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1、10申请公布号CN101991571A43申请公布日20110330CN101991571ACN101991571A21申请号200910057782122申请日20090827A61K31/407200601A61K31/12200601A61P35/0020060171申请人上海中医药大学地址201203上海市浦东新区蔡伦路1200号72发明人苏式兵周钱梅74专利代理机构上海浦一知识产权代理有限公司31211代理人潘诗孟54发明名称姜黄素联合丝裂霉素C在制备治疗乳腺癌的药物中的用途57摘要本发明公开了姜黄素联合丝裂霉素C在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。姜黄素联合丝裂霉素CMMC应用于体外人。
2、乳腺癌细胞模型与体内异种移植瘤裸鼠模型，较单独运用MMC起到了减毒增效的效果，其中运用于体外人乳腺癌细胞中的药物浓度分别为姜黄素40M联合MMC25M、单独运用MMC5M；运用于体内异种移植瘤裸鼠中的药物浓度分别为姜黄素100MG/KG联合MMC12MG/KG、单独运用MMC12MG/KG。本发明从姜黄素和MMC联合用药增加对细胞及肿瘤生长抑制、改善肾功能、减轻骨髓抑制与增加细胞凋亡、引起细胞周期阻滞、减少MMC的DNA交联角度，阐明其对乳腺癌的治疗较单独运用化疗药物MMC起到减毒增效的效果与机理，为临床用药奠定基础。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页。
3、说明书8页附图3页CN101991573A1/1页21姜黄素联合丝裂霉素C在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。2权利要求1所述的用途，其特征是，抗人乳腺癌细胞MCF7增殖的浓度为姜黄素580M，丝裂霉素C0175M。3权利要求2所述的用途，其特征是，抗人乳腺癌细胞MCF7增殖的浓度为姜黄素40M，丝裂霉素C25M。4权利要求1所述的用途，其特征是，抑制人乳腺癌细胞MCF7异种移植瘤裸鼠体内肿瘤生长的浓度为姜黄素100MG/KG，丝裂霉素C12MG/KG。5权利要求4所述的用途，其特征是，抑制人乳腺癌细胞MCF7异种移植瘤裸鼠体内肿瘤生长的浓度为姜黄素100MG/KG，丝裂霉素C15MG/KG。权利。
4、要求书CN101991571ACN101991573A1/8页3姜黄素联合丝裂霉素C在制备治疗乳腺癌的药物中的用途技术领域0001本发明属于医药生物技术领域，尤其涉及姜黄素联合丝裂霉素C在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。背景技术0002本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书。0003CURCUMIN姜黄素，购自中国药品生物制品检定所；0004MMC丝裂霉素CMITOMYCINC，购自美国ICN公司；0005RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；0006FBS胎牛血清FETALBOVINESEMM，购自美国PAA公司；0007INSULIN牛胰岛素，购自美国SIGMA公司；000。
5、8HEPES羟乙基哌嗪乙磺酸HYDROXYETHYLPIPERAZINEETHANESULFONICACID，购自美国ICN公司；0009MTT甲基噻唑基四唑METHYLTHIAZOLYLTETRAZOLIUM，购自美国SIGMA公司；0010DMSO二甲基亚砜DIMETHYLSULFOXIDE，购自美国SIGMA公司；0011AO吖啶橙ACRIDINEORANGE，购自美国SIGMA公司；0012基因组DNA提取试剂盒购自天根生物；0013人乳腺癌细胞株MCF7中国科学院健康所荆清课题组惠赠；0014CR血肌酐SERUMCREATININE，CR检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；0015。
