，该亲本是一种柔毛腐质霉脂肪酶，例如SEQ ID NO:2的脂肪酶或其成熟多肽。
将理解的是，对于上述种类而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态两者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而无论已知的它们的种类名称如何。本领域普通技术人员将容易地识别鉴定适当等效物。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏机构为公众所得到，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Ccntraalbureau Voor Schimmelcultures,CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北部研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center,NRRL)。
可从其他来源鉴别并得到亲本，这些来源包括使用上述探针从大自然(例如土壤、堆肥、水等)中分离的微生物或从天然物质(例如土壤、堆肥、水等)中直接得到的DNA样本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测了编码一种亲本的一种多核苷酸后，可以将多核苷酸通过利用本领域普通技术人员已知的技术来分离或克隆(参见例如萨姆布鲁克等人，1989，同上)。
变体的制备
本发明还涉及一种用于获得脂肪酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37、N39或G91的一个或多个位置处向亲本脂肪酶中引入一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性，并且与该亲本脂肪酶相比在一种选自下组的有机催化剂的存在下具有改进的性能，该组由具有以下化学式的有机催化剂组成：
(a)化学式1；(b)化学式2；或(c)其混合物，其中每个R1独立地是包含从3个至24个碳的支链烷基基团或包含从1个至24个碳的直链烷基基团；并且回收该变体。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中R1独立地是包含从8个至18个碳的支链烷基基团或包含从8个至18个碳的直链烷基基团。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基、以及异十五烷基。优选地，R1选自下组，该组由以下各项组成：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异十三烷基、以及异十五烷基。
典型地以提供0.001-0.02g活性材料/升洗涤液的量或以提供0.01至4.5、0.5至4.0、1.0至3.5、1.5至3.0或2.0至2.5ppm活性材料/升洗涤液的量使用有机催化剂。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中有机过氧酸源作为漂白剂存在。有机过氧酸源可以是一种预先形成的过酸或二酰基过氧化物，或它可以包括一种过氧化氢源以及一种漂白活化剂。
适合的漂白剂包括二酰基过氧化物、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸及其混合物。
通常，当使用一种漂白剂时，本发明的组合物可以包括按标的清洁组合物的重量计从约0.1％至约50％或甚至从约0.1％至约25％的漂白剂。漂白剂典型地是一种有机过氧酸源或活化的过氧化物源。
当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从约0.1至约60wt％、从约0.5至约40wt％或甚至从约0.6至约10wt％的量存在于该组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中该亲本脂肪酶包括一个与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％一致性的氨基酸序列；由SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列或其具有脂肪酶活性的片段组成。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中该变体是：(a)一种包括与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％一致性的氨基酸序列的多肽；b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至少在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补链杂交，c)一种 由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包括一个与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％一致性的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中该取代选自T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置D96、T143、A150、E210、G225、T231、N233以及P250的一个或多个位置处进一步包括一个取代。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中该取代选自D96G、T143A、A150G、E210Q、G225R、T231R、N233R以及P250R。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是一种技术，其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或更多个定义的位点上引入一个或更多个(例如若干个)突变。
通过涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的使用的PCR可以体外实现定点诱变。还可以通过以下方式在体外进行定点诱变：涉及由一种限制性内切酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒的一个位点处进行切割的盒式诱变，并且随后连接一种包含该多核苷酸中的突变的寡核苷酸。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如谢雷尔(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)，18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，Nature Biotechnol.(《自然生物技术》)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，Nat.Med.(《自然医学》)4:285-290；以及卡利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，Fungal Genet.Newslett.(《真菌遗传学通讯》)43:15-16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，例如由田(Tian)等人(2004， Nature(《自然》)432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序是例如由Reidhaar-Olson(瑞德哈尔-奥尔森)和Sauer(萨奥尔)，1988，Science(《科学》)241:53-57；Bowie(鲍依)和萨奥尔，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，Biochemistry(《生物化学》)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及定区诱变(德比希尔(Derbyshire)等人，1986，Gene(《基因》)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness(内斯)等人，1999，Nature Biotechnology(《自然生物技术》)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达 载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短的及杂合启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse(阿盖斯)和Lereclus(里瑞克拉斯)，1994，Molecular Microbiology(《分子微生物学》)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon(埃贡)等人，1988，Gene(《基因》)69:301-315)，天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa(维拉)-Kamaroff(卡玛诺夫)等人，1978，《美国国家科学院院刊》75:3727-3731)，连同tac启动子(DeBoer(德波尔)等人，1983，《美国国家科学院院刊》80:21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白)”，Gilbert(吉尔伯特)等人，1980，Scientific American(科学美国人)，242:74-94；以及萨姆布鲁克等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶–样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡 聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶IV、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，连同NA2tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变的、截短的、和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，Yeast(《酵母》)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列也可以是转录终止子，它被宿主细胞识别以终止转录。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子获得自克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue(化)等人，1995，Journal of Bacteriology(《细菌学杂志》)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
Guo(郭)和Sherman(谢尔曼)，1995，Mol.Cellular Biol.(《分子与细胞生物学杂志》)15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列。
控制序列还可以是编码连接至一个变体的N-末端上的一个信号肽并指导该变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区。该多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该变体的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。该编码序列不天然地包含一个信号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，一种外源信号肽编码序列可简单地替换该天然的信号肽编码序列以便提高该变体的分泌。然而，可以使用指导所表达的变体进入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen(西蒙纳)和Palva(帕尔瓦)，1993，Microbiological Reviews(《微生物学评论》) 57:109-137描述了另外的信号肽。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉葡聚糖内切酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于一个变体的N末端的前肽的一种前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制 酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列是位于该载体中，以使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等效物。优选在曲霉细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中不依赖该基因组而自主复制的一种或多种元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其 他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制基因。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制基因(plasmid replicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems(格姆斯)等人，1991，Gene(《基因》)98:61-67；Cullen(卡伦)等人，1987，Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属、以及尿素原体。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌的细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于类马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽疫亚种的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang(张)和Cohen(科恩)，1979，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与基因组学》)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young(杨格)和Spizizen(斯皮宰曾)，1961，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)81:823-829；或Dubnau(杜拜努)以及Davidoff-Abelson(大卫杜夫-阿贝尔森)，1971，《分子生物学杂志》56:209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa(茂川)和Dower(道尔)，1988，Biotechniques(《生物技术》)6:742-751)、或者偶联 (参见，例如Koehler(克勒)和Thorne(索恩)，1987，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan(哈纳汗)，1983，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower(道尔)等人，1988，《核酸研究》16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如Gong(贡)等人，2004，Folia Microbiol.(《Folia微生物学》)(Praha(布拉格))49:399-405)、偶联(参见例如，Mazodier(马佐迪耶)等人，1989，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke(伯克)等人，2001，《美国国家科学院院刊》98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi(蔡)等人，2006，J.Microbiol.Methods(《微生物学方法杂志》)64:391-397)或偶联(参见例如，Pinedo(皮内多)和Smets(斯梅茨)，2005，Appl.Environ.Microbiol.(《应用环境微生物学》)71:51-57)。将DNA引入链球菌细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，Perry(佩里)和Kuramitsu(藏满)，1981，Infect.Immun.(《感染与免疫》)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt(凯特)和Jollick(乔力克)，1991，Microbios(《微生物学》)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley(巴克利)等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.(《应用环境微生物学》)65:3800-3804)、或者偶联(参见，例如，Clewell(克莱威尔)，1981，Microbiol.Rev.(《微生物学评论》)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门以及接合菌门连同卵菌门和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi(安斯沃思和拜斯比真菌词典)，第8版，1995，CAB International(国际应用生物科学中心)，University Press(大学出版社)，英国剑桥中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母以及属于半知菌类(芽生菌)的酵母。由于酵母的分类未来可能改变，故出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast(《酵母生物学与活性》)(斯金纳(Skinner)，帕斯莫(Passmore)及达 文波特(Davenport)编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium(应用细菌学学会)，第9辑，1980)中所描述进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、酵母菌属酵母、裂殖酵母或耶氏酵母细胞，例如产乳糖酶酵母、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁维酵母、诺地酶母、卵形酵母或亚罗解脂酵母细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌门和卵菌门(如由霍克斯沃思等人，1995，同上所定义)。