6、BUN血尿素氮BLOODUREANITROGEN，BUN检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；0016GPT谷丙转氨酶GLUTAMICPYRUVICTRANSAMINASE，GPT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；0017GOT谷草转氨酶GLUTAMICOXALACETICTRANSAMINASE，GOT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；0018TUNEL末端脱氧核苷酰基转移酶介导性DUTP切口末端标记TERMINALDEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASEMEDIATEDDUTPNICKENDLABELING，TUNEL检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司；0019E。
7、LISA酶标记免疫吸附测定ENZYMELABELEDIMMUNOSORBENTASSAY，ELISA检测试剂盒购自德国ROCHE公司；0020GRP58糖调节蛋白GLUCOSEREGULATORYPROTEIN，GRP58SIRNA购自美国AMBION公司；0021注射用丝裂霉素购自浙江海正药业股份有限公司。0022乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国每年约有13万人被诊为乳腺癌。据中国抗癌协会最新统计数字显示，我国近年来乳腺癌发病率正以每年3的速度递增，成为城市中死亡率增长最快的癌症，高发地区主要集中在沿海的大城市，其中以上海为最高。目前说明书CN101991571ACN101991573。
8、A2/8页4中医药在防治乳腺癌的基础研究和临床治疗方面取得了一定进展，已经成为乳腺癌术后有效的辅助疗法之一，弥补了现代医学的不足，但其作用机理尚不明确。随着现代生命科学技术的发展和对乳腺癌生物学行为的分子和基因水平了解的加深，中药现代化的不断深入研究，基础与临床研究紧密结合，进一步探讨中药和中西药配伍治疗乳腺癌的效果及其作用机制显得尤为必要。0023目前，乳腺癌的防治尚缺乏理想的治疗药物。临床上认为乳腺癌是一种全身性疾病，其治疗效果取决于远处微小转移的控制程度，而非局部处理范围的大小，故手术范围的大小不是预后的决定性因素。随着全身性治疗作用的日益突出，化疗和内分泌治疗成为当前确有成效的全身性治。
9、疗方法。目前临床上应用的化疗药物主要有丝裂霉素、紫杉醇类、多西他赛、去甲长春花碱、吉西他滨；内分泌治疗主要有雌激素、抗雌激素药物如三苯氧胺、芳香化酶抑制剂如氨鲁米特、福美坦、瑞宁得、来曲唑。上述有些化学合成药物毒副作用大，影响生存质量。如三苯氧胺TAM是治疗绝经妇女恶性乳腺癌的一线药物，根据瑞典对其临床研究结果，该药可增加患子宫内膜癌的危险，同时提示有增加胃肠道癌的可能。0024姜黄素是以传统中药材姜黄为原料，采用现代先进科学提取精制而得的食用天然黄色素。已有文献报道姜黄素具有抗病毒、消炎、降低胆固醇、抑制血小板聚集、增加纤溶活性等作用。MMC是一种细胞周期非特异性广谱抗瘤药物，可使细胞的DN。
10、A解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制癌细胞分裂。但当其作为化疗药物时有损害肾功能的副作用，对周围神经的毒性作用与所用剂量呈正相关，此药可抑制骨髓及引起明显的血小板减少，有的患者有出血倾向且恢复缓慢。0025当前紫杉醇与铂类抗癌药的配伍应用已成为癌症的标准化疗方案，使晚期患者的中位生存期进一步延长。尽管此联合化疗较其他的联合化疗方案的毒性作用有所减轻，但依然存在着较严重的骨髓抑制、肾脏毒性、神经毒性、胃肠道反应和过敏反应及偶发的低血压和心动过缓等。如林纯青报道了紫杉醇与卡铂联合用药产生了诸多的副作用。因此，寻找一个更好的配伍应用的药物组合具有重要的意义。发明内容0026针对上述临床运用化疗药物。
11、产生的诸多不足，本发明所要解决的问题是用一种来源于中药且作为食品添加剂的CURCUMIN联合临床上行之有效的化疗药物MMC在人乳腺癌细胞和异种移植瘤裸鼠中的应用后，不仅降低了MMC的用量、提高了疗效，而且缓解了单独应用MMC的毒副作用，同时观察了其作用的关键靶点。0027本发明针对现今临床运用化疗药物产生毒副作用所存在的问题，选择了中药来源的CURCUMIN与小剂量的MMC联合，抑制人乳腺癌细胞增殖、肿瘤生长及改善临床MMC用量引起的毒副作用，提供了一种低剂量联合治疗乳腺癌的方法，开拓了用药思路，为增效减毒治疗方案提供参考。0028本发明是CURCUMIN联合MMC在制备治疗乳腺癌的药物中的用。
12、途。其中所述CURCUMIN与MMC抗人乳腺癌细胞增殖的浓度分别为580M与0175M；CURCUMIN联合MMC的优选浓度为CURCUMIN40M联合MMC25M。CURCUMIN与MMC抑制异种移植瘤裸鼠体内肿瘤生长的浓度分别为CURCUMIN100MG/KG与12MG/KG；CURCUMIN联合MMC的优选浓度为CURCUMIN100MG/KG联合MMC15MG/KG。说明书CN101991571ACN101991573A3/8页50029上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效效果的方法是体外抗人乳腺癌细胞MCF7增殖时，将IC50浓度的CURCUMIN40M与1/2IC50浓度的MMC25。
13、M联合用药，与单独运用IC50浓度的MMC5M比较，观察联合用药抗人乳腺癌细胞增殖效果；体内抑制人乳腺癌细胞MCF7异种移植瘤裸鼠肿瘤生长时，将CURCUMIN100MG/KG与降低MMC临床成人用量至15MG/KG联合用药，与单独运用临床成人用量折算的MMC2MG/KG比较，观察联合用药抑制异种移植瘤裸鼠体内肿瘤生长及缓解单独运用临床成人用量MMC引起的毒副作用的效果。0030为了更好地理解本发明的实质，下面用药理实验及结果来说明CURCUMIN联合MMC在治疗乳腺癌起到减毒增效效果中的应用。0031CURCUMIN与MMC药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果，由以下步骤完成。00321人乳。
14、腺癌细胞株MCF7细胞培养人乳腺癌MCF7细胞采用开放式单层贴壁培养，培养液即RPMI164010FBS，青霉素100U/ML，链霉素100G/ML，INSULIN001MG/ML，HEPES20MM，恒温37，5CO2，相对饱和湿度。每日观察生长情况，贴壁25天传代一次。传代时PBS缓冲液洗涤，025胰蛋白酶消化后，加入等量培养液吹打成为细胞悬液，1000RPM/MIN离心2分钟，吸取上清液，加入培养液吹打成为单细胞悬液，分盘，传代，实验时取对数生长期细胞。00332CURCUMIN对细胞生长的抑制作用选用对数生长期人乳腺癌MCF7细胞，025胰蛋白酶消化，以5104/ML细胞浓度接种于96。
15、孔板，每孔200L，培养24H后换新鲜培养基，空白与细胞对照组每孔200L，溶媒对照与各用药处理组180L，每组设4个平行孔。再分别加入不同浓度溶媒DMSO及CURCUMIN5M、10M、20M、40M、80M后继续培养，24H、48H、72H后，避光环境下每孔加入MTT5MG/ML溶液20L，37，5CO2培养箱内继续培养4H，吸弃上清液，每孔加入150LDMSO，微量振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用MTT比色法测定光密度值，即对应的活细胞数。选择490NM波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值，分别记录各种药物各自作用于MCF7细胞的浓度效应数据，用下列公式计算药物对细胞增殖的抑制率，并。
16、绘制效应曲线。同样的实验重复过3次。实验结果用以下药物抑制率公式计算00343MMC对细胞生长的抑制作用选用对数生长期人乳腺癌MCF7细胞，调整细胞浓度为5104/ML接种于96孔板，每孔200L，培养24H后换新鲜培养基，空白与细胞对照组每孔200L，溶媒对照与各用药处理组180L，每组设4个平行孔。再分别加入不同浓度溶媒生理盐水及MMC01M、05M、25M、5M、75M各20L后继续培养，24H、48H、72H后，避光环境下每孔加入MTT5MG/ML溶液20L，37，5CO2培养箱内继续培养4H，吸弃上清液，每孔加入150LDMSO，微量振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用MTT比色法测定。
17、光密度值，即对应的活细胞数。选择490NM波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值，分别记录各种药物各自作用于MCF7细胞的浓度效应数据，用下列公式计算药物对细胞增殖的抑制率，并绘制效应曲线。同样的实验重复过3次。实验结果用上述药物抑制率公式计算。00354与单独运用IC50浓度5M的MMC比较，IC50浓度的CURCUMIN40M与1/2IC50浓度25M的MMC联合应用对细胞生长的抑制作用选用对数生长期人乳腺癌说明书CN101991571ACN101991573A4/8页6MCF7细胞，调整细胞浓度为5104/ML接种于96孔板，每孔200L，培养24H后换新鲜培养基，空白与细胞对照组每孔2。