丝状真菌的特征一般在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的，并且碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、腐质霉属、稻瘟菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳 霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉和木霉宿主细胞的适合的程序描述于EP 238023，Yelton(约尔顿)等人，1984，《美国国家科学院院刊》81:1470-1474，以及Christensen(克里斯滕森)等人，1988，Bio/Technology(生物/技术)6:1419-1422中。Malardier(马拉迪耶)等人，1989，Gene(《基因》)78:147-156和WO 96/00787描述了用于转化镰刀菌物种的适合的方法。可以使用Becker(贝克尔)和Guarente(瓜伦特)在Abelson,J.N.(阿贝尔森)和Simon,M.I.(西蒙)编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(对酵母遗传学和分子生物学的指导)，Methods in Enzymology(《酶学方法》)，第194卷，pp182-187，Academic Press,Inc.(学院出版社有限公司)，纽约；Ito(伊藤)等人，1983，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)153:163；以及Hinnen(希南)等人，1978，《美国国家科学院院刊》75:1920中描述的程序来转化酵母。
生产方法
本发明还涉及用于生成变体的方法，该方法包括：(a)在适于该变体表达的条件下对本发明的宿主细胞进行培养；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法以在适于生成变体的营养培养基中对宿主细胞进行培养。合适的例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序在一种适合的营养培养基中发生，该营养培养基包含碳源和氮源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商处获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则可直接将该变体从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则可以将它从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法来检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体，以获得基本上纯的变体，这些程序包括，但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、有差别的溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如Protein Purification(蛋白纯化)，Janson(詹森)和Ryden(赖登)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。
组合物
本发明还涉及如描述于EP 11170520中的微粒状组合物，这些组合物包括一种脂肪酶变体，该脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q的一个或多个位置处包括一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性。
在一些实施例中，本发明涉及一种微粒状组合物，该组合物包括：(a)包括一种有机过氧酸源的颗粒；以及(b)包括一种漂白催化剂的颗粒；以及(c)包括含有由延迟释放包衣(ii)包围的酶的芯(i)的颗粒，其中该酶是一种脂肪酶变体，该脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q的一个或多个位置处包括一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性。
在一些实施例中，本发明涉及一种微粒状组合物，该组合物包括：(a)包括一种有机过氧酸源的颗粒；以及(b)包括一种漂白催化剂的颗粒；以及(c)包括含有作为由延迟释放包衣(ii)包围的第一洗涤脂解酶的酶的芯(i)的颗粒，其中该酶是一种脂肪酶变体，该脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、 H、I、P、Q的一个或多个位置处包括一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性。
用途
本发明还涉及一种脂肪酶变体用于制备如描述于EP 11170520中的脂肪酶颗粒的用途，该脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q的一个或多个位置处包括一个取代，其中该变体具有脂肪酶活性。
在一些实施例中，本发明涉及一种用于制备脂肪酶颗粒的方法，该方法包括：(a)通过以下方式测试至少一种酶的漂白-催化剂灵敏度：确定该酶与一种漂白催化剂和一种有机过氧酸源的组合的洗涤性能，并且与在没有该漂白催化剂的情况下的性能进行比较，以鉴别一种漂白-催化剂敏感酶；(b)提供一个包括该敏感酶的芯，并且用延迟释放包衣包围该芯，其中该至少一种酶是一种脂肪酶变体，该脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置T37A、D、E、F、G、H、I、L、N、P、Q、R、S、V、W、Y，N39A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y，以及G91D、H、I、P、Q的一个或多个位置处包括一个取代。
本发明的脂肪酶可以被胶囊化。在一个方面，胶囊化物包括一个芯，具有内表面和外表面的包壳，所述包壳胶囊化所述芯。在所述胶囊化物的一个方面，所述芯可以包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：香料；增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂，在一个方面是石蜡；酶；抗菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，可任选地包含其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一个方面，所述氨基塑料可以包括聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯(polyureaurethane)，在一个方面，所述聚脲可以包括聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一个方面，所述多糖可以包括海藻酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。
在一些实施例中，以从0.00001％至2％，更优选从0.0001％至0.02％，最优选从0.001％至0.01％wt％的量将脂肪酶用于一种组合物中。典型地，该 清洁和/或处理组合物以从0.001至5％的量存在于水中，以使得在水性处理步骤中优选的脂肪酶变体水平是从0.000001至1000ppm。
植物
本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该变体。该变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，含有该变体的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或进料的质量，例如，改善营养价值、可口性以及流变特性，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草例如草甸草(蓝草，早熟禾属)，饲草例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)，温带草例如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草，豆类例如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花的植物(十字花科)例如花椰菜、油菜籽，以及紧密相关的模式生物拟南芥。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子以及块茎连同包括这些部分的单个组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样，植物部分，例如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
还包括在本发明的范围内的是这类植物、植物部分、和植物细胞的后代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包括编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决 于所用的引入DNA的方法)。