18、00L，各用药处理组180L，每组设4个平行孔。再分别加入药物MMC5M、MMC25M、CURCUMIN40M及CURCUMIN40M联合MMC25M两药物合用时采用两药合用比例为11的方案，每种单药剂量浓缩1倍后继续培养，24H、48H、72H后，避光环境下每孔加入MTT5MG/ML溶液20L，37，5CO2培养箱内继续培养4H，吸弃上清液，每孔加入150LDMSO，微量振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用MTT比色法测定光密度值，即对应的活细胞数。选择490NM波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值，分别记录各种药物各自作用于MCF7细胞的浓度效应数据，用下列公式计算药物对细胞增殖的抑制率，。
19、并绘制效应曲线。同样的实验重复过3次。实验结果用上述药物抑制率公式计算。00365人乳腺癌MCF7细胞异种移植瘤裸鼠模型的制备按每只雌性裸鼠乳房颊脂垫接种细胞数2106/02ML，即1107/ML再加入无血清RPMI1640培养基制备成单细胞悬液后，接种MCF7人乳腺癌细胞，且在接种细胞前24H造模裸鼠均腹腔注射5G/KG苯甲酸雌二醇短效一次，每隔5天补加一次。6周后颈脱位法处死小鼠。00376与单独运用临床用量的MMC2MG/KG比较，CURCUMIN100MG/KG与MMC15MG/KG联合用药对MCF7异种移植瘤裸鼠体内肿瘤质量的影响为了观察CURCUMIN与不同剂量MMC联合用药对移植。
20、瘤裸鼠体内肿瘤生长的影响，本实验运用人乳腺癌MCF7细胞株建立了移植瘤裸鼠模型，给药组分别为MMC1MG/KGM1、MMC15MG/KGM15、MMC2MG/KGM2、CURCUMIN100MG/KGCUR及M1CUR、M15CUR、M2CUR，对照组给予等量的溶媒，给药途径均为腹腔注射，给药4周。与单独运用MMC比较，观察各联合用药组对异种移植瘤裸鼠体内肿瘤生长的影响。00387与单独运用临床用量的MMC2MG/KG比较，CURCUMIN100MG/KG与MMC15MG/KG联合用药对异种移植瘤裸鼠生存时间及体质量、肾功能、骨髓抑制的影响对乳腺癌模型给药过程中记录每只实验动物的生存时间，处死。
21、前称量其体质量；眼球取血后观察各用药组实验动物肝肾功能的变化；处死后取其右侧股骨，观察各用药组的骨髓生长抑制状况。00398CURCUMIN40M与MMC25M联合用药对人乳腺癌MCF7细胞凋亡、细胞周期及其相关蛋白的影响AO荧光染色，即收集MCF7细胞，以PBS制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1106，取出95L细胞悬液与5L001AO混匀后，涂片后镜检拍照，观察细胞凋亡的形态学变化；DNALADDER，即依细胞基因组DNA提取试剂盒说明，提取细胞基因组DNA，鉴定其纯度并测定提取的DNA浓度，取20L上样，1琼脂糖胶，50V，12H，观察细胞凋亡后出现的典型的断片化变化；流式细胞仪测定细胞的。
22、凋亡率，即收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞，细胞于70乙醇中4固定过夜，2000R/MIN离心，以PBS洗两遍，依据ANNEXINVPI双染试剂盒说明操作后，上流式细胞仪检测。流式细胞仪PI单染法观察细胞周期分布。WESTERNBLOT方法观察细胞凋亡相关蛋白CASPASE3、CASPASE9、CASPASE8、BAX、BCL2的表达及细胞周期相关蛋白CYCLIND1、CYCLINA、CYCLINE、CDK2、P21、P27的表达。00409CURCUMIN100MG/KG与MMC15MG/KG联合用药对异种移植瘤裸鼠体内肿瘤组织中细胞凋亡及其相关蛋白的影响用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒观。
23、察肿瘤组织中细胞凋亡情况；用细胞凋亡ELISA检测试剂盒观察细胞质中核小体的富集量，评价细胞凋亡；说明书CN101991571ACN101991573A5/8页7WESTERNBLOT方法观察肿瘤组织细胞凋亡相关蛋白CASPASE3、CASPASE9、CASPASE8、BAX、BCL2的表达。004110CURCUMIN与MMC联合运用对GRP58介导的DNA交联的影响1退火寡核苷酸序列5CTACATCGTGTCATGCACAGGAT3与其互补链等量混合，70退火15MIN，渐渐冷却至室温。2标记用DNAPOLYMERASEILARGEKLENOWFRAGMENT选择性将A32PDCTP于上游。
24、链3末端。3分离、纯化标记了的寡核苷酸用15非变性聚丙烯酰胺凝胶分离、纯化。4DNACROSSLINKING标记了32P的寡核苷酸与05MG蛋白、100MMPBSPH58、LMMNADH、150MMMC、5MFAD、001TWEEN20、018MGBSA于37孵育1H，加入乙醇、10MMMGCL2与15MAMMONIUMACETATE终止反应。DNA于413,700RPM离心30MIN，弃上清，沉淀的寡核苷酸用SPEEDVAC离心至干燥。5DNA检测用DNASEQUENCINGDYECONTAININGFORMAMIDE重悬沉淀的寡核苷酸，95变性15MIN，迅速至冰上冷却。样品用含8M尿素的。
25、15聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳后胶置暗盒中用KODAKMAXMS胶片于70曝光18H，即可见交联的及未结合的寡核苷酸。004211统计学处理每组实验重复3次，数据采用T检验或方差分析。0043实验结果0044上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果中步骤2和3所述的CURCUMIN或MMC对人乳腺癌MCF7细胞增殖的抑制作用均呈时间和剂量依赖性，且结果显示CURCUMIN与MMC的IC50浓度分别为40M与5M。0045上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果中步骤4所述的实验结果显示，与单独运用MMC5M相比较，在不同时间点24H、48H、72H，CURCUMIN40M联合MMC25M对MCF。
26、7细胞增殖的抑制率分别提高了192、249、262P005。0046上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果中步骤6所述联合用药起到增效效果的实验结果发现，与单独运用MMC2MG/KG比较，CURCUMIN100MG/KG联合MMC15MG/KG致移植瘤裸鼠体内肿瘤质量降低了92。联合用药提高了单独运用MMC的抑瘤效果。0047上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果中步骤7所述联合用药起到减毒效果的实验显示，单独运用临床剂量的MMC2MG/KG致该组实验动物死亡一半，未死亡的实验动物生存质量较差，出现食欲减退、皮肤苍白、萎靡不振、恶液质等现象。单独运用MMC15MG/KG组实验动物死亡一只。。
27、而CURCUMIN100MG/KG分别联合MMC2MG/KG、MMC15MG/KG、MMC1MG/KG组实验动物无任何死亡现象，实验动物体质量比单独运用MMC2MG/KG、MMC15MG/KG、MMC1MG/KG分别提高了12、24、18，基本恢复至正常实验动物体重。MMC2MG/KG、MMC15MG/KG、MMC1MG/KG致血清中CR水平较模型组分别升高了82、27、14，BUN水平分别升高了54、52、37；与MMC2MG/KG、MMC15MG/KG、MMC1MG/KG相比较，CURCUMIN100MG/KGMMC2MG/KG、CURCUMIN100MG/KGMMC15MG/KG、CUR。
28、CUMIN100MG/KGMMC1MG/KG联合用药后致CR水平分别降低了43、25、19，BUN水平分别降低了34、41、37。提示CURCUMIN100MG/KG与不同浓度的MMC联合用药缓解了单独运用MMC引起的肾功能损伤。MMC1MG/KG、MMC15MG/KG、MMC2MG/KG组骨髓造血细胞分别呈现轻、中、重度抑制，骨髓腔内血管扩张，并见大量脂肪细胞增生；CURCUMIN100MG/KGMMC1MG/KG、CURCUMIN100MG/KGMMC15MG/KG、CURCUMIN100MG/KGMMC2MG/KG用药后明显改善了骨髓抑制状况，呈现正常或轻微抑制状态，骨髓腔内造血细胞明显。