例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达该变体来确定对调控序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调节序列是例如由Tague(塔格)等人，1988，Plant Physiology(《植物生理学》)86:506描述的。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉蜀黍泛素1、或水稻肌动蛋白1启动子(Franck(弗兰克)等人，1980，Cell(《细胞》)21:285-294；Christensen(克里斯滕森)等人，1992，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)18:675-689；Zhang(张)等人，1991，Plant Cell(《植物细胞》)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990，Ann.Rev.Genet.(《遗传学年鉴》)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998，Plant Cell Physiol.(《植物与细胞生理学》)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998，J.Plant Physiol.(《植物生理学杂志》)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998，Plant Cell Physiol.(《植物与细胞生理学》)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka(京冢)等人，1993，Plant Physiol.(《植物生理学》))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra(密特拉)和Higgins(希金斯)，1994，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)26:85-93)，来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya(加贺)等人，1995，Mol.Gen.Genet.(《分子和普通遗传学》)248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu(徐)等人，1993，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)22:573-588)。同样，启动子可通过非生物处理，例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质(例如乙醇，雌激素， 植物激素例如乙烯、脱落酸、和赤霉酸，以及重金属)来诱导。
还可以使用启动子增强子元件来在该植物中实现变体的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是放置在启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如Xu(徐)等人，1993，同上披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser(加塞尔)等人，1990，Science(《科学》)244:1293；Potrykus(波特里库斯)，1990，Bio/Technology(《生物/技术》)8:535；Shimamoto(岛本)等人，1989，Nature(《自然》)338:274)。
根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(有关评述，参看霍伊卡(Hooykas)和斯查珀特(Schilperoort)，1992，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)19:15-38)和用于转化单子叶植物的方法，尽管其他转化方法也可以用于这些植物。一种用于产生转基因单子叶植物的方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包衣的微观金或钨颗粒)(Christou(克里斯托)，1992，Plant J.(《植物杂志》)2:275-281；Shimamoto(岛本)，1994，Curr.Opin.Biotechnol.(《生物技术新见》)5:158-162；Vasil(瓦西尔)等人，1992，Bio/Technology(《生物/技术》)10:667-674)。如Omirulleh(奥米如列)等人，1993，Plant Molecular Biology(《植物分子生物学》)21:415-428中所述，单子叶植物转化的替代方法是基于原生质体转化。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植林。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除，在再生期间或在后代中选择性地清除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转 化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
可以通过回交转换过程产生植物。例如，植物包括被称为回交转换的基因型、系、近交、或杂交的植物。
遗传标记可以用于协助将本发明的一种或多种转基因从一种遗传背景渗入到另一种遗传背景中。相对于常规育种，标记辅助选择提供了很多优点，它可以用于避免由表型变异引起的错误。此外，遗传标记可以提供在一次特定杂交的个体子代中优异种质的相对程度的数据。例如，当具有希望的性状(否则会具有非农艺学上希望的遗传背景)的植物与优异亲本杂交时，遗传标记可以用于选择不仅拥有感兴趣的性状、而且还具有较大比例的希望的种质的后代。以此方式，将一个或多个性状渗入特定的遗传背景所需的世代数被最小化。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包括编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞；并且(b)回收该变体。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应被解释为限制本发明的范围。
实例
实例1：用于衣物洗涤的自动机械应力测定
为了评定洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行衣物洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积脂肪酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子对着所有缝开口强力挤压弄脏的纺织品。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械压力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。
在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
洗涤剂剂量4.48g/L测试溶液体积160微升pH大约10洗涤时间20分钟温度30℃水硬度18°dH
模型洗涤剂和测试材料如下：

^*漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：
其中R¹³是2-丁基辛基，
通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺＝4:1:7.5)添加到测试系统中将水硬度调节至18°dH。洗涤后，将纺织品用自来水冲洗并且在加热柜中在85℃下干燥5分钟。
将洗涤性能测量为所洗涤纺织品颜色的亮度。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))，Midtager 29，DK-2605(丹麦(Denmark))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为 红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
int-r2+g2+b2.]]>
根据以下公式计算脂肪酶变体的洗涤性能(P)：P＝ΔInt＝Int(v)–Int(r)，其中Int(v)是用该脂肪酶变体洗涤的纺织品表面的光强度值，并且Int(r)是未用该脂肪酶变体洗涤的纺织品表面的光强度值。
相对性能分数(RP_洗涤)的计算：作为根据以下定义洗涤的全规模的结果给出相对性能分数：
相对性能分数(RP_洗涤)给出针对常规的脂肪酶而言的本发明脂肪酶变体的性能(P)：RP＝P(本发明脂肪酶变体)/P(常规的脂肪酶)。如果一种脂肪酶配制品比常规的脂肪酶表现好，那么认为它展示出改进的洗涤性能。
实例2：在漂白催化剂的存在下，G91变体具有改进的性能
突变RP_洗涤-1,00G91V2,20G91I2,10G91L1,91G91Q1,89G91S1,71G91A1.69G91T1,65G91N1,62G91W1.55G91R1,16G91K1,10
实例3：在漂白催化剂的存在下，T37变体具有改进的性能
突变RP_洗涤-1,00T37R2,14
实例4：在漂白催化剂的存在下，N39变体具有改进的性能
突变RP_洗涤
-1,00N39R1,84N39K1,58
实例5：具有两个或更多个突变并且在漂白催化剂的存在下具有改进的性能的变体
突变RP_洗涤T231R N233R1,00T37R N39R G91A D96G T231R N233R1.18G91Q A150G E210Q T231R N233R P250R1.49G91Q T143A E210Q T231R N233R P250R1.57G91A D96G G225R T231R N233R1.21
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。