29、增说明书CN101991571ACN101991573A6/8页8多，血管扩张及脂肪细胞减少。0048上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果中步骤8所述联合用药产生增效的作用机制为增加细胞凋亡，结果显示，CURCUMIN40M联合MMC25M作用细胞后，荧光显微镜下观察到典型的细胞凋亡特征性变化凋亡细胞胞核呈固缩状的或半月形绿色荧光或橘黄色荧光。DNALADDER实验结果显示，CURCUMIN40MMMC25M明显诱导了DNA的断片化，基因组DNA断裂成180200BP及其倍数的片段。流式细胞仪分析结果显示，联合用药后诱导的细胞凋亡率比单独运用MMC提高了2653P005。联合用药后致G0/。
30、G1期细胞较单独运用MMC增加了236。CURCUMIN与MMC联合用药可激活CASPASE3、CASPASE9、CASPASE8活性，下调BCL2表达，上调BAX表达，与单独运用MMC比较，BAX与BCL2比值增加了338倍；同时抑制了细胞周期依赖性蛋白激酶CDK2、细胞周期蛋白CYCLIND1、CYCLINA与CYCLINE的表达，提高了细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂P21、P27的表达。0049上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果中步骤9所述实验结果显示，CURCUMIN100MG/KGMMC2MG/KG、CURCUMIN100MG/KGMMC15MG/KG致细胞释放的单/低聚核小体片。
31、段的特别聚集值，比单独运用临床剂量MMC2MG/KG处理组分别升高了153和161倍。表明，CURCUMIN100MG/KG联合MMC15MG/KG明显诱导了肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡。CURCUMIN100MG/KG联合MMC15MG/KG激活了CASPASE3、CASPASE9与CASPASE8的活性，下调了抗凋亡蛋白BCL2的表达，上调了促凋亡蛋白BAX的表达。可见CURCUMIN100MG/KG与MMC15MG/KG联合用药诱导肿瘤细胞凋亡的机制与对这些细胞凋亡相关蛋白的调节有关。0050上述药物联合治疗乳腺癌起到减毒增效的效果中步骤10所述实验结果显示，SIRNAGRP58致DNA交联明。
32、显减少，MMC单独运用诱导了DNA交联，CURCUMIN与MMC联合用药抑制了DNA交联，当转染SIRNAGRP58入MCF7细胞提取的蛋白再分别加入MMC、MMCCURCUMIN、CURCUMIN，此时三组药物对DNA交联无明显不同影响，可见当GRP58蛋白被抑制后即取消了药物诱导的DNA交联的变化，因此GRP58介导了药物诱导的DNA交联。提示CURCUMIN与MMC联合用药降低单独运用MMC引起毒副作用的作用机制与联合用药抑制GRP58介导的DNA交联有关。0051利用本发明的实验方案可以成功地使联合用药治疗乳腺癌起到减毒增效的效果，即在降低了化疗药物用药剂量的同时，亦未削弱其治疗效果，。
33、而且对化疗药物产生的毒副作用有一定的缓解作用。0052本发明从联合用药角度出发，为临床药物联合用药方案提供了参考。附图说明0053图1是CURCUMIN与MMC联合用药在24H、48H、72H不同时间点对MCF7细胞增殖的影响示意图A，B，C，表示P001，分别于24，48，72H与CURCUMIN40M联合MMC25M进行比较。0054图2是CURCUMIN与MMC联合用药对异种移植瘤裸鼠体内肿瘤生长的抑制作用示意图与M2比较，P005；，P005。0055图3是CURCUMIN与MMC联合用药对单独运用MMC引起的毒副作用的缓解效果示说明书CN101991571ACN101991573A7。
34、/8页9意图。0056图3A是联合用药对异种移植瘤裸鼠体质量的影响示意图与M2比较，P005。0057图3B是联合用药对血清中CR、BUN的影响示意图与M2比较，P005。图3C是联合用药对实验动物骨髓增生状态的影响示意图指向血管扩张，指向脂肪细胞。具体实施方式0058下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。0059实施例100601药物CURCUMIN，体外细胞实验时，以少量二甲亚砜DMSO溶解粉末。
35、，配制成40MM溶液储存液，置4避光保存，临用时稀释成所需浓度DMSO终浓度01；体内动物实验时，以1DMSO、10TWEEN80的生理盐水溶解粉末，配制成10MG/ML溶液，置4避光保存，实验动物行腹腔注射100MG/KG。药物MMC，体外细胞实验时，以生理盐水溶解，配制成1MM溶液储存液，4避光保存，临用时稀释成所需浓度；体内动物实验采用注射用丝裂霉素C。00612利用发明内容部分所述的药物配制方法可成功进行药物联合实验。0062实施例200631与单独运用MMC5M比较，CURCUMIN40M联合MMC25M对细胞增殖的抑制作用调整人乳腺癌MCF7细胞浓度为5104/ML接种于96孔板，。
36、每孔200L，培养24H后换新鲜培养基，空白与细胞对照组每孔200L，各用药处理组180L，每组设4个平行孔。再分别加入药物MMC5M、MMC25M、CURCUMIN40M及CURCUMIN40M联合MMC25M两药物合用时采用两药合用比例为11的方案，每种单药剂量浓缩1倍后继续培养，24H、48H、72H后，避光环境下每孔加入MTT5MG/ML溶液20L，37，5CO2培养箱内继续培养4H，吸弃上清液，每孔加入150LDMSO，微量振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用MTT比色法测定光密度值，即对应的活细胞数。选择490NM波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值。同样的实验重复过3次。用下列公。
37、式计算药物对细胞增殖的抑制率006400652利用本发明的技术方案可以成功地将MMC浓度降低一半与CURCUMIN联合应用，起到比单独运用MMC浓度对人乳腺癌细胞增殖更强的抑制作用。如图1所示，与单独运用MMC5M相比较，在不同时间点24H、48H、72H，CURCUMIN40M联合MMC25M对MCF7细胞增殖的抑制率分别提高了192、249、262P005。0066实施例3说明书CN101991571ACN101991573A8/8页1000671与单独运用临床用量的MMC2MG/KG比较，CURCUMIN100MG/KG与MMC15MG/KG联合用药对MCF7异种移植瘤裸鼠体内肿瘤质量的。
38、影响本实验运用人乳腺癌MCF7细胞株建立了移植瘤裸鼠模型，即按每只雌性裸鼠乳房颊脂垫接种细胞数2106/02ML，即1107/ML再加入无血清RPMI1640培养基制备成单细胞悬液后，接种MCF7人乳腺癌细胞，且在接种细胞前24H造模裸鼠均腹腔注射5G/KG苯甲酸雌二醇短效一次，每隔5天补加一次。给药组分别为MMC1MG/KGM1、MMC15MG/KGM15、MMC2MG/KGM2、CURCUMIN100MG/KGCUR及M1CUR、M15CUR、M2CUR，对照组给予等量的溶媒，给药途径均为腹腔注射，给药4周。与单独运用MMC比较，观察各联合用药组对异种移植瘤裸鼠体内肿瘤生长的影响。0068。
39、2利用本发明的技术方案可以成功地将降低了剂量的MMC与CURCUMIN联合应用，比单独运用临床剂量的MMC对实验动物体内肿瘤生长有更好的抑制作用。如图2所示，与单独运用MMC2MG/KG比较，CURCUMIN100MG/KG联合MMC15MG/KG致移植瘤裸鼠体内肿瘤质量降低了92。与单用大剂量MMC比较，小剂量MMC与CURCUMIN联合用药提高了抑瘤效果。0069实施例400701与单独运用临床用量的MMC2MG/KG比较，CURCUMIN100MG/KG与MMC15MG/KG联合用药对异种移植瘤裸鼠生存时间及体质量、肾功能、骨髓抑制的影响在乳腺癌模型给药过程中记录每只实验动物的生存时间，。
40、处死前称量其体质量；眼球取血后观察各用药组实验动物肝肾功能的变化；处死后取其右侧股骨，观察各用药组的骨髓生长抑制状况。00712利用本发明的技术方案可以成功地观察联合用药对单独运用临床剂量的MMC所产生的毒副作用的缓解效果。如图3A3C所示CURCUMIN100MG/KG与MMC15MG/KG联合用药延长了实验动物生存时间，维持了实验动物正常的体重，改善了MMC2MG/KG所致的实验动物肾功能损伤，减轻了MMC2MG/KG所致的骨髓生长抑制状况。说明书CN101991571ACN101991573A1/3页11图1图2图3A说明书附图CN101991571ACN101991573A2/3页12图3B1图3B2说明书附图CN101991571ACN101991573A3/3页13图3C说明书附图CN101991571